Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sự hoạt hoá giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bào hình sao gắn trong mối quan hệ với sự tự thực

LỜI CAM ĐOANTôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học, với đề tài “Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bảo hình sao gan trong mối quan hệ với sự t

LE VAN TRINH

NGHIEN CUU SU HOAT HOA GIAI DOAN SOM IN VITRO

VA IN VIVO CUA TE BAO HINH SAO GAN TRONG MOI

QUAN HE VỚI SU TỰ THUC

LUAN AN TIEN Si

TP Hồ Chi Minh — Nam 2023

VIET NAM NATIONAL UNIVERSITY - HO CHI MINH

UNIVERSITY OF SCIENCE

LE VAN TRINH

STUDY ON INITIAL ACTIVATION PHASE OF HEPATIC

STELLATE CELLS IN VITRO AND IN VIVO IN

RELATION TO AUTOPHAGY

Doctoral Thesis

Ho Chi Minh City — 2023

_ ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCM `

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ VĂN TRÌNH

NGHIÊN CUU SỰ HOAT HÓA GIAI DOAN SOM IN

VITRO VA IN VIVO CUA TE BAO HINH SAO GAN

TRONG MOI QUAN HE VỚI SỰ TỰ THỰC

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã sô ngành: 9420201

Phản biện 1: PGS.TS Vòng Bính Long

Phản biện 2: PGS.TS Trần Công Toại

Phản biện 3: TS Phạm Lê Bửu Trúc

Phản biện độc lập 1: miễn

Phản biện độc lập 2: miễn

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS TRƯƠNG HAI NHUNG

TP Hồ Chi Minh — Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học, với đề tài “Nghiên cứu sự hoạt

hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bảo hình sao gan trong mối quan hệ với sự tự

thực” là công trình khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Trương Hải

Nhung Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không

trùng lap với các công trình đã công bô trong và ngoai nước.

Nghiên cứu sinh (Ký tên, ghi họ tên)

LÊ VĂN TRÌNH

LỜI CẢM ƠN

Đê hoàn thành luận án này, Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới:

Các cơ quan cấp kinh phí dé thực hiện luận án gồm: Quy phát triển khoa học và công nghệ

quốc gia với đề tài Nafosted mã số 108.05-2017.30, ĐHQG HCM với đề tài C ĐHQG mã

số C2021-18-10.

Sự hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện tối đa của CBHD hướng dẫn, Cô PGS TS Trương

Hải Nhung.

Quí Thầy Cô, các thế hệ lãnh đạo, nhân viên, và đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm Nghiên

cứu va Ứng dụng Tế bào gốc, cũng như Viện Tế bào gốc, Trường đại học Khoa học Tự

nhiên ĐHQG HCM.

Các đóng góp to lớn của các thế hệ đồng nghiệp, nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh

viên và các Thầy Cô có vấn, hợp tác với Nhóm Khoa học tái tạo gan và tiêu hóa.

Các cơ quan don vi gồm: Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh, Trường đại học Khoa học Tự

nhiên, Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học, va các cơ quan đơn vi đã hợp tac, tạo điều

kiện cho Tôi hoàn thành luận án này.

Xin cảm ơn!

LOT CAM DOAN - chư i

LOT CAM ƠN tt nh HH re ii

i19 08 109 0 -Ă 1H

TRANG THONG TIN LUẬN ÁN 2 52522E22EE2ESEEEE121121121 2111211212 re vii DANH MỤC HÌNH ẢNH - 2-52 S2+SSEEEEEEE2121121121121711111211 212111111 e6 xi DANH MỤC BANG BIBU w o0 ccccsccsessssssssscsscscssescscsvcscsscsvssesesscsesicsesicsesscsssesneseeseaes xiv

DANH MUC TU VIET TAT o occcceccccccccsscssssssssssessessesssssssuesscsessesussucsessessesssesssnsaeeees XV CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 25+ 2t tt tt re |

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIBU - 2 2 2 SSE£E£2E£2EE£EEtEEezEzEzresrxee 5

2.1 Bệnh lý xơ gan và tế bào hình sao 2 + Sc x+Sx‡EE2E2E2EeExerxerxerrrrrkee 5

2.1.1 Gan và bệnh ly xơ Øañ - - - cv HT TH nh 5

2.1.2 Tế bào hình sao gan: tên gọi và lich sử nghiên cứu - 2s z+s+cs+: 10

2.1.3 Tế bào hình sao gan: hình thái và cấu trúc -¿- - 2 + s+£+£++£zzx+xzxszeez 12

2.1.4 Tế bào hình sao gan: marker phan tử -¿- 2s 2+s+S++E+£++E+Ex+Eerxerrrerxes 15

2.1.5 TẾ bào hình sao gan: chức năng sinh lý -¿- 5 2 2+x+£+Ee+xzEezcszxsreree 17

2.1.6 Vai trò của tế bào hình sao gan trong bệnh lý xơ gan - - 25 s52 21 2.1.7 Điều trị bệnh lý xo gan nhắm trúng dich tế bào hình sao - s5: 22

2.2 Sự tự thực bao và vai trò của sự tự thực bào ở gan - -. -<c<<<++ 24

2.2.1 Sự tự thực ĐàO HH TH TH HH HH HH HH 24 2.2.2 Quá trình tự thực bào 1001111111111 1192211111111 ng 011151111 kh 26

2.2.3 Các phương pháp đánh giá sự tự thực bào - -.c Ăn re 28

2.2.4 Vai trò của sự tự thực bào ở các tế bào gan góp phần vào bệnh ly xơ gan 30

2.3 Mô hình nghiên cứu tế bào hình sao gan it vifr0 .-52-5-5cccccccc2 34

2.3.1 Phân lập tế bào hình sao gan sơ cấp - ¿+ 2s 2+x+££+Ev£zEeEeEerkererrerees 34 2.3.2 Các mô hình nuôi cấy tế bào hình sao gan in wif0 - - 5: 55+55+55+c: 36 2.3.3 Mô hình dòng tế bào hình sao gan thương mạii ¿2 + ++s++s++: 37

2.4 Tình hình nghiên cứu về van đề đặt ra bởi đề tài 2 -cccccccce 38 CHƯƠNG 3: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP - 2 52 SeS++E££E+EezEezzrereee 42

3.1 Vật liệu — Hóa chất - Dụng cụ - Trang thiết bị - 5-52 cczzxcczxerszed 42

3.1.1 Vat GU 42

3.1.2 Hóa chất, dụng CU cececcccsccscscsscscsessescscssssescscscscsesucscsvssecscsesscscsvsesscscsesecscsvees 42 3.1.3 Tit 00 42

3.2 Cách tiếp cận và thiết kế nghiên cứu - - 2 2+ + E+EE£E+EeE£EzEerersrxsrree 43

3.2.1 Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy HSC in vifrO -7- 252 5c+ccce+eccesceei 43

3.2.1.1 Xây dựng quy trình phân lập HSC từ gan chuột BALB/c 43

3.2.1.1 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in vitro -5-5255-55<55¿ 45

3.2.2 Đánh giá mối liên hệ và vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa giai đoạn

CÔN Ni an 70

4.1.1 Xây dựng quy trình phân lập tế bào hình sao gan từ chuột BALB/c 70

4.1.1.1 Khảo sát đường truyền dịch - - 2-5 5s+xeEE‡EEEEEEEEEEEeEkrEerkrrerkrree 70

4.1.1.2 Khảo sát enzyme ColÏagØ€TiaS€ - - - G11 ng kg re 74

4.1.1.3 Khảo sát nồng độ Nycodenz trong làm giàu HSC - - 25+: 75 4.1.1.4 Kết quả phân lập tế bào ứng viên từ quy trình xây dựng được 79 4.1.1.5 Quy trình chi tiết phân lập HSC từ gan chuột . -2-25+55+¿ 81 4.1.2 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in Vitro - 5-55-5252 552 552 82

4.1.2.1 Đặc tinh chất nền là Fibrin từ huyết tương 2 ¿55 s+c+2c++s+>se2 83 4.1.2.2 Mức độ hồi phục, khả năng tăng sinh và hình thái của HSC 86

4.1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên chức năng HSC - 88

4.1.2.4 Vai trò của gel Fibrin trong nuôi cấy HSC - ¿5 ccz+s+csczcx+z 92

iv

LÊN G7 dd 97

4.2.1 Ảnh hưởng của LPS và CQ lên sự tăng sinh và hình thái của HSC in vitro 98 4.2.2 Ảnh hưởng của LPS và CQ lên sự biểu hiện collagen 6 HSC in vi/ro 100 4.2.3 Ảnh hưởng của LPS và CỌ lên sự biểu hiện ơ-sma ở HSC hoạt hóa in vitro 101

4.2.4 Ảnh hưởng của LPS va CQ lên chức năng dự trữ lipid ở HSC hoạt hóa in vitro

¬ 103

4.2.5 Tác động của CQ và LPS lên sự tự thực bào ở HSC hoạt hóa in vifro 104

4.3 Nội dung 3 ¿5c St 221 2112112121212112112111111112112112111111 111.1 rre 113

4.3.1 Tạo mô hình chuột tổn thương gan cấp tính -2- 2 2s x+z++s++s++s+2 113

4.3.1.1 Mô hình chuột BDIL ¿2 ¿+ 2©++S£+E+EE+E£EE2EEEEEEEEEErkerrrxererrerres 113

4.3.1.2 Mô hình chuột CCla -¿- ¿25+ +2S++E+2EEE+EE+EE+EE2E+zEezxervervzrvrrves 116

4.3.3 Khao sát mức độ hoạt hóa va su tự thực bào ở HSC từ chuột tôn thương gan120

4.3.3.1 Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột BDL - << <<<<<<<< 120 4.3.3.2 Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột CC ]¿ - << << <<<<<<<+ 123

4.4 NOG Ung e 128

4.4.1 Ảnh hưởng của CQ lên chuột BDIL - 225 2 52+E+E££££E+E£Ee£EzEeEzrzzxez 128

4.4.1.1 Ảnh hưởng của CQ lên tình trạng bệnh lý chuột BDL - 129 4.4.1.2 Anh hưởng của CQ lên sự hoạt hóa HSC trong gan chuột BDL 132 4.4.2 Ảnh hưởng của CQ trên chuột CCÌ 2-2 2+ S2+E+E£2E£EEzE££EzEe£EzErxsree 134

4.4.2.1 Ảnh hưởng của CQ lên tình trạng bệnh lý chuột CC1¿ -. 135 4.4.2.2 Ảnh hưởng của CQ lên sự hoạt hóa HSC trong gan chuột CCla 138

4.5 Tom lược kết quả của luận án - 2© k+S£SE+E£E£EEEEEEEEEEEEEEEErErkrrrrrreee 143

CHUONG 5: KET LUẬN - KIÊN NGHỊ, 55:5 2ctisrtierrrrrrrrrrierre 145

5.1 Kết luận -¿ :¿+5++2++2Yx222122122112211211221121121121121121121 11.1.1.1.e 145 {0 1) 01 35 145

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-52 SSE‡EE£EE2EE2E2EEEEEEEEE121121171 711111111 146 DANH MỤC BÀI BAO, CÔNG TRINH KHOA HỌC 2- 2-52 255: 168

PHỤ LỤC

vi

TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN

Tên đề tai luận án: Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro va in vivo của tế bào hình sao

gan trong mối quan hệ với sự tự thực

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 9420201

Họ tên nghiên cứu sinh: LÊ VĂN TRÌNH

Khóa đào tạo: K29/2019

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Hải Nhung

Cơ sở dao tạo: Truong Đại học Khoa học Tự nhiên, DHQG.HCM

1 TOM TAT NỘI DUNG LUẬN ÁN:

Xo hóa gan là kết qua chung của nhiều bệnh lý tổn thương gan Trong đó, các tế bào gan bị chết

và được thay thế bởi mô sẹo, có bản chất là sự tích tụ của chất nên ngoại bào (ECM) tiết ra từ

nguyên bào sợi cơ (MFB) Trong gan ton thuong, 80% nguồn gốc của MFB đã được chứng minh

là từ tế bào hình sao gan (HSC), một loại tế bào của gan có chức năng dự trữ vitamin A Do đó,

sự chuyền dạng hay hoạt hóa của HSC thành MEB khi gan ton thương được xem là bước then chốt

trong tiến trình phát triển của bệnh lý xơ gan Sự hoạt hóa HSC thành MFB được chia thành 2 giai

đoạn là khởi đầu và duy trì Khởi đầu là giai đoạn sớm trong sự hoạt hóa HSC chuyên từ trạng

thái im lặng sang trạng thái hoạt hóa Các đặc trưng của HSC trong giai đoạn này gôm sự chuyên dang từ hình sao sang MFB, mat giọt lipid chứa vitamin A, biểu hiện các phân tử hoạt hóa như ơ-

sma/collagen, hướng hóa động và tiết yếu tô viêm Giai đoạn duy trì trạng thai MFB với các đặc

tính như tăng sinh mạnh, sản xuất ECM tạo xơ, vả di cư Sự tự thực bảo là một con đường sinh lý nội bảo mới được phát hiện, giữ nhiều vai trò quan trọng trong tế bảo nhân thực, đặc biệt là giúp

tế bào đáp ứng với điều kiện môi trường bắt lợi Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung đánh giá mối liên hệ của sự tự thực bảo trong giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC in vitro và in

vivo.

Nghiên cứu gồm 4 nội dung: (1) Phân lập và nuôi cay HSC in vitro; (2) Đánh giá mối liên hệ và

vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa HSC in vitro ở giai đoạn sớm; (3) Tạo mô hình chuột

ton thương gan cấp tính và đánh giá trạng thái hoạt hóa ở HSC in vivo; (4) Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân ức chế sự tự thực lên sự hoạt hóa HSC giai đoạn sớm in vivo ở chuột bi tôn thương gan cấp tính.

Các kết quả đã đạt được gồm: Nghiên cứu đã thiết lập được quy trình phân lập HSC sơ cấp từ gan chuột BALB/c và điều kiện nuôi cấy để duy trì kiểu hình im lặng in vitro bang giá thé Fibrin Nghiên cứu ghi nhận sự tự thực bảo được cảm ứng biểu hiện từ giai đoạn sớm khi HSC hoạt hóa

HSC in vitro bằng tác nhân lipopolysacharide, xử ly HSC với chat ức chế sự tự thực là Chloroquine

5 uM làm giảm sự hoạt hóa Trên in vivo, sử dụng hai mô hình tốn thương gan cấp tính là tiêm 2 mL/kg CCl, và phẫu thuật thắt ống dẫn mật ở đối tượng chuột BALB/c Nghiên cứu đã khảo sát được giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC ở hai mô hình này (sự hoạt hóa in vivo) là 2 ngày sau gây tôn thương Đồng thời, ghi nhận sự tăng biểu hiện của con đường tự thực bào trong HSC hoạt hóa in vivo Tiêm Chloroquine 2 liều 60 mg/kg trước 24 giờ và sau 24 giờ gây mô hình bệnh, giúp giảm ton thương và xơ hóa gan Di kèm với đó là tac động ức chế sự hoạt hóa HSC trong gan

ton thương cấp tính của Chloroquine Kết luận, sự tự thực bao đi kèm với giai sớm của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo, tác động ức chế sự tự thực bảo giúp ngăn ngừa sự hoạt hóa HSC, làm

giảm xơ hóa gan.

2 NHỮNG KÉT QUÁ MỚI CỦA LUẬN ÁN:

Các kết quả sau đây của luận án đã được đăng trên 5 bài báo khoa học ở các tạp chi quốc tế thuộc

danh mục ISI.

Thiết lập thành công quy trình phân lập HSC từ chuột BALB/c phù hợp điều kiện thực tế.

Thiết lập được mô hình nuôi cây HSC sơ cấp in vitro bằng gel Firbin từ huyết tương đông lạnh,

giúp hạn chế hiện tượng tự hoạt hóa của HSC so với nuôi trên đĩa nhựa truyện thống.

Trong giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo có đi kèm với sự tăng biểu hiện

của con đường tự thực bào Đồng thời, tác nhân ức chế sự tự thực bào là Chloroquine giúp ngăn ngừa sự hoạt hóa và chuyền dang HSC in vitro ở nồng độ 5 uM trong 24 giờ và trên in vivo với 2

vii

liều tiêm 60 mg/kg Ngoài ra, CQ giúp giảm ton thương và xơ hóa gan trên hai mô hình chuột tonthương gan cấp tính.

3 CAC UNG DỤNG/ KHẢ NANG UNG DỤNG TRONG THỰC TIEN HAY NHỮNG VAN

DE CON BO NGO CAN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU

HSC là công cụ thiết yếu, quan trọng cho các nghiên cứu về bệnh lý gan nói chung và bệnh lý xơ

gan nói riêng Việc thiết lập thành công quy trình phân lập và điều kiện nuôi cấy, là cơ sở nền tảng

cho các nghiên cứu trong lĩnh vực trên mô hình tế bào này.

Mô hình nuôi cay HSC sơ cấp in vitro bằng giá thé Fibrin giúp giải quyết được hạn chế của điều

kiện nuôi cay trên đĩa nhựa là sự tu hoạt hóa Do đó, mô hình nay sé giúp các nha nghiên cứu mô phỏng gần với điều kiện in vivo.

Tác nhân ức chế sự tự thực bào giúp ngăn ngừa sự hoạt hóa HSC và hiệu quả giảm xơ hóa gan,

mở ra hướng dụng điều trị mới cho các được chất có tác động trên con đường tín hiệu này

Một sô vân dé tồn tại cần được nghiên cứu xa hơn: hoàn thiện quy trình và tối ưu hóa mô hình nuôi cấy HSC trên giá thể fibrin, chứng minh cơ chế của giá thể trong việc duy trì đặc tính im lặng

của HSC Phát triển hệ dẫn thuốc trúng mục tiêu là HSC hoạt hóa dé tối ưu hóa hiệu quả và hạn

chế tác dụng phụ của tác nhân ức chế sự tự thực bào trên các tế bảo khác của gan.

viii

THESIS INFORMATION

Thesis title: STUDY ON INITIAL ACTIVATION PHASE OF HEPATIC STELLATE CELLS

IN VITRO AND IN VIVO IN RELATION TO AUTOPHAGY

Speciality: Biotechnology

Code: 9420201

Name of PhD Student: LE VAN TRINH

Academic year: K29/2019

Supervisor: Associate Professor Doctor Truong Hai Nhung

At: VNUHCM - University of Science

1 SUMMARY

Liver cirrhosis is the final stage of different liver etiologies Specifically, the liver was replaced

by extracellular matrix (ECM) secreted by myofibroblasts (MFBs) Recent researches indicated

that over 80% of MFBs originate from hepatic stellate cells (HSCs), a type of vitamin A storage

cell in the liver Therefore, the activation of HSCs into MFBs was considered a crucial step in

fibrosis development The two phases of HSCs activation are initiation and perpetuation The initiation is the early phase characterized by the transition of HSCs from quiescence to activation stage During this phase, HSCs will transform from a starlike shape to MFBs morphology, lose their vitamin A stored in lipid droplets, express activated molecules o-sma/collagen, chemotaxis, and secrete inflammatory cytokines Following this is the perpetuation or MFBs maintenance phase, which is characterized by robust proliferation, ECM secretion, and

migration Autophagy was currently demonstrated as a novel and essential role in the cell,

especially for cell response to stressful This study evaluated the relationship between autophagy and initiation phase of HSCs activation in vitro and in vivo.

The study consists of 4 parts: (1) Isolation and culture of HSCs in vitro; (2) Evaluation the relation of autophagy and HSCs initiation activation in vitro; (3) Establishing the acute liver injury mice model and examination the HSCs activation in vivo; (4) Evaluation the effects of autophagy inhibitor in the HSCs activation in vivo and liver pathophysiology.

The main findings from the thesis were: successfully established the procedure for isolating HSC from the BALB/c mice and the in vitro culture conditions Specifically, the discovery of

the potential of Fibrin gel in maintaining the quiescence phenotype of HSCs culture in vitro In

vitro induction of autophagy by lipopolysaccharides was found to be accompanied by HSCs activation, and inhibition of autophagy by 5 uM chloroquine inhibited HSCs activation Using two models of acute liver injury in BALB/c mice, 2 mL/kg CCl, and bile duct ligation, we determined that the initial phase of HSCs activation occurred on day 2 after injury Concurrently, autophagy increased expression 1n activated HSCs in vivo Inhibitor of autophagic flexus by two injections of chloroquine 60 mg/kg, the day before and after, reduced fibrosis and inhibited HSC

activation.

2 NOVELTY OF THESIS

The results of this thesis have been published in five ISI-indexed journal articles.

We established a successful method for isolating HSCs from BALB/c mice.

Fibrin gel is suitable for maintaining primary HSCs during culture This model helps to overcome the disadvantages of the traditional culture condition for HSCs, which is autoactivation.

ix

During the initial phase of HSC activation in vitro and in vivo, increased autophagic flexus

expression was observed Similarly, the autophagy inhibitor chloroquine inhibited HSC activation in vitro at 5 uM for 24 hours and in vivo with two doses of 60 mg/kg chloroquine.

In addition, chloroquine mitigated liver damage and reduced fibrosis in both models: CCl, and bile duct ligation.

3 APPLICATIONS/ APPLICABILITY/ PERSPECTIVE

The successful establishment of isolation procedures and culture conditions serves as the foundation for future research into this cell model Fibrin substrate has great potential for use in

in vitro HSC culture assays, as it helps to overcome the challenge posed by this cell's traditional self-activation culture condition.

The effectiveness of autophagy-inhibiting agents in treating acute liver disease and cirrhosis paves the way for new therapeutic applications for these agents.

After the completion of this study, future necessitous studies will be able to optimize the fibrin

substrates model for primary HSC culture and investigate its underlying mechanisms.

Development of an HSC-targeting drug delivery system is require to maximize effectiveness and minimize adverse effects of an autophagy inhibitor on other liver cells.

DANH MỤC HÌNH ANH

Hình 2.1: Hình mô phỏng cấu trúc tiểu thùy gan ở người và sự sắp xếp các loại tế bàotrong tiểu thủy gan ¿5-5-5221 E21 1521212121111 211121211111111111 01110101111 xe 6

Hình 2.2: Tiến trình của các bệnh gan mạn tính theo năm - -«++++ 8

Hình 2.3: Biểu đồ thé hiện số lượng công bó liên quan tới HSC theo năm 12Hình 2.4: Hình anh cấu trúc 3 chiều HSC trong mô gan . - 55+ 13

Hình 2.5: Siêu cau trúc gai của HSC trong xoang gan - 2 ¿+ ++sz+szx+zs+sz 14

Hình 2.6: Kiểu hình HSC trong nuôi cấy it ifro - ¿2-52 52+c+c2+E+£ctzecrzrccez 14Hình 2.7: Gan chuột được nhuộm với các marker khác nhau để xác định vị trí của cácloại tẾ bào trong gan - 5c St E1 121111 2121112111211111111 11211011211 txe 16Hình 2.8: Tiến trình hoạt hóa HSC theo 2 Ø1a1 OẠI Series 19Hình 2.9: Chất nền ngoại bào tích tụ trong xơ hóa gan có nguồn gốc chủ yếu từ HSC

Hình 2.10: Các thụ thể bề mặt tăng biểu hiện ở HSC hoạt hóa có thé được chọn làm

Marker trúng đích - -.- G1 1011911199101 HH Hư 23

Hình 2.11: Khái quát hóa các thuốc phân tử điều trị xơ gan nhắm trúng đích HSC hoạt

0 24

Hình 2.12: Một số kiểu tự thực bào và các cấu trúc thé tự thực - 26

Hình 2.13: Quá trình và các phân tử tham gia vào sự tự thực bảo 27

Hình 2.14: Ảnh hưởng của sự tự thực bào tới tế bào gan tác động lên bệnh lý xơ gan

¬ 31

Hình 2.15: Sự tự thực bào ức chế sự chuyên dang của LSEC và xơ hóa gan 32Hình 2.16: Sự tự thực bào thúc đây sự hoạt hóa HSC thành MFB gây xơ hóa gan 33Hình 3.1: Đối tượng nghiên cứu +- 2 252 S2+E£EE2E£E£E£EEEEEEEEErEerrkrrerree 42

Hình 3.2: Xây dựng quy trình phân lập HSC từ gan chuột BALB/c 44

Hình 3.3: Nghiên cứu nuôi cay HSC im lặng bằng giá thé Fibrin - 45

Hình 3.4: Thiết kế thí nghiệm nội dung 2 - 2-2 25 2 2+E£££+E+£czxezzxez 47

xi

Hình 3.5: Tạo mô hình chuột tôn thương gan cấp tính - 25+: 49

Hình 3.6: Khảo sát sự hoạt hóa HSC in vivo ở chuột mô hình 50

Hình 3.7: Thiết kế thí nghiệm nội dung 4 22 22+ 2 £2+£+££+E+£zxzzzxez 51 Hình 4.1: Chuẩn bị tủ thao tác truyền dịch và luồn kim vào tĩnh mạch cửa gan chuột "— 72

Hình 4.2: So sánh hiệu qua thu nhận HSC giữa 3 nồng độ Nycodenz 76

Hình 4.3: Phần trăm tế bào dương tính với Desmin -2- 2555552 77 Hình 4.4: Tế bào ứng viên thu nhận được là tế bào hình sao gan 79

Hình 4.5: Các bước trong giai đoạn 2 của quy trình phân lập HSC từ chuột 81

Hình 4.6: Đặc tinh gel Fibrin từ huyết tuong o c.ccecececseccseeseseessscseseseesesesseseseesees 84 Hình 4.7: Anh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên mức độ hồi phục, tăng sinh và hình thái FSC 87

Hình 4.8: Hình anh HSC dưới kính hiển vi điện tử quét 2-5 =s+<zs4 88 Hình 4.9: Ảnh hưởng của chat nền lên dự trữ lipid ở HSC trong nuôi cấy 89

Hình 4.10: Ảnh hưởng của chat nền lên biểu hiện collagen 1 ở HSC nuôi cấy 90

Hình 4.11: Ảnh hưởng của chất nền lên biểu hiện a-sma 6 HSC nuôi cấy 91

Hình 4.12: Fibrin duy trì đặc tính im lặng của HSC trong nuôi cấy tới 7 ngày 92

Hình 4.13: Hình thái HSC khi nuôi trong khối gel Fibrin -5-52- 93 Hình 4.14: CQ ức chế sự tăng sinh và chuyền dang của HSC hoạt hóa in vitro 99

Hình 4.15: CQ ức chế biểu hiện collagen 1 ở HSC hoạt hóa in vifro 100

Hình 4.16: CQ ức chế biểu hiện a-sma ở HSC hoạt hóa in vi/ro - 102

Hình 4.17: CQ duy trì chức năng dự trữ giọt lipid của HSC hoạt hóa in vitro 104

Hình 4.18: Ảnh hưởng của CQ lên sự biểu hiện Ic3 6 HSC hoạt hóa in vifro 105

Hình 4.19: Ảnh hưởng của CQ lên sự biểu hiện p62 ở HSC hoạt hóa in vitro 107

Hình 4.20: Kết quả về hình thái, tỷ lệ sống và mô học ở chuột mô hình BDL 114

Hình 4.21: Sự thay đổi các chỉ số sinh hóa chuột BDL theo thời gian 115

Hình 4.22: Kết quả về tỷ lệ sống và mô học ở chuột mô hình CC: 116

xii

Hình 4.23: Sự thay đôi các chỉ số sinh hóa chuột mô hình CCl theo thời gian 117

Hình 4.24: Sự thay đồi biểu hiện o-sma ở chuột BDL 2- 2525525252 121 Hình 4.25: Kết quả nhuộm Sirius red mô gan chuột BDL - 2-5: 122 Hình 4.26: Sự thay đổi biểu hiện gene hoạt hóa và tự thực ở HSC phân lập từ chuột BDL "0 0 — 123

Hình 4.27: Sự thay đổi biểu hiện a-sma ở chuột CC]: - - 2 2552s+£+££s>x2 124 Hình 4.28: Kết quả nhuộm Sirius red mô gan chuột CCl¿ 2- 2 2 s+=s+5+ 125 Hình 4.29: Sự thay đổi biểu hiện gene hoạt hóa và tự thực ở HSC phân lập từ chuột CCla 2 TBẦY HH 126 Hình 4.30: Tác động của CQ lên các chỉ số sinh hóa và bach cầu tong chuột BDL 2 ngày ¬ 129

Hình 4.31: Anh hưởng của CQ lên mô gan chuột BDL 2 ngày 130

Hình 4.32: Anh hưởng của CQ lên xơ hóa gan chuột BDL 2 ngày 131

Hình 4.33: Ảnh hưởng của CQ lên sự tự thực bao ở HSC từ chuột BDL 2 ngày 132

Hình 4.34: Ảnh hưởng của CQ lên sự tự hoạt hóa HSC trong gan chuột BDL 2 ngày ¬ 134

Hình 4.35: Biéu đồ so sánh tác động của CQ lên các chi số sinh hóa và khối lượng gan chuột tiêm CC] sau 2 ngay - - - Gv n 135 Hình 4.36: Ảnh hưởng của CQ lên mô gan chuột CC1¿ 2 ngày - - 137

Hình 4.37: Anh hưởng của CQ lên sự tự thực bào ở HSC từ chuột CCl 2 ngày 139

Hình 4.38: Ảnh hưởng của CQ lên sự hoạt hóa HSC từ chuột CCly 2 ngày 140

Hình 4.39: Sơ đồ tóm lược kết quả đạt được của luận án «‹+- 144

xiii

DANH MUC BANG BIEU

Lich str phat hién HSC 11

Tổng hop và so sánh đặc tính 2 trạng thai HSC - + 20Đặc tính các tế bảo trong gan -¿- 2-5: s+S++E2EvEE2E2ECEEEEEEErrkerrrree 36

Các dòng HSC thương mai - - -. G5 <5 11121111191 11 key 38

Tổng hợp các nghiên cứu trong lĩnh vực - ¿5 + s+s+zs+x+ss 39

Trinh tự mỗi sử dụng trong phản ứng Realtime RT-PCR 68Danh mục kháng thé sử dụng trong đề tài 2- 5255255: 68Các biện pháp khắc phục dé cải thiện hiện quả truyền dịch vào gan 71

So sánh hiệu quả truyền dich giữa các đường mạch vào gan 73

So sánh hiệu quả phân cắt gan thành tế bào đơn giữa các loại enzyme 74

xiv

DANH MỤC TỪ VIẾT TÁT

Viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

2/3D Two/three dimension Hai/ba chiều

AL Autolysosome Túi tự thực tiêu hóa

AM Amphisome Túi tự thực dung hợp

AMPK AMP-activated protein kinase

AP Autophagosome Tui tu thuc

APAP Acetaminophen

AST/ALT Aspartate/alanine transferase

Atg Autophagy related gene Phân tử liên quan tiễn trình tự thực

BD Bile duct Ong mat

BDL Bile duct ligation That ống dan mật

BEC Bile endothelial cell Tế bao biéu mô ống mật

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

CBD Common bile duct Ong mật chủ

cCCu Carbon tetrachloride

CCk§ Cell Counting Kit 8

CK7 Cytokeratin 7

CLEC4F C-Type Lectin Domain Family 4 Member F

CQ Chloroquine

CTCF Corrected total cell fluorescence Huynh quang té bao hiéu chuan

CV Central vein Tinh mach trung tam

DAPI 4', 6-diamidino-2-phenylindole

DR Ductal reaction Phan ứng tăng sinh ống mật

ECM Extra cellular matrix Chat nén ngoai bao

EGTA Ethylene glycol bis(2-aminoethy]) tetraacetic acid

ET-1 Endothelin-1

FACS Fluorescence-activated cell sorting Chọn lọc tệ bào bang huynh quanghoạt hóa

FB Fibroblast Nguyén bao soi

FBS Fetal Bovine Serum Huyét thanh bao thai bd

FCM Flow cytometry Đếm tế bao dang dòng chảy

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

XV

GBSS Gey's Balanced Salt Solution

GFAP Glial fibrillary acidic protein

GFP Green fluorescence protein Protein phat huynh quanh xanh

HA Hepatic artery Dong mach gan

HBV/HCV Hepatitis virus B/C Viém gan B/C

HCC Hepatocarcinoma Ung thư biéu mô tế bào gan

HFD High fat diet Chế độ ăn giàu chất béo

HGF Hepatocyte growth factor Nhân tổ tăng trưởng tê bào ganH/I-R Hypoxia/Ischemia-reperfusion Thiếu máu và tái tuần hoàn

HPC Hepatic progenitor cell Té bao tién than gan

HSC Hepatic stellate cell Té bao hinh sao gan

ICC Immunocytochemistry Hóa tế bào miễn dịch

IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dich

IL Interleukin

IVC Inferior vein cava Tinh mach than tang

KO Knock out Loại bỏ hoặc bất hoạt gene

LC3 Microtubule-Associated Protein 1 Light Chain 3

LD Lipid droplet Giot lipid

LPS Lipopolysacharide

LRAT Lecithin Retinol Acyltransferase

LSEC Liver sinusoidal endothelial cell Tế bào nội mach xoang gan

LY Lysosome Túi tiêu hóa

MaA Macroautophagy Tự thực bào cấp lớn

MAPK Mitogen-activated protein kinases

MFB Myofibroblast Nguyên bao sợi cơ

mTOR The mammalian target of rapamycin

NAFLD Nonalcoholic fatty liver disease Gan nhiễm mỡ không do rượu

NASH Nonalcoholic steatosis hepatitis Viêm gan nhiềm mỡ không do

rượu

NPC Nonparenchymal Tế bào không nhu mô

OD Optical density Mat d6 quang

ORO Oil red O

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor 1 Chất ức chê plasminogen

PBS Phosphate-buffered saline Nước muỗi sinh lý

xvi

PC Parenchymal Tế bào nhu mô

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tông hợp

PDGF Platelet derived growth factor Nhân tố tăng trưởng từ tiêu cầu

PECAM-I Platelet endothelial cell adhesion molecule

PFA Parafolmadehyde

PG Phagophore Khoang tu thuc

PV Portal vein Tinh mach cua

ROS Reactive oxygen spiece Gốc tự do

RT-PCR Real-time Polymerase Chain Reaction

SEM Scanning electron microscope Kinh hién vi dién tir quét

siRNA Short inhibitor RNA

SMA Smooth muscle actin

SQSTM1 Sequestosome 1

TBS Tris buffer saline

TLR Toll like receptor

TGF Transforming growth fator Nhân tổ tăng trưởng chuyên dang

Vitamin A VitA

xvii

CHƯƠNG 1: MO DAU

Giới thiệu

Gan là một nội quan lớn nhất của cơ thể, thực hiện gần 500 chức năng khác nhau Gancũng là cơ quan chịu nhiều tác nhân gây ton thương như nhiễm virus viêm gan, sử dụngchất cồn, nhiễm mỡ, di truyền, và tự miễn Tén thương mạn tính là quá trình tôn thươnggan lặp lại trong thời gian dài, kết quả cuối cùng thường dẫn tới xơ gan Xơ gan là nguyênnhân gây chết thứ 4 ở Châu Âu và thứ 14 trên thế giới Hiện nay, xơ gan chưa có thuốcđiều trị đặc hiệu trên lâm sàng và ghép gan là chỉ định duy nhất cho bệnh nhân xơ gangiai đoạn cuối Tuy nhiên, thiếu mô ghép, chỉ phí cao, gây xâm lấn, và thải loại là cáctrở ngại của phương pháp này Do đó, nhu cầu về các liệu pháp điều trị mới cho bệnh xơgan là luôn cần thiết Dé phát triển liệu pháp ngăn ngừa, điều trị, chan đoán được hiệuquả và chính xác thì luôn cần các nghiên cứu về cơ chế bệnh ở cấp độ phân tử, tế bảo,

và mô.

Hơn một thập kỷ trở lại đây, các công bố về cơ chế bệnh lý của xơ gan đã dần chỉ rađược tế bào giữ vai trò then chốt trong tiến trình xơ hóa gan đó là tế bào hình sao gan(HSC) Khi gan bị ton thương, HSC đã trải qua hiện tượng hoạt hóa (activation) hay

chuyên dang (transformation) thành nguyên bào sợi cơ (MFB) MEB là tế bao sản xuất

các chất nền ngoại bảo (ECM), cấu trúc chính của mô xơ Trong gan khỏe mạnh, HSC

nằm ở khoảng Disse và dự trữ trên 80% lượng vitamin A của gan Khi gan tôn thương,

HSC hoạt hóa thành MFB do các phân tử tín hiệu tiết ra từ phản ứng viêm và các tế bàoton thương Gần đây, sự hoạt hóa của HSC được các nhà nghiên cứu thông nhất chia

thành hai giai đoạn là giai đoạn khởi phat (initiation — giai đoạn sớm) và giai đoạn duy

trì (perpetuation) Giai đoạn khởi phát là giai đoạn tế bào chuyên dạng từ hình sao sangnguyên bao sợi và giai đoạn duy trì là giai đoạn tế bao tôn tại ở dang MFB dé tăng sinh

và tiết ECM, gây xơ hóa gan Các tín hiệu từ vi môi trường gan tôn thương sẽ cảm ứngcác con đường nội bào của HSC, hay còn gọi là đáp ứng của tế bào trong quá trình hoạt

hóa Như vậy, các con đường tín hiệu nội bào này là cơ chê bệnh lý quan trọng cân được

làm rõ, đây là đối tượng mà nghiên cứu này quan tâm Một con đường sinh lý nội bàoquan trọng trong tế bào nhân thực mới được phát hiện là sự tự thực bào (autophagy) Vaitrò của sự tự thực bào là dọn dẹp, phân hủy vật chất tích tụ, và các bào quan bị sai hỏng

dé cung cấp nguyên liệu và năng lượng giúp tế bào tăng sinh, biệt hóa, sống sót khi điềukiện môi trường bắt lợi Trong quá trình hoạt hóa của HSC, sự tự thực bào cũng đượcmột số nghiên cứu chỉ ra là con được phân hủy giọt lipid, làm nguồn năng lượng tế bào

hoạt hóa Do đó, tác động ức chế tự thực bảo trên MEB làm tế bào giảm tăng sinh, đi vào

chu trình chết Tuy nhiên, mối liên hệ và ảnh hưởng của sự tự thực trong giai đoạn sớm

của sự chuyền dang hay hoạt hóa HSC vẫn chưa được làm rõ Trong khi giai đoạn này

là giai đoạn quan trọng ở bước khởi phát quá trình xơ hóa gan Tác động tới sự hoạt hóa

của HSC ở giai đoạn này là tiềm năng dé ngăn ngừa tiến trình xơ hóa gan Mục tiêu củanghiên cứu này là tìm hiểu vai trò của quá trình tự thực bào trong giai đoạn sớm của sựhoạt hóa HSC nhăm hướng tới đề xuất các liệu pháp can thiệp trúng đích mới cho điềutrị bệnh lý xơ hóa gan Giả thuyết của chúng tôi là sự tự thực thúc đây sự hoạt hoá HSC

ở giai đoạn sớm, dẫn tới việc chuyên dạng MFB, khởi phát cho tiến trình xơ hoá ở gan

Lý do chọn đề tài

Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sự sống, trong sinh lý và bệnh lý nói chung,

nghiên cứu ở cấp độ tế bao luôn giữ vai trò chủ chốt giúp làm rõ cơ chế bệnh Ở bệnh lý

xơ gan, HSC là một công cụ nghiên cứu cần thiết phục vụ cho việc tìm hiểu, giải thích

cơ chế bệnh Cơ sở cho việc phát triển các thuốc ngăn ngừa và điều trị, tìm ra marker

phân tử phục vụ chân đoán bệnh hiệu quả Hiện nay, nhiều thuốc đặc trị cho bệnh lý xơgan đã và đang được thử nghiệm lâm sàng Các thuốc này hầu hết đều là các phân tử tácđộng trực tiếp hoặc gián tiếp lên HSC hoạt hóa Do đó, HSC là đối tượng nghiên cứu màchúng tôi lựa chọn cho đề tài này Kết hợp với các công bố gần đây về một con đườngsinh lý nội bào quan trọng của tế bào nhân thực là sự tự thực bào Chúng tôi tiễn hành

dé tài “Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bào hình sao gan

trong môi quan hệ với sự tự thực” nhăm làm rõ thêm môi liên hệ của sự tự thực và sự

hoạt hóa HSC và thử nghiệm tác động can thiệp vảo sự tự thực bảo trong quá trình hoạt

hóa HSC in vitro va in vivo.

Câu hỏi nghiên cứu

Tác động can thiệp vao sự tự thực bao có ảnh hưởng tới giai đoạn sớm của sự hoạt hóa

HSC in vitro và in vivo hay không? Đồng thời, tác động này dẫn tới tinh trạng bệnh lýgan cấp tính thế nào?

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được mối liên hệ của sự tự thực bào lên giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC invitro và in vivo trong quá trình chuyên dạng thành nguyên bào sợi cơ dẫn tới quá trình

xơ hóa gan.

Đối tượng nghiên cứu: Chuột BALB/c Albino, trên 5 tháng tuổi, khối lượng trung bình

25 gram.

Dòng tế bào NIH/3T3: Dòng tế bào thương mại, có nguồn gốc từ nguyên bào sợi phôichuột được sử dụng làm tế bào đối chứng cho các thử nghiệm cần thiết

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 4 nội dung:

Nội dung 1: Nghiên cứu phân lập và nuôi cay HSC in vitro

Nội dung 2: Đánh gia mối liên hệ và vai trò của su tự thực bào trong sự hoạt hóa giai

đoạn sớm HSC in vitro

Nội dung 3: Tao mô hình chuột ton thương gan cấp tinh và đánh giá trạng thai hoạt hóa

ở HSC in vivo

Nội dung 4: Khao sát ảnh hưởng cua tác nhân ức chế sự tự bào thực lên chuột mô hình

và giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vivo

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Xơ gan là căn bệnh gây nhiều hậu quả nghiêm trọng cho đời sống con người Do đó,nghiên cứu làm rõ cơ chế phát sinh bệnh để phát triển liệu pháp mới cho điều trị là rấtcần thiết Nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng tế bào hình sao, một tế bào giữ vai

trò chính trong bệnh lý xơ gan nói riêng và gan nói chung Một con đường nội bào mới

được phát hiện gần đây điều khiển quá sinh lý, bệnh lý của tế bào và cơ thê đó là sự tựthực bào Vai trò quan trọng vả tiềm năng ứng dụng to lớn của sự tự thực đã được khẳngđịnh bằng giải Nobel về sinh lý học năm 2016 Chủ đề nghiên cứu về mối liên hệ giữa

cơ chế tự thực và sự hoạt hóa HSC dẫn đến bệnh lí xơ gan sẽ là hướng tiếp cận mới có ýnghĩa khoa học và thực tiễn trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh xơ gan

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Bénh ly xo gan va té bao hinh sao

2.1.1 Gan và bệnh ly xơ gan

Cấu trúc giải phẫu

Ở động vật có vú, gan là một nội quan lớn nhất trong cơ thé, có màu đỏ sam, năm ở góc

phần tư trên bên phải của ô bụng Gan được chia thành nhiều thùy (lobe), ở người là 2

thùy, ở động vat gam nhắm là 5 thùy Đi kèm với gan là túi mật (gall bladder), nơi chứadịch mật do tế bào gan (hepatocyte) sản xuất để tiết vào ruột non qua ống mật chủ(common bile duct - CBD) Ngoài động mạch gan (hepatic artery — HA) dẫn máu vào nuôi gan, tĩnh mạch chủ dưới (inferior vein cava — IVC) dẫn máu từ các nội quan và gan

về tim, thì gan còn có hệ tĩnh mạch cửa (portal vein -PV) dẫn máu từ màng ruột vào [1](hình 2.1) Chi tiết hơn cấu trúc của gan là hình ảnh giải phẫu vi thé mô gan, ở cấp độ tếbào trong cấu trúc mô gan giữa các loài động vật có vú là tương tự nhau Cụ thể, hình2.1 cho thấy mô gan được cau tạo bởi các đơn vi cấu trúc và chức năng, gọi là tiêu thùygan (lobule) Tiểu thùy gan có hình lục giác (hexagonal), chứa các tế bào nhu mô(parenchymal - PC) gan được bao quanh bởi các vách (septa) là mô liên kết Các đỉnh

của hình lục giác là bộ ba cửa (portal triad), tâm của nó là tinh mạch trung tâm (central

vein - CV) Bộ ba cửa gồm có các mạch nhánh của HA, PV và BD

Trong gan, tế bào được chia thành 2 nhóm gồm tế bào nhu mô và tế bào không nhu mô(NPC - nonparenchymal) (hình 2.1) [2] PC hay còn gọi là tế bao gan chiếm khoảng 50%

về số lượng và 80% về khối lượng/thể tích của gan Tế bào gan thực hiện tat cả các chức

năng của gan như sinh tổng hop protein, bién dưỡng, san xuất acid mật, dữ trữ các chất

NPC gồm các loại tế bào khác của gan ngoại trừ PC gồm có: HSC dự trữ Vitamin A(VitA), tế bào nội mạch xoang gan (liver sinusoidal endothelial cell - LSEC) cau tracthành mạch xoang gan, tế bao kuffer (KC) thực bao ở gan, tế bào biểu mô ống mật (bileendothelial cell - BEC) cau trúc BD, nguyên bào sợi cơ (myofibroblast MFB) cấu trúc

các mach mau trong gan

Tiểu thùy gan

Portal vein (Tĩnh mạch

cửa]

Hepatocyte (tế bào gan)

Sinusoid (Xoang gan}

Central vein (Tĩnh

mach trung tam) Hepatic artery (Động mach trung tam)

Bile canaliculus (Kênh

Hình 2.1: Hình mô phỏng cấu trúc tiểu thùy gan ở người và sự sắp xếp các loại tế bào

trong tiểu thầy gan Gan được tạo nên bởi các đơn vị cau trúc và chức năng là tiểu thùy

(lobule) Tiểu thùy gan gồm: các cấu trúc mạch, bộ ba cửa (PV - tĩnh mạch cửa, HA —

động mạch cửa, BD - ống mật), CV — tinh mạch trung tâm, S — xoang gan; các loại tếbào, tế bào gan, LSEC — tế bào nội mạch xoang gan, HSC — tế bào hình sao, BEC - tế

bào nội mô ống mật, Kuffer — đại thực bào gan [2]

Hoạt đông chức năng

Chức năng của gan là do các tê bao gan hay nhu mô gan thực hiện Gan đóng vai trò

trung tâm trong biến dưỡng các chất của cơ thể Gan là nơi oxi hóa vật chất và tạo năng

lượng, dự trữ và điều hòa nồng độ đường, biến dưỡng các chat lipid của cơ thé như oxihóa, tạo thể keton, cholesterol, lipoprotein, biến đưỡng các amino acid đi kèm với chuyênhóa hợp chất nitơ, biến dưỡng acid mật, biến dưỡng các chat di sinh Gan là cơ quan

sinh tổng hợp và tiết, gan là nơi sản xuất albumin, tổng hợp và dự trữ các chất đường,

tổng hợp các protein huyết tương như protein đông máu, lipoprotein, một số hormonehay phân tử tín hiệu, tiết acid mật [3]

Bệnh lý gan và xơ gan ; ;

Tôn thương gan thường được chia thành 2 dạng dựa vào thời gian tôn thương: tôn thương

gan cấp tinh (acute liver injury) và ton thương mạn tinh (chronic liver injury) Tổnthuong gan cap tính là các tổn thương diễn ra trong thời gian ngắn khi gan chịu tác độngcủa các yếu tô tôn thương, nó thường đi kèm với viêm gan, chết tế bào gan Tôn thươngmạn tính là quá trình tổn thương gan kéo dài, đó là sự viêm (inflammation) mạn tính,chết tế bào (necrosis/apoptosis), nhiễm mỡ (fatty) và xơ gan (cirrhosis) Gan là một cơ

quan thường chịu nhiều yếu tố gây tổn thương Các nguyên nhân gây ton thương gan

như viêm gan do nhiễm virus, bệnh tự miễn, ứ mật, chất côn, di truyén và hóa chất gây

độc cho gan Các tác nhân này thường làm gan bị hoại tử, viêm, nhiễm mỡ, xơ hóa và

thay đôi hệ mạch trong gan [4] Bệnh lý gan ở người có thể được chia theo nguyên nhân

gây bệnh hoặc kiểu hình bệnh Một nguyên nhân có thé gây nhiều kiểu hình bệnh khácnhau và ngược lại, một dạng tồn thương gan có thé do nhiều nguyên nhân gây nên Do

đó, việc nghiên cứu các bệnh lý gan sử dụng các mô hình tế bào, động vật có thể theonguyên nhân gây hoặc theo kiểu hình bệnh lý

Xo gan (liver cirrhosis) được định nghĩa là sự xuất hiện của các mô sẹo (scar) thay thé

nhu mô gan [5] Bản chất của mô sẹo chính là sự lắng đọng (deposite) của chất nền ngoại

bào (extracellular matrix — ECM) trong quá trình mô gan bị tổn thương hay còn gọi là

sự xơ hóa gan (fibrosis) Sự tạo mô sẹo tai vị tri tôn thương này chính là quá trình lànhvết thương (would healing) của cơ thé Tuy nhiên, tổn thương kéo dài làm ECM tích tụmột lượng lớn trong mô gan dẫn tới suy gan, ung thư gan và tử vong Ở hầu hết cáctrường hợp, bệnh gan mạn tính do các nguyên nhân khác nhau đều có kết quả chung là

xơ gan (hình 2.2) Xo gan là căn bệnh phổ biến do có nhiều nguyên nhân khác nhau

Trong đó, có ba nguyên nhân chính dẫn tới xơ gan là do virus viêm gan B (HBV), virus

viêm gan C (HCV) và sử dụng chất cồn [6] Năm 2015, ước tính số lượng người nhiễmHCV toàn cầu là khoảng 1% dân số (tương đương với khoảng 70 triệu người) [7] Sốngười mang virus HBV mạn tính là khoảng 257 triệu (global hepatitis report, 2017) Chấtcồn là nguyên nhân phô biến nhất gây các bệnh về gan do có tới một nửa dân số có sửdụng chat cồn [8] Trung bình mỗi năm có khoảng 1 triệu 300 nghìn người chết do xơ

gan và số lượng tử vong do ung thư gan là 810 nghìn người [9, 10] Ngoài ra, các bệnh

lý gan khác còn có bệnh tự miễn, các chất độc gan (gồm cả thuốc), di truyền và tổnthương hệ mạch trong gan Ở Việt Nam, tỉ lệ lưu hành HBV mạn tính khoảng 12%, HCVmạn tính là 2% va là nơi có tỉ lệ người nam sử dụng rượu bia phô biến [10]

Tiến trình bệnh gan mạn tính

Nhiễm virus (HBV, HCV), chất cần Alcohol, gan nhiễm mữ không do rượu, bệnh ứ mật, bệnh tự miễn, di truyền

Gan khỏe Gan viêm, Xơ hóa gan Xơ gan Ung thư gan

mạnh nhiem mở ' Giai đoạn cudi

rrr ————> 5-10 —————* 10-15—————> 15-20 —————* 20-40g YF

Hình 2.2: Tiến trình của các bệnh gan man tính theo nam Gan khỏe mạnh chịu các tacnhân tôn thương lâu dài theo thời gian dẫn tới viêm gan nhiễm mỡ, xơ hóa gan, xơ gan

và cuối cùng là ung thư gan hoặc suy gan Hình ảnh được vẽ bằng công cụ biorender

Mô hình động vật trong nghiên cứu bênh lý

Mô hình động vật trong nghiên cứu y sinh học là một công cụ hữu hiệu và cần thiết để

phục vụ cho các nghiên cứu về sinh lý hay bệnh lý Động vật cũng được sử dụng như là

nhà máy sản xuất sinh phẩm, công cụ phát triển và thử nghiệm các liệu pháp điều trị

trước khi có thể áp dụng trên người Một trong các loài động vật được sử dụng nhiều

nhất trong nghiên cứu là chuột nhờ các ưu điểm vượt trội Mỗi năm có hơn 2 tỷ con chuộtđược sử dụng phục vụ cho các nghiên cứu y sinh Nhằm mục tiêu nghiên cứu về bệnh lýgan cũng như xơ gan, các liệu pháp điều trị và hiểu biết chuyên sâu về cơ chế sinh bệnhtrước khi có thé áp dụng trên người Mô hình chuột bệnh lý gan là việc sử dụng chuột dé

gây tôn thương gan bằng các phương pháp như biến đổi gen, hóa chất độc gan, hay cácvirus viêm gan HBV, HCV Trong đó, phương pháp gây mô hình tổn thương gan banghóa chất CCl¿ (carbon tetracloride) và phẫu thuật thắt ống dan mật (bile duct ligation —BDL) là hai phương pháp phô biến và hiệu quả.

Mô hình chuột ton thương gan do CCls

CCl, là một trong những chất độc hướng gan được sử dụng rộng rãi dé cảm ứng sự tôn

thương gan ở chuột thí nghiệm CCl¿ gây độc cho tế bao gan bằng cách thay đổi tính

thấm của màng tế bao, màng lysosome va màng ty thé CCl khi được hap thụ vào tế bao

sẽ được chuyền hóa bởi Cytochrom P-450 2E1, một loại enzyme được tim thấy nhiều ở

tế bào gan, thành trichloromethyl (CCH:) CCl" là một sốc tự do hoạt động mạnh, nógây ra peroxid hóa lipid trên mang ti thé hoặc lysosome làm tổn thương mang Sự tổnthương màng dẫn tới giải phóng các thành phần nội bào, vỡ bào quan và chết tế bảo [1 1-14] Sử dụng CCl, lặp lại theo thời gian sẽ dẫn tới xơ gan và ung thư gan, trên thực

nghiệm là khoảng 8-12 tuần [15, 16] Trong giai đoạn tôn thương gan cấp tinh do CCla

gây ra sự hoại tử vùng trung tâm của tiêu thùy gan, viêm và xơ hóa nhẹ Sự tổn thươngnay có thé được sửa chữa và phục hồi nhờ vào khả năng tái tạo của gan trong 72 giờ.BALB/c là chủng chuột có độ nhạy cao với CCly với mức độ tôn thương nặng và tỉ lệ tử

vong cao [17].

Có nhiều phương pháp dé đưa CCl, vào cơ thể chuột như tiêm 6 bụng, tiêm dưới da, đưavào đường thực quản, đưa vào buông khí cho động vật hít Nhìn chung, các phương phápnày đều cho hiệu quả tao mô hình như nhau nên tùy thuộc vào điều kiện dé áp dụng phùhợp Cần lưu ý răng, tac động xâm lan của các phương pháp có thé gây tôn thương và tửvong lên chuột, đặc biệt là phương pháp cho uống trực tiếp vào dạ dày sẽ yêu cầu thaotác kỹ thuật tốt dé giảm thiêu tỷ lệ tử vong [18] CC1¿ được biết là một tác nhân hiệu quanhất trong việc tạo mô hình tốn thương gan cấp và xơ gan [19] Sau khi ngừng sử dụngCCl 4 tuần, gan sẽ trai qua quá trình tự phân giải mô xơ với việc tái tạo lại cau trúc mô

Mô hình chuột ton thương gan do BDL

Phương pháp sử dụng chất độc hướng gan dé gây tổn thương theo kiêu hình bệnh nhưhoại tử, viêm và xơ hóa gan Phương pháp BDL nhằm mục đích mô phỏng nguyên nhân

gây bệnh hẹp được mật ở người Hẹp đường mật dẫn tới việc dịch mật bị ứ đọng, hạn

chế việc tiết acid mật xuống hệ tiêu hóa Sự ứ đọng dịch mật trong gan làm cho gan sưng,viêm và tốn thương tế bao, hệ ống mật Ngoài tác động tôn thương gan, BDL còn ảnh

hưởng tới sự hoạt động của hệ tiêu hóa Cu thé, thiếu dịch mật khiến cho việc tiêu hóa

và hấp thụ lipid bị gián đoạn Sự thiếu vắng của acid mật trong đường ruột dẫn tới thayđổi của hệ vi sinh vật, gây bùng phát các vi sinh vật có hại Các chất tiết hoặc sự xâmnhiễm từ vi sinh vật đường ruột này làm cơ thể động vật viêm, nhiễm trùng [20]

Đặc trưng của ton thương do BDL là tình trạng vàng da, chi, đuôi hoặc chat thải của

động vật Sắc tổ gây nên màu vàng trong bệnh ứ mật là bilirubin, thành phần chính của

dịch mật, tang mạnh trong huyết tương ở đối tượng bị bệnh Về hình ảnh tổn thương trên

gan có thé dé dàng nhận thấy sự sưng và vàng của gan, cũng như túi mật Trên cấu trúc

mô bệnh học, mô gan tổn thương do ứ mật thường xuất hiện các vùng hoại tử (necroticarea) là các vùng tế bào gan chết, viêm và xơ khu vực cửa, và phản ứng ống mật (ductualreaction - DR) hay sự tăng sinh của các ống mật mới Về cơ chế bệnh lý, sự tôn thương

tế bào gan do dịch mật chưa được chứng minh rõ ở cấp độ phân tử và tế bào Tuy nhiên,

sự tích tụ (aggregate) của acid mật là nguyên nhân khiến các phân tử và bào quan trong

tế bào gan bị cản trở hoạt động, dẫn tới tôn thương [21]

2.1.2 Tế bào hình sao gan: tên gọi và lịch sử nghiên cứu

Lich sử phát hiện và tên gọi

Tom lược lịch sử các phát hiện đầu tiên về HSC được thé hiện trong bảng 2.1 Bang kỹthuật nhuộm vàng chloride (AuCI3), lần đầu tiên Kuffer mô tả các tế bào có dang sao(star cell) trong gan vào năm 1876 Tuy nhiên, ông vẫn chưa phân biệt được tế bào này

và đại thực bao ở gan (KC) Gần một thé ky sau đó các nhà nghiên cứu khác cũng quansát tế bào này băng nhiều phương pháp khác nhau như: Zimmerman nhuộm thể Golgi

10

bạc và gọi là tế bào xung quanh mạch trong gan (hepatic pericyte), Ito nhuộm chất béonên gọi là tế bào dự trữ chất béo (Fat storing cell), Suzuki nhuộm tâm bạc để mô tả tế

bào kẽ (interstitial cell) Sau đó, các nghiên cứu khác của Bronfenmajer, Schaffner,

Popper đều chỉ ra răng tế bào có dạng sao này có chức năng là dự trữ VitA và đặt tên là

lipocyte Cuối cùng, Nakame và Wake đã xác thực được đây là một loại tế bào ở gan vớitính chất chuyên biệt là hap thụ và dự trữ VitA dé khang định Kuffer là người đầu tiên

phát hiện ra HSC Tới năm 1996, các nhà nghiên cứu chính thức công nhận tên chung

của tế bào này là HSC [22, 23]

Bảng 2.1: Lịch sử phát hiện HSC

Năm, tác giả Tên gọi Phương pháp

1876, Kupffer Đại thực bào gan (Kuffer) Gold chloride: VitA

1882, Rothe Tế bao hình sao (“sternzellen”/“star | Gold chloride

cells”)

1950: Tế bào quanh mach ở gan (pericytes) Golgi silver: fat

Zimmerman, Ito, | Tê bao dự trữ chat béo (fat-storing cells) | Fat staining

Suzuki Tê bào kẽ (interstitial cells) Silver impregnation

1966, Té bao chat béo (lipocytes) VitA uptake

Bronfenmajer

1963, Nakane

1971, Wake

1988, Wake Té bao quanh xoang gan (perisinusoidal) | Gold chloride

1996: Té bao hinh sao gan - Hepatic stellate cell/HSC Hepatology, Baltimore

Sư gia tang các công bo liên quan tới HSC

HSC ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Gan

học (Hepatology) Hình 2.3 cho thấy tổng số lượng công bố có liên quan về HSC tăng

mạnh theo các năm Trên cơ sở dữ liệu y sinh của Hoa Kỳ (Pubmed), thuật ngữ “hepatic

stellate cell” được tìm kiếm cho kết quả hơn 8000 công bố và những năm gan đây luôn

có khoảng 700 công bô môi năm liên quan.

11

Hình 2.3: Biểu đô thể hiện số lượng công bố liên quan tới HSC theo năm Số liệu từ kết

qua tìm kiếm trên Pubmed (thuật ngữ “hepatic stellate cell” tháng 4/2023)2.1.3 Tế bào hình sao gan: hình thái và cấu trúc

Hình thái cấu trúc HSC in vivo

Hình ảnh thực về cấu trúc HSC trong mô gan cho thấy đây là tế bào có cau trúc rất phức

tạp với hệ thống nhánh tế bao chang chit Bằng phương pháp nhuộm Golgi-kopsch vớibạc chrome và quan sát hiển vi HSC trong mô có thân tế bào dạng trục chính (spindle

shape) tròn hoặc góc cạnh với nhiều nhánh kéo dài từ tế bào chất (cytoplasmic process)

(hình 2.4 A) Nhánh tế bào chất HSC được phân thành 2 loại: nhánh phụ nội mach(subendothelial process) và nhánh xen kẽ xoang gan (intersinusoidal) Nhánh tế bào chất(cell process) hình thành từ sự kéo dài của tế bào chất và đi dọc theo bề mặt của các tếbào nội mạch xoang (endothelia sinusoidal), phân ra nhiều nhánh nhỏ thứ cấp bao xungquanh xoang gan Những nhánh tế bào chất thứ cấp có kiểu hình đặc trưng này được gọi

là vi gai (spine), nó tương tác với các tế bào nội mô ở mặt bên Loại nhánh tế bào còn lạiđược hình thành từ thân tế bào hay từ phần gốc của tế bào, đọc xuyên theo khoảng không

giữa các tế bào gan tới 2-3 xoang gan liền kề Bề mặt của các nhánh tế bào này trơn và

không có gai Một HSC có thể có 2 hoặc nhiều nhánh xen kẽ xoang mạch và được buộc

thành bó [24] Gần đây, nhờ sự ra đời của kính hiển vi đồng tiêu (confocal) Cấu trúc

không gian ba chiều của HSC trong mô gan được ghi nhận và thê hiện ở hình 2.4 B với

12

marker phân tử là desmin Có thể thấy HSC nằm bao quanh xoang gan, dọc theo các

LSEC với các nhánh kéo dài theo xoang gan.

Hình 2.5: Hình ảnh cấu trúc 3 chiều HSC trong mô gan A: HSC có cấu trúc nhánh tế

bào phức tạp, gồm các nhánh phụ nội mạch (subendothelial) có nhiều gai (đầu mũi tên)

và nhánh xen kẽ xoang gan (intersinusoidal) tạo ra từ phần kéo dai của nhánh tế bào

(mũi tên) [24] B: Hình ảnh kính hién vi đồng tiêu mô gan được tây rửa dé làm trongsuốt, sau đó nhuộm với kháng thé desmin (HSC) và CD31 (LSEC) thé hiện cấu trúc 3

chiều của HSC bao quanh xoang gan [25].

Siêu cấu trúc HSC dưới kính hiển vi điện tử [24]

Dưới kính hién vi điện tử quét (SEM — Scanning electron microscope): các nhánh phụ

nội mạch của HSC có các gai (throny) năm ở mặt khuất của tế bào nội mạch (abluminal

surface endothelial) được quan sát thông qua vách nội mạc (wall endothelium) từ mặt

ngoài (luminal surface) cua tế bào nội mạch

Phương pháp maceration: các gai kéo dai ở cạnh bên trên nhánh phụ nội mạch

(subendothelial process) xuyên qua khoảng disse từ mặt sau của tế bào nội mạch tới

tương tác với màng tế bào chất của tế bào gan (hình 2.5) Phần màng tế bào của nhánh

phụ nội mạc gắn với tế bào nội mạch này có dang tron, trong khi phần màng ngoài đối

diện có các vi lông ngắn (short microvillous).

13

Hình 2.5: Siêu cầu trúc gai của HSC trong xoang gan BC — kênh dan mật, SEP — gai

tiếp xúc tế bào nội mach xoang gan, H - tế bao gan [24]

Hình thái cau trúc khi nuôi cây in vitro

- VA fi} % ica Hình 2.6: Kiểu hình HSC trong nuôi cấy in vitro Sự thay đôi kiêu hình của HSC trong

phôi (A) ngày 1, 1 tuần (B), 3 tuần (C) và 5 tuần (D) và trong nuôi cay (E) HSC vừabám dính, (F) sau 160 phút nuôi cấy, (G-H) sau 24 giờ nuôi cấy [24], (1) sau 3 ngày,

(K) sau 7 ngày và (L) sau 2 tuần

14

Khi HSC được phân lập ra khỏi mô gan và nuôi cay trên bề mặt đĩa nuôi cay có dang 2D

thi HSC sẽ tự hoạt hóa (autoactivation) Sự tự hoạt hóa này là sự chuyển dạng của HSC

do điều kiện nuôi cấy khác biệt so với trong mô gan như độ cứng của vật liệu, môi trườngnuôi cấy và rất nhiều tác nhân khác HSC khi nuôi cấy mất dần các nhánh tế bào và gaitrên màng trong 1-2 ngày nuôi và chuyên hoàn toàn sang dạng MFB (hình 2.6) khi nuôi

cay in vitro sau 7 ngay.

2.1.4 Té bao hinh sao gan: marker phan tir

Một số đặc tinh chủ chốt của HSC: vi tri nằm ở khoảng Disse trong tiêu thay gan, códạng hình sao với thân và nhiều nhánh tế bào chất, chức năng dự trữ VitA trong các giọtlipid Trong mô gan, quan thé HSC không đồng nhất hoàn toàn về hình thái và markerphân tử Do đó, việc sử dung marker phân tử định danh có vai trò bố sung thêm vào cácđặc tính của quan thé HSC Trong gan khoẻ mạnh, HSC phân bố ở các vị trí khác nhautrong tiểu thùy gan có sự khác biệt về mặt hình thái và biểu hiện phân tử Dé so sánh sự

khác nhau về mặt hình thái của HSC ở các vùng trong tiêu thay, một tiêu thùy gan được

chia thành 10 vùng từ trung tâm trở ra khu vực cửa HSC ở vùng trung tâm có nhiềunhánh hon HSC ở vùng cửa, HSC ở vùng cửa biểu hiện desmin mạnh hơn HSC vùng

trung tâm tiêu thùy HSC vùng 2-4 dự trữ nhiều VitA hơn các vùng khác [26].

Desmin, protein sợi trung gian (microfilament) của bộ xương tế bào là một marker đặctrưng của HSC được phát hiện sớm nhất từ 1984 [27] Desmin là marker cho định danhHSC trên gan người [28] và gam nhắm [27] Từ đó cho tới nay, desmin được sử dụngnhư là tiêu chuẩn vàng (gold standard) đề định danh HSC Mặc dù vẫn còn nhiều tranhcãi vì HSC thay đổi biểu hiện desmin trong tinh trạng bệnh lý và phụ thuộc vi trí củaHSC trong tiêu thùy [29, 30] Một số phân tử khác cũng được công bồ là marker chuyên

biệt cho HSC như GFAP (glial fibrillary acidic protein), N-CAM (neural cell adhesion

molecule) [31], Vimentin [28].

Marker HSC hoạt hóa: trong nghiên cứu theo dõi sự biểu hiện của sợi actin tế bào cơtrơn (a-SMA — smooth muscle actin) trong gan, o-SMA thường biéu hién trén thanh

15

mạch của HA và PA của tiêu thùy gan trong mô khỏe mạnh Tuy nhiên, ở chuột đượctiêm 1 liều CCl¿, a-SMA biểu hiện ở các tế bao có dạng hình sao trong khu vực giữa vàtrung tâm tiêu thùy Nhuộm đồng thời ø-SMA và desmin, các nhà nghiên cứu đã ghinhận tế bào dương tính với cả hai phân tử này (hình 2.7) Vì vậy, các tác giả kết luậnrằng HSC là tế bao đã thay đổi kiểu hình trong gan tổn thương Sự thay đổi kiểu hìnhnày gọi là sự hoạt hóa (activate) hay chuyên dang (transformation) Từ đó, a-SMA được

xem là marker vàng của HSC hoạt hóa (aHSC) hay MFB [32].

Hình 2.7: Gan chuột được nhuộm với các marker khác nhau đê xác định vị tri của các

loại tế bào trong gan CCR2 — marker phân tử của monocyte và đại thực bào, CLECF4

16

— marker phân tử của tế bào Kuffer, CD31 — marker phân tử của tế bao nội mô, Desmin

— marker của tế bào hình sao gan [33] Ảnh chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu

2.1.5 Tế bào hình sao gan: chức năng sinh lý

Các phát hiện đầu tiên về HSC từ những năm 1970 dựa trên đặc tính điển hình của tế

bào này là dự trữ các giọt lipid (Iipid droplet - LD) nội bảo Nhờ vậy, các nhà nghiên cứu

đã suy đoán và chứng minh thực nghiệm vai trò của LD là nơi chứa VitA Sự thay đổichế độ ăn bổ sung hoặc thiếu VitA làm tăng/giảm số lượng cũng như kích thước LDtrong HSC [23] Các nghiên cứu tiếp theo về biến dưỡng, định lượng, đánh dấu theo dõi

sự hấp thu, chuyển hóa và dự trữ VitA cũng như các con đường phân tử liên quan sự dự

trữ VitA ngày càng làm rõ hơn vai trò của HSC là dự trữ khoảng 80% lượng VitA trong

gan [34] Ngoài ra, HSC biểu hiện thụ thể megalin/gp330 cho protein gc-globulin(protein liên kết với vitamin D) và hấp thụ protein này cho thấy HSC còn liên quan tới

sự biến dưỡng VitD của cơ thé [35]

Vai trò thứ hai của HSC trong gan là điều hòa cân bằng nội môi thể hiện qua sự tươngtác giữa HSC với các tế bào bên cạnh (neighboring cell) và các protein/phân tử tín hiệu

mà nó tiết ra Trong mô gan, HSC là tế bào có cấu trúc phức tạp với nhiều nhánh tế bào

kéo dai, một tế bao HSC tương tác/tiếp xúc/liên kết với khoảng 40 tế bào gan và hang

chục tế bào nội mô xoang gan Một số nghiên cứu còn chỉ ra sự tương tác giữa HSC với

tế bào Kuffer Hơn thế nữa, HSC cũng tương tác với các tế bào miễn dich trong điềukiện viêm Các chất mà HSC tiết ra ảnh hưởng tới vi môi trường và hoạt động sinh lýcủa các tế bào khác được biết như pleiotrophin cảm ứng phân chia tế bào gan [36] Cuốicùng, HSC cũng là tế bảo tiếp nhận tín hiệu thần kinh khi đáp ứng với chất trung giandẫn truyền thần kinh a-adrenergic [37]

Trong điều kiện gan tốn thương, HSC điều hòa trạng thái tuần hoàn của xoang mạch như

gây co rút làm xoang gan thu hẹp kích thước, giảm lưu lượng máu vào nhu mô gan, tăng

áp tĩnh mạch cửa [38], sản xuất yếu tố tạo mạch hình thành các mạch mới trong gan [39].HSC còn là tế bào quan trọng liên quan tới sự tương tác và đáp ứng của các tế bào miễn

17

dịch Cụ thể, dưới tác động của các phân tử tín hiệu viêm/tiền viêm như lymphotoxin-B,tác động lên thụ thé trên HSC làm tế bao tiết các phân tử hướng hoa động (chemostaxis)góp phần kêu gọi tế bào miễn dịch vào mô gan và HSC còn tương tác trực tiếp với các

tế bào miễn dịch qua phân tử liên kết trung gian tế bào loại 1 (intercellular adhesion

molecule 1 — ICAMI) [40] Một số nghiên cứu khác cho thấy, ảnh hưởng của HSC lên

đáp ứng viêm ở gan thông qua sản xuất protein bé thé C4 [41], tiết MCP-1 thu hút các

tế bào đơn nhân [42], biểu hiện CX3CLI liên kết với CX3CRI trên Kuffer [43]

Cuối cùng, HSC là tế bào giữ vai trò trung tâm trong sự phát triển của bệnh lý xơ gan.HSC chuyên dạng thành MFB sẽ biểu hiện mạnh ECM như collagen | tạo mô sẹo trongquá trình xơ hóa gan [44] và tái cau trúc chất nền ngoại bào trong gan nhờ sự biểu hiệnenzyme phân hủy chất nền ngoài bào như MMP2 (matrix mellatoprotease) [45]

2.1.6 Sự hoạt hóa và chuyển dạng HSC thành MEB

Quá trình hoạt hóa HSC

Quá trình chuyên dạng hay hoạt hóa của HSC từ trạng thái “quiescence - im lặng” sang

“hoạt hóa — activation” gần đây được các nhà nghiên cứu chia thành 2 giai đoạn (hình

2.8) [46, 47]:

- Giai đoạn sớm: khởi dau (Initiation) sự chuyên dang hình sao sang dạng MEB.

Quá trình xảy ra trên mô hình nuôi cấy HSC trong vòng 7 ngày, hay còn gọi là hiệntượng tự hoạt hóa (autoactivation) Trên in vivo, quá trình này xảy ra trong giai đoạn đầuhay còn gọi là giai đoạn cấp tính khi gan tổn thương

- Giai đoạn sau: duy tri (Perpetuation) duy trì kiểu hình MFB với các đặc tinh tăngsinh mạnh, co rút, tiết ECM, đi cư và hướng hóa động, tiết các phân tử tiền viêm Giaiđoạn này diễn ra đi kèm với tác động lâu dài của các yếu tố trong nuôi cấy hoặc gan tônthương man tính Đặc tính tăng sinh và phân chia mạnh làm cho số lượng MEB gia tăng,

càng thúc day xơ hóa gan.

Trước đây, các nghiên cứu trên HSC chủ yếu tập trung trên các dòng tế bào bắt tử, hoạthóa hoặc các mô hình bệnh xơ gan hay đồng nghĩa với dạng MFB của HSC Tuy nhiên,

18

gần đây một số nhà nghiên cứu cho thấy được tầm quan trọng của giai đoạn sớm trongtiến trình HSC hoạt hóa Đồng thời, việc ức chế hoạt hóa HSC trong giai đoạn khởi phátđược đánh giá là cho hiệu quả ngăn ngừa sự phát triển của xơ gan tương đương với việctác động vào giai đoạn duy trì của sự hoạt hóa HSC Do đó, nghiên cứu về giai đoạn đầucủa sự hoạt hóa HSC đang dần được quan tâm và tập trung hơn Đây củng là giai đoạn

hoạt hóa mà luận án này chọn đề nghiên cứu.

Khởi đầu /nitiation Duy tri Perpetuation

Hình 2.8: Tiến trình hoạt hóa HSC theo 2 giai đoạn [48]

Hai trang thái của HSC

Bang 2.2 so sánh các đặc tính giữa hai trạng thái của HSC Sự thay đổi biểu hiện cácphân tử khi HSC hoạt hóa được nghiên cứu nhiều nhằm mục đích làm rõ cơ chế phân tử

và tìm marker cho chan đoán bệnh Có rất nhiều phân tử thay đôi biểu hiện ở aHSC với

aHSC như: nhân tố IGF-I (Insulin-like growth factors) giảm biểu hiện mạnh ở aHSC

19

[49]; protein bổ thé C4 tăng theo thời gian HSC nuôi cấy [41]; ICAM-1 không biểu hiện

ở qHSC nhưng biểu hiện mạnh ở aHSC [50] Các phân tử aHSC tiết gồm: TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1) [51], renin, angiotensin va enzyme chuyên hoáangiotensin [52], SPARC (Acidic and rich in cysteine) [53] Cac protein liên quan cautrúc và chức năng tế bao thay đổi biểu hiện ở aHSC như tăng phân tử bám dính integrin

av, B3 [54] Một phân tích day đủ so sánh các phân tử thay đổi biểu hiện ở dòng HSC

bat tử như LX-2 cho thấy tế bào này biểu hiện a-SMA, GFAP, Nestin, CD271 và các

marker của dòng trung mô như CD105, CD44, CD29, CD13, CD90, HLA class-I, CD73,

CD49e, CD166 va CD146 Âm tinh các marker CD31, CD133, CD45, CD34 [55]

Bang 2.2: Tong hợp và so sánh đặc tính 2 trang thai HSC

Đặc tính HSC im lặng HSC hoạt hóa Phương pháp đánh giá

Hình thái | Hình sao Nguyên bao sợi | Quan sát dưới kính hiên vi

cơ

Giọt lipid |Chứa nhiều giọt | Không chứa giọt | Quan sát dưới kính hiển vi phản

lipid lipid pha và nhuộm ORO.

Vitamin | Trong giọt lipid Không dự trữ Chụp hình huỳnh quang tự phát xạ

A của vitamin A

a-SMA Không biểu hiện Biéu hiện mạnh | Gene hoặc protein

Tang sinh | Không tăng sinh Tăng sinh mạnh | Đo tăng sinh bang kit CCk8,

nhuộm marker Ki67

Collagen | Không hoặc biéu | Biéu hiện mạnh | PCR hoặc nhuộm kháng thê

hiện thấpCác TLR Thấp Biểu hiện mạnh | PCR hoặc nhuộm kháng thê

VỊ trí | Khoảng disse Di cư vào mô gan | Nhuộm hóa mô miễn dịch xác định

trong mô VỊ trí trong gan

20