Luận án tiến sĩ Sinh học: Tạo và đánh giá hoạt tính vắc xin bất hoạt phòng ngừa bệnh tay chân miệng do EV71 trên mô hình động vật thử nghiệm in vivo

DANH MUC CAC TU VIET TAT: Acid amin Axit amin : Ammonium Persulfate Tên muối : Base pair Cặp bazo : cell culture infectious dose 50% Liều gây nhiễm 50% tế bào: Cytopathic Effect Biến đổi

_ ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYEN THỊ YEN NHI

LUẬN AN TIEN SĨ SINH HOC

Thành Phố Hồ Chí Minh — Năm 2023

_ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM l

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYEN THỊ YEN NHI

TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH VẮC XIN BÁT HOẠT

PHÒNG NGỪA BỆNH TAY CHAN MIỆNG DO EV71

TREN MÔ HÌNH DONG VAT THU NGHIỆM INVIVO

Nganh: Vi sinh vat hoc

Mã số ngành: 62420107

Phản biện 1: PGS TS Trần Cát ĐôngPhản biện 2: PSG.TS BS Hồ Đặng Trung Nghĩa

Phản biện 3: TS Trần Tan Thanh

Phản biện độc lap 1: PGS TS BS Phạm Quang Thái

Phản biện độc lập 2: TS Trần Tan Thanh

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC: PSG TS Cao Thị Bảo Vân

Thành Phó Hồ Chí Minh — Năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Vi sinh vật học, với đề tài “Tạo và đánhgiá hoạt tính của vac xin bất hoạt phòng ngừa bệnh tay chân miệng do EV71 trên

mô hình động vật thử nghiệm in vivo” là công trình khoa hoc do Tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của PGS TS Cao Thị Bảo Vân

Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và

không trùng lap với các công trình đã công bô trong và ngoai nước.

Nghiên cứu sinh

(Ký tên, ghi họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Em xin gời lời cảm ơn tới PGS.TS Cao Thị Bảo Vân với tất cả lòng kính

trọng và biết ơn sâu sắc đến CÔ đã tận tâm hướng dẫn, đào tạo cho em trong suốt

thời gian công tác tại Viện Pasteur TP HCM cũng như thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới: Tập thể cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật

viên phòng Sinh học Phân tử, Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur TP HCM đã

hỗ trợ và đồng hành cùng tôi trong nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn PGS TS Phan Thị Phượng Trang (giảng viên

Bộ môn Vi sinh), PGS TS Đặng Thị Phương Thảo, cô Trần Thị Phượng Giang(phòng Đào tạo Sau Đại học), Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP HCM

đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá học

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình thân thương của tôi, nhữngngười luôn bên cạnh yêu thương, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian tôi thựchiện nghiên cứu cũng như trong tat cả hành trình mà tôi di qua

Xin trân trọng cảm on!

ii

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC TỪ VIET TÁẮTT 2-2 ©<©2#£Es#£Ess£Ess£Essezssezssesssezssre vii

DANH MỤC CAC BANG TRONG LUẬN AN -° se ©cse©eseesseessevssecssee x DANH MỤC CAC HINH TRONG LUẬN ÁN -s«-cs<©vssecvseervssersssrrssee xi

1.2.3.4 Giải phóng vi rút khỏi tế bào 2-22 5222x+2Ex2EErerxrerxrrrxrrrrree 11

1.2.4 Nhóm gene EV71 (ðenOðTOU)) - <1 E9 1T nh 12

1.2.5 Sự lây lan và tính sinh bệnh học của EV71 s++sk + vskkseeresereseresere 12

1.3 Các cơ chế miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của E;V71 . -s- 52s + 14 1.4 Dịch tễ học phân tử của EV71 «<< 5s se+ssSxse+etteEtserkeesserserseerserseoksee 18

1.5.3 Vắc xin VLP (virus-like partiCÌ€) - 5-55 52SEEE2EEE SE EEE1211211 11.1111 cyee 24

1.5.4 Vac xin tái tỔ hỢp -¿-2¿- + t2 2E2EE211271211271711211211 11121121121 re 26 1.5.5 Vac xin peptide tổng hợp - + ©2++2+++2+++EE++EE+2EE+SEEESEEEEErEEkrrrkrrrrrrrrres 26 1.6 Công nghệ sản xuất vac xin toàn phan bất hoat -sc 2 -scs<ssessecssesses 28

1.6.1 Chọn chủng Ứng CỬ - G5 1v TH TH nh HH HT HH nh nghệ 28

11

1.6.2 Sản xuất kháng nguyên E'V71 -2- 2+ ©2++2+++2E++EE+SEEESEEESEEEEErErkrrrkrrrrrrrrree 28

1.6.2.1 Dòng tế bào -¿-©:- 2c 2k E1 211211211211111211 211111211 11 11 11 11g ey 28

1.6.2.2 Giá thể nuôi cấyy -¿- 2-52 SE+SE9EE9EE9EE2E12E1211211211211217111711111 11111 c1e 29 1.6.2.3 Tinh chế kháng nguyên -¿-22- 22 +¿+E++2EE2EE2EEEEEEEEEEEEEEEErerkrerkrrree 32 1.6.2.4 Tá chất nhôm với vac xin EV71 toàn phan bat hoạt . : 5252 34

1.7 Đánh giá hiệu qua bảo vệ của VAC XỈn e-s-sc se csessessevssesserserssersersssssee 35

2 CHƯƠNG2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1.3.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA và khuếch đại gen VP1 40 2.1.3.2 Hóa chất điện đi DNA ¿22-52222223 2232221122112711221221 22121111 tre 40 2.1.3.3 Hóa chất cho sắc ký lọc gel - ¿- + ¿++£+++E£+E£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEkEEkrrkrrkrrs 4I 2.1.3.4 Hóa chất điện di và lai protein ¿ -¿- ¿+++2+++cx+2zxtzrxrerxrsrxrrrxerrreee 41 2.1.3.5 Hóa chất định lượng protein bang phương pháp Bradford - 41 2.1.3.6 Hóa chat cho phản ứng ELISA xác định kháng thé IgG kháng EV71 42 2.1.3.7 Hóa chat cho phản ứng ELISA khảo sát phân lớp kháng thé IgG1 và IgG2a

Khang EV71 ooo 42

2.1.3.8 Hóa chat tiêm chuột và gây mê - 22 +¿+2+++x+2Ex2EE2EEerxrrrxerrreee 42 2.1.3.9 Hóa chất nuôi cấy tế bào, nuôi cấy vi rút - :- 2© x+cx+£srsrssrssrssrs 42

2.2 Phương pháp nghiÊn CUU <5 5œ << 99 090 95409095 408408908906 43

2.2.1 Chọn chủng ứng cử cho vắc xin bằng phân tích xu hướng tiến hoá và so sánh

0á 43

iv

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy tẾ bào -2- 22 ©2++2+++EE+tEEEvEEESrEeerkrerkrsrkrerkee 43

2.2.2.1 Xác định số lượng tế bào bang buồng đếm hồng cầu - 2¿ 43

2.2.2.2 Nuôi cấy tế bào trên hệ thống lắC - 2 2 +©S+2E++£xt£E+Exerxezrerrxerxee 44 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy vi rút EV 71 -¿-©++2+++2+++2x++Ex++rx+erxterkeerkesrxrsrxee 45

2.2.3.1 Phương pháp xác định hiệu giá vi rút (TCTIDso) - 5 + +5s 5s £+£s+ss 45

2.2.3.2 Phương pháp plaque assay va thu nhận plaque 5+ ++<s+sx+sxs2 46

2.2.2.3 Phương pháp RT-PCR khuếch đại trình tự gen VPI -. ¿-5z©55¿ 49

2.2.2.4 Phương pháp giải trình tự SanØ€T 6 3 vn kg Hệ, 49

2.2.4 Phương pháp tinh chế và đánh giá chất lượng kháng nguyên . 49

2.2.4.1 Phương pháp cô đặc kháng nguyÊn - + 2h ng ghen 50

2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lọc gel - ¿5£ +E£EE£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEkEEkrrkrrrrex 50 2.2.4.3 Định lượng protein bằng phương pháp đo Brafford . -s+ 55552 52

2.2.4.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE óc SH re, 53

2.2.4.5 Xác định thành phần EV71 bang phương pháp Western Blot 55 2.2.4.6 Phương pháp bat hoạt kháng nguyên - 2 2£ ++2++cx+cxz+zevrxersee 58

2.2.5 Phương pháp đánh giá tinh sinh miễn dich và hiệu quả bảo vệ - 58

2.2.5.1 Gay đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C: .:2¿ 2 5+5++2++z++z+zz+sss 58

2.2.5.2 Phương pháp thu máu chuỘPt - - 5 c2 32+ E**E+E+everrerrerrrerrrrerrre 59

2.2.5.3 giai 0i( 0.10 60

2.2.5.4 Phương pháp ELISA xác định kháng thé IgG kháng EV7I trong huyết thanh

000111177 62

2.2.5.5 Phương pháp ELISA xác định kháng thé phân lớp kháng thé IgG1, IgG2a

kháng EV71 trong huyết thanh chuột 2- 2 5¿©5£+++2+£2£E££+£E£Exerxezxezrxrrxeee 64 2.2.5.6 Phương pháp thử thách đánh giá hiệu quả bảo vệ của VAC xin - 66

2.2.5.7 Xử lý $6 liệu -2¿- k2 EEEE12112712112111112111111211 1111.111 1x 66

3 CHƯƠNG 3 KET QUA VÀ BAN LUẬN e -°-s<cse©csecssecsseessersserse 69

3.1 Chọn chúng bang phân tích dữ liệu dịch tễ học phân tử -«- << 69

3.2 Thích nghỉ chúng trên tế bào V€rO ss-s°ss©sse+vsee+xseerxeesrserrssesrseesrsee 75 3.3 Sản xuất kháng nguyên trên hệ thống wave bioreaCfOF -. -se-s-scsscssess 79

3.3.1 Nuôi cấy tế bào Vero trên hệ thông lắc wave bioreactor với giá thê Cytodex 1 79 3.3.2 Khảo sát liều lây nhiễm tối ưu và thời gian thu hoạch Vi rút .: - 81 3.3.3 Khao sát thời điểm thu hoạch vi rút trên hệ thống wave bioreactOr 83

3.4 Tỉnh chế, bat hoạt kháng nguyên và đánh giá chất lượng kháng nguyên 84

3.4.1 Tinh chế kháng nguyên 2-2 S2 SE‡EE£EEEEEEEE2112711211211111111 11111111 c0, 84

3.4.2 Bat hoạt kháng nguyÊn ¿- + + ©+2+EE£EE2EEE2EE211211271121122121211 1121111 re, 87

3.4.3 Độ tinh sạch, tính kháng nguyên va hàm lượng protein của kháng nguyên sau tinh

1 89

3.5 Kết quả nghiên cứu tinh sinh miễn dịch: -. -s- 2s se ©ssesse=ssessessessess 92

3.5.1 Kết quả dò liều kháng nguyên ở hàm lượng thấp - -: : s++cs++-5+2 93 3.5.2 Kết quả khảo sát lịch tiêm -:- 22 St x22E£EE£EE2EEEEE2EE271E2122121 21.1 re 95 3.5.3 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trên các liều kháng nguyên khác nhau và

đánh giá hiệu quả của tá chất nhôm -2- ¿2 ©++E+++EE++EE++EE++EE++EE++EE+zrxesrxeerxee 98 3.5.4 Khảo sát subtype kháng thé IgG (IgG 1/IgG2a) cesessessesssessesseessecsesssessesssesseeses 101 3.5.5 Kết qua khả năng trung hoa chéo của chủng vac xin ứng cử với các kiểu gen khác

Maul CUA EV71 oo Ố 103

3.6 Hiệu qua bảo vệ của vac xin trên chuột nhắt trang ccccsecsescessssssecsessseseeeaseeseeees 105

4 CHƯƠNG 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ -. 5° << cssessessecsee 109 4.1 KKẾT luận «°-+.d©SSSE 44EE7E.1444 E714 E97721444EE07E.441EE2024441 9900214410 eprrr 109

4.2 Kiến nghi ssssssssssssssssssssssssssssssesssssssssssssssssssssssssssessssssessssssssssssssessssssessssssesessssseesssses 109

DANH MỤC CÔNG TRINH CUA TÁC GIA -essse<ececccveessssee 110

TÀI LIEU THAM KHẢO 2° s£s£s2€ESs#SES9£ESse©ESseE2see22sevxsetrsserrssere 111

VI

DANH MUC CAC TU VIET TAT

: Acid amin (Axit amin)

: Ammonium Persulfate (Tên muối)

: Base pair (Cặp bazo)

: cell culture infectious dose 50% (Liều gây nhiễm 50% tế bào): Cytopathic Effect (Biến đổi bệnh lý tế bào)

:3,3°-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Tên hợp chất hóa học): Dendritic Cell (Tế bào tua)

: Deoxyribonucleic Acid (DNA) : Dulbecco's Modified Eagle Medium (Tên một loại môi trường nuôi

: Dimethyl Sulfoxide (DMSO-hợp chất hữu cơ)

: Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

: Fetal Bovine Serum (Huyét thanh bao thai bé)

: Ethylenediaminetetraacetic acid (Axit Etylen Diamin Tetra Acetic)

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch hap thụliên kết với Enzyme)

: Enterovirus 71 (Vi rút EV71)

: Geometric Mean Titer (Hiệu giá trung bình nhân)

: Human Leukocyte Antigen (Kháng nguyên bạch cầu người)

: Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (ribonucleoprotein nhân

không đồng nhất): Horseradish Peroxidase (Peroxidaza cải ngựa)

: Interferon (Tén protein)

: Interleukin (Tên protein)

: Internal Ribosome Entry Site (Vi tri x4m nhap cua ribosome bén

trong)

: Kilo base (Don vi do kích thước DNA)

vil

: Kilo Dalton (Đơn vi đo kích thước protein)

: Lethal Dose (Liều gây chết 50%)

: Messenger RNA (RNA thong tin)

: Molecular Weight Cut-off (Trọng lượng phân tử ngưỡng)

: Nucleotide Oligomerization Domain-like Receptors (Thụ thé tương

tu phan oligo nucleotide)

: Nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like

receptors (Thu thé tương tu NOD): NLR family pyrin domain containing 3 (Tén protein)

: Optical Density (Mat d6 quang)

: O-phenylenediamine dihydrochloride (Tén hop chất hóa học)

: Open Reading Frame (Khung đọc mở)

: Phosphate Buffered Saline (Tên dung dịch)

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

: Plaque Forming Unit (Don vi tao plaque)

: p-Nitrophenyl Phosphate (Tên hợp chất hóa học): Pattern Recognition Receptor (Thu thé nhận diện kiều mau)

: P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 (Tên protein)

: Retinoic acid-inducible gene I-like receptor (Thu thé tương tự gen

cam tng acid retinoic) : Ribonucleic acid (Axit ribonucleic) : Streptavidin Alkaline Phosphatase (Tén protein)

: Scavenger Receptor Class B Member 2 (Tên protein)

: Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Tên

một phương pháp điện di)

: Tris-Buffered Saline (Tên dung dich)

: 50% Tissue Culture Infection Dose (Liều gây nhiễm 50% tế bào)

: Tay, chan, miéng

: Tetramethylethylenediamine (Tén hop chất hóa học)

Vili

: Untranslated Regions (Vùng không được dịch ma)

: Virus-Like Particle (Hat giả virus)

: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

1X

DANH MỤC CAC BANG TRONG LUẬN AN

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại EnterOVirus 2- ¿2s ©++2x+2£x+2xxvzxeerxesrxerrrxee 3Bang 2.1 Sơ đồ thí nghiệm xác định hiệu giá kháng thé trung hoà 62Bảng 3.1 Tổng hợp các sai khác trong các vùng epitop giữa các chủng 72

Bảng 3.2 Hiệu giá vi rút của chủng B5-203P-2013 tại các đời thích ứng khác nhau

trên tế bào V€TO :- 5c St 2x2 2E21127127121121121111.211 21111112111 1y 76

Bang 3.3 Hiệu giá TCIDSO của vi rút trong các phân đoạn - -«+-«2 86

Bang 3.4 Ham lượng protein tổng số của các phân đoạn thu được sau quá trình sắc

[$0 90

Bảng 3.5 Các thí nghiệm đánh giá tính sinh miễn dịch -2- 2s 25s 93

Bảng 3.6 Kha năng dap ứng miễn dịch chéo của kháng thé kháng

5-203P-2013-P10.1 với các kiểu gen EV 71 khác -¿- s¿©++cx++zx+zxerxesrxeer 103

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Hình 1.1 Cấu trúc vỏ của EV71 ¿-©5++c++2++22E22322122112711271E211 71.21 E crke 5

Hình 1.2 Cấu trúc vỏ của EV71 - ¿+ +2x+2++22E22X2212112711271E211711 21.22 xe 5

Hình 1.3 Sơ đồ đại diện cho cấu trúc 8 sợi liên kết thành phiến đối song song 6Hình 1.4 Cấu trúc bộ gen của E'V7 + ++2+++E++EE£EEEEEEEEEEEEEkrrkrrrrerkerreee 9Hình 1.5 Các yêu tố sao chép cis-acting cần thiết cho sự nhân lên của RNA vi rút 11Hình 1.6 Vai trò của miễn dich bam sinh và miễn dịch thích ứng trong sự xâm

nhiễm của EV77l ¿+ x+St+St+E2E+2E2E2EE2EEEEEEEEEEEEE212121 2.2 crkrrrrree 16

Hình 1.7 Sự phân bố kiểu gen của vi rút EV71 ở một số nước giai đoạn 1997-201819Hình 1.8 Các giá thé nuôi cấy tế bào dang bám dính 2 25c s2 s+£s2 5+2 30Hình 1.9 Các giá thể nuôi cấy tế bào dang huyền phù -2- ¿52552552 30

Hình 1.10 Cấu trúc của Cytodex l -¿-©2¿©+¿+2++2E++EE+2EEt2EEtrkeerkesrrerresree 31

Hình 1.11 Cau trúc của Cytodex 3 v ccecccceccssscsssessssssssessessessessesssssesssscsessessessessesseaes 32Hình 1.12 Kết qua về ly thuyết của các phân đoạn có sự phân giải cao 33

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm plaque asSay - 5: 2 E+SES£2E£+E£2E£EezEerxerxrrsrree 47

Hình 2.2 Đường chuẩn của phương pháp Bradford - 2 2s x+cx+zszzszss2 53Hình 2.3 Thứ tự các thành phần chuyền thẩm -:- ¿22 ©5z++z++zx+zz++ 56Hình 2.4 Thiết kế thí nghiệm khảo sát liều kháng nguyên - 5+ 58Hình 2.5 Thiết kế thí nghiệm khảo sát lịch tiêm -2¿ 2£ 52+z2+£xz+c+z 59Hình 2.6 Thiết kế thí nghiệm khảo sát các hàm lượng kháng nguyên khác nhau 59Hình 3.1 So sánh trình tự tại các vị trí epitop của chủng B5-203P-2013 các kiểu

BEN KhAC MAU 0 70

Hình 3.2 Cây phát sinh loài gen VP1 (891 bp) eee eeeeeeeeeeeteceeeeeeeeseeeseceseeeeeeaeees 74

Hình 3.3 Kết quả gây nhiễm của chủng ở các nồng độ pha loãng khác nhau trong

quá trình thích ngÏ1 - - - <6 1 3111391183189 911191 11 ng ng 75

Hình 3.4 Kết quả tao plaque trong đời cấy thứ 10 2 ¿+ secxszxerszrsxee 77

Hình 3.5 Thu nhận gen VP1 của chủng chọn lỌC .- - + +-x£++£secssessersee 78

Hình 3.6 Sự bám của tế bào trên vi hạt qua các thời gian nuôi cấy - 80

XI

Hình 3.7 Sự phá huỷ tế bào của Vi rút ¿- + s++++Ex+EEtEE2EEEEEerkrrkerrkerkerkrree 84Hình 3.8 Sắc ký đồ của quá trình tỉnh chế 2: + s¿+++2++zx++zxrzrxerxesree 85Hình 3.9 Hình chụp dưới kính hién vi điện tử truyền suốt -. : - 86Hình 3.10 Kết qua SDS PAGE của vi rút trước và sau tinh chế -: 89Hình 3.11 Kết quả lai Western của các phân đoạn sắc ký -:5 91Hình 3.12 Dau hiệu bệnh tật của chuột được gây nhiễm ¿2s s+x+s+x+x+xez 106

Hình 3.13 Chuột qua các giai đoạn thử thách - - - + + *++sesseeeeseesesee 107

xH

DANH MỤC CÁC BIEU ĐỎ TRONG LUẬN AN

Biểu đồ 3.1 Sự bám của tế bào trên vi hạt qua các thời gian nuôi cấy 81

Biểu đồ 3.2 Sự lây nhiễm của vi rút trên các liều lây nhiễm khác nhau 82

Biểu đồ 3.3 Thời gian xâm nhiễm của vi rút trên hệ thong wave bioreactor 83

Biéu đồ 3.4 Kết quả bat hoạt vi rút ở các nhiệt độ khác nhau - - 88

Biểu đồ 3.5 Kết quả đáp ứng miễn dịch sau mũi l -¿- ¿5252 94 Biéu đồ 3.6 Kết quả đáp ứng miễn dịch của các lịch tiêm nhắc khác nhau 96

Biểu đồ 3.7 Kết quả đáp ứng miễn dịch của các liều kháng nguyên khác nhau 98

Biểu đồ 3.8 Hiệu giá kháng thé IgG thời điểm 4 tuần và 8 tuần - 100 Biểu đồ 3.9 Hiệu giá kháng thé IgG1 và IgG2a ở các nhóm qua mũi tiêm lần 1 và

VAN 2 5c 2t 2t 1221221071 211211 2117121121111 T111 1 111 E1rerrreg 102

Biểu đồ 3.10 Ty lệ kháng thể IgG2a/IgG l - - 2 2 2 E+2E£+E£+E++£xezxzzxezrsee 102 Biểu đồ 3.11 Hiệu quả bảo vệ chuột mới sinh của vac xin EV71 ở các liều kháng

nguyên 2.5 Ug; 5g; LOU 5c 5c St SeEssrerserrrrerrsrrererske 106

xIH

MỞ DAU

Bệnh tay, chân, miệng (TCM) là một bệnh truyền nhiễm phổ biến ở trẻ em, nhất là

trẻ dưới 5 tuổi Bệnh lây truyền theo đường tiêu hoá với các dấu hiệu đặc trưng như

sốt, đau họng, tôn thương niêm mạc miệng và da chủ yếu ở dang bóng nước thườngthấy ở lòng bàn tay, lòng bàn chân, đầu gối, mông Bệnh có thể diễn biến nặng vàgây biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp dẫnđến tử vong Bệnh do một nhóm Enterovirus thuộc họ Picornaviridae gây ra gồm

các chung Coxsackie virus A6, A10, A16 (CA6, CA10, CA16) va Enterovirus

71 (EV71) trong đó EV71 là một tác nhân được quan tâm nhiều nhất do liên quan

đến các bệnh cảnh nặng kèm theo biến chứng thần kinh, tim, phối và thậm chí còn

có thê dẫn đến tử vong [1] Ngoài các triệu chứng của bệnh TCM ở trẻ nhỏ, EV71

còn có khả năng gây nên bệnh ở hệ thần kinh trung ương như viêm màng não hay

hiếm hơn là các thé tram trọng như viêm não hay liệt kiểu bại liệt [2]

Vi rút EV71 lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1969 Năm 1997, dịch EV71bùng phát va lan rộng tại khu vực Châu A — Thái Binh Dương Trung bình mỗi năm

có trên 1 triệu ca nhiễm được ghi nhận trên khắp châu A [3, 4].Tại Việt Nam, vi rútEV71 được phân lập lần đầu tiên vào năm 2003 Từ đó, hàng loạt các trận dịchTCM lớn, nhỏ có liên quan đến loại vi rút này liên tiếp xảy ra vào năm 2005, 2006-

2007, 2008, 2009, 2011-2012, 2018 với hàng chục ngàn ca nhiễm và ít nhất 250

trường hợp tử vong [5-8] Trong cuối năm 2020 đến nay, dịch TCM có dấu hiệu

quay trở lại với số ca nhiễm tăng đột biến.

Hiện nay, bệnh TCM vẫn chưa có thuốc điều trị, vắc xin vẫn đang là chiến

lược tốt nhất để kiểm soát dịch bệnh Hiện đã có một số vac xin EV71 toàn phần bat

hoạt đã được thương mai hoá ở Trung Quốc cũng như dang trai qua các giai đoạnnghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng ở Đài Loan, Singapore, Hàn Quốc, Thái Lan Tuy nhiên, các vắc xin này được phát triển dựa trên đặc điểm của các chủng vi rút

lưu hành tại từng khu vực, điển hình như chủng C4a đã được sử dụng ở Trung

Quốc, các chủng B3 và B4 tương ứng được sử dụng ở Singapore và Đài Loan [9]

Hiệu quả bảo vệ của chúng đôi với các chủng lưu hành tại Việt Nam hâu như chưa

được ghi nhận Trong khi đó, đặc điểm về dịch tễ học phân tử của virus EV71 tại

Việt Nam có nhiều điểm khác biệt, các kiêu gene EV71 đã được ghi nhận lại là C1,

C4, C5 và BS [5, 6] Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào mục tiêu

nghiên cứu phát triển việc sản xuất vac xin phòng bệnh TCM do EV71 dựa trên các

chủng lưu hành tại Việt Nam và đánh giá tính sinh miễn dịch cũng như hiệu quả bảo

vệ trên mô hình chuột nhắt trắng Việc phát triển vac xin EV71 sẽ giúp tạo một môhình cho việc phát triển các vắc xin đơn giá của các tác nhân khác gây bệnh TCM

cũng như tạo điều kiện phát triển vắc xin đa giá phòng bệnh TCM

Nghiên cứu được tiên hành với các nội dung nghiên cứu như sau:

1 Chọn chung vi rút EV71 ứng cu đại diện cho chủng lưu đang lưu hành,

có xu hướng lưu hành, mang kiểu gen phô biến và có khả năng tạo

kháng thể trung hoà chéo với các kiểu gen phụ khác lưu hành tại Việt

Nam.

Thích ứng chủng trên tế bào Vero nhằm chọn dòng chủng có khả năng

6n định di truyền so với chủng ban dau và tăng sinh tốt trên dòng tế bàonày phục vụ sản xuất (trên 107 TCIDs0)

Chuẩn hoá việc sản xuất kháng nguyên trên hệ thống Wave bioreactor

kết hợp vi hạt nhằm thu được lượng kháng nguyên cao nhất với năngsuất tối thiểu đạt trên 107 TCIDso/ml

Tinh chế kháng nguyên dé loại bỏ các thành phần nuôi cấy và mảnh vỡ

tê bào.

Đánh giá đáp ứng miễn dịch nhằm thu được liều tiêm và lịch tiêm tối

ưu trên chuột nhắt trăng

Đánh giá hiệu quả bảo vệ thông qua thí nghiệm thử thách trên chuột sơ

sinh 1 ngày tuổi

1 CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN

1.1 Enterovirus

Enterovirus là một chi thuộc họ Picornaviridae, bao gồm các vi rút không vỏ

và có bộ gen là sợi RNA don Piconarviridae là họ vi rút RNA lớn nhất bao gồm 12

chi dựa trên đặc tính sinh học và tính chất di truyền Enterovirusbao gồm 10 loài có

khả năng gây bệnh cho người và động vat Các nhóm dưới loài được xếp dựa vào sựtương đồng trong trình tự gen [10]

Những enterovirus ở người được phân loại thành 5 phân nhóm có tên là

Echovirus, Coxsackie A và vi rút B, Poliovirus và những enterovirus khác Dựa trên

tính chất phân tử, chúng được phân loại lại thành 5 loài: enterovirus ở người từ A

đên D và poliovirus.

Bang 1.1 Hệ thống phân loại Enterovirus

Loài (Species) Dưới loài (Subspecies)

Coxsackievirus 2-8, 10, 12, A14, A16

Human enterovirus À | terovirus 71, 76, 89-92, 114, 119, 120, 121

Coxsackievirus A9, A23, Coxsackievirus BB6, Echovirus Human enterovirus B 9, 11-21, 24-27, 29-33, Human enterovirus 69, 73-75, 77-88,

1-93, 97,98, 100, 101, 106, 107 Poliovirus 1-3, Coxsackievirus Al, All, A13, A17, A19, Human enterovirus C A20-A22, A24, Human enterovirus 95, 96, 99, 102, 104, 105,

109, 113, 116, 117 and 118 Human enterovirus D Human enterovirus EV68, EV70, EV94, EV111 and EV120

Human rhinovirus Al, A2, A7-A13, A15, A16, A18-A25, A28-A34, A36, A38-A41, A43-A47, A49-A51, A53-A68, A71, A73-A78, A80-A82, A85, A88-A90, A94-A96, A98, A100-A103

Human rhinovirus A

Human rhinovirus B3-B6, B14, B17, B26, B27, B35, B37, Human rhinovirus B B42, B48, B52, B69, B70, B72, B79, B83, B84, B86, B91-

B93, B97 and B99 Human rhinovirus C Human rhinovirus C1-C49

Bovine enterovirus 1 Bovine enterovirus

Bovine enterovirus 2 Porcine enterovirus B Porcine enterovirus 9, Porcine enterovirus 10

Simian enterovirus Al Simian enterovirus A Other type: SV28, SA4

Cho đến nay, có 86 serotype của enterovirus được biết đến trong đó có 65

serotype có khả năng gây bệnh cho người Thông thường, các chủng vi rút này được

phân lập bằng phương pháp nuôi cấy tế bào trên những dòng tế bào chuyên biệt như

human Rhabdomyosarcoma (RD), Vero, WI-38 and MRC-5, và được phân loại

thành những serotype khác nhau dựa trên phản ứng trung hòa kháng huyết thanh

[H1].

1.2 Enterovirus 71

Enterovirus 71 (EV71) được phân loại như một thành viên của loài

Enterovirus A trên người trong chi Enterovirus Enterovirus 71 trên người được

phân lập lần đầu tiên từ phân của một trẻ sơ sinh bị bệnh viêm não tại California,

Mỹ vào năm 1969 Ké từ đó, EV71 được biết đến như một tác nhân có liên quanđến một loạt các bệnh, chủ yếu là sự bùng phát của bệnh tay chân miệng (TCM).Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em, với các biểu hiện như sốt, sưng miệng, nổi ban có

bong nước trên bàn tay, ban chân và miệng Ngoài TCM, EV71 còn gây ra bệnh

herpangina — một bệnh khởi phát với triệu chứng sốt đột ngột và đau hong do các

mụn nước nhỏ hoặc các vết loét ở xoang miệng sau Các thành viên khác của

Enterovirus A, đặc biệt là coxsackievirus A6 (CVA6), coxsackievirus A16

(CVA16) va coxsackievirus A10 (CVA10) cũng gây bệnh TCM và herpangina [12].

Các triệu chứng lâm sàng của bệnh TCM do EV71 gây ra thường không thé phân

biệt được với TCM do CVA6, CVA16 hay CAV10 Tuy nhiên, dịch bệnh TCM gây

ra bởi EV71 đang trở thành mối quan tâm hàng đầu của các tổ chức y tế cộng đồng

vì trẻ em dưới 5 tuổi bị nhiễm EV71 có nguy cơ phát triển biến chứng ở hệ thần

kinh trung ương như viêm mang não vi rút hay liệt bại liệt [13].

1.2.1 Cấu trúc hạt vi rút

EV71 là một vi rút không mang bao, vật liệu di truyền là một sợi ribonucleic

acid (RNA) dương 7,4kb, có kích thước nhỏ khoảng 30nm Hạt vi rút bao gồm một

vỏ protein (capsid) không có màng bao lipid xung quanh bộ gen Cấu trúc tinh thécủa HEV71 gần đây đã được xác định [14] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc vé của EV71

Capsid bao gồm 60 đơn vị giống hệt nhau (protomer), mỗi tiểu đơn vị bao

gồm ba protein bề mặt (VP1, VP2 và VP3) và protein VP4 nằm bên trong (Hình1.2) Việc thiếu màng bao lipid tao sự 6n định trong môi trường ký chủ, bao gồm cả

khi tiếp xúc với dịch vị ở dạ dày Hat vi rút cũng có thé tồn tại nhiều ngày ở nhiệt

độ phòng [15].

Mỗi protomer trong capsid có chứa bản sao của

4 loại protein cau trúc (VP1-VP4) [16]

Các polypeptide VP1, VP2, VP3 không có trình tự tương đồng, nhưng ca ba

protein đều có cách thức liên kết tương tự nhau, bao gồm 8 sợi liên kết với nhau tạo

thành hai phiến B đối song song kết hợp thành vùng cấu trúc hình nêm có dang

thùng Một phiến tạo thành vỏ của hình nêm, phiến còn lại uốn cong ở vùng trung

tâm để tạo thành cả vỏ và đáy của hình nêm Một mạng lưới liên kết protein —

protein xảy ra bên trong của capsid do sự duỗi ra của đầu N làm cho quá trình liên

kết diễn ra thuận lợi, tạo một vỏ protein dày, cứng và kiên có Đây là nền tảng cho

sự bền của hạt vi rút [17] Chuỗi polypeptide của VP4 khác đáng ké so với cácprotein khác ở chỗ VP4 có một vùng cấu trúc mở rộng Vùng protein này có vị trí

và cầu tạo tương tự như trình tự ở đầu NH2 của VP1 và VP3, có chức năng như mộtphần ở đầu NH2 của VP2 bị cắt ra hơn là một protein hoạt động độc lập Cấu trúckhác biệt chính giữa VP1, VP2 và VP3 nam ở bên trong vòng kết nối của các sợi B

và trong trình tự ở đầu N va C duỗi ra từ vùng cấu trúc B dang thùng Các chi

picornavirus khác nhau ở cấu trúc vòng bên ngoài, hình thành nên sự khác biệt ở bề

mặt của mỗi chi và độ dày của vỏ capsid, cho phép mỗi picornavirus có hình thái và

kháng nguyên riêng biệt của nó [17].

Hình 1.3 Sơ đồ đại diện cho cấu trúc 8 sợi liên kết thành phiến B đối song song1.2.2 Cấu trúc bộ gen

Bộ gen của EV71 là một sợi RNA đơn dương, có đuôi polyA, kích thước

khoảng 7,4 kb RNA vi rút là nhân tố truyền nhiễm và sợi RNA dương trực tiếp mã

hóa cho các protein cần thiết cho quá trình sao chép Bộ gen của enterovirus 71 có

chứa một vùng không dịch mã 5’ (5’UTR), một khung đọc mở (OFR) mã hóa cho

một đoạn polyprotein có chứa 2,194 amino acid, một vùng không dịch mã gắn đầu

3’ (3' UTR) và một đuôi poly-A Đầu 5’UTR chứa những yếu tố quyết định cho sự

dịch mã RNA vi rút và độc lực của nó dựa trên các vector IRES (internal ribosome

entry site) Điểm cuối được định dạng lại bằng sự hiện diện của một protein VPg

Chuỗi polyprotein được phân chia thành 3 vùng PI, P2 và P3 Vùng PI mã hóa cho

protein cấu trúc (VPI — VP4), vùng P2 và P3 mã hóa cho 7 protein không cấu trúc(từ 2A đến 2C, 3A đến 3D) Chuỗi polyprotein trải qua quá trình phân cắt sau dịch

mã trở thành 4 protein cấu trúc VP1, VP2, VP3 và VP4 Vùng 3’UTR có chứa cautrúc pseudo-knot là vùng cấu trúc quan trọng cho sự tổng hợp chuỗi RNA âm

Hai bên khung đọc mo ORF là 2 vùng không dịch mã (UTR) ở đầu 5’ và 3’,

với đuôi poly (A) gắn với điểm cuối của vùng không dịch mã đầu 3' [13] Vùng

không dịch mã đầu 5’ là vùng gấp nếp bên trong 6 thong long (SLDs), với SLD Imang cấu trúc lá chẻ ba (cloverleaf) và SLD II đến VI tạo thành vector IRES [17]

Đa số các thành viên trong họ Enterovirus đều có vector IRES ở vùng không dịch

mã đầu 5’ Vai trò chính của cấu trúc lá chẻ ba và vector IRES là điều khiển quá

trình sao chép và dịch mã của RNA vi rút [13].

1.2.3 Quá trình lây nhiễm của vi rút EV71 trên té bào chủ

Ở mức độ phân tử, quá trình lây nhiễm của EV71 bao gồm 4 bước: vi rút xâmnhập vào tế bào (sự nhập bào), tồng hợp protein, sao chép RNA vi rút, lắp ráp vàgiải phóng hat vi rút [18].

1.2.3.1 Nhập bào

Giai đoạn đầu tiên của quá trình các picornavirus xâm nhiễm vào các tế bào

là sự tương tác của capsid vi rút với các thụ thể chuyên biệt trên màng tế bào Thụ

thé là các phân tử của tế bào chủ (thường được gan trên màng) liên kết với cácprotein của vi rút Các thụ thé đóng vai trò rất cần thiết trong giai đoạn đầu của quá

trình xâm nhiễm và là yếu tố quyết định chính cho sự nhập bào của vi rút vào kýchủ Có nhiều loại phân tử khác nhau trên bề mặt tế bào có thé là thụ thé chopicornavirus, trong khi một số khác có thể là thụ thể của picornavirus va một thànhviên khác trong cùng một họ.

EV71 sử dụng một vài thụ thé khác nhau dé gắn vào tế bào, quan trọng nhất

là thụ thể SCARB2 (scavenger receptor class B, member 2) [19, 20] Một axit aminQ172 của protein VP1, nằm gần khe trên vỏ protein, sẽ tương tác với một aa quantrọng trên thụ thé SCARB2 là I144-F151 [20, 21] Sau khi thụ thé đã gan với EV71,SCARB2 cho phép vi rút nhập bào bằng việc tạo ra một túi nội bào [21, 22] Cacnghiên cứu phân tích có độ phân giải cao đã cung cấp một mô hình hoàn chỉnh chogiai đoạn đầu của quá trình phóng thích bộ gene của EV71 [23] Ở đây, vòng lặp

GH trên VPI hoạt động như một bộ chuyển đổi cảm biến để gan vào các thụ thé của

tế bào Virion ấn sâu vào màng tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo thành túi nội bào hay

endosome được lớp clathrin bao phía ngoài Kênh proton của màng endosome vận

chuyển H+ vào trong làm cho pH trong endosome giảm xuống (pH 4.5 - 5)

Endosome sẽ dung hợp với lysosom Trước khi dung hợp, lớp clathrin bị loại bỏ.

pH thấp hoạt hoá enzyme phân giải capsid, pH thấp trong endosome dẫn đến việc

dung hợp vỏ capsid với màng endosome, làm vỡ vỏ capsid và giải phóng bộ gene

rút vào trong tế bào

1.2.3.2 Quá trình tổng hợp protein vi rút

Sau khi EV71 giải phóng bộ gene vào trong tế bào, quá trình tổng hợp

protein bắt đầu Đầu tiên, các protein không cấu trúc cần thiết để hỗ trợ cho quá

trình sao chép vi rút được giải mã từ bộ gene RNA của vi rút Bộ gene EV71 không

có mũ và vùng 5’UTR cho phép dịch mã polyprotein của vi rút theo cách thức

không phụ thuộc mũ, mà nhờ đoạn IRES [17] Quá trình này bao gồm cácribosomes sẽ gan va di chuyén dọc theo mRNA để xác định vị trí codon bắt đầu

dịch mã AUG Các ribonucleoprotein không đồng nhất trong nhân (hnRNP) AI gắn

với vùng IRES; và một trong hai hnRNP Al và hnRNP A2 chịu trách nhiệm cho sự

định hướng quá trình dịch mã của vùng IRES [24] Các mối liên kết giữa vùng

IRES và khung đọc mở (ORF) sau đó sẽ liên kết với 2 yếu tố liên kết protein

(FBPs) Liên kết với FBP2 sẽ ức chế quá trình dich mã tuy nhiên, FBPI có thé cạnhtranh liên kết với FBP2 dé quá trình dịch mã diễn ra tiếp tục [25] Một vài yếu tố

khác của tế bao cũng kết hợp với vùng IRES của EV71 tuy nhiên vai trò của của các

yêu tô trong quá trình dịch mã protein cho đên hiện nay vẫn chưa được xác nhận.

Sau khi dịch mã protein, quá trình phân cắt chuỗi polyprotein của vi rút

thành các tiền chất và các protein vi rút trưởng thành xảy ra thông qua enzyme

proteinase do vi rút mã hóa [26] Sự kiện phân tách chính xảy ra tại đường giao

nhau giữa các protein tiền thân P1 và P2 và qua trung gian bởi enzyme proteinase

2A của vi rút, dẫn đến sự phân chia nhanh chóng của capsid tiền thân P1 từ các

protein không cấu trúc (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc bộ gen của EV71 [28]

Proteinase 2A có thé phân cắt một số protein trong tế bào chủ, bao gồm cácyếu tố khởi đầu dịch mã eIF4G Sự kiện phân cắt thứ cấp trong protein tiền chat của

vi rút được thực hiện bởi các protease 3C, sản xuất các yếu tố quan trọng trong quá

trình xử lý protein và sao chép RNA Ngoài ra, proteinase 3C còn phân cắt các yếu

tố kích thích phân chia tế bào, pre-RNA, tiêu đơn vị 2, 64 kDa (CstF-64), các yếu tố

này đều cần thiết cho qua quá trình polydenylate của mRNA tế bào [27] Điều này

giúp tăng cường sự dịch mã của bộ gen EV71 băng cách tắt sự tong hợp protein của

tế bào chủ, tông hợp nguồn lực dé tổng hợp protein của vi rút [17]

1.2.3.3 Sao chép bộ gene vi rút

Picornavirus sử dụng cơ chế sao chép độc nhất dé tạo ra thé hệ con cháu mớibằng cách sử dụng một khuôn RNA (-) để tổng hợp RNA (+) Lộ trình sao chép

RNA của picornavirus được tiền hành như sau:

+ sợi RNA (+) > tổng hợp sợi RNA (-) > hình thức nhân lên (RF) >

tổng hop sợi RNA (+) > sao chép trung gian (RI) > sợi RNA (+)

Các protein vi rút vừa tổng hợp liên kết với nhau và liên kết với một sốprotein của tế bào dé tạo thành phức hợp sao chép và mở đầu cho sự sao chép RNA

vi rút Gene 3B mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 22 amino acid được gọi là VPg.Trong polio vi rút, enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA sẽ gắn hai nucleotideuracil (U) vào hai nucleotide adenosine (A) trên cấu trúc vòng thân (stem loop)trong chuỗi VPg của RNA vi rút - được gọi là yếu tố sao chép cis-acitng (cre) Quátrình này được gọi là quá trình uridyl hóa [28] Cau trúc vòng thân cre của HEV71nam trong gene 2C [29] VPg và VPg được uridyl hóa (VPGpUpUOH) có chứcnăng như mồi cho sự nhân lên của RNA vi rút

Có 4 yếu tô sao chép cis-acting cần thiết cho sự nhân lên của RNAvi rút: khu

vực lá chẻ ba (cloverleaf domain), vùng cre, đầu 3’UTR, và đuôi poly A (Hình 1.5).Soi khuôn RNA âm được sao chép từ đầu 3' của sợi dương RNA Đầu 3’UTR củaHEV71 có 3 khu vực vòng thân (stem loop domain - SLDs) X, Y và Z, tiếp sau đó

là đuôi poly A có gắn với protein PABP (poly A binding protein) của tế bào chủ và

phức hợp sao chép 3Dpol-VPgpUpUOH có liên kết với hai uracil tạo thành mỗi cho

sự kéo dai của sợi RNA âm PABP cùng lúc liên kết với phức hợp sao chép của virút và protein của tế bào chủ tại khu vực lá ché ba ở đầu 5’ UTR Kết quả tạo thành

sợi RNA kép, được gọi là hình thức nhân lên của RNA vi rut (replicative form), đây

cũng là tín hiệu để tắt sự dịch mã của protein vi rút

Soi RNA dương của EV71 có hai uracil ở đầu 5° chịu trách nhiệm cho quá

trình nhân lên Sau khi tổng hợp sợi âm, phức hợp 3Dpol-VPgpUpUOH thứ hai ganvào đầu 3’ của sợi âm Tại đây adenosine bồ sung sẽ nhận ra đoạn moiVPgpUpUOH va gắn vào, 3Dpol sau đó kéo dai thành một soi RNA dương mới

10

Quá trình nhân lên gồm hai giai đoạn này diễn ra trong một phức hợp sao chép nằmtrên mạng lưới lipid có cấu trúc giống như autophagosome [25] Một nghiên cứu

gần đây chứng minh rang sự sao chép RNA của EV7I phụ thuộc vào một loại

protein COP 1 trên vỏ của tế bào chủ, protein này là thành phan thiết yếu trong bộmáy vận chuyền giữa mạng lưới nội chất và bộ máy Golgi [23]

Hình 1.5 Các yếu tổ sao chép cis-acting cần cho sự nhân lên của RNA vi rút

RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRps) của Picornavorus được biết có tỉ

lệ kết hợp sai rất cao dẫn đến sự hình thành đa dạng di truyền trong quá trình saochép RNA vi rút, điều này ảnh hưởng đến sự thích nghi của picornavirus trong quátrình lây nhiễm lên tế bào chủ [30]

1.2.3.4 Giải phóng vi rút khỏi tế bào

Theo mô hình lắp ráp hiện nay của picornavirus, vỏ protein của vi rút baogồm các protein VP1-VP4 ghép lại với nhau thành protomer Năm protomer sau đó

lắp ráp lại với nhau qua vùng tương tác trải dài từ vị trí aa 66-297 trên VPI dé tao

thành pentamer Các pentamer sau đó sẽ liên kết với bộ gen của vi rút 12 pentamer,với RNA vi rút, lắp ráp lại với nhau tạo thành vi rút hoàn chỉnh

Nhiều bằng chứng từ các mô hình lắp ráp của picornavirus cho thấy rằngnhững loại vi rút này điều chỉnh quá trình gây chết tế bào (apoptosis) rất chặt chẽ,

chúng một mặt ngăn chặn quá trình gây chêt tê bào thông qua việc sản xuât virion,

11

mặt khác lại thúc đây quá trình apoptosis dé hỗ trợ việc giải phóng thế hệ con cháu.EV71 gây ra quá trình apoptosis trong khoảng 24 giờ sau khi lây nhiễm Sự biểuhiện của một trong hai enzyme protease 2A hoặc 3C có thể gây ra quá trìnhapoptosis trong tế bào bị nhiễm Cơ chế mà EV7I có thé gây ra apoptosis bao gồm

sự phân cắt eIF4G của protease 2A và sự kích hoạt caspase-3 của protease 3C Cácphân tích trong phòng thí nghiệm cho thấy rằng môi trường có bổ sung glucose-6-phosphate dehydrogenase có thé làm tăng cường sự sao chép của vi rút và tăng hiệuứng gây chết tế bào (CPE) [31]

1.2.4 Nhóm gene EV71 (genogroup)

EV71 được phan loại thành 7 nhóm gene: A — G [32] Sự phân loại phụ

thuộc vào các biến thé trình tự trong VP1 Nhóm gene A chỉ có chủng nguyên mẫu

BrCr được phân lập ở Hoa Kỳ vào năm 1969 Hau hết các chủng EV71 đều thuộc

nhóm gen B hoặc C, mỗi nhóm lại được chia thành các phân nhóm phụ

(subgenogroup) Các phân nhóm phụ B4, B5 va C4 chủ yếu được giới hạn ở các

quốc gia ở Châu Á, trong khi C1 và C2 lưu hành chủ yếu ở Châu Âu và khu vực

Châu Á - Thái Bình Dương [33] Nhóm gene D và nhóm gene G mới được đề xuấtdường như là nhóm ban địa của An Độ, trong khi nhóm gene E và F gần đây đượcphát hiện ở Châu Phi và Madagascar.

1.2.5 Sw lây lan và tính sinh bệnh học của EV71

EV7I lây truyền qua đường phân - miệng nhưng cũng có thé lây lan qua tiếpxúc với dịch tiết từ miệng, dịch mụn nước, hay qua hạt bắn từ đường hô hấp Giống

như các enterovirus khác, ban đầu vi rút phát triển ở mô lymphô như amidan và

mang Peyer ở ruột non; sau đó đến các hạch lympho khu vực gây tình trạng nhiễm

vi rút trong máu (viraemia) Tai đây, các đáp ứng của tế bào chủ sẽ ngăn chặn sựtruyền nhiễm của vi rút và không gây triệu chứng Tình trạng nhiễm trùng lan rộng

khi EV71 lan ra hệ võng nội bi (reticuloendothelial system) như gan, lách, tủy

xương, tim phổi, tụy tạng; EV71 có thé lan ngược axon tế bào thần kinh của dâythần kinh ngoại biên hoặc thần kinh sọ để vào hệ thần kinh trung ương cũng như

12

hiện diện ở da, màng nhay và trùng khớp với thời kỳ phát bệnh lâm sàng EV71 cóthể tiếp tục được phát tán từ hầu họng đến sau 2 tuần hay vẫn còn phân lập được từ

phân sau 11 tuần ké từ khi bị nhiễm [34]

Sự đa dạng của các biểu hiện lâm sàng do nhiễm EV71 từ bệnh tay chânmiệng nhẹ đến viêm não gây tử vong, đã chứng tỏ sự phức tạp của bệnh do EV71gây ra EV71 gây rối loan thần kinh chủ yếu là thông qua cảm ứng của viêm thầnkinh trung ương Mặc dù sinh bệnh học của EV71 liên quan đến các bệnh thần kinh

đã được nghiên cứu sâu, các cơ chế của EV71 trong quá trình phát triển của bệnhvẫn chưa rõ ràng Ban đầu, quá trình nhân lên của vi rút có thể xảy ra trong ruột, vì

vi rút có thể được phát hiện trong phân trong vài tuần sau khi nhiễm bệnh Khả năngEV71 xâm nhập, lây nhiễm và nhân lên trong tế bào thần kinh trung ương đã đượcchứng minh rõ ràng, như kháng nguyên vi rút đã được phát hiện trong tế bào chấtcủa tế bào thần kinh Các mục tiêu chính của EV71 trong hệ thần kinh trung ương là

tủy sống và não [35]

Cơ chế xâm nhập của vi rút vào thần kinh trung ương sau khi nhân rộng

trong các mô ngoại vi hiện tại vẫn chưa biết Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng quátrình nhiễm vi rút trong máu cần thiết cho sự lây lan của vi rút vào hệ thần kinh

trung ương, ví dụ, những con khi được lây nhiễm EV71 qua đường tiêm tĩnh mach,

tiêm 6 bụng hoặc đường uống cũng phát triển hội chứng thần kinh lâm sang và bệnh

lý tương tự như trường hợp người mắc bệnh viêm não Wong và cộng sự đã kiểmtra việc phân phối các phản ứng viêm trong các trường hợp viêm não do EV71 ởcon người Dựa trên các đáp ứng viêm khác nhau được tìm thấy trong hệ thần kinh

trung ương (tủy sông, não, vùng dưới đôi, và hạt nhân dưới đồi và răng, các tác giả

cho rằng vi rút lây lan vào thần kinh trung ương thông qua hệ thống thần kinh ngoại

biên, rất có thê thông qua con đường vận động Tuy nhiên, vẫn còn nhiều giả thuyết

về sự lây lan của vi rút vào hệ thần kinh trung ương vẫn chưa được xác định một

cách rõ ràng [36].

Các yeu tố như độc lực vi rút, sự phân phối của các thụ thé và hệ thống miễn

dịch trên tế bào chủ có thể đóng góp vào quá trình phát triển của bệnh viêm não và

13

là yếu tố chịu trách nhiệm chính trong quá trình quan sát sự khác biệt trong các biéuhiện lâm sàng khi bị nhiễm EV71 Một nghiên cứu di truyền ở Đài Loan báo cáorằng HLA-A33 có liên quan đến việc cơ thé dễ bị nhiễm EV71, mặc dù vai trò củaMHC vẫn chưa được biết đến Các nhà nghiên cứu lưu ý rằng HLA-A33 xuất hiện ởngười châu A thường xuyên hơn người da trắng, điều này có thé giải thích cho sựphô biến của dịch bệnh EV71 ở châu A Họ cũng cho rằng HLA-A2 có thé đượcliên kết với những rủi ro về tim ở những bệnh nhân bị nhiễm EV71 [37].

Vai trò của các yếu tô trên tế bào chủ có liên quan đến bệnh viêm não do

EV71 đã được đề xuất bởi một số phát hiện Trẻ em bị viêm não dẫn đến phù phổi

đã kích hoạt cytokine một cách bất thường để tạo ra các đáp ứng đối với các phảnứng viêm nghiêm trọng Bệnh nhân thần kinh phù phổi đã được tìm thấy có nồng độ

cao hơn đáng kê của interleukin-6 (IL-6), IL-10, IL-13, IL-IB va interferon (IFN) —

y; các tế bào T CD4 +, tế bào T CD8 + và tế bào diệt tự nhiên (NK) có nồng độ thấp

hơn so với các trường hợp EV71 khác Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trẻ em vớiviêm não màng não có đáp ứng miễn dịch tế bao bị thay đổi cùng với tan số xuất

hiện cao của kiểu gen G/G trong các tế bào lympho T gây độc tạo thành các khángnguyên đa hình [38] Số lượng tế bào B tăng đáng ké cũng gan liền với sự phát triểncủa các biểu hiện thần kinh ở trẻ em nhiễm EV71 [39]

1.3 Các cơ chế miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của EV71

Hệ đáp ứng miễn dịch là một hang rào bảo vệ cơ thể chống lại vi rút vô cùng

quan trong thông qua việc nhận diện kháng nguyên vi rút Ngay khi xâm nhập vào

cơ thé, các tế bào trình diện kháng nguyên đã nhận diện tác nhân thông qua nhiềuloại thụ thể nhận dạng (PRR) khác nhau như TLR (Toll-like receptor), NOD

(nucleotide oligomerization domain-like receptor) và RIG-I (retinoic acid-inducible

gene I-like receptor) Các thụ thé này hoạt hoá các tế bào trình diện kháng nguyên

bằng cách tăng cường biểu hiện các phân tử bề mặt dẫn đến việc sản xuất các

cytokine va chemokine tiền viêm và sau đó kích hoạt các chuỗi tín hiệu nội bao phíasau Các cytokine do các tế bào tua (DC) tiết ra rất quan trọng trong việc hoạt hoá

14

các đại thực bào và có thể xa hơn là kích hoạt các tế bào T trợ giúp (Th) và T gây

độc (T‹) cũng như kích hoạt đáp ứng miễn dich dịch thê để trung hoà vi rút [40]

EV71 có khả năng trốn tránh hệ thống miễn dich bam sinh khá hiệu qua Đặcbiệt là việc khoá các chuỗi tín hiệu từ các thụ thể nhận dạng và tín hiệu của

Interferon (IFN) tuýp I thông qua các protease khác nhau như 2A, 3C, 2C và 3D

[41] Protein 2A gây ảnh hưởng đến sự đáp ứng của chất kháng vi rút IEN tuýp Ibang cách phân cắt MDAS trong các tế bào bị lây nhiễm, điều này dẫn đến ức chếyêu tố điều hoà interferon (IRF) số 3 thông qua tín hiệu MAVS và giảm sản sinh

IFN-ơ/B [42, 43] Protein 3C của vi rút ngăn cản sự kết hợp của MAVS va MDAS,

ngăn sự sản sinh IEN-B thông qua con đường TRIF (TIR-domain-containing

adapter-inducing interferon-B) khi TLR3 được hoạt hoá Protein 2A và 3C được biết

là can thiệp đến việc tập hợp các chất gây viêm thông qua phân cắt NLRP3 còn

protein 3C ức chế sản sinh IFN-B bang cách kết hợp với NLRP3 Ngược lại, việc

tập hợp các chất gây viêm hỗ trợ sự gan kết của protein 3D và NLRP3 dẫn tới sản

sinh IFN-B.

Cơ chế làm thé nào hệ miễn dich bam sinh phát hiện sự xâm nhiễm củaEV71 và kích hoạt đáp ứng miễn dịch kháng lại vi rút và một số thụ thể quan trọngtrong sự xâm nhiễm của vi rút đã được khám phá Vi rút được biết thông qua các

thụ thé SCARB2 (Scavenger Receptor Class B Member 2) và PSGL-1 (P-selectin

glycoprotein ligand-1) dé bắt đầu sự xâm nhiễm Một số phân tử bề mặt tế bào khác

như sialylated glycans, nucleolin va heparan sulphate glycosaminoglycan cũng

được biết là có vai trò trong tăng cường sự lây nhiễm trong tế bào động vat hữunhũ TLR3 được biết là yếu tố nhận diện sự xâm nhiễm của EV71 và kích hoạt sản

sinh IEN-B tuýp I Protein 2A được chứng minh là đã làm giảm sự sản sinh IFN-B

tuýp I thông qua việc phân cắt NLRP3 [44] (Hình 1.6)

15

Hình 1.6 Vai trò của miễn dich bam sinh va miễn dịch thích ứng trong sự xâm

nhiễm của EV71 [46]

Đối với hệ thống miễn dịch thích ứng, sự cảm ứng tế bào B và T phụ thuộcvào sự hoạt hoá của các tế bào trình diện kháng nguyên Các tế bao DC đóng vai tròquan trọng trong việc khởi động và kết nối hệ miễn dịch bam sinh và miễn dichthích ứng thông qua nhận diện kháng nguyên của vắc xin Tế bào B có vai trò chủyếu trong việc sản sinh kháng thé gắn kết đặc hiệu với vi rút Tế bao gây độc T CD8

có vai trò hạn chế sự lây lan của vi rút băng cách tiêu diệt các tế bào đã bị lây nhiễm

trong khi tế bào T CD4 cần thiết trong việc cảm ứng kháng thể ái lực cao và tạo ra

16

các tế bào nhớ miễn dịch (Hình 1.6) Việc bảo vệ lâu dài đòi hỏi sự hiện diện 6nđịnh của kháng thể trên ngưỡng bảo vệ và tạo được phản ứng của các tế bào nhớ khi

vi rút xâm nhiễm sau đó.

Đối với EV71, miễn dịch tế bào có vai trò hơn trong biểu hiện lâm sàng củabệnh hơn là miễn dịch dịch thể Các nghiên cứu chỉ ra rằng khi miễn dịch tế bàogiảm và IFN-y thấp hơn có tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh, trongkhi không có sự khác biệt trong kháng thể trung hoà giữa các ca bệnh nhẹ, nghiêmtrọng thậm chí là tử vong [45, 46] Các tế bào CD4 và CD8 được hoạt hoá làm sản

sinh IEN-y đã cho thấy chúng tạo ra sự bảo vệ miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của

EV71 Một nghiên cứu khác cũng cho thấy việc nhiễm EV71 làm tăng số lượng các

tế bào CD4 và CD8 đi kèm với sự gia tăng biểu hiện của các gen mã hoá cytokinenhư IFN-y, IL-2, IL-10 cho thấy tế bào CD4 và CD§ có vai trò như nhau trong hoạtđộng kháng lại vi rút [47] Tuy nhiên, Tan và cộng sự đã báo cáo rằng trong 4

protein cấu trúc của EV71, chỉ có VP2 mang những peptide miễn dịch phân bé rộngthúc đây đáp ứng của tế bào T với EV71 và chủ yếu là các tế bào CD4 tiết IFN-y

Sự đa dạng trong phân bổ các vùng có tính kháng nguyên với tế bào T trên VP2năm từ đầu N đến đầu C của phân tử protein này Epitope đối với tế bào CD4 ở VP2

nhiều hơn so với ở VP1, VP3 hay VP4 [48]

Các cytokine IL-2, IL-4, IL-10 và IFN-y có vai trò quan trọng trong đáp ứng

miễn dịch với EV71 [49] Việc sản sinh nhiều cytokine tiền viêm như IFN-y, IL-8,IL-17 cũng có thé làm bệnh trở nên trầm trong Cũng có báo cáo cho thay mức IFN-

y do tế bào Th1 tiết ra đặc biệt cao ở ở các bệnh nhân TCM nhẹ va nặng trong khiIL-17 do tế bào Th17 tiết ra đạt cao nhất ở các bệnh nhân nặng Điều này cho thayviệc mat cân bang trong tỷ lệ Th1/Th2 và Th17/T điều hoà có liên quan đến tính

sinh bệnh của EV71 [50].

Bên cạnh tế bào T, đáp ứng kháng thé cũng góp phan quan trọng không kém

trong việc kháng lai vi rút Hiệu giá kháng thé trung hoà cao kết hợp với sản sinh

IFN sau khi tiêm vac xin có thé giúp bảo vệ 100% số chuột trong thí nghiệm thử

thách [51].

17

1.4 Dịch tễ học phân tử của EV71

1.4.1 Trên thé giới

Sự lưu hanh của các dòng EV71 ở những vùng địa lý khác nhau đã được

công bố trong rất nhiều nghiên cứu từ năm 1960 Thành viên duy nhất của vi rútEV71 nhóm A, chủng BrCr, được xác định vào năm 1970 tại Mỹ va hau như biếnmat sau đó Năm 2008, chúng xuất hiện trở lại ở An Huy, Trung Quốc và dan lanrộng ra nhiều tỉnh ở đất nước này [52] Hai nhóm gene EV71 chính (B và C) chịu

trách nhiệm cho hau hết các trận dịch tay TCM trên thé giới Sự đồng lưu hành của

chúng đã dẫn đến sự tái tổ hợp di truyền, làm xuất hiện các kiểu gene mới, từ đó,gây ra các trận dịch với nhiều quy mô khác nhau

Ở nhóm gene B, các kiểu gene BI và B2 có 12% khác biệt về nucleotide, lưu

hành mạnh vào những năm 1970 và 1980 Trong khi đó, kiểu gene B3 và B4 nổi lên

ở Đông Nam A từ năm 1997 Kiểu gene B5 lần đầu tiên được phân lập tại Nhật Bản

và Malaysia vào năm 2003 Đây được xem là căn nguyên tạo nên vụ dịch ở Brunel,

Sarawak và Đài Loan năm 2006 [3] So với các phân nhóm khác, vi rút mang kiểugene B5 thê hiện sự khác biệt lớn hơn giữa các dòng tách biệt về mặt không gian.Đặc biệt, từ năm 2007, hai biến thể chính của B5 đã được ghi nhận ở Malaysia và

Đài Loan.

Ở nhóm gene C, phân nhóm C1 đã lưu hành rộng rãi trên thé giới kê từ lầnđầu tiên được phát hiện ở Úc vào năm 1986 và đã gây ra dịch bệnh hàng loạt tại Úc,Malaysia và Singapore [53] Năm 1996, tất cả các dong Cl xuất hiện trước đó đềubiến mất, ngoại trừ một dòng được đưa vào Malaysia Và đây cũng là nguồn gốc

của các vi rút C1 được phát hiện tai Châu Âu và Đông Nam Á sau này Phân nhóm

gene C2 cũng đã xuất hiện vào năm 1995 và dan thay thé cho C1 tại châu Âu TạiChâu Á, phân nhóm gene C3 được phân lập tại Nhật Bản vào năm 1994 và tại HànQuốc năm 2000 [54] Từ năm 1997, C4 được xem là kiểu gene chiếm ưu thế và lưuhành liên tục ở Trung Quốc trong hơn 14 năm Trong quá trình đó, kiểu gene này đãliên tục tiến hóa, gây ra sự gia tăng liên tục trong việc tích lũy thay thế các protein

phi cấu trúc, từ đó đã phát triển thành 2 dòng chính là C4a và C4b Ngày càng có

18

nhiều bệnh nhân TCM với các biến chứng thần kinh gây tử vong ở khắp Trung

Quốc từ năm 2007, trong đó nguyên nhân chủ yếu là do kiểu gen C4a Nhóm gen

C4 cũng được ghi nhận tại một số quốc gia khác như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài

Loan, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam và một số khu vực của châu Âu Bên cạnh

đó, nhóm gene C5 chủ yếu được ghi nhận tại Việt Nam và Đài Loan [3]

Sự chuyên đổi kiểu gene giữa các kiểu gene EV71 thường xảy ra đồng thờivới các đợt bùng phát dịch ở khu vực Châu Á-Thái Bình Dương [54] Điển hình

như tại Dai Loan, trong trận dịch TCM năm 1998, vi rút EV71 có kiểu gene C2

chiếm 90% và kiểu gene B4 chỉ chiếm 10%, tuy nhiên, đến năm 2000 và 2001, B4

lại là kiểu gene chiếm ưu thế Điều thú vị là trình tự của B4 ở các trận dịch này

tương tự nhau, do đó có thê thấy đã có sự thay đổi giữa các kiểu gene từ C2 sang

B4 Kiểu gene chiếm ưu thế trong các đợt dịch năm 2004 và 2008 đã lần lượt thay

đổi từ B4 sang C4 và từ C4 thành B5 Tương tự, thứ tự thay đổi kiểu gene đã được

ghi nhận ở Nhật Bản với các kiểu gene C2, B4, C4 và BS (Hình 1.7)

EV71 được biết là tác nhân chính gây bệnh TCM, thường chiếm tỷ lệ 30%

-50% các ca tay chân miệng Ngoài EV71, tác nhân phổ biến gây bệnh TCM còn có

19

nhóm Coxsackievirus mà phổ biến là các chủng Al6, A6 bên cạnh một số chủngkhác [55, 56] Trước thời điểm năm 2016, khi vắc xin EV71 chưa được đưa vào sử

dung ở Trung Quốc, các thông kê cho thấy EV71 chiếm tỷ lệ vượt trội so với các

tác nhân khác Tuy nhiên khi vắc xin được đưa vào sử dụng ở Trung Quốc, tỷ lệnhiễm EV71 vẫn ở mức cao tuy nhiên đã giảm đáng ké so với trước khi áp dung vacxin và giảm các ca bệnh nghiêm trọng và tỷ lệ tử vong, độ tuôi trung bình mắc bệnhtăng lên [55] Việc sử dung vac xin ở Trung Quốc tuy làm giảm tỷ lệ nhiễm EV71(có nơi ghi nhận xuống thấp nhất là gần 2%) [57] nhưng lại làm tăng tỷ lệ

Coxsackievirus A16 (từ thấp nhất là 10% lên cao nhất 49%) các Coxsackievirus

khác (đến 88%) [58-62] Điều này cho thấy sự cần thiết đưa vào sử dụng một vac

xin da giá trong việc phòng ngừa bệnh TCM.

1.4.2 Dịch té học bệnh ở Việt Nam

Tại Việt Nam, EV71/C4 được phân lập lần đầu tiên trên một bệnh nhân viêmnão cấp ở miền Bắc vào năm 2003 Năm 2005, các kiểu gen C1, C4 và C5 cũng đãđược ghi nhân trong một đợt dich TCM ở miền Nam với 51 trường hợp bị biếnchứng thần kinh và 3 trường hợp tử vong [6] Bốn loại vi rút mang kiểu gen C1 xuất

hiện trong giai đoạn này được xác định cùng chung nhóm với trình tự Cl ở châu

Au, do đó các chủng C1 này có thé đã xâm nhập trực tiếp vào Việt Nam và lưu hànhvới tỉ lệ thấp trong dân số từ trước [7] Tình hình dịch càng trở nên nghiêm trọng vàlan rộng hơn trong giai đoạn 2011-2013 với hơn 300.000 ca mắc và 225 ca tử vong

[63] Trong giai đoạn này, EV71 C4 và B5 là hai kiểu gene chính lưu hành ở Việt

Nam Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy kiểu gene C4 có khả năng bắt nguồn

từ Trung Quốc, trong khi kiểu gene B5 có liên quan chặt chẽ với các trình tự vi rút

thu thập được ở Malaysia và Đài Loan, và có khả năng vào Việt Nam năm 2010

(2-3 năm sau C4) Nhóm gene BS là nguyên nhân cua sự bùng phát lớn của Malaysia

năm 2006, và sự xuất hiện của nó ở Đài Loan năm 2008 đã dẫn đến sự bùng phát

dich TCM lớn nhất khu vực trong 11 năm Một nhánh nhỏ của kiểu gene C5 cũngđược tìm thấy và có liên quan chặt chẽ với một đợt dịch trước đó vao năm 2005 tại

Việt Nam Bên cạnh đó, các trình tự C5 thu nhận ở Đài Loan, Thái Lan, Singapore

20

và Phần Lan dường như có nguồn gốc từ Việt Nam [7] Điều này cho thấy C5 là

chủng đặc hữu của Việt Nam trong thập kỷ qua và đã du nhập định kỳ sang các

nước châu Á khác Tuy nhiên, sự lưu hành của C5 bên ngoài Việt Nam hạn chế và

lẻ tẻ Do tính chất đặc hữu của C5 ở Việt Nam, sự đa dạng di truyền tương đối đượcước tính cho bộ dit liệu toàn cầu phan lớn có nguồn gốc từ Việt Nam với biến độngnhỏ hai năm một lần

Một nghiên cứu khác về sự lưu hành các kiểu gene của vi rút gây bệnh TCM

ở tỉnh Đắk Lắk cũng cho thấy kiêu gene EV71/C4 chiếm ưu thế trong năm

2011-2013 và sau đó được thay thé bang kiểu gene B5 Kiểu gene B5 chiếm ưu thế giữa

năm 2014 và 2015, và sau đó C4 được tái xuất hiện vào năm 2016 [8] Tại khu vựcphía Nam Việt Nam cũng cho thấy có sự thay đôi các chủng lưu hành từ kiểu geneC4 ở giai đoạn 2011-2012 sang kiểu gene B5 ở giai đoạn 2013-2016 Sự chuyên đôi

từ C4 sang B5 ở Việt Nam có thé ngụ ý rang sự lưu hành của C4 không cung cấp

khả năng bảo vệ chéo lâu đài đối với kiêu B5 và khả năng miễn dịch ở người nhiễm

bệnh có thé thúc đây su chuyén đổi kiéu gene Bên cạnh đó, việc chuyên sang BShầu như chưa gây ra một trận dịch lớn nảo như đã xuất hiện trong năm 2011 và

2012 [64] Các thống kê tại Việt nam cho thấy từ năm 2018 trở lại đây, kiểu genecủa EV71 lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là C4 với 90% các trường hợp EV71 và

BS lưu hành rải rác với 10% [56, 64].

Vào năm 2022, kết qua thử nghiệm lâm sàng vac xin EV71 dựa trên chủngB4 của Đài Loan tại Việt Nam đã được công bố Thử nghiệm được thực hiện trênđối tượng trẻ em từ 2 — 71 tháng tuổi tại Việt Nam va Đài Loan Kết quả cho thaytính an toàn và hiệu quả của vac xin trong phòng ngừa bệnh TCM bao gồm cả trẻ sơ

sinh từ 2 — 5 tháng tuổi, đối tượng thường có ty lệ bệnh nghiêm trọng và tử vongcao nhất Vắc xin cho thấy có khả năng bảo vệ lại các chủng EV71 B4, B5 và C4

trong vòng ít nhất là 1 năm Việc đánh giá hiệu quả vắc xin cho thấy trẻ tiêm vắcxin được bảo vệ trong khu vực lưu hành bệnh từ cuối năm 2020 đến đầu năm 2021.Các ca ghi nhận nhiễm EV71 chủng C4 và B5 đều nằm trong nhóm giả được [65]

21

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vac xin EV71

Đến nay, đã có rất nhiều loại vac xin EV71 được nghiên cứu và công bốthành công như vắc xin virion bất hoạt, vắc xin peptide tổng hợp, vắc xin tái tổ hợp,vắc xin VLP (virus-like particle)

1.5.1 Vite xin toàn phan bat hoạt

Vac xin toàn phan bat hoạt thu hút nhiều sự quan tâm hon từ các nha nghiêncứu trên thế giới vì một số ưu điểm như tính an toàn cao và khả năng miễn dịch tốt

Hơn nữa, loại vắc xin này còn có thé được phát triển nhanh hơn nhờ vào việc tham

khảo các công nghệ hiện có của vac xin bất hoạt phòng bệnh bại liệt và viêm gan A[66, 67] Vắc xin giảm độc lực được phát triển bởi nhóm nghiên cứu Shimizu củaNhật Bản đã được chứng minh có thể tạo ra kháng thể trung hòa một loạt các kiểu

gene khác nhau của EV71 ở khi đuôi dai nhưng một số triệu chứng về thần kinh nhẹ

vẫn được tìm thấy Những lo ngại về khả năng gây độc trở lại của vac xin sông

giảm độc lực làm cho vắc xin bất hoạt trở thành sự lựa chọn hấp dẫn hơn dé pháttriển vac xin EV71 Một số vac xin bat hoạt ngừa vi rút EV71 đang được phát triển

tại một số quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan, Singapore, Hàn Quốc, Thái Lan

đã đạt được một số thành tựu nhất định [67-69]

Hiện tại, ở Hoa Kỳ, cơ quan quản lý thực phẩm và được phẩm của Hoa Kỳ

(US FDA) vẫn chưa phê chuẩn có một vắc xin EV71 nào cho nước này do sự longại về hiệu quả đối với các chủng gây dịch khác nhau, tính an toàn và kiểm soátchất lượng của quy trình sản xuất Tuy nhiên hiện đã có 3 vắc xin EV71 toàn phần

bat hoạt được Cơ quan quản lý dược pham quốc gia Trung Quốc (NMPA) cấp phép

và đã được thương mại hoá ở Trung Quốc Đó là các vac xin EV71 bat hoạt bằng

formalin do Sinovac Biotech, Beijing Vigoo và Viện học thuật Trung Quốc về Khoa

học Y khoa (CAMS) phát triển Các vac xin này đều sử dụng chủng C4, là chủnggây bệnh phô biến ở Trung Quốc [70]

Trong các thử nghiệm lâm sàng trên diện rộng, vắc xin cho thấy có đáp ứng

miễn dịch, an toàn và có khả năng bảo vệ ở hầu hết trẻ được tiêm chủng Tuy nhiên,

thời gian bảo vệ sau khi tiêm ngừa của những vac xin này bi hạn chê.

22

Đáp ứng miễn dịch do EV71 C4a có thé tạo ra sự bảo vệ chéo phổ rộng đốivới các kiểu gene B và C nhưng không đủ dé bảo vệ hoàn toàn chống lại các chủngmang kiểu gen A Hơn nữa, hiệu quả bảo vệ của các loại vắc xin này đối với cáckiểu gene EV71 lưu hành ở các khu vực khác như Ấn Độ, Châu Phi, vẫn chưađược xác định Bên cạnh đó, những vắc xin này cũng không có hiệu quả đối với cáctác nhân gây TCM dang quan tâm khác như CA16 và CA6 Do đó, các vac xin nàythường có hiệu quả kém đối với các trường hợp TCM do các chủng CA16 và CA6riêng lẻ hoặc liên kết với EV71 gây ra Những kết luận tương tự có thể được rút ra

đối với các loại vac xin đơn giá (monovalent) dựa trên chủng EV71 B3 và B4 tương

ứng được sản xuất tại Singapore và Đài Loan Vắc xin bất hoạt đa giá (multivalent)được xem là một đối tượng tiềm năng có thể khắc phục được những vấn đề này.Vac xin toàn phần chứa EV71 và CA16 dựa trên tá chất nhôm đã được thử nghiệmtrên chuột và đã cho thay c6 kha nang bao vé chống sự nhiễm trùng nặng do hai loại

vi rút này [52] Tuy nhiên, hiện nay sự kết hợp hiệu quả giữa các chủng vi rút vẫn

chưa được thiết lập Do đó, cần có thêm những nghiên cứu chuyên sâu để có thể tạo

ra một loại vắc xin phổ rộng và hiệu quả bảo vệ lâu dài

Ở Đài Loan, Viện nghiên cứu Sức khoẻ quốc gia (NHRI) sử dụng chủng B4

dé sản xuất vac xin EV71 toàn phan bat hoạt [71] Thử nghiệm lâm sàng pha 1 với 2

liều kháng nguyên 5ug và 10ug cho thấy vac xin kích hoạt tạo kháng thé kháng

EV71 mà không có phan ứng phụ Kháng thể được tao ra ở phan lớn đối tượng thamgia nghiên cứu thé hiện khả năng miễn dịch chéo với các nhóm chủng BI, B5 và C4[72] Thử nghiệm lâm sang pha 2 sau đó cũng cho thấy vac xin tạo được kháng thé

kháng lại các chủng B4, B5, C4a, C4b và C5 mà không có các phản ứng phụ

nghiêm trọng [73] Hiện tại vắc xin đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 ở

nhiều quốc gia và dự kiến hoàn thành vào năm 2023

Tại Hàn Quốc, Viện nghiên cứu sức khoẻ quốc gia cũng phát triển vắc xinEV7I toàn phan bat hoạt dựa trên chủng C4a phân lập từ 1 bệnh nhân Hàn Quốc.Vắc xin cho đáp ứng miễn dịch mạnh ở chuột và hiện đang bước vào pha 1 của thử

nghiệm lâm sàng [74].

23

Thái Lan cũng đã có sự phát triển sớm vac xin EV71 bất hoạt với việc sửdụng chủng C4 tăng sinh trên tế bào Vero trong hệ thống chai xoay Vi rút tinh chế

và bat hoạt có thé cảm ứng kháng thé trung hoà kháng EV71 ở chuột Sản pham ban

đầu này sẽ hướng đến việc phát triển thành 1 ứng cử viên vac xin ngừa EV71 [75]

1.5.2 Vắc xin vi rút sống giảm độc lực

Vắc xin vi rút sống giảm độc lực có lợi thế là đáp ứng miễn dịch kéo dài vàchi phí sản xuất thấp hơn Tuy nhiên cơ chế sinh bệnh học phân tử hiện chưa được

hiểu rõ hết, các yếu tố quyết định độc tính của vi rút chưa hoàn toàn được loại bỏ

Một vài yếu tố quyết định độc tính của vi rút đã được xác định như UTR đầu 5’, các

vùng VPI, VP2, 2A, 3C và 3D [54] Một trong những yếu tố quyết định độc tính

quan trọng là acid amin tại vị trí 145 của VPI Việc thay đổi từ glutamine sang

glutamic acid tại vị tri này làm tăng độc tính trên khỉ [76] Vùng có cau trúc tô chức

cao UTR đầu 5’ đóng vai trò quan trọng trong việc dich mà và độc tính của vi rút

Việc thay thế cytosine thành uridine ở vị trí 158 trong vùng stem-loop II của UTRđầu 5’lam giảm sự dịch mã và độc tính trên mô hình chuột [77]

Một ứng cử viên vac xin EV71 khác mang đột biến nhạy cảm với nhiệt độ cótên S1-3’ cho thay khả năng cảm ứng đáp ứng miễn dịch hiệu quả trên khi Tuynhiên chủng này lại gây ra một số triệu chứng thần kinh trên khi Điều này làmngười ta lo ngại về tính an toàn của vac xin này [78]

1.5.3 Vac xin VLP (virus-like particle)

VLP là một loại vac xin hứa hen do nó có hình dang và tính kháng nguyêncủa vi rút thật Vắc xin VLP có thể kích hoạt đáp ứng miễn dịch tự nhiên cũng như

miễn dịch thích ứng và an toàn hơn do không mang bộ gen vi rút nên chúng không

thể nhân lên trong tế bào chủ Cùng với sự thành công của vắc xin VLP ngừa viêm

gan B và papillomavirus ở người đã được cấp phép và thương mại hóa [79], xu

hướng vac xin VLP-EV7I sản xuất từ baculovirus ngày càng được nghiên cứu rộngrãi Dé sản xuất vac xin VLP cho EV71, tế bào côn trùng được gây nhiễm vớibaculovirus tái tổ hợp cùng biểu hiện vùng P1 và 3 CD protease từ các promotor

24

khác nhau Vùng P1 được 3 CD protease phân cắt tạo thành vỏ capsid của vi rút từVP1 đến VP4 Vac xin VLP EV71 từ baculovirus thể hiện khả năng bảo vệ khitránh khỏi sự xâm nhiễm của EV71 cho thấy đây là một ứng cử viên vac xin hứahẹn Tuy nhiên, hàm lượng VLP thu hoạch được thấp do sự phân huỷ của chúng.Nhằm tăng năng suất và độ tinh sạch, Zhao và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc

ký để tinh chế qua nhiều cột như Capto Core 700, Capto Adhere resin và CaptoButyl của hãng GE Healthcare [80] Việc trải qua nhiều bước sắc ký như vậy đạtđược độ tinh sạch trên 95% nhưng hiệu suất chỉ đạt 31,52% Một trong những yếu

tố cần lưu ý là sự biến đổi sau dịch mã glycosyl hoá, việc này đóng vai trò quan

trọng trong tính sinh miễn dịch của kháng nguyên VLP của HBV được xử lý thêm

các vị trí glycosyl hoá đã cảm ứng tăng cường tính sinh miễn dich [81] Zhang và

cộng sự đã cải tiến tăng năng suất bang cách biểu hiện VLP EV71 trên nam menPichia pastoris [82] VLP EV71 thu được cao và có khả năng cảm ứng kháng thétrung hoà kháng lại nhiều chủng EV71 trên mô hình chuột Quan trong hơn nữa là

việc gây đáp ứng miễn dịch cho chuột mẹ đã bảo vệ chuột con trong thí nghiệm thử

thách với chủng EV7I gây chết

Các nhóm của Tsol và Yan đã sử dụng hệ thống Adenovirus và vi rútVesicular stomatitis để biểu hiện VLP EV71 trên tế bào động vật Cả hai loại VLP

đều tạo ra được kháng thể kháng lại EV71 ở chuột [83, 84]

Bệnh tay chân miệng là bệnh lây nhiễm mạnh chủ yếu do các tác nhân

EV-71 và các Coxsackievirus A6 (CVA6), A10 (CVA10) và A16 (CVA16) gây ra Tuy

nhiên vac xin EV71 toàn phần bat hoạt hiện tại đều không cho bảo vệ chéo với cácEnterovirus gây bệnh tay chân miệng còn lại Để phát triển một vắc xin đa giáphòng bệnh tay chân miệng, Zhang và cộng sự đã sử dụng hệ thong Baculovirusnhằm tạo ra VLP tái tổ hợp của EV71, CVA6, CVA10 và CVA16; sau đó kết hợpchúng lại tạo thành một vắc xin VLP tứ giá có khả năng bảo vệ chuột khỏi sự xâm

nhiễm riêng lẻ hay cùng lúc 4 chủng Đây cũng là một ứng cử viên hứa hẹn cho việc

sản xuất vac xin TCM [85]

25