nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép cyprinus carpio trong nito lỏng

Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, chất chống đông, quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng.. Các yếu tố

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi

TÓM TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 3

1.1.4 Đặc điểm sinh thái 4

1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản 4

1.2 Đại cương về tinh trùng 4

1.2.1 Quá trình tạo tinh trùng 4

1.2.1.1 Giai đoạn tăng sinh 4

1.2.1.2 Giai đoạn sinh trưởng 5

1.2.1.3 Giai đoạn thành thục 5

1.2.2 Cấu tạo tinh trùng 5

1.2.2.1 Phần đầu 6

1.2.2.2 Phần cổ 6

1.2.2.3 Phần đuôi 6

1.2.3 Đặc điểm sinh học của tinh trùng 6

1.2.3.1 Kích thước và số lượng 6

1.2.3.2 Đặc điểm vận động 7

1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam 16

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Cá đực và vuốt tinh 19

2.2.1.1 Cá đực 19

2.2.1.2 Vuốt tinh 19

2.2.2 Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh dịch cá 19

2.2.2.1 Màu sắc tinh dịch 19

2.2.2.2 Thể tích tinh dịch 19

2.2.2.3 Kiểm tra hoạt lực tinh trùng 20

2.2.2.4 Kiểm tra mật độ tinh trùng 21

2.2.3 Bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng 22

2.2.4 Ảnh hưởng của chất bảo quản và chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh 22

2.2.5 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 24

2.2.6 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 25

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 26

3.2 Ảnh hưởng của chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh 27

3.3 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến kết quả bảo quản tinh 29

3.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 30

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 32

4.1 Kết luận 32

4.1.1 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 32

4.1.2 Ảnh hưởng của chất chống đông lên bảo quản tinh 32

4.1.3 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 32

4.1.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên chất lượng tinh bảo quản 32

4.2 Đề xuất ý kiến 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 2.1 Chiều dài, khối lượng, thể tích tinh dịch, màu sắc tinh dịch của

Bảng 2.2 Hoạt lực ban đầu của tinh trùng……….… 21 Bảng 2.3 Mật độ trung bình tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm (*109 tb/ml) 22 Bảng 2.4 Thành phần các ion trong dịch tương của một số loài cá [56] … 23 Bảng 2.5 Thành phần các chất bảo quản được sử dụng cho nghiên cứu… 24

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình dạng ngoài cá chép [57]…… ……….…… 3

Hình 1.2 Cấu tạo tinh trùng [44]……… 5

Hình 2.1 Quy trình nội dung nghiên cứu ……… 18

Hình 2.2 Các quy trình làm lạnh sử dụng cho thí nghiệm.… ……… 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh………… 26

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh… 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng của các quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 29

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh…… 30

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

CCSE: Common carp sperm chất bảo quản

DMSO: Dimethyl sunfoxide

TÓM TẮT

Bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng là phương pháp đã và đang được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều quốc gia bởi vì lợi ích của chúng trong công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gen Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, chất chống đông, quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng Về thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất: tinh trùng được pha loãng trong các chất bảo quản (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 hoặc CCSE-4 và bổ sung 10% DMSO như là chất chống đông ở tỉ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng) Về thí nghiệm tìm ra chất chống đông tốt nhất: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung các chất chống đông như là DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol, và Methanol ở nồng độ là 10% với tỷ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng) Thí nghiệm về chất bảo quản và chất chống đông được bảo quản theo qui trình: hơi nitơ lỏng -76 o C khoảng 6 phút và sau đó cho thẳng xuống nitơ lỏng -196 o C Thí nghiệm về quy trình làm lạnh: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung DMSO ở nồng độ 10% như là chất chống đông, sau đó tiến hành bảo quản theo ba quy trình: (1) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -20◦C trong 3 phút rồi chuyển xuống -76◦C trong 3 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (2) đưa các cọng

rạ xuống nhiệt độ -76◦C trong 6 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (3) đưa thẳng các cọng rạ vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C Kết quả thí nghiệm cho thấy chất bảo quản CCSE-2, chất chống đông là DMSO ở nồng độ 10%, và quy trình làm lạnh (2) cho kết quả tốt nhất Kết quả thí nghiệm này góp phần cung cấp thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng

Từ khóa: Cá chép, Cyprinus carpio, chất bảo quản, chất chống đông

MỞ ĐẦU

Bảo quản tinh có vai trò quan trọng trong các chương trình chọn giống và các chương trình bảo tồn nguồn gen của vật nuôi Bảo quản tinh sẽ góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di truyền phân tử áp dụng trong các chương trình chọn giống Nhờ bảo quản tinh có thể chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trường hợp có hiện tượng lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực

và cái Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác Ngoài ra, bảo quản tinh còn hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lượng di truyền do lai cận huyết [6] Hiện nay, bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là phương pháp đơn giản nhất của việc lưu trữ tinh trùng cá trong thời gian dài Từ các dữ liệu của Ashwood-Smith [13], Whittingham [52] và Stoss and Holtz [46] đã ước tính thời gian lưu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng là từ 200 đến 32.000 năm Thành công của việc bảo quản lạnh tinh trùng từ các loài cá biển đến các loài cá nước ngọt, Cloud và Patton [21] chứng minh rằng bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là một phương pháp có thể được sử dụng để bảo quản tinh trùng của nhiều loài cá

Cá Chép (Cyprinus carpio) là một trong những loài có giá trị kinh tế quan trọng

được nuôi ở khắp châu Á và châu Âu Sản lượng cá được nuôi toàn cầu chiếm khoảng 6,14% (3.172.488 tấn) tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới [22] Ở Việt Nam, cá Chép là đối tượng nuôi có giá trị thương phẩm, thịt thơm ngon

và được nuôi khá phổ biến [8]

Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh cá

Chép Cyprinus carpio được công bố rộng rãi với nhiều phương pháp bảo quản khác

nhau Tuy nhiên, hiện nay do quá trình di nhập cá Chép giữa các vùng trên cả nước

và di nhập cá Chép từ nước ngoài dẫn tới quá trình lai tạp xảy ra nhiều làm cho biến đổi nguồn gen, nên việc lưu trữ và bảo tồn giống thuần phục vụ công tác lai tạo, chọn giống là yêu cầu đặt ra của ngành thủy sản Bên cạnh đó, do đặc điểm sinh lý, hóa của mỗi loài cá khác nhau nên việc tìm ra quy trình bảo quản tinh thích hợp cho từng loài cá trong điều kiện cụ thể là rất cần thiết [39]

Và để góp phần cung cấp thêm thông tin về kỹ thuật bảo quản tinh cho các đối

tượng thủy sản, đề tài: “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus

carpio trong nitơ lỏng” được thực hiện

Đề tài thực hiện gồm những nội dung chính sau đây:

- Ảnh hưởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của chất chống đông lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của quy trình bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

- Ảnh hưởng của thời gian bảo quản trong nitơ lỏng lên hoạt lực tinh trùng Mục tiêu chính của đề tài là:

- Tìm ra một số dung dịch bảo quản và chất chống đông phù hợp với việc bảo

quản tinh trùng cá Chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam

- Góp phần bổ sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép

Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại Việt Nam

- Lưu trữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ cho công tác lai tạo

Do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình viết báo cáo không thể tránh thiếu sót Kính mong nhận được góp ý từ thầy, cô và các bạn để đồ

án được hoàn thiện hơn Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Thu Hiền

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trên thế giới: Cá chép (Cyprinus carpio) phân bố rộng khắp các vùng trên toàn

thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc [8]

Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tỉnh phía Bắc Việt Nam Cá có nhiều dạng hình như: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép đỏ, chép lưng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v [8]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Thân cá hình thoi, mình dây, dẹp bên Viền lưng cong, thuôn hơn viền bụng Đầu

cá thuôn, cân đối Mõm tù, lưng xanh đen, hai bên thân phía dưới đường bên vàng xám, bụng trắng bạc Gốc vây lưng và vây đuôi hơi đen Vây đuôi và vây hậu môn

đỏ da cam [8]

1.1.4 Đặc điểm sinh thái

Cá chép sống ở tầng đáy cá vực nước, nơi có nhiều mùn bã hữu cơ, thức ăn đáy

và cỏ nước Cá có thể sống được trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt, chịu đựng được nhiệt độ từ 0-40oC, thích hợp ở 20-27o

C [8]

1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản

Thức ăn của cá khá đa dạng như mảnh vụn thực vật, rễ cây, các loài giáp xác

(Copeporda, Decaporda, Gatstropoda), ấu trùng muỗi, ấu trùng côn trùng, thân

mềm Tuỳ theo kích cỡ cá và mùa vụ dinh dưỡng mà thành phần thức ăn có sự thay đổi nhất định Ngoài thức ăn tự nhiên có trong thuỷ vực thì cá còn ăn thức ăn nhân tạo như cám nổi [8]

Cá chép là loài có kích cỡ trung bình, lớn nhất có thể đạt tới 15-20kg Tốc độ tăng trưởng giảm dần theo chiều dài nhưng lại tăng dần theo trọng lượng [8]

Cá chép thành thục ở 1+

tuổi Sức sinh sản của cá lớn, khoảng 150.000-200.000 trứng/kg cá cái Mùa vụ sinh sản kéo dài từ mùa xuân đến mùa thu nhưng tập trung nhất vào các tháng xuân-hè khoảng tháng 3-6 và mùa thu khoảng tháng 8-9 Trứng

cá chép ở dạng dính.Trứng cá sau khi đẻ bám vào thực vật thuỷ sinh Ở các sông cá thường di cư vào các bãi ven sông, vùng nhiều cỏ nước Cá thường đẻ nhiều vào ban đêm, nhất là từ nửa đêm đến lúc mặt trời mọc hoặc đẻ nhiều sau các cơn mưa rào, nước mát [8]

1.2 Đại cương về tinh trùng

1.2.1 Quá trình tạo tinh trùng

Tinh trùng trước khi thành thục trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau cuối cùng mới phân hóa cao độ hình thành tế bào sinh dục đực hoàn thiện có năng lực thụ tinh Quá trình tạo tinh trùng của cá diễn ra trong tinh sào [5], bắt đầu từ tế bào sinh dục nguyên thủy và trải qua các giai đoạn sau:

1.2.1.1 Giai đoạn tăng sinh

Từ tế bào sinh dục nguyên thủy phân chia nguyên nhiễm nhiều lần tạo thành các tinh nguyên bào Tinh nguyên bào có một nhân to, chất nguyên sinh trong nhân phân

bố đều Đường kính của tinh nguyên bào dao động từ 9-16 µm [1]

1.2.1.2 Giai đoạn sinh trưởng

Ở giai đoạn này, chất dinh dưỡng do tinh nguyên bào hấp thụ được đồng hóa và chuyển thành nguyên sinh chất của tế bào Do đó tế bào sinh trưởng mãnh liệt, thể tích tăng lên và hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào cấp 1) Nguyên sinh chất trong nhân tế bào từ dạng hạt đã biến thành thể nhiễm sắc sợi mảnh hoặc thô chuẩn bị cho giai đoạn phân chia tiếp theo

1.2.1.3 Giai đoạn thành thục

Tinh bào sơ cấp trải qua 2 lần phân chia liên tục:

- Lần 1: Từ 1 tinh nguyên bào sơ cấp phân chia giảm nhiễm hình thành 2 tế bào thứ cấp Số lượng nhiễm sắc thể trong nhân giảm đi một nửa (thể đơn bội kép)

- Lần 2: Tinh bào thứ cấp phân chia nguyên nhiễm tạo nên 2 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n Như vậy, từ 1 tế bào sinh dục nguyên thủy sẽ tạo thành 4 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n Tinh tử trải qua các quá trình biến thái đặc biệt để hình thành nên tinh trùng

1.2.2 Cấu tạo tinh trùng

Tinh trùng của các lớp động vật khác nhau thì khác nhau khá nhiều về hình thái, tuy nhiên tất cả đều có nét chung về hình thái có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1] Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần cổ và phần đuôi

Hình 1.2 Cấu tạo tinh trùng [44]

1.2.2.1 Phần đầu

Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất di truyền vào trong trứng Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương đầu tinh trùng có cấu tạo đơn giản gần như hình tròn [1]

Đầu tinh trùng thường rất to so với các phần khác Trên cùng của đầu là thể đỉnh Thể đỉnh có hình như chiếc mũ trùm xuống phía dưới, trong nó chứa enzyme Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đường cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh Thể đỉnh do bộ máy Golgii tạo thành Nhân tinh trùng nằm dưới thể đỉnh, rất to và đơn độc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất khá mỏng [3]

1.2.2.2 Phần cổ

Phần cổ tương đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng Trong cổ chứa trung tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng

1.2.3 Đặc điểm sinh học của tinh trùng

1.2.3.1 Kích thước và số lượng

Kích thước của tinh trùng thường rất bé so với tế bào trứng của cùng 1 loài Ví dụ: Hầu 75µm, tôm He 10µm, cá Rô 20 µm,… [1]

Ngược lại với kích thước tinh trùng có số lượng vô cùng lớn Ví dụ: 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [3]

1.2.3.2 Đặc điểm vận động

a Hoạt lực của tinh trùng

Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động nhưng khi rơi vào nước nó vận động mạnh [1]

Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của

nó và điều kiện môi trường mà nó đang sống Sự chuyển động và thời gian vận động của tinh trùng có thể giúp đánh giá được chất lượng tinh trùng Persov (1941) (dẫn theo Trịnh Thị Nguyên [6]) đã đề nghị một bảng để đánh giá mức độ (5 mức: Mức 5:Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy chỉ có một số ít tinh trùng dao động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, đã có một số tinh trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao động, 3

4 số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động) chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào môi trường kích hoạt

b Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng

Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng gồm:

- Nhiệt độ:

Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ hoạt động của tinh trùng tăng khi nhiệt độ tăng nhưng thời gian sống của tinh trùng sẽ ngắn lại, vì nhiệt độ tăng làm tăng nhanh quá trình oxy hóa vật chất trong tinh trùng và sự tiêu hao năng lượng tăng lên Tuy nhiên nếu nhiệt độ vượt quá giới hạn cho phép của phạm vi thích hợp thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng vận động và chết Ở nhiệt độ thấp sự vận động của tinh trùng bị ức chế và tăng thời gian sống của tinh trùng Tinh trùng có thể duy trì khả năng thụ tinh của mình khá lâu nếu được giữ ở nhiệt độ thấp 0-4oC [1] Đây là cơ sở khoa học của việc bảo quản lạnh tinh trùng ở nhiệt độ thấp

Ví dụ: Tinh trùng cá chép bảo quản ở nhiệt độ 0-2ºC thì sống được 8 ngày

- Áp suất thẩm thấu của môi trường:

Áp suất thẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng Đối với cá nước ngọt, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng tương đương với dung dịch nước muối NaCl 0,5% Đối với cá biển, áp suất thẩm thấu của

tế bào chất tương đương với dung dịch nước muối NaCl 0,75% [11]

- Ion kim loại:

Tinh trùng nhạy cảm với ion kim loại hóa trị 2 và 3 hoặc acid, sự có mặt của các ion này làm cho tinh trùng kết vào nhau Ở môi trường kiềm hóa tinh trùng hoạt động tích cực hơn nhưng mau chóng hết năng lượng và chóng chết [1]

- Độ pH của môi trường cũng có liên quan đến sự vận động của tinh trùng: tinh trùng cá Hồi vận động tốt nhất khi pH=8,3 [11]

- Tuổi thọ của tinh trùng còn phụ thuộc vào chất lượng thành thục của cá

- Ảnh hưởng của việc bảo quản lạnh tinh trùng:

Quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cũng góp phần vào làm giảm chất lượng tinh trùng sau khi bảo quản Một số nghiên cứu này cũng đã được nhiều tác giả công bố [19, 47] Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng bao gồm:

Kỹ thuật chọn cá bố mẹ: Đây là khâu đầu tiên quan trọng vì chất lượng tinh

trùng của cá đực có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục của nó và điều kiện đang sống Khả năng vận động của tinh trùng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với thành thục vừa Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng

Thao tác thu mẫu tinh: Trước khi thu mẫu, dụng cụ cần được khử trùng và để

nơi thoáng mát, cá bố mẹ phải được kiểm tra lại Trước khi thu mẫu nên lâu khô phần dọc theo bụng cá Khi thu mẫu phải hết sức cẩn thận và nhẹ nhàng, tránh không để phân cá, máu chảy vào tinh dịch, nếu không tinh trùng dễ bị kích hoạt dẫn đến thời gian cất giữ ngắn Nên lấy tinh dịch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát để tinh dịch không bị biến đổi, không nên lấy tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thương

Những ống đựng tinh dịch nên được để trên khay đá khô, không nên nắm trong tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tuổi thọ tinh trùng

Tinh dịch thu xong nên được vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra

và xử lý mẫu Tinh dịch nên được vận chuyển ở nhiệt độ 0-4oC

Chất bảo quản: Chất bảo quản (chất bảo quản) là một dung dịch muối, có tác

dụng làm tăng dung tích và duy trì trạng thái vô hoạt cũng như thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng Nghiên cứu về Chất bảo quản không những có thể đạt được mục đích pha loãng tăng dung tích của tinh dịch mà còn có thể nâng cao tỉ lệ thụ tinh của tinh dịch, kéo dài thời gian sống cũng như tiết kiệm được nhiều tinh dịch

Lựa chọn chất bảo quản cần chú ý các điều kiện sau:

- Có chất dinh dưỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng

- Tránh được sự kích thích của nhiệt độ

- Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất trong tinh trùng

- Có pH thích hợp với pH tinh dịch

- Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động

Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ được tinh trùng

ở trạng thái bất động Chất bảo quản có thể được pha chế trước và giữ trong tủ lạnh trước khi sử dụng Tỷ lệ pha loãng tối ưu cần được xác định theo từng loài[50] Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp Một vài dung dịch đơn giản như dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [39] cũng cho hiệu quả

tốt Ở một số loài cá biển như cá Trích Clupea harengus và cá Đối Mugil cephalus

[16]; các tác giả đã sử dụng thành công nước biển pha loãng cho thêm chất chống đông Những nghiên cứu gần đây trên cá Rô phi cho thấy sử dụng nước pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột để pha loãng sẹ cũng có kết quả [39]

Gần đây một số tác giả đã sử dụng đường để làm chất bảo quản cho một số loài

cá nước ngọt Horváth và ctv [28] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là 350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá Chép Yavas và Bozkurt [55] sử dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho

cá Trắm cỏ và kết quả tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt lực tinh trùng sau bảo quản là 83,4±2,1%

Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng góp phần vào sự thành công của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

Tỷ lệ pha loãng: Mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hưởng đến quá

trình đông lạnh, khi pha loãng tinh dịch, tinh dịch nào có mật độ tinh trùng cao thì khả năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có mật độ tinh trùng thấp [6]

Tỷ lệ pha loãng giữa tinh dịch và chất bảo quản có thể từ 1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ pha loãng lớn hơn 1:20 thường cho tỷ lệ hoạt động của tinh trùng bảo quản thấp [7] Theo Stein và Bayrle [45] tỷ lệ thích hợp cho cá Chép là 1:3; Legendre và Billard [33] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá Hồi là 1:3; Harvey [25] tỉ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá Rô phi là 1:5

Việc lựa chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp sẽ nâng cao sức sống của tinh trùng khi rã đông, vì vậy nghiên cứu để đưa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần thiết [42]

Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: Chất chống đông (chất bảo vệ

tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập vào các tế bào tinh trùng Chất chống đông được thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hưởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông Một số nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản không có chất chống đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tượng bị kết lại và tế bào bị phá hủy, dẫn đến tinh trùng bị chết Hiện nay, các chất chống đông thường được sử dụng nhất là DMSO, Glycerol và Methanol

Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông Nồng độ chất chống đông phải thích hợp thì mới bảo vệ được các tế bào tốt nhất trong quá trình làm lạnh và rã đông Nồng độ các chất chống đông của các loài cá khác nhau thì khác nhau, và nồng độ tốt nhất cho các loài cá thường từ 10-15% bao gồm cả DMSO, Glycerol và Methanol

Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá Rô phi vằn O niloticus của Rana và

McAndrew [43] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức

nồng độ giống nhau Có loài có phổ DMSO khá rộng như cá Đù đỏ (Sciaenop

ocellatusa) 7-15%, nhưng cá Hồi (Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng

Methanol 10% Tóm lại, việc lựa chọn chất chống đông và nồng độ các chất chống đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

Chất bảo vệ màng tế bào: Một lượng lớn các hợp chất hoặc hỗn hợp sinh học

được trộn trong dung dịch làm lạnh với mục đích bảo vệ, ổn định bề mặt ngoài tế bào tinh trùng trong quá trình bảo quản Baynes và Scott [14] đã chứng minh rằng việc thêm 5-10% lòng đỏ trứng gà vào dung dịch bảo quản sẽ làm tăng khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi rã đông

Thời gian cân bằng: Thời gian cần thiết để chất chống đông thẩm thấu vào tinh

trùng gọi là thời gian cân bằng [51] Trong hầu hết các trường hợp, thời gian cân bằng có thể kéo dài từ 10 đến 30 phút nhưng có thể thay đổi phụ thuộc vào chất chống đông được sử dụng Nếu nồng độ chất chống đông cần thiết gây độc cho tế bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu vào tế bào cần được rút ngắn Một số tài liệu cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết Rana và McAndrew [43] đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hưởng không có ý nghĩa tới hoạt

lực tinh trùng cá Rô phi (O niloticus) sau khi rã đông, vì trước khi làm lạnh thời

gian từ khi pha loãng đến khi đóng cọng đã mất khoảng 30 phút

Tốc độ hạ nhiệt: Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản

lạnh là tốc độ hạ nhiệt Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nước ra khỏi các tế bào

để các tinh thể băng không hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong các tế bào để không làm hỏng các thành phần trong tế bào [37, 38] Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng lớn đến thành công của việc bảo quản tinh, vì vậy cần tìm được chu trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu Có nhiều phương pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trước khi chuyển vào lưu giữ trong nitơ lỏng Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó khoảng 3-10 cm, hoặc làm

lạnh trong đá Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chương trình hạ nhiệt được cài sẵn trong máy tính Tốc độ làm lạnh được điều chỉnh với các tốc độ khác nhau tùy theo loài Trong thực tế, phương pháp làm lạnh thành công và thực tế nhất về bảo quản lạnh tinh trùng cá là phương pháp làm lạnh hai bước Bước đầu tiên là giảm nhiệt

độ của tinh trùng từ nhiệt độ lưu giữ (ví dụ, nhiệt độ lưu giữ bình thường tinh trùng

C xuống -85oC, 4mm là -70oC xuống -75oC, và 20mm là -50oC xuống -55oC Dung dịch tinh cá Hồi

có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt 30-35oC / phút bằng chương tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng được thụ tinh Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm ra qui trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu

Phương pháp rã đông: Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải được rã đông để

đưa vào sử dụng Do điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh nên cần áp dụng phương pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh trùng sống lại sau khi rã đông Tùy vào các loài cá khác nhau, tùy vào việc sử các chất chống đông và tùy vào điều kiện thí nghiệm mà tiến hành rã đông ở các thang nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau Ví dụ Horvath và Urbanyri [27] rã đông tinh trùng cá Trê ở 40oC trong 5 giây, tỷ lệ vận động của tinh trùng đạt 50% Yasui

và ctv [54] rã đông tinh trùng cá Chạch Misgurnus anguillicaudatus ở nhiệt độ 25oC trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47% Le và ctv [32] rã đông tinh trùng cá Đù

vàng Larimichthys polyactis ở nhiệt độ 37oC trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần lần lượt là 45,7±3,2% và 27,2±5,0%

Dựa vào những đặc điểm trên của tinh trùng, ngày nay người ta nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng nguyên tinh dịch trong các dụng

cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp và kín đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả Đặc biệt là phương pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới

1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng

1.3.1 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới

Tình hình nghiên cứu chung: Trước những năm 50 của thế kỉ XX, việc lưu giữ

tinh ban đầu chỉ là việc cất giữ tinh trong điều kiện nhiệt độ thấp như tủ lạnh hay đá khô Tuy nhiên, kể từ khi công trình của Blaxter được công bố vào năm 1953 trên

đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến

trên nhiều đối tượng thủy sản Cho đến nay nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được tiến hành trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [47] với việc sử dụng các dung dịch muối làm chất bảo quản [31] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose Tóm lại, ở các đối tượng khác nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau Và có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi như cá Trích [16]; cá Hồi ([14], [15], [17]); cá Mú đen [24]; cá Trê châu Âu [34]; cá Chình Nhật [41]; cá Chép ([35], [29], [49], [48], [30]); cá Đù vàng [32] ……

Đối với cá nước ngọt: Năm 1986, Chao và ctv [18] công bố kết quả bảo quản

tinh 6 loài cá Rô phi bao gồm Oreochromis aureus, O mossambicus, O niloticus,

Tilapia zilli, cá Rô lai giữa O niloticus và O mosambicus, và Oreochromis spp Độ

pH của tinh dịch các loài cá Rô phi dao động từ 6,2-8,2 Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và 5% Methanol Sau khi pha loãng tinh với tỉ lệ 1:1 nhanh chóng làm lạnh xuống -35oC và hạ tiếp tục với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày

bảo quản là 72,7%, đối chứng là 85,7%; với con lai đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%,

đối chứng là 90,0% Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản,

tinh vẫn có khả năng thụ tinh

Năm 1978, Stein và Bayrle [45] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá Hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần như sau:

750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2 gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà Tỉ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3, tinh được lưu trữ trong nitơ lỏng Sau 7 ngày bảo quản, tinh được rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1% Có hơn 70% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây

Năm 2000, Horváth và Urbanyi [27] đã công bố kết quả về bảo quản tinh trùng

cá Trê (Clarias gariepilus) Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo

quản gồm 6% đường fructose và 10% chất chống đông DMSO, độ pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm NaHCO3 0,1N Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv [36] Phương pháp rã đông nhanh (trong thời gian 5 giây) ở nhiệt

Năm 2009, Yasui và ctv [54] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp

rã đông lên hoạt lực của tinh trùng cá Trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi

bảo quản trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ

ở nhiệt độ 35◦C trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%

Đối với các loài cá nước mặn lợ: Blaxter là người đầu tiên thành công trong

việc nghiên cứu bảo quản tinh Năm 1953, ông đã nghiên cứu bảo quản thành

công tinh trùng cá Trích (Lupea herenffus), thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt

độ -70o

C trong dung dịch nước biển, nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tỷ lệ pha loãng tinh dịch với nước biển là 1:4 Kết quả thu được là 80-85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh

Cho đến nay đối tượng cá biển còn chưa được nghiên cứu nhiều, khoảng 30 loài

đã và đang được nghiên cứu [47], nhiều nhất là cá Song (Epinephlus taurina) Theo

nghiên cứu của Withler và ctv [53] ở cá Song Dung dịch bảo quản gồm có hai chất bảo quản, chất bảo quản 1 gồm 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3, 251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất, chất bảo quản 2 bao gồm 6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3,

251 mg buffer hòa trong 1000 ml nước cất Chất chống đông là DMDO 10% Sau khi cân bằng ở 5-10oC tinh được chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng Nhiệt độ rã đông ở 21-26oC trong tủ ấm Kết quả thu được là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông

Năm 2011, Le và ctv [32] đã công bố bảo quản tinh cá Đù vàng trong nitơ lỏng Chất bảo quản là artificial seminal plasma (ASP), chất chống đông là 10% ethylene glycol (EG) và bảo quản theo qui trình hạ nhiệt từ hơi nitơ lỏng (-76oC) rồi đến nitơ lỏng (-196oC) Sau đó, các cọng rạ được rã đông ở nước ấm (37o

C) Kết quả thu được là tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần và 1 năm rã đông lần lượt là 45,7±3,2%, 27,2±5,0% và 37,5±4,4%, 27,2±5,0%

Cùng trên một đối tượng, nhưng ở trong từng điều kiện cụ thể sẽ có một quy trình bảo quản lạnh khác nhau Ví dụ như cùng trên một đối tượng là cá Hồi,

Stein và Bayrle [45] đã bảo quản tinh trùng các loài cá Hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase Sau 7 ngày bảo quản, tinh được rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1% Hơn 70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng 30 giây Trong khi đó, Cabrita và ctv [17] đã tiến hành nghiên

cứu bảo quản tinh trùng cá Hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5

ml Tỉ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3 trong dung dịch theo Erdahl và Graham với 7% DMSO, 10% lòng đỏ trứng và 7,5 mg/ml promine Kết quả là tỉ lệ thụ tinh ở cọng rạ 0,5 ml là 84,0%, cọng rạ 1,8 ml là 73,2%, cọng rạ 5 ml là 73,0%

Cùng trên đối tượng là cá Chép, nhưng Irawan và ctv ở Thái Lan [30] sử dụng 6 chất bảo quản CCSE1-CCSE6 và 3 chất chống đông DMSO, Propylene glycol và Methanol, kết quả là CCSE2-DMSO cho tỷ lệ thụ tinh cao nhất 73,6±6,5% Trong khi đó, Horváth và ctvở Hungary [29] sử dụng 5 chất bảo quản là sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trương, hai chất chống đông được sử dụng là DMSO và Methanol 10% Kết quả là glucose và fructose kết hợp với Methanol 10% cho tỉ lệ thụ tinh cao nhất lần lượt là 74,0±15,0% và 71,0±12,0%

Kurokura và ctv [31] nghiên cứu trên cá Chép Nhật Bản đạt được tỉ lệ thụ tinh là 68,6% Cũng trên cá Chép Nhật Bản [10] đã bảo quản thành công với kết quả đạt được là 53,0±6,0% tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ nở đạt 75,0±9,0%

Qua đó, ta thấy được rằng ở các đối tượng khác nhau sẽ có quy trình bảo quản tinh khác nhau, và cùng trên một đối tượng nhưng tùy vào điều kiện cụ thể mà sẽ có phương pháp bảo quản khác nhau Vì vậy, mặc dù cá Chép là một trong những đối tượng được nghiên cứu nhiều trên thế giới, nhưng việc tiếp tục nghiên cứu để đưa ra quy trình cụ thể phù hợp với điều kiện thực tế của từng quốc gia là hết sức thiết thực

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bảo quản tinh cũng đã được nghiên cứu, song chủ yếu là trên các đối tượng là gia súc Trong đó, phương pháp bảo quản tinh chủ yếu là bảo quản ngắn hạn, tinh dịch được cất giữ ở nhiệt độ thấp có thể được duy trì khả năng thụ tinh trong thời gian 1 đến 2 tuần [11] Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới được thực hiện từ những năm 2000, nhưng phần lớn chỉ bảo quản trong thời gian ngắn, khoảng một vài ngày

Năm 2002, tác giả Hồ Kim Diệp và ctv [2] đã công bố kết quả nghiên cứu bảo quản tinh một số loài cá nước ngọt như cá Chép, Trắm cỏ, Mrigan, cá Bỗng Kết quả như sau: tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng cá Chép đạt đến 81,7%, tỉ lệ nở cá con là