Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chiết xuất CO2 siêu tới hạn từ lá hương thảo (Rosmarinus officinalis L.): Tiềm năng bảo vệ da khỏi quá trình Peroxide hóa Lipid

Trong luận văn, các yếu tố như tỉ lệ đồng dung môi ở phân đoạn 2, áp suất phân đoạn 1, và áp suất phân đoạn 2 được thay đổi để tìm ra điều kiện chiết thích hợp cho hoạt chất carnosol và

TỔNG QUAN

Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật

Cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) ( Hình 1.1 ) thuộc họ Hoa môi có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, và sau đó được trồng phổ biến hơn ở tất cả các lục địa [1] Vào năm 2007, cây hương thảo bắt đầu du nhập vào Việt Nam, tập trung chủ yếu tại khu vực miền Trung nước ta, với đặc trưng khí hậu nóng ẩm quanh năm, chia làm hai mùa khô và mùa mưa rõ rệt Các loại cây thường xanh có xu hướng phát triển phong phú, đặc biệt đối với khu vực ven biển [2] và đặc biệt là nơi có thời tiết khí hậu lạnh, thổ nhưỡng như ở Lâm Đồng Ở Việt Nam, cây hương thảo còn được gọi với một tên gọi khác là Mê Diệt Hương [3] Hiện nay, loài cây này thường được dùng như một gia vị không thể thiếu khi nấu các món ăn phương Tây như beefsteak hay pizza [4] Ngoài ra, tinh dầu và các chiết xuất từ lá hương thảo còn mang lại rất nhiều lợi ích cho sức khỏe [5] a) Lá hương thảo tươi b) Hoa hương thảo c) Lá hương thảo khô

Hình 1.1 Một số hình của hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)

Năm 2013, K Hcini và các đồng nghiệp đã nghiên cứu các loại cây hương thảo được trồng tại ba vùng ở Tunisia, gồm Beja, Sidi Bouzid và Gabes Kết quả cho thấy rằng đất, khí hậu và độ cao đều có ảnh hưởng đến chất lượng, thành phần và hàm lượng các hợp chất trong tinh dầu hương thảo [6] Về phân bố, cây này thích nghi tốt trong môi trường khí hậu bán khô hạn và nhiệt đới [7] Hơn nữa, cây hương thảo phát triển tốt trên đất cát, có khả năng thoát nước tốt và thích hợp với độ pH từ 6,0 đến 7,0 [8]

Cây hương thảo là một loại cây bụi thường xanh, còn được biết đến là cây có chứa chất tương tự hương thơm của hoa oải hương như camphor, 1,8-cineole, linalool Cây trưởng thành có thể đạt đến chiều cao 180 cm và các nhánh của nó có thể phát triển tới 90 cm [9] Hoa của cây hương thảo có màu trắng, xanh lam hoặc tím, có kích thưởng khoảng 8,5 – 13,5 mm và mọc theo từng cụm nhỏ trên thân cây [10] Lá cây hương thảo nhỏ 2 – 4cm hình nhọn, mép lá gập xuống có màu xanh đậm hoặc xanh lam, có mùi thơm đặc trưng do có chứa hàm lượng lớn tinh dầu [11] Lá thường mọc đối diện dọc theo cành, có chiều dài 15 đến 40 mm và không có cuống lá [12] Mép lá gập xuống có màu xanh đậm hoặc xanh lam, có mùi thơm đặc trưng do có chứa hàm lượng lớn tinh dầu (khoảng 2%) [11] Ngoài ra, mùi thơm đặc trưng từ lá hương thảo còn được chứng minh đếm từ 8% các chất khác như tannin, ursolic acid, flavonol và vitamin

Hiện nay, đã có hơn 20 loại hương thảo xuất hiện trên khắp thế giới và được phân loại theo màu sắc, mùi hương và hình dạng của cây, một số loài được trình bày trong

Hình 1.2 Về màu sắc, hương thảo được chia thành 3 loại chính là Tuscan Blue,

Majorca Pink và White Flower [13] Tuscan Blue có màu xanh lam với hoa màu xanh xám đậm, lá hình kim và có thể cao hơn 90 cm trong môi trường nhiệt đới Majorca Pink, hay còn được gọi là "Salem", có hoa màu tím mọc thành chùm trên cành thẳng đứng, với chiều cao tối đa khoảng 120 cm và lá to hơn so với các loại khác của hương thảo [13] Loại hương thảo có hoa màu trắng được gọi là "hương thảo Albus" hoặc đơn giản là "Trắng" Thường, cây nở hoa và phát ra hương thơm vào cuối mùa xuân và mùa hè [14] Trong y học cổ truyền, lá hương thảo được sử dụng như một loại cây chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm [15] Ngoài ra, tinh dầu hương thảo được chiết xuất từ hoa và lá còn được sử dụng để điều trị đau đầu [16] a) Tuscan Blue Rosemary b) Majorca Pink Rosemary c) White Flower Rosemary d) Barbeque Rosemary

Hình 1.2 Các loại hương thảo

Phương pháp chiết xuất thường sử dụng các phần của cây hương thảo có tác dụng mạnh như lá, rễ, thân hoặc hoa bằng dung môi thích hợp Các yếu tố chính ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình chiết xuất bao gồm đặc tính của thực vật, dung môi, nhiệt độ, áp suất và thời gian chiết [16] Các phương pháp truyền thống (phơi khô, sắc, …) và hiện đại (siêu âm, chưng cất, …) đều được sử dụng để chiết xuất hương thảo, nhưng mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng.

Thành phần hóa học nổi bật

Các phương pháp phổ biến để thu được các hoạt chất quý giá có trong lá hương thảo có thể kể đến như ngâm, sắc, chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết bằng dung môi [17] Ngoài ra còn có những phương pháp hiện đại hơn như là chiết suất chất lỏng siêu tới hạn (SCF) hoặc sử dụng các phương pháp vi sóng và siêu âm [18, 19] Bảng

1.1 cho thấy các hoạt chất phong phú được tìm thấy trong lá hương thảo, và một số công thức cấu tạo của các phân tử nổi bật được biểu diễn ở Hình 1.3 [17]

Bảng 1.1 Các hoạt chất chính có trong lá hương thảo [17]

1,8–Cineole (eucalyptol), Camphor (ketone), α–pinene, Borneol, β–pinene, Limonene y p–cymene, Verbenone (ketona), và Sesquiterpenes (β–caryophyllene)

Carnosic acid, carnosol, rosmarol, epirosmanol, isorosmanol, và rosmaridiphenol

Oleanolic acid, ursolic acid, betulin, α–amyrin, và β– amyrin

Các Flavonoid Luteolin, apigenin, genkwanin, diosmetin, hispidulin, 5– hidroxi–7, 4′–dimetoxi–flavone, và cirsimaritin

Các Phenolic acid Caffeic acid, chlorogenic acid, và rosmarinic acid

Từ bảng trên có thể thấy các hợp chất trong dịch chiết lá hương thảo phân thành ba nhóm: terpen (carnosic acid), flavonoid (apigenin, luteolin) và acid phenolic (rosmarinic acid) [20] Tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu khoa học sẽ tập trung nghiên cứu về các hoạt chất kháng oxy hóa có trong lá hương thảo, 90% đặc tính kháng oxy hóa của cao chiết từ hương thảo đến từ hai hợp chất carnosic acid và carnosol [21] Đối với rosmanol và rosmaridiphenol thì nồng độ của hai chất này thấp tới mức không thể phát hiện được [22] Do đó, tiềm năng dược lý của cây hương thảo được thể hiện mạnh mẽ thông qua các hợp chất carnosol, carnosic acid và tinh dầu [23]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của (1) rosmarinic acid và (1a và 1b) các dẫn xuất, (2) carnosic acid, (3) carnosol, (4) ursolic acid và (5) oleanolic acid

Tinh dầu hương thảo thường được chiết xuất bằng phương pháp chưng cất hơi nước, sản phẩm cho ra thường không màu đến màu vàng nhạt và có mùi thơm đặc trưng của xạ hương (thyme) [24] Trong đó, các thành phần dễ bay hơi có trong tinh dầu hương thảo được đưa phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) [25] Thành phần chính của tinh dầu hương thảo bao gồm long não (5,0 – 21,0%), 1,8-cineole (15 – 55%), borneol (1,5 – 5,0%), limonene (1,54 – 5,0%), cùng với nhiều hợp chất bay hơi khác và tỷ lệ của chúng thay đổi tuỳ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và điều kiện khí hậu [24] a Carnosic acid

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của carnosic acid [26]

Carnosic acid là diterpene ortho-diphenolic – chất kháng oxy hóa quan trọng trong lá hương thảo và đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ tế bào ở động vật có vú [26] Năm 1964, hợp chất này lần đầu tiên được phát hiện ở Salvia officinalis L bởi Linde, sau đó người ta phát hiện rằng hàm lượng carnosic acid trong lá Rosmarinus officinalis L cao hơn so với cây xô thơm [27] Carnosic acid có thể được coi là một hợp chất cụ thể trong họ Lamiaceae và được khám phá trong nhóm Gymnospermatophyta vào năm 2002 [28] Carnosic acid được phân bố ngẫu nhiên trong các bộ phận của cây, ví dụ, thành phần này được tìm thấy chủ yếu trong các mô quang hợp của cây hương thảo như lá, đài hoa và cánh hoa [26]

Mặc dù là một polyphenol nhưng carnosic acid lại có một số đặc điểm giống với nhóm chức terpenoid, điển hình là tocopherol và carotenoid [29] Carnosic acid có 2 nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí ortho tại C11 và C12 sự liên hợp 3 vòng trong đó có 1 vòng thơm cơ bản như Hình 1.4 , giúp cho cấu trúc này tạo ra khả năng trung hòa các gốc tự do và đóng vai trò là một chất kháng oxy hóa [30] Carnosic acid tan trong dung môi hữu cơ như ethanol, DMSO và dimethyl formamide, nên được tẩy bằng khí trơ Độ hòa tan của carnosic acid trong các dung môi này là khoảng 30 mg/mL thể hiện như một chất có độ phân cực trung bình - cao [31]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, lá cây hương thảo được phơi ở mức độ tia UV-B cho hiệu suất chiết carnosic acid cao hơn so với cây chưa được xử lý Bên cạnh đó, các yếu tố môi trường như nước, cường độ chiếu sáng và nhiệt độ lúc cây sinh trưởng cũng ảnh hưởng đến nồng độ carnosic acid có trong cây [32] Tuy được phân loại như một polyphenol nhưng dựa theo phân phối cấu trúc, con đường tổng hợp và tính tan, carnosic acid có vai trò khác biệt hơn so với các polyphenol khác và tương đồng với các terpenoid như tocopherol và carotenoid [33] Hợp chất này có thể được sử dụng làm chất phụ gia để duy trì thời gian bảo quản [34] Mặt khác, carnosic acid cũng là một hoạt chất đa chức năng như một chất ức chế protease kháng khuẩn, chống ung thư và HIV-1 [35, 36] Hiện nay quá trình tổng hợp carnosic acid từ các chất hữu cơ còn chưa được phát triển tuy nhiên nghiên cứu của, Brückner và cộng sự (2014) đã đề xuất một hợp chất trung gian, abietatriene, có vòng C thơm hóa và trọng lượng phân tử là 270 Sau đó, quá trình hydroxyl hóa kép abietatriene trên khung 20 C của diterpenoid tạo ra nhóm carboxyl trong carnosic acid [37] Tương tự như các chất chống oxy hóa khác, cơ chế hoạt động bắt gốc tự do của carnosic acid là do sự có mặt của hai nhóm hydroxyl O-phenolic ở vị trí C11 và C12 (phân tử catechol) Ở 60°C, carnosic acid thể hiện khả năng chống oxy hóa cao hơn trong hệ lipid so với 𝛼- tocopherol Ở nhiệt độ cao hơn, tốc độ tiêu thụ carnosic acid trở nên nhanh hơn so với alpha-tocopherol, cho thấy các sản phẩm oxy hóa của carnosic acid góp phần đáng kể vào phản ứng chống oxy hóa [37] Đáng chú ý, hiệu suất thu hồi của hoạt chất này thay đổi từ 68,1% đến 96,2% tùy thuộc vào nền mẫu [36] b Carnosol

Carnosol là một acid orthodiphenolic, giống như carnosic acid, được kết nối với các nhóm hydroxyl (-OH) ở C11, C12 và một phần vòng lactone trên vòng B Lần đầu tiên được phân lập từ Salvia officinalis L vào năm 1942, cấu trúc của carnosol được xác định bởi Brieskorn và cộng sự vào năm 1964 [37] Hợp chất này là một trong những chất chống oxy hóa có thể có trong cây hương thảo và là kết quả chính của quá trình oxy hóa carnosic acid [34] Mặc dù carnosol và carnosic acid chỉ chiếm 5% tổng trọng lượng của lá hương thảo khô, tuy nhiên loại hoạt chất này lại chiếm hơn 90% hoạt tính chống oxy hóa [38]

Hình 1.5 Quá trình tổng hợp carnosol từ carnosic acid [39]

Hình 1.5 biểu diễn quá trình tổng hợp carnosol từ carnosic acid với xúc tác bạc oxide trong CH2Cl2 được diễn ra trong vòng 1,5 giờ ở nhiệt độ môi trường Hỗn hợp phản ứng sau đó được lọc qua Celite và dịch lọc được rửa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa Sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa là quinon methide (C) và đồng phân ortho – quinone (B) có thể được biến đổi thành lactone thông qua việc bổ sung nucleophilic của nhóm carboxylic acid cho carbon C7 Sau khi được đưa qua sắc ký cột, thu được sản phẩm carnosol với năng suất là 67% [39] Ngoài ra, carnosic acid khi tiếp xúc với metanol trong 1 tuần ở nhiệt độ phòng bị oxy hóa và chuyển thành carnosol Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa carnosic acid thành carnosol diễn ra trong lá hương thảo ngay sau khi lá được thu hoạch và để khô tự nhiên [21]

Carnosol có thể loại bỏ các gốc peroxyl và ngăn chặn quá trình oxy hóa do Cu 2+ tạo ra bởi các lipoprotein mật độ thấp, khiến các gốc lipid tự do được tạo ra trong gan chuột, theo quan sát của Aruoma và đồng nghiệp [40] Khả năng thay đổi trật tự của màng phospholipid của Carrosol là một cách khác để nó ức chế quá trình peroxid hóa lipid một cách hiệu quả Khi phân tử được phân tích bằng màng phospholipid thay vì màng không có, hoạt tính chống oxy hóa của hóa chất này được tăng cường đáng kể, lên tới 4 hoặc 6 lần [21]

Carnosol ít tan trong nước, muốn hòa tan carnosol trong nước, trước tiên phải hòa tan trước trong ethanol, sau đó pha loãng với nước Carnosol có độ tan khoảng 0,5 mg/mL trong dung dịch EtOH:PBS (1:1) tại pH 7,2, carnosol cũng tan trong PBS (pH 7,2) ở với độ tan < 30 μg/mL [41].

Hoạt tính sinh học của cây hương thảo

Kể từ khi được phát hiện, cây hương thảo đã thu hút rất nhiều sự chú ý do có nhiều chức năng sinh học cũng như mùi hương đặc biệt của nó Nghiên cứu được tiến hành trên toàn cầu đã chứng minh tính hiệu quả của hương thảo trong việc giảm thiểu sự phát triển của khối u, kháng oxy hóa và kháng lipid a Hoạt động chống oxy hóa

Hoạt động chống oxy hóa là một trong những hoạt động có tác dụng tốt trong cây hương thảo và đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Điều này có thể được giải thích là do cây hương thảo chứa nhiều chất chống oxy hóa phổ biến, bao gồm carnosic acid, rosmarinic acid và carnosol [42] Hơn nữa, ursolic acid và oleanolic của chiết xuất hương thảo cùng nhau có hoạt tính chống oxy hóa nhẹ [42]

Khả năng kháng oxy hóa của lá hương thảo có tác dụng làm giảm quá trình peroxide hóa lipid và đã được ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên thay thế cho các chất bảo quản nhân tạo như BHA, BHT và propyl gallate [43] Ngoài ra, các đặc tính chống oxy hóa phụ thuộc vào giai đoạn ra hoa đậu quả: sự gia tăng nồng độ polyphenol, bao gồm carnosol, rosmarinic acid và hesperidin trong giai đoạn đậu quả có liên quan trực tiếp đến việc cải thiện khả năng chống oxy hóa của chiết xuất [44]

Neura Bragagnolo và cộng sự đã phát hiện ra trong một nghiên cứu năm 2005 rằng việc chiên ức gà ở nhiệt độ 95°C làm tăng đáng kể tốc độ hình thành các gốc tự do

So với mẫu ức gà không có loại cây này, việc bổ sung hương thảo vào bữa ăn này đã giúp giảm tốc độ tiêu thụ oxy và xu hướng tạo ra các gốc tự do [21] Hương thảo có khả năng ngăn chặn quá trình peroxid hóa lipid trong cả hệ thống liposome và microsome, chủ yếu do hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ của carnosol và carnosic acid, chiếm hơn 90% tổng hoạt động chống oxy hóa của cây Carnosol và carnosic acid loại bỏ hiệu quả các gốc hydroxyl, giảm cytochrome C và loại bỏ CCl3O2 (gốc peroxyl) Cụ thể, carnosic acid được biết là có khả năng loại bỏ H2O2 và có thể đóng vai trò là chất nền cho hệ thống peroxidase [44] Munné-Bosch và cộng sự lưu ý rằng mối quan hệ giữa diterpene và khả năng loại bỏ các gốc tự do của chúng là sự kết hợp quan trọng tạo nên hiệu quả chống oxy hóa của cây hương thảo [45] Vòng thơm (C11–C12) trong nhóm catechol và sự liên hợp của ba vòng cơ bản là hai thành phần cấu trúc quan trọng nhất của cây hương thảo b Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2006, Moreno cùng cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất hương thảo trong các dung môi khác nhau bằng phương pháp khuếch tán đĩa Vi khuẩn được nuôi cấy ở 37°C trong 24 giờ trong Muller Hinton Broth, trong khi nấm men được nuôi cấy ở 30°C trong Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Kết quả cho thấy sau 24 giờ ủ, dịch chiết hương thảo ở nồng độ 250 àL/mL cho hiệu quả ức chế 100% Tuy nhiên, sau 48 giờ, vi khuẩn được quan sát thấy phát triển trở lại [45] Bảng 1.2 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration – MBC) của chiết xuất hương thảo trong các dung môi khác nhau đối với các loại vi khuẩn khác nhau

Bảng 1.2 Giá trị MIC và MBC của chiết xuất hương thảo trong các dung môi khác nhau đối với các loại vi khuẩn khác nhau (μg dịch chiết/mL) [45]

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

X campestris pv campestris 1 60 NT NT NA -

NT: non-dectived; NA: not applicable c Hoạt động chống viêm

Bên cạnh hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn, hoạt tính chống viêm của lá hương thảo cũng đã được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới Theo Scheckel và cộng sự, rosmarinic acid có thể ức chế hiệu quả sự biểu hiện của gen gây viêm cyclooxygenase-2 (COX-2) - yếu tố góp phần làm tăng nguy cơ hình thành khối u ở đại tràng HT-29 và mô vú MCF10A lành tính [46] Vào năm 2015, Rocha và cộng sự đã chứng minh rằng nồng độ rosmarinic acid ở mức 25 mg/kg giúp giảm sưng chân hiệu quả sau 6 giờ và giảm các dấu hiệu rối loạn chức năng cơ quan bằng cách điều chỉnh NF-κB và metallicoproteinase-9 trong mô hình chấn thương do nhiệt [47] Nghiên cứu được thực hiện bởi Poeckel và cộng sự cho thấy diterpene phenolics - đặc trưng bởi carnosic acid và carnosol - có khả năng điều hòa gen và kích hoạt thụ thể gamma để tăng sự tăng sinh peroxisome (PPARγ) [48] Ngoài ra, các thành phần này còn góp phần ngăn chặn sự hình thành leukotrien - chất trung gian gây viêm trong tế bào bạch cầu - và ức chế hoạt động của enzyme 5-lipoxygenase [49] Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ đánh giá khả năng chống viêm của từng hợp chất riêng lẻ Trên thực tế, chiết xuất được làm giàu bằng carnosic acid và carnosol từ lá hương thảo có thể có tác dụng mạnh hơn từng thành phần riêng lẻ Đặc biệt, chiết xuất hương thảo có khả năng ức chế các cytokine tiền viêm, làm giảm sự giải phóng TNF-α (yếu tố hoại tử khối u), IL-1β (chất trung gian phản ứng viêm) và IL-6 (chất kích hoạt phản ứng viêm để bảo vệ cơ thể) trong mô hình tế bào bạch cầu THP-1 [50] d Khả năng chống lại các khối u

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng carnosol có trong chiết xuất từ lá hương thảo không chỉ có khả năng hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú T47D mà hợp chất này còn kích thích gia tăng tỷ lệ thụ thể estrogen phụ α và β trong cơ thể phụ nữ, và ngăn chặn sự gia tăng của tế bào ung thư vú MCF – 7 [51] Ngoài ra, theo Ren Boxue và cộng sự, hợp chất rosmarinic acid có trong lá hương thảo cũng là một chất có khả năng ứng chế sự phát triển của các tế bào ung thư vú MDA – MB – 231 theo thời gian và liều lượng [52]

Theo Zhao Shasha và cộng sự, rosmarinic acid có thể ức chế sự gia tăng của tế bào ung thư gan Huh7 ở người bằng cách tăng nồng độ, liều lượng và thời gian đáp ứng tăng dần [53] Bên cạnh đó, Qunfeng Wu và cộng sự cũng chứng minh rằng việc kết hợp carnosic acid, vitamin D và sorafenib có tác dụng chống ung thư gan bằng cách kích hoạt protein LC3 [54]

Nghiên cứu của Tang Shuangyi và cộng sự đã chỉ ra rằng rosmarinic acid có trong chiết xuất hương thảo cũng có thể ức chế hoạt động của tế bào ung thư tuyến tiền liệt

PC3, và đóng vai trò chống khối u bằng cách điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu [55] Hơn nữa, carnosic acid trong chiết xuất hương thảo còn có thể gây ra quá trình apoptosis của các tế bào ung thư thận ở người bằng cách điều hòa sự gia tăng hàm lượng ADN đơn bội [53].

Ứng dụng của cây hương thảo

Từ thời Ai Cập cổ đại, con người đã có nhu cầu chăm sóc cơ thể và lĩnh vực thẩm mỹ dường như đã đáp ứng được nhu cầu đó [15] Da có cấu trúc phức tạp, nhạy cảm với các gốc tự do do tiếp xúc lâu dài với oxy và các chất kích thích từ môi trường [16] Trong cuộc sống hiện đại, người dùng ngày càng khắt khe hơn trong việc lựa chọn sản phẩm chăm sóc da và chú ý đến mỹ phẩm thuần chay hoặc thiên nhiên Kể từ năm 2000, mỗi năm có khoảng 120 bài viết được công bố về khía cạnh hương thảo, bao gồm: dầu massage, nước hoa, gel gội đầu, tẩy trang, hay kem chống nắng, …[15]

Theo nghiên cứu vào năm 1998, Isabelle C Hay và cộng sự kết luận rằng tinh dầu hương thảo có thể kích thích mọc tóc, giảm tiết bã nhờn và có khả năng điều trị rụng tóc Ngoài ra, rosmarinic acid và các dẫn xuất khác của caffeic acid trong loại thảo mộc này là một trong những chất chống oxy hóa bảo vệ tóc và da đầu khỏi bị hư hại một phần [56] Ngày nay, trên thị trường xuất hiện sản phẩm NutroxsunTM – sự kết hợp giữa hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) và bưởi (Citrus paradisi) có khả năng chống lão hóa và bảo vệ da khỏi tác hại từ ánh nắng mặt trời

Năm 2016, nhà khoa học người Ý Vincenzo Nobile và các đối tác đã chứng minh tính hiệu quả của sản phẩm NutroxsunTM bằng cách đo độ đỏ, độ sâu nếp nhăn và độ đàn hồi của da Nghiên cứu đánh giá 90 tình nguyện viên từ tháng 2 đến tháng 4 năm 2015; Kết quả minh họa rằng chiết xuất hương thảo có thể làm giảm mẩn đỏ ở cả nồng độ 100 và 250 mg khi da tiếp xúc với 1 liều tia UVB tối thiểu (MED) Về độ sâu của nếp nhăn, nồng độ chiết xuất ở mức 250 mg có thể giảm 9,1%, 12,6% và 13,9% sau 0,5; lần lượt là 1 và 2 tháng Khi thử nghiệm với nồng độ 100 mg, kết quả cho ra tương tự như thí nghiệm đã làm trước đó với nồng độ 250mg Về độ đàn hồi của da, hai nồng độ đều cho thấy khả năng nâng cao giá trị độ đàn hồi tổng thể và đạt mức cao nhất khoảng 4,6% sau 2 tháng [57]

Chiết xuất từ hương thảo (E 392) đã được đánh giá vào năm 2008 về độ an toàn sử dụng bởi Cơ quan an toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) và Hội đồng về Phụ gia Thực phẩm, Hương liệu, Chất hỗ trợ chế biến với Thực phẩm (AFC) [58] Sau đánh giá này của EFSA, chiết xuất hương thảo (E 392) đã được phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm ở Liên minh Châu Âu (EU) trong một số danh mục thực phẩm với mức tối đa phù hợp Vào năm 2016, Ủy ban Chuyên gia quốc tế FAO / WHO về Phụ gia Thực phẩm (JECFA) đã thiết lập mức tiêu thụ hàng ngày tạm thời có thể chấp nhận được (ADI) đối với chiết xuất hương thảo (E 392) là 0 – 0.30 mg (carnosic acid và carnosol) / kg thể trọng người lớn (bw) [58] Dựa trên dữ liệu được cung cấp bởi ngành công nghiệp thực phẩm, Ban Hội thẩm đã đưa ra mức tiêu thụ tối đa đối với trẻ từ 3 – 9 tuổi là 0.09 mg (E 392) / kg thể trọng (bw), và tối đa 0.20 mg (E 392) / kg (bw) đối với trẻ có độ tuổi từ 9 tuổi trở lên [58] Trong một nghiên cứu đường miệng kéo dài

13 tuần ở chuột đực và chuột cái, NOAEL (Thuật ngữ thể hiện không có mức độ nghiêm trọng nào của tác dụng phụ có thể quan sát được) của các chất chiết xuất từ cây hương thảo khác nhau là từ 20 – 60 mg (carnosol và carnosic acid) / kg thể trọng người lớn mỗi ngày [59] Chiết xuất từ cây hương thảo còn được cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn, chất làm mới và phụ gia trong các sản phẩm mỹ phẩm, theo Cơ sở dữ liệu của Ủy ban Châu Âu - CosIng7 [60]

CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT HƯƠNG THẢO

Trích ly bằng dung môi hữu cơ

S Rodríguez-Rojo cùng các cộng sự (2011) đã nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ lá cây hương thảo bằng việc kết hợp dung môi ethanol và nước trong các quy trình khác nhau (trích ly thông thường, có sự hỗ trợ của vi sóng, có hỗ trợ của siêu âm) Lá hương thảo được khảo sát ở 2 điều kiện lá tươi và lá đã được loại bỏ tinh dầu thông qua việc xử lý bằng lò vi sóng ở điều kiện 1000 W và trong 5 phút [61] a Trích ly bằng dung môi hữu cơ

Trích ly rắn – lỏng trong quá trình chiết xuất là một phương pháp phổ biến được sử dụng để tách chiết các hoạt chất từ nguyên liệu thực vật Nguyên liệu trong quá trình được nghiền nhỏ, đồng thời kết hợp sử dụng cánh khuấy giúp tăng bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi Dung môi có độ phân cực tăng dần được dùng để khảo sát quá trình chiết xuất carnosol và carnosic acid trong lá hương thảo là hexane, acetone, ethyl acetate, ethanol [49] Kết quả chiết xuất hoạt chất được thể hiện tại Bảng 1.3

Bảng 1.3 Kết quả trích ly carnosol và carnosic acid (mg/kg) bằng dung môi hữu cơ

Dung môi Carnosol Carnosic acid

Kết quả trên cho thấy, hàm lượng carnosol và carnosic acid thu được khi dùng dung môi là acetone và ethyl acetate là cao hơn so với hai dung môi còn lại Và hexane là dung môi cho hàm lượng hoạt chất tương đối thấp bởi hexane là một dung môi có độ phân cực thấp, không phù hợp để làm dung môi trích các chất có độ phân cực cao như carnosol và carnosic acid [62] Mặt dù acetone và ethyl acetate là hai dung môi cho thấy hàm lượng hoạt chất thu được là lớn nhất, nhưng với việc sử dụng cao chiết lá hương thảo trong thực phẩm, mỹ phẩm và chăm sóc cá nhân cho con người thì việc sử dụng hai dung môi này làm dung môi trích ly hoạt chất mang đến nguy cơ gây hại ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do đó, việc hướng đến và sử dụng ethanol làm dung môi trích ly hoạt chất ở lá hương thảo đang được sử dụng phổ biến hơn cả, do có thể thay đổi độ phân cực của dung môi bằng cách pha loãng nhằm thu được hoạt chất là cao nhất, vừa mang lại khả năng an toàn trong sản phẩm b Trích ly bằng dung môi hữu cơ có sự hỗ trợ của vi sóng

Nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng việc sử dụng chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng vi sóng có thể cải thiện hiệu suất trong thời gian ngắn hơn ở cùng một nhiệt độ chiết và sử dụng ít dung môi hơn [63] Với tính chất điện từ của nó, sóng vi ba tạo ra điện trường và từ trường vuông góc với nhau Điện trường này gây ra sự gia nhiệt thông qua hai cơ chế quay lưỡng cực và dẫn ion Sự dao động này gây ra va chạm với các phân tử xung quanh, giải phóng năng lượng nhiệt vào môi trường, dẫn đến sự gia nhiệt nhanh chóng Khác biệt với các phương pháp gia nhiệt dẫn điện truyền thống, sóng vi ba có khả năng làm nóng toàn bộ mẫu một cách đồng thời và đồng đều [63] c Trích ly bằng dung môi hữu cơ có sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Sự cải thiện quá trình chiết xuất các hợp chất hữu cơ bằng siêu âm được cho là do sự tăng cường truyền khối do hiện tượng tạo bọt trong dung môi do sự truyền qua của sóng siêu âm Các bong bóng và khí bên trong chúng bị nén dẫn đến nhiệt độ và áp suất tăng đáng kể Điều này dẫn đến sự phá vỡ của bong bóng với một “sóng xung kích” truyền qua dung môi và xảy ra hiện tượng trộn tăng cường Tuy nhiên, việc sử dụng sóng siêu âm để chiết xuất có thể ảnh hưởng đến hoạt chất chiết xuất khi các phản ứng phụ đồng thời xảy ra [64] Các chất chống oxy hóa hoạt động mạnh từ lá hương thảo như carnosic acid và rosmarinic acid, bị phân hủy thành các sản phẩm như rosmanol, galdosol và carnosol Các dung môi khác như ethanol, ethyl acetate tạo ra ít gốc tự do hơn nước trong các điều kiện siêu âm tương tự và người ta đã quan sát thấy rằng việc chiết xuất carnosic acid được cải thiện đáng kể bằng siêu âm [65] Các bước chiết xuất được thực hiện tương tự như quy trình có sự hỗ trợ của vi sóng

Bảng 1.4: Kết quả chiết xuất từ lá hương thảo tươi [48]

Phương pháp chiết Dung môi Hiệu suất chiết

Siêu âm (liên tục) Ethanol 1,1 ± 0,02 0,22 ± 0,006

Từ kết quả của nghiên cứu trên cho thấy, việc chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng cho kết quả gần với phương pháp chiết bằng dung môi thông thường, nhưng thời gian chiết xuất giảm đi đáng kể, và quy trình được tinh gọn hơn nhiều hơn so với phương pháp trích ly bằng dung môi thông thường

Bảng 1.5: Kết quả chiết xuất từ lá hương thảo đã loại tinh dầu [48]

Phương pháp chiết Dung môi Hiệu suất chiết

Siêu âm (liên tục) Ethanol 2,35 ± 0,02 2,21 ± 0,01

Qua kết quả của nghiên cứu trên cho thấy, việc sử dụng lá hương thảo sau khi loại bỏ tinh dầu, thu được nồng độ hoạt chất kháng oxy hóa cao hơn so với chưa xử lý Điều này có thể giải thích như sau, lá hương thảo được loại bỏ tinh dầu bằng phương pháp nhiệt, do đó chỉ có các thành phần dễ bay hơi như tinh dầu được loại bỏ, mà các hoạt chất kháng oxy hóa như carnosol và carnosic acid là những chất không bay hơi do đó còn nằm lại trong nguyên liệu Việc sử dụng nguyên liệu đã loại bỏ tinh dầu (các thành phần dễ bay hơi) làm cho hàm lượng các hoạt chất kháng oxy hóa trong lá tăng lên do quy trình chiết xuất đã tách biệt được phần dầu, giúp tăng cường nồng độ các hoạt chất trong sản phẩm sau chiết xuất dẫn đến tăng khả năng kháng oxy hóa của cao chiết do tăng được nồng độ của hoạt chất trong sản phẩm Tuy nhiên, quy trình này lại phụ thuộc vào phương pháp chiết và loại bỏ tinh dầu, tinh dầu không được thu hồi bởi vì được loại bỏ bằng phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng.

Trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn (Sc – CO 2 )

CO2 siêu tới hạn (ScCO2) là một trạng thái của CO2 khi ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao hơn điểm tới hạn (điểm tới hạn của CO2 đạt tại P = 73,8 bar và T = 31,1 o C) [66] Khi đạt đến trạng thái này, ScCO2 có thể di chuyển như môi chất lỏng và khuếch tán tốt như chất khí [67] Độ phân cực của ScCO2 có thể thay đổi dễ dàng thông qua việc điều chỉnh áp suất, nhiệt độ và sử dụng đồng dung môi do đó làm cho dung môi chiết xuất có độ phân cực phù hợp với hoạt chất có trong nguyên liệu Áp suất tăng khiến các phân tử CO2 nén càng gần lại với nhau, thúc đẩy khả năng tương tác giữa C=O dẫn đến tăng độ phân cực của dung môi Sự thay đổi độ phân cực này được đánh giá qua việc tăng khối lượng riêng của phân tử CO2 khi các phân tử càng bị ép, dẫn đến mật độ phân tử trên một đơn vị diện tích tăng theo làm cho khối lượng riêng cũng thay đổi theo chiều hướng tương tự [68] Vì vậy, ScCO2 là một dung môi hiệu quả cho quá trình chiết xuất các hoạt chất vì khả năng chọn lọc và độ khuếch tán cao [68] quy trình chiết xuất ScCO2 được trình bày trong Hình 1.6

Vicente cùng các cộng sự đã có nghiên cứu về các điều kiện chiết xuất lá hương thảo từ phương pháp ScCO2 để cho thấy tiềm năng phát triển cũng như là tối ưu được quy trình của phương pháp [69] Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện cố định nhiệt độ chiết xuất là 40 o C và lần lượt thay đổi áp suất và sử dụng đồng dung môi trong quá trình chiết

Hình 1.6 Quy trình chiết xuất bằng CO 2 siêu tới hạn [57]

Các mẫu được thực hiện khảo sát nhằm đánh giá hiệu quả, cũng như tối ưu ở điều kiện chiết thích hợp cho phương pháp:

Thí nghiệm 1: Được thực hiện ở điều kiện áp suất 30MPa, nhiệt độ 40 o C, không sử dụng đồng dung môi và thời gian chiết là 300 phút (mẫu M1-1) Sau đó phần bã của mẫu M1-1 tiếp tục được chiết trong điều kiện áp suất là 15MPa, có sử dụng đồng dung môi là 10% C2H5OH trong thời gian 180 phút

Thí nghiệm 2: Được thực hiện chiết ở điều kiện có sử dụng đồng dung môi là

C2H5OH (5%w/w) và ở áp suất là 15MPa trong thời gian 180 phút (mẫu M2)

Thí nghiệm 3: Lá hương thảo ban đầu được chiết ở điều kiện áp suất là 15MPa, không sử dụng đồng dung môi và trong thời gian là 60 phút (mẫu M3-1) Sau đó phần bã của mẫu M3-1 tiếp tục được chiết trong điều kiện như trên chỉ thay đổi là có sử dụng đồng dung môi là 10% C2H5OH và được chiết trong thời gian 120 phút (mẫu M3-2)

Bảng 1.6 Kết quả chiết xuất phân đoạn lá hương thảo bằng CO 2 siêu tới hạn [69]

Thí nghiệm Mẫu Hiệu suất chiết (%)

Phần trăm cấu tử nhẹ (%)

Kết quả thu được cho thấy, ở điều kiện áp suất thấp hơn và không sử dụng đồng dung môi thì hàm lượng carcosic acid thu được tương đối thấp, dịch chiết chủ yếu thu được chứa các cấu tử nhẹ dễ bay hơi (tinh dầu) Ở điều kiện chiết áp suất cao, việc sử dụng đồng dung môi dẫn đến hàm lượng carnosic acid tăng đáng kể do độ phân cực của dung môi tăng Bảng 1.6 cho thấy ở lần phân đoạn 1, hàm lượng carnosic acid thu được khá thấp và chỉ đạt từ 2 – 10,89% Sau đó, khi thay đổi điều kiện áp suất và sử dụng đồng dung môi lại cho kết quả thu hồi carnosic acid tăng lên đáng kể, cụ thể hàm lượng carnosic acid đạt 25,66 – 30,69% Phân tích trên cho thấy tiềm năng sử dụng của lá hương thảo sau khi chiết lấy các thành phần dễ bay hơi thì bã hương thảo vẫn còn chứa một lượng lớn hoạt chất đáng giá là đối tượng tiềm năng để nghiên cứu và ứng dụng trong tương lai

Hình 1.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan áp suất, khối lượng riêng của CO 2 [70]

TỔNG QUAN VỀ DA VÀ QUÁ TRÌNH OXY HÓA

Cấu trúc của da, và mô hình nghiên cứu

Về mặt chức năng, da là một trong những cơ quan đặc biệt nhất trên cơ thể với cấu trúc phức tạp và đóng vai trò quan trọng, đây cũng là một lĩnh vực nghiên cứu tích cực của da liễu [71] Ngoài chức năng làm rào chắn bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn và các chất độc hại từ môi trường, da còn giúp điều hòa sự thoát hơi nước, nhiệt độ cơ thể và mang lại cảm giác xúc giác [72] Với diện tích bao phủ lớn 1,7 m 2 , da là cơ quan nặng nhất chiếm tới 15% tổng khối lượng cơ thể người Da có cấu trúc gồm 3 lớp riêng biệt: lớp biểu bì (epidermis), lớp trung bì (dermis) và lớp dưới da (lớp mỡ) ( Hình 1.8 ) [73]

Lớp biểu bì, là một trong những mục tiêu nghiên cứu trong luận văn này, chủ yếu bao gồm các tế bào keratinocytes, rất giàu enzyme giải độc ROS như superoxide dismutase, catalase, thioredoxin reductase glutathione peroxidase Bên cạnh đó, lớp biểu bì cũng chứa nhiều phân tử chống oxy hóa có khối lượng phân tử thấp như tocopherol, glutathione và ascorbic acid Do đó, lớp biểu bì cung cấp một số biện pháp bảo vệ tự nhiên chống lại stress oxy hóa [74] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bảo vệ da khỏi ánh sáng bao gồm các chiến lược chống oxy hóa nhằm ngăn ngừa tổn thương lipid và protein [75, 76] tiếp xúc trực tiếp với môi trường oxy hóa [77] Hơn nữa, một số chất chống oxy hóa được áp dụng một cách có hệ thống tích tụ ở lớp ngoài cùng của biểu bì và đóng vai trò quan trọng chống lại tổn thương do ánh sáng do tia cực tím gây ra trên da [74]

Nhằm hướng tới ứng dụng chiết xuất từ cây hương thảo trên da người, luận văn này sử dụng da lợn như một mô hình thay thế do những tính chất tương đồng đã được chứng minh Cấu trúc và chức năng sinh lý của da lợn rất giống với da người [78, 79] Đặc biệt, độ dày của lớp biểu bì, lớp sừng hóa và tỷ lệ độ dày giữa da và biểu bì của da lợn tương tự như da người [80] Hơn nữa, da lợn cũng có các đặc điểm như các đường gân và pars papillaris, tương tự như da người [81] Một lợi thế quan trọng là da lợn ex vivo luôn có sẵn tại các lò mổ, giúp giải quyết các vấn đề đạo đức liên quan đến sử dụng động vật trong nghiên cứu và đồng thời giảm chi phí thí nghiệm [82].

Peroxide hóa lipid trên da

Bức xạ tia cực tím gây ra mối đe dọa môi trường cho da bằng cách làm tăng nguy cơ tổn thương quang oxy hóa do các loại oxy phản ứng (ROS) như gốc anion superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl và oxy nhóm đơn [83, 84] Các oxy phản ứng có thể gây ra quá trình oxy hóa các phân tử sinh học, bao gồm lipid và protein Trong quá trình peroxid hóa lipid, các acid béo không bão hòa đa dễ bị oxy hóa do liên kết carbon-hydro ở vị trí bis allylic ( Hình 1.9 ) [85-87] Quá trình oxy hóa này tạo thành các dạng gốc khác nhau bao gồm gốc alkyl (R⋅), gốc peroxyl (ROO⋅), hydroperoxide lipid (ROOH), và gốc alkoxyl (RO⋅) [88] Quá trình này ở da xuất hiện do tổn thương do quang oxy hóa Các phản ứng cơ bản của quá trình peroxid hóa lipid là do khả năng phản ứng cao của các nhóm methylene của chất không bão hòa đa acid béo đến tác nhân oxy hóa Quá trình peroxid hóa lipid có thể được xác định bằng cách đo lượng tổn thất của acid béo không bão hòa, lượng sản phẩm peroxid hóa sơ cấp (hydroperoxide) và lượng sản phẩm thứ cấp/sản phẩm cuối cùng (aldehyde, pentane và ethane) [89]

Sự tích tụ sản phẩm peroxy hóa lipid trong quá trình lão hóa là hệ quả của sự suy giảm hệ thống phòng vệ chống oxy hóa và gia tăng stress oxy hóa [90-92] Aldehyd được tạo ra trong quá trình peroxid hóa các acid béo không bão hòa đa (PUFA), như

4-hydroxynonenal (4-HNE), malondialdehyd (MDA), và acrolein, có một số đặc tính tương tự như AGEs (Advanced Glycation End-products) Với khả năng tạo thành các phức hợp với protein trong tế bào, Aldehyd gây ra sự rối loạn chức năng protein và tiến triển của bệnh lão hóa về mặt sinh lý [93]

Hình 1.9 Quá trình peroxide hóa lipid [94] ệztas và cộng sự (2003) đưa ra giả thuyết rằng hệ thống chống oxy húa ở da bị khiếm khuyết có thể xảy ra ở da của những bệnh nhân mắc bệnh rosacea nặng Từ kết quả sinh thiết của những bệnh nhân mắc bệnh rosacea nặng cho thấy có hàm lượng malondialdehyd (MDA) cao hơn, đây là sản phẩm peroxy hóa lipid chính của các acid béo trong tế bào da Đồng thời, hoạt động của superoxide dismutase (SOD), một enzym dập tắt gốc oxy húa, cũng bị giảm (ệztas và cộng sự, 2003) Nồng độ ROS cao hơn có thể là hệ quả của quá trình viêm như đã đề cập ở trên [95]

MDA, như một sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxid hóa lipid, có thể được chuyển hóa bằng enzyme hoặc phản ứng với các protein hoặc DNA của tế bào và mô để tạo thành các chất gây nghiện dẫn đến tổn thương phân tử sinh học [96-98] MDA cũng góp phần vào các phản ứng có hại thứ cấp như liên kết ngang protein/DNA và gây ra sự thay đổi sâu sắc về đặc tính sinh hóa của các phân tử sinh học, liên kết với sự phát triển của các bệnh như ung thư và các bệnh di truyền khác [99-105] (Bảng 1.7 )

Bảng 1.7 Các bệnh lý gây ra bởi Malondialdehyde (MDA)

Một tác dụng độc hại khác có thể xảy ra của MDA liên quan đến collagen Ngay cả khi bản chất của liên kết chéo chưa được xác định chi tiết, liên kết ngang giữa các phân tử của collagen thông qua MDA có thể góp phần đáng kể vào việc làm cứng mô tim mạch [132] Việc định lượng MDA (dưới dạng aldehyd tự do hoặc dẫn xuất thiobarbituric của nó) có thể được sử dụng như một phép đo để phát hiện và định lượng quá trình peroxid hóa lipid trong mô bị tổn thương Xét nghiệm thiobarbituric acid (TBA) đo lượng MDA được hình thành để định lượng quá trình peroxid hóa lipid Một số tác giả đã sử dụng phương pháp in vitro để xác định số lượng lipid peroxide được hình thành [93]

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu về các sản phẩm chăm sóc da từ thiên nhiên ngày càng tăng cao do người tiêu dùng ưa chuộng các sản phẩm an toàn và không gây kích ứng Lá hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) đã được biết đến với nhiều công dụng trong y học cổ truyền và hiện đại, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ nhờ vào các hợp chất phenolic Chiết xuất từ lá hương thảo có khả năng bảo vệ da khỏi quá trình peroxide hóa lipid, một trong những nguyên nhân chính gây lão hóa da Phương pháp chiết xuất CO2 siêu tới hạn là một trong những kỹ thuật hiện đại, an toàn và hiệu quả nhất hiện nay, giúp thu được chiết xuất tinh khiết và giữ nguyên các hoạt chất quý giá trong lá hương thảo Nghiên cứu này không chỉ mang lại giá trị khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng cao trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm, đóng góp vào việc phát triển các sản phẩm chăm sóc da tự nhiên, an toàn và hiệu quả Hơn nữa, việc sử dụng các nguyên liệu tự nhiên, thân thiện với môi trường trong các sản phẩm chăm sóc da là một xu hướng tất yếu, góp phần vào việc bảo vệ môi trường và phát triển bền vững Từ những lý do trên, việc nghiên cứu chiết xuất CO2 siêu tới hạn từ lá hương thảo nhằm bảo vệ da khỏi quá trình peroxide hóa lipid là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng trong cả lĩnh vực khoa học và ứng dụng thực tiễn.

THỰC NGHIỆM VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong đề tài luận văn đều đạt chuẩn phân tích và được trình bày chi tiết tại Bảng 2.1

Bảng 2.1 Hoá chất được sử dụng trong bài nghiên cứu

Hóa chất Nhà cung cấp Xuất xứ

Ascorbic acid Xylong Trung Quốc

Thuốc thử Folin – Ciocalteau Merck Đức

Methanol (HPLC) VWR Chemicals Mỹ

Phosphoric acid (HPLC) VWR Chemicals Mỹ

Acetonitrile (HPLC) VWR Chemicals Mỹ

Carnosic acid Sigma – Aldrich Mỹ

Alpha-tocopherol Sigma – Aldrich Mỹ

Thiết bị thí nghiệm

• Mỏy đo độ ẩm Satorius (MA35, Sartorius, Gửttingen, Đức);

• Cõn phõn tớch điện tử (ED 224S, Sartorius, Gửttingen, Đức);

• Máy đo UV – VIS (Thermo Genesys 10S UV–Vis, Waltham, MA, Mỹ);

• Máy cô quay chân không Buchii – R210 (Marshall Scientific, Hampton,

• Máy ly tâm Dlab (DM0412, Mỹ);

• Thiết bị chiết xuất CO2 (sản xuất bởi China Pharmaceutical Equipment Industry);

• Thiết bị hệ thống chưng cất tinh dầu (sản xuất bởi Công ty Bảo Châu, Việt Nam);

• Máy đo Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Agilent 1200 Series Gradient HPLC System, Agilent Technologies, Santa Clara, Mỹ)

Xử lý nguyên liệu

Lá hương thảo được thu hái tại huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 1 năm 2024 – là thời gian lý tưởng để tiến hành thu hoạch Trước khi thu hái, nhà vườn không tưới tiêu trong vòng 1 tuần, để đảm bảo hương thảo không ngậm nước gây ảnh hưởng mùi vị cũng như hoạt tính Sau khi thu hoạch, lá hương thảo được phơi dưới nắng mặt trời trong 2 ngày

Lá hương thảo sau sấy được nghiền nhỏ bằng máy nghiền chuyên dụng đến khi đạt kích thước đồng đều ( Hình 2.1 ) Độ ẩm nguyên liệu phải đạt dưới 12% để thuận tiện cho quá trình bảo quản và tránh tác động của vi sinh vật gây ẩm mốc [155] Cuối cùng, nguyên liệu đã xử lí được cho vào túi zip kèm gói hút ẩm và lưu trữ nơi khô ráo

Hình 2.1 (a) Lá hương thảo khô và (b) sau khi nghiền nhỏ

Phương pháp đo độ ẩm

Nguyên liệu khô được dàn trải đều trên đĩa nhôm với khối lượng là > 0,5 g và được sấy ở nhiệt độ cao (105 o C) cho đến khi máy đo phát tín hiệu báo kết thúc quá trình đo và số liệu được thể hiện trên màn hình Với mỗi lần thực hiện cần thời gian nghỉ để máy hạ nhiệt, hạn chế sai lệch kết quả Khối lượng nguyên liệu khô được tính theo công thức:

𝑚 𝑘ℎô : Khối lượng nguyên liệu khô (g)

𝑚 𝑐â𝑛 : Khối lượng nguyên liệu đã cân (g)

𝜇: Độ ẩm nguyên liệu đã cân (%)

Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước được sử dụng trong luận văn này là một hệ thống công nghiệp, chế tạo bởi Công ty Công nghệ Bảo Châu, với công suất chưng cất từ 5-10 kg nguyên liệu khô mỗi mẻ Lá hương thảo khô được chưng cất trong vòng một giờ để thu lấy tinh dầu

Cấu tạo của hệ thống, mô phỏng trong Hình 2.2 , bao gồm buồng đốt tạo hơi, sinh hàn và bộ tách tinh dầu Đầu tiên, nước được bơm vào để lấp đầy sinh hàn, sau đó lá hương thảo khô được đặt lên lưới đỡ trong buồng chưng cất Nước được cấp vào buồng đốt và được đun sôi nhờ điện trở, tạo ra hơi nước cần thiết cho quá trình chưng cất Trong suốt quá trình này, nguyên liệu chỉ tiếp xúc với hơi nước mà không bị ngâm trong nước, giúp giảm thiểu sự thất thoát của các hoạt chất do tan trong nước Điều này đảm bảo việc tách chiết các hoạt chất quý giá từ nguyên liệu một cách hiệu quả Sau khi hơi nước mang theo tinh dầu rời khỏi lá hương thảo, nó được dẫn qua hệ thống sinh hàn để ngưng tụ thành chất lỏng Tinh dầu hương thảo nhẹ hơn nước, được giữ lại trong hệ thống tách tinh dầu, nơi tinh dầu hương thảo được chiết tách dựa trên sự khác biệt về tỉ trọng giữa tinh dầu và nước Cuối cùng, tinh dầu được chiết ra khỏi nước bằng phễu chiết và được làm khan bằng Na2SO4 [156]

Hình 2.2 Hệ thống chưng cất tinh dầu hương thảo

Sau khi kết thúc quá trình chưng cất, bã hương thảo được lấy ra và sấy khô đến độ ấm không đổi dưới 12% Sau đó bã hương thảo được bảo quản trong túi kín, cho thêm các gói hút ẩm silica gel, để bã không bị ẩm mốc, đủ điều kiện để sử dụng cho các quy trình thí nghiệm sau này.

Quy trình chiết xuất phân đoạn bằng phương pháp siêu tới hạn

Trong quá trình nghiên cứu về chiết xuất sản phẩm tự nhiên, lựa chọn dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo nguyên vẹn của các thành phần cần chiết xuất Một trong những dung môi nổi bật được sử dụng là CO2, nhờ vào cấu trúc tương đối bền, tính ổn định và khả năng không gây biến tính cho sản phẩm So với các loại dung môi hữu cơ như ethanol, ethylene và propylene, CO2 được coi là một lựa chọn ưu tiên do khả năng giữ nguyên các đặc tính tự nhiên của nguyên liệu Việc lựa chọn CO2 và cồn 98 o làm dung môi không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình mà còn giảm thiểu lượng chất thải và tác động tiêu cực đến môi trường, điều mà các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm và đề cao

Quy trình chiết suất siêu tới hạn mô tả như Hình 2.3 , nguyên liệu sau khi được nạp vào bình chứa nguyên liệu được đóng kín và tiến hành quá trình chiết xuất Khí CO2 được nạp từ bên ngoài vào thiết bị chiết, sau đó dòng khí được làm lạnh và nén đến điều kiện siêu tới hạn trước khi được đẩy vào bình nguyên liệu bằng bơm piston Dưới mỗi buồng nguyên liệu, có gắn tấm phân phối khí để đảm bảo cho dòng lưu chất siêu tới hạn được phân bổ đều, tăng hiệu quả chiết xuất Dòng lưu chất siêu tới hạn sau khi tiếp xúc và lôi kéo các hợp chất có trong nguyên liệu ra ngoài, dòng lưu chất siêu tới hạn và sản phẩm được dẫn qua thiết bị giảm áp suất nhằm giảm áp suất của hệ về dưới 7,5 MPa, sản phẩm được thu hồi tại bình tách, dòng ScCO2 sau khi bị giảm áp suất quay trở về trạng thái khí ban đầu và tiếp tục tuần hoàn cho vòng chiết tiếp theo

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất CO 2

Hệ thống chiết xuất siêu tới hạn bằng CO2, được sản xuất bởi China Pharmaceutical Equipment Industry, có năng suất tối đa từ 25-30 kg Quy trình chiết dựa trên nghiên cứu của Andrea Sánchez-Camargo và cộng sự, tuy nhiên, để phù hợp với điều kiện thí nghiệm, luận văn thực hiện khảo sát ở mức 5 kg/thí nghiệm và nhiệt độ được duy trì ở 40 °C ở cả 2 phân đoạn, với khối lượng CO2 nạp vào là 30 kg/thí nghiệm Quy trình này được thiết kế để đảm bảo thu lấy hoạt chất từ lá hương thảo một cách hiệu quả và an toàn, với mục tiêu là cải thiện hiệu suất và tiết kiệm dung môi cũng như thời gian nghỉ giữa các mẻ Quy trình thí nghiệm được tiến hành như sau:

Phân đoạn 1: Mục đích của phân đoạn 1 là thu lấy các cấu tử dễ bay hơi có trong lá hương thảo, tạo điều kiện chiết xuất cho phân đoạn 2 Trong thời gian 1 giờ, tốc độ dòng dung môi là 350 L/h, chiết xuất siêu tới hạn được thực hiện trong điều kiện không sử dụng đồng dung môi Mỗi 15 phút, một lượng nhỏ sản phẩm được thu lấy để tránh việc các sản phẩm đông tụ tạo sáp khó tách

Phân đoạn 2: Là phân đoạn thu lấy hoạt chất chống oxy hóa có trong lá hương thảo

Sau khi phân đoạn 1 kết thúc, ngừng cung cấp CO2 vào ống nguyên liệu và tiến hành nâng nhiệt độ bồn chứa sản phẩm lên 65 o C nhằm hóa lỏng các chất có trong bồn và thực hiện xả đáy thu toàn bộ sản phẩm Sau 30 phút cồn được nạp vào bình chứa và hòa với dòng CO2 với tốc độ dòng là 450 L/h, quá trình chiết xuất phân đoạn 2 được tiến hành trong 2 giờ a Quy trình xử lý sản phẩm

Sản phẩm phân đoạn 1: Sản phẩm chính thu được từ quá trình chiết xuất siêu tới hạn ở phân đoạn 1 (không sử dụng đồng dung môi) chủ yếu bao gồm các hợp chất dễ bay hơi như 1,8-cineole, camphor và α-pinene [157] Ở nghiên cứu này, chỉ tập trung vào mức độ hiệu quả của phương pháp chiết xuất ở phân đoạn 2, nhằm thu lấy hàm lượng carnosol và carnosic acid Sau đó, sản phẩm được tách nước để đánh giá hiệu suất thu hồi tinh dầu và so sánh với các phương pháp khác

Hiệu suất sản phẩm phân đoạn 1:

𝑚 𝑠𝑝 : khối lượng sản phẩm thu được ở phân đoạn 1 (g)

𝑚 𝑛𝑙𝑘 : khối lượng nguyên liệu khô (g)

Sản phẩm phân đoạn 2: Trong phương pháp chiết bằng cồn ở nhiệt độ 65°C, dịch chiết sau khi lọc chân không có độ đồng nhất Tuy nhiên, đối với sản phẩm thu được ở phân đoạn 2 của quá trình chiết xuất siêu tới hạn, dịch chiết được phân chia thành hai phần ( Hình 2.4 )

• Phần trên của dung dịch có màu đen

• Phần chất rắn không tan màu vàng đất nằm ở phía dưới

Hình 2.4 Sản phẩm phân đoạn 2

Dịch chiết là phần dịch đen ở trên không lẫn chất rắn, được tách bằng phương pháp ly tâm Để giảm thiểu khả năng carnosol và carnosic acid bị lẫn vào phần chất rắn, phần rắn này được hòa tan với 30ml cồn nóng Sau đó, ly tâm hỗn hợp này một lần nữa, phần lỏng này được nhập chung với dung dịch ban đầu Quá trình tiếp theo là cô quay để thu lấy cao chiết và tính hiệu suất, cao chiết này được bảo quản ở nhiệt độ -20°C

Hiệu suất cao chiết thu được:

𝑚 𝑐𝑎𝑜 : khối lượng cao khô thu được sau cô quay (g)

𝑚 𝑛𝑙𝑘 : khối lượng nguyên liệu khô (g)

Quy trình xử lý mẫu được trình bày trong Hình 2.5

Hình 2.5 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu b Khảo sát quá trình tối ưu thông số

Trong lĩnh vực chiết xuất ScCO2, việc tối ưu hóa quy trình là một vấn đề quan trọng để đảm bảo hiệu suất và chất lượng của sản phẩm chiết xuất Trong nghiên cứu này, các thông số quan trọng như tỷ lệ đồng dung môi, áp suất quá trình chiết phân đoạn

1 và áp suất quá trình chiết phân đoạn 2 được khảo sát và được trình bày như Hình

2.6 Để thực hiện mục tiêu này, đề tài đã cố định khối lượng CO2 là 30 kg/mẻ, khối lượng nguyên liệu là 5 kg và nhiệt độ trong quá trình chiết xuất là 40 o C với tốc độ dòng là 350 (L/h) cho phân đoạn 1 và 450 (L/h) cho phân đoạn 2 Bên cạnh đó, mỗi thí nghiệm được thực hiện hai lần để đảm bảo tính chính xác

Tỷ lệ đồng dung môi: là một trong những thông số quan trọng đầu tiên được khảo sát Bằng cách thay đổi tỷ lệ này từ 5% đến 20% so với khối lượng khô, khả năng phân cực của dung môi chiết xuất để lôi kéo hoạt chất ra khỏi mẫu đã được xác định Hàm lượng hoạt chất chiết xuất phụ thuộc rất lớn vào độ phân cực của dung môi Do đó, việc khảo sát tỷ lệ đồng dung môi là bước quan trọng để chọn lựa dung môi phù hợp và tối ưu hiệu suất chiết xuất Castro-Vargas và cộng sự (2013) chỉ ra rằng sự gia tăng ethanol có thể tạo ra sự hình thành hai pha do độ bão hòa CO2, làm giảm chức năng dung môi của hỗn hợp CO2-ethanol [158] Mặt khác, việc sử dụng dư thừa ethanol làm đồng dung môi có thể làm giảm sự đóng góp của các yếu tố khác như nhiệt độ và áp suất (Reyes và cộng sự, 2014) [159] Vì vậy, tăng nồng độ ethanol không nhất thiết có nghĩa là việc chiết xuất hiệu quả hơn Do đó cần nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ của đồng dung môi đến hiệu suất chiết Áp suất phân đoạn 1: Sau khi lựa chọn dung môi tối ưu, áp suất phân đoạn 1 được khảo sát, với các giá trị: 15, 20, 25, 30 MPa Mặc dù trong phân đoạn 1 hàm lượng carnosol và carnosic acid thu được tương đối thấp [160] Với việc thay đổi áp suất ở phân đoạn 1 làm cho độ phân cực của dung môi cũng thay đổi theo, các chất có cùng độ phân cực được lôi cuốn theo ở phân đoạn này, làm cho hàm lượng của carnosol và acid tăng lên ở phân đoạn 2 Nghiên cứu của Sanchez-Camargo và cộng sự, đã chỉ ra rằng việc thay đổi áp suất ở phân đoạn 1 không chỉ làm tăng hiệu suất thu hồi tinh dầu, mà còn tăng hàm lượng carnosol và carnosic acid trong phân đoạn 2 [25] Điều này làm nổi bật tầm quan trọng của việc điều chỉnh áp suất để đạt được hiệu suất và hàm lượng hoạt chất tối ưu trong quy trình chiết xuất Áp suất phân đoạn 2: Áp suất được khảo sát với các giá trị từ 15 đến 30 MPa Việc tăng áp suất có thể làm tăng lực nén của dòng lưu chất và tương tác giữa các phân tử, ảnh hưởng đến độ phân cực của dung môi và khả năng chiết xuất Mục tiêu chính là nâng cao hiệu suất và hàm lượng hoạt chất trong lá hương thảo

Hình 2.6 Tóm tắt quy trình tối ưu hóa sử dụng chiết xuất CO 2 siêu tới hạn

Quy trình khảo sát chiết xuất hoạt chất có trong lá hương thảo bằng ethanol – H 2 O

Quy trình chiết xuất hoạt chất từ lá hương thảo được thực hiện theo điều kiện đã khảo sát từ nhóm nghiên cứu của Cuong T Q cùng cộng sự [155] Lá hương thảo sau quá trình sấy khô được chiết theo tỉ lệ rắn: lỏng là 1 : 7,5 (g/mL) trong dung môi ethanol 65% (v/v) Hỗn hợp được khuấy với tốc độ 350 rpm liên tục trong thời gian 15 phút tại nhiệt độ 65 ± 5 o C Sau đó, tiến hành lọc hỗn hợp trên qua thiết bị lọc chân không và thu lấy hai phần: phần dịch chiết và phần bã sau lọc Tiếp tục dùng bã hương thảo để thực hiện chiết lần hai tương tự quy trình trước đó Dịch chiết lần hai được gộp chung với phần dịch chiết ban đầu rồi tiến hành làm bay hơi dung môi bằng máy cô quay chân không, với nhiệt độ bể điều nhiệt là 45 ± 5 o C

Hình 2.7 Sơ đồ quá trình chiết cao tổng từ lá hương thảo khô

Phần cao chiết hương thảo sau khi đuổi dung môi được đo và ghi giá trị độ ẩm, sau đó chứa trong bình Duran tối màu, và bảo quản lạnh tại nhiệt độ –20 o C và tránh ánh nắng trực tiếp để tránh sự phân hủy hoạt chất có trong cao Sơ đồ khối quy trình được thực hiện theo Hình 2.7

Phương pháp định tính và định lượng hoạt chất

a Định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hàm lượng carnosic acid và carnosol có trong mẫu cao chiết được định lượng bằng cách tiến hành đo mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Quy trình được sử dụng trong nghiên cứu này được tham khảo từ quy trình của Vicente cùng các cộng sự và có thay đổi một vài thông số để phù hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm [69]

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc (1000 𝜇 g/mL): các chất chuẩn gồm carnosol và carnosic acid được cân chính xác đến 10,00 ± 0,01 mg vào bình định mức 10 mL Các nồng độ dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn trung gian thành các mức nồng độ 200, 400, 600, 800, và 1000 𝜇g/mL trong dung môi ethanol 99,5% (v/v) quy trình pha dung môi được trình bày trong Bảng 2.2 [161]

Bảng 2.2 Quy trình pha dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn trung gian

Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc (𝝁g/mL)

Thể tích chuẩn trung gian

Tổng thể tích dung dịch chuẩn làm việc (mL) 5 5 5 5 5 5 5

Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích

Mẫu cao chiết được cân chính xác đến 0,015 ± 0,001g và hòa tan hoàn toàn trong 10mL ethanol 99% (1500 ppm) trong vòng 15 phút dưới sự hỗ trợ của bể siêu âm Phần dung dịch sau khi hũa tan được lọc qua màng lọc cú kớch thước lỗ 0,45 àm để loại bỏ các chất bẩn nhằm bảo vệ cột sắc ký Điều kiện chạy phân tích thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Quá trình xác định hàm lượng carnosol và carnosic acid được thực hiện bằng thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo quy trình của Tena cùng cộng sự kèm một số thay đổi phù hợp với điều kiện thực nghiệm [162]

Pha động Pha A – nước: 0,1% phosphoric acid pha trong nước

Cột sắc kớ Cột sắc ký pha đảo C18 (150 ì 4,6 mm); kớch thước hạt 5àm

Tốc độ dòng 1 mL/phút

Thể tớch bơm mẫu 5 àL

Chương trình gradient nồng độ được thể hiện cụ thể trong Bảng 2.3 như sau:

Bảng 2.3 Chương trình gradient nồng độ đo HPLC

Giai đoạn Thời gian (phút) Tỉ lệ pha B%

Qua quá trình khảo sát, thu được đường chuẩn HPLC của carnosol và carnosic acid lần lượt là y 1 = 1,3339x 1 – 7,6197 và y 2 = 1,1097x 2 + 23,422 được thể hiện tại Hình

Trong đó: x: Nồng độ hoạt chất (ppm) y: Diện tích peak (mAu)

(b) Hình 2.8 Đường chuẩn (a) carnosol và (b) carnosic acid b Định lượng hàm lượng phenolic tổng (TPC) bằng thuốc thử Folin– Ciocalteu

Nồng độ (ppm) Đường chuẩn Carnosol y2 = 1,1097x2 + 23,422 R² = 0,9962

Nồng độ (ppm) Đường chuẩn Carnosic acid

Thí nghiệm được xác định hàm lượng phenolic tổng bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu là một thí nghiệm đã và đang được thực hiện rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới để xác định tổng hàm lượng phenolic từ các mẫu thực phẩm và cao chiết Trong bài luận văn này, phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol của các mẫu cao chiết được tham khảo và thay đổi từ phương pháp của Vernon cùng cộng sự [163] Độ hấp thụ của tất cả các mẫu được đo ở bước sóng 740 nm bằng cuvette thủy tinh và máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Các phép đo của mỗi chiết xuất đều được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình Kết quả được biểu thị dưới dạng đương lượng gallic acid trên mẫu phân tích (mg GAE/g cao), thông qua việc xây dựng đường chuẩn thu được với chất chuẩn gallic acid

Lập đường chuẩn gallic acid

Dung dịch gallic acid được pha đến nồng độ 1000 ppm bằng cách cân chính xác 0,005 g gallic acid và pha trong 5 mL dung dịch DMSO Dung dịch gallic acid được tiếp tục pha loãng đến các nồng độ 200, 400, 600, 800 và 1000 ppm bằng cách cho thêm DMSO Sau đú, một lượng 200 àL thuốc thử Folin – Ciocalteau được hỳt vào 40 àL dung dịch gallic acid ở các nồng độ khác nhau như trên, các mẫu Blank được chuẩn bị với quy trỡnh tương tự nhưng thay 40 àL gallic acid bằng DMSO Sau đú cỏc mẫu được đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong vòng 5 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi lấy cỏc mẫu ra khỏi bể siờu õm, thờm 3160 àL nước cất, sau đú đến 600 àL dung dịch

Na2CO3 20% vào hỗn hợp, tiếp tục đồng nhất bằng bể siêu âm trong 30 phút, chú ý thay nước để nhiệt độ luôn cân bằng ở mức nhiệt độ phòng Cuối cùng, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 740 nm Lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình

Cân 0,005 g cao chiết hòa tan trong 5 mL dung dịch DMSO 100%, sau đó pha ra các nồng độ phù hợp để thu được độ hấp thu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn gallic acid Tiến hành đo mẫu tương tự như các bước dựng đường chuẩn Lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình Ghi nhận các giá trị độ hấp thu của mẫu và tính toán hàm lượng ước tính của polyphenol tổng có trong mẫu theo công thức:

𝑇𝑃𝐶: Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g nguyên liệu khô)

𝐺𝐴𝐸: Nồng độ GAE nội suy từ đường chuẩn với gallic acid (àg/mL)

𝑣: Thể tích dung môi pha loãng (mL)

𝑚: Khối lượng cao chiết có trong thể tích 𝑣 (g)

Hàm lượng polyphenol của mẫu được tính dựa trên phương trình đường chuẩn y =

0,0014x – 0,0062 của chất chuẩn gallic acid và đường chuẩn được biểu diễn ở Hình

Hình 2.9 Đường chuẩn gallic acid ở bước sóng 740 nm c Định tính khả năng ức chế gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl)

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, được mô tả lần đầu bởi Goldschmidt và Renn năm 1932 Gốc tự do DPPH có màu tím, không tan trong nước, y = 0,0014x - 0,0062 R² = 0,9993

Nồng độ (ppm) Đường chuẩn Gallic acid tan được trong một số dung môi hữu cơ với sản phẩm khử là 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng cam Gốc tự do DPPH có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm

Tác nhân kháng oxy hóa có khả năng cho nguyên tử H để trung hòa gốc tự do DPPH, do đó làm giảm giá trị độ hấp thu quang tại bước sóng 517 nm Màu của mẫu đo chuyển từ tím đến vàng nhạt và giá trị mật độ quang OD đo được càng nhỏ nếu khả năng kháng oxy hóa của tác chất càng mạnh [164] Đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 517 nm, giá trị IC50 càng thấp đi kèm với khả năng bắt gốc tự do và kháng oxy hóa càng cao

Khả năng kháng oxy hóa của các mẫu cao chiết được khảo sát theo phương pháp kháng gốc tự do DPPH Phương pháp này dựa trên phép đo quang phổ về sự thay đổi nồng độ DPPH do phản ứng DPPH với chất chống oxy hóa, vitamin C (ascorbic acid) được sử dụng làm chất chuẩn đối chứng [165]

• Dung dịch DPPH gồm 30 àg/mL DPPH pha trong methanol 80% sao cho

• Dung dịch cao chiết được pha theo cỏc nồng độ từ 0 – 100 àg/mL trong methanol 80%

• Mẫu chứng dương vitamin C được pha ở nồng độ 0 – 10 àg/mL trong methanol 80%

Phương pháp tiến hành Đầu tiờn cho vào erlen 1200 àL dung dịch cao chiết, sau đú cho thờm 1800 àL dung dịch DPPH, bọc lại bằng giấy bạc để tránh ánh sáng, lắc đều và ủ trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng 25 o C và đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm

Mẫu đo màu của dung dịch caoc chiết ban đầu được thực hiện với 1200 àL dung dịch mẫu đo và 1800 àL dung dịch methanol 80% (𝐴𝑐)

Mẫu trắng được pha tương tự nhưng thay dung dịch cao chiết bằng dung dịch methanol 80% Mẫu trắng gồm 1200 àL dung dịch methanol 80% và 1800 àL dung dịch DPPH Mẫu chứng dương cũng được pha tương tự với 1200 àL vitamin C và

Phần trăm ức chế gốc tự do được tính theo công thức:

𝐴 𝑏 : Độ hấp thu của mẫu trắng

𝐴 𝑠 : Độ hấp thu của mẫu cao chiết

𝐴 𝑐 : Độ hấp thu màu cao chiết

Hình 2.10 Quy trình đo kháng oxy hóa

Dựa trên quy trình đo từ Hình 2.10 , chúng ta xây dựng đường chuẩn y = ax + b dựa trên phần trăm ức chế DPPH ở các nồng độ khác nhau của mẫu và chất đối chứng

Quy trình phân tích thành phần hỗn hợp sau phản ứng bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS

Phân tích sắc kí ghép khối phổ tinh dầu hương thảo được thực hiện trên hệ thống sắc ký khí - GC (Agilent G1530A, Agilent Technologies, Hoa Kỳ), cùng với cột HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) Khí mang helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút đóng vai trò như pha động, áp suất đầu cột là 9,3 psi Sắc ký được kết hợp với máy dò khối phổ -

MS (Agilent 5973N, Technologies, Hoa Kỳ) để định danh hợp chất Nhiệt độ đầu phun là 250°C, tỷ lệ phân chia là 1:50 [49] Điều kiện phân tích MS: tác nhân bắn phá ion: EI+; electron energy: 70 eV; nhiệt độ bộ nguồn: 230°C; phạm vi quét khối lượng: 40 - 400 amu, khối phổ mẫu được so sánh với khối phổ chuẩn trong thư viện NIST Ver 2.0a

Mẫu đo được pha theo tỷ lệ: 20 μL chất cần phân tích + 1000 μL acetone Mẫu được hút và đem đi phân tích GC – MS với chu trình nhiệt như sau:

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hiệu suất chiết xuất

Trong quá trình nghiên cứu chiết xuất hoạt chất kháng oxy hóa từ lá cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp siêu tới hạn, tỉ lệ đồng dung môi trong phân đoạn 2 đã được xác định là yếu tố quan trọng đối với hiệu suất chiết xuất Ethanol là một dung môi có tính phân cực cao, có khả năng tương tác với các hợp chất phân cực khác như các polyphenol có trong lá hương thảo nên được sử dụng như một tác nhân có thể ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết xuất [66] Kết quả thí nghiệm ( Hình 3.2 ) đã cho thấy mối liên hệ giữa tỉ lệ đồng dung môi và hiệu suất chiết xuất

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ đồng dung môi lên hiệu suất thu cao chiết

Từ Hình 3.2 đã chứng minh được hiệu suất chiết xuất phân đoạn 2 tăng mạnh mẽ theo nồng độ cồn, đặc biệt bứt phá từ 5% lên 10% Đáng chú ý, cao chiết 20% cồn đạt hiệu suất vượt trội (3,78 ± 0,10%), gấp 3 lần so với 5% cồn (1,26 ± 0,02%) Sự gia tăng tỷ lệ đồng dung môi ethanol không chỉ đóng vai trò then chốt trong việc nâng cao hiệu suất chiết xuất mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến cơ chế của quá trình Khi tỷ lệ ethanol tăng, độ phân cực của dung môi siêu tới hạn cũng được nâng lên, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hòa tan các hợp chất phân cực, từ đó tối ưu hóa quá trình chiết

H iệu su ất ca o chiết P Đ 2 (%) g ethanol / g nguyên liệu khô (%) xuất Nghiên cứu của Juchen và cộng sự (2019) đã củng cố thêm cho nhận định này, khi chứng minh hiệu suất chiết xuất tăng dần tương ứng với tỷ lệ ethanol trên nguyên liệu khô là 0,5:1; 1:1 và 2:1, đạt lần lượt 5,51%, 16,26% và 19,66% ở điều kiện áp suất 100 bar và nhiệt độ 40°C [178] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Vicente và cộng sự cũng một lần nữa khẳng định hiệu quả của việc bổ sung ethanol vào quá trình chiết xuất ScCO2 đối với lá hương thảo [69], khi hiệu suất tăng gấp đôi ở tỷ lệ đồng dung môi 5% và 10% Việc tăng cường ethanol còn giúp giảm thiểu nguy cơ quá bão hòa dung môi với các chất cần chiết xuất, từ đó hạn chế tối đa tổn thất sản phẩm [179]

Tổng hợp các phân tích trên, kết luận rằng việc sử dụng ethanol 20% làm dung môi mang lại hiệu suất chiết xuất vượt trội so với các tỷ lệ dung môi khác, đặc biệt đối với lá hương thảo.

Hàm lượng polyphenol tổng của cao chiết phân đoạn 2

Các hợp chất phenolic có trong lá hương thảo thể hiện những hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư [17] Vì vậy, việc khảo sát tổng hàm lượng polyphenol là cần thiết trong nghiên cứu này, nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ lá hương thảo Kết quả được thể hiện trong Hình 3.3

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi lên hàm lượng polyphenol tổng

T P C ca o chiết P Đ 2 (m g G AE /g ca o ) g ethanol / g nguyên liệu khô (%)

Kết quả Hình 3.3 thể hiện chiều hướng giảm hàm lượng polyphenol tổng của cao chiết phân đoạn 2 Khi tỉ lệ ethanol được điều chỉnh từ 5% lên 10%, lượng TPC thu được cũng thay đổi theo chiều hướng tích cực, từ 206,78 ± 5,79 mg GAE/g cao lên 230,14 ± 4,71 mg GAE/g cao Đồng thời số liệu thu được còn cho thấy hàm lượng cao đột ngột ở tỉ lệ đồng dung môi 10% (230,14 ± 4,71 mg GAE/g cao) Tuy nhiên, khi tỉ lệ ethanol tiếp tục tăng lên 15%, lượng TPC bắt đầu giảm xuống còn 190,36 ± 4,91 mg GAE/g cao, và tiếp tục giảm khi tỉ lệ ethanol đạt 20% (173,08 ± 2,00 mg GAE/g cao) Chiều hướng biến đổi này có thể được giải thích bằng sự xuất hiện của các chất có độ phân cực cao nhưng không phải là polyphenol Nhận định nêu trên cũng tương đồng với nghiên cứu của Michielin và cộng sự (2009) bởi họ đã quan sát thấy hàm lượng hoạt chất giảm khi sử dụng quá nhiều ethanol trong chiết xuất CO2 siêu tới hạn [180] Với kết quả có được, có thể dễ dàng nhận định tỉ lệ đồng dung môi 10% dường như đang cung cấp một môi trường dung môi tối ưu để hòa tan và chiết xuất các hợp chất phenolic từ lá cây hương thảo Nghiên cứu của Genena và cộng sự [181] cũng ủng hộ kết luận này, khi sử dụng chiết xuất siêu tới hạn CO2 với ethanol làm đồng dung môi để chiết xuất các hợp chất phenolic từ hương thảo Báo cáo này cho thấy tỷ lệ ethanol được điều chỉnh từ 0% lên 10%, tổng hàm lượng phenolic trong dịch chiết cũng đồng thời được cải thiện, tăng lên từ 8,4% lên 11,8% Mặc dù nghiên cứu này không tập trung vào việc xác định tỷ lệ ethanol tối ưu, kết quả của báo cáo trên cho thấy xu hướng tương tự với nghiên cứu hiện tại Việc sử dụng đồng dung môi ethanol trong chiết xuất siêu tới hạn CO2 có khả năng nâng cao hiệu quả chiết xuất các hợp chất phenolic từ hương thảo như trong thí nghiệm của Chang và cộng sự [182] Tỉ lệ đồng dung môi được chứng minh là tỷ lệ thuận với độ phân cực của dung môi chiết, dẫn đến việc tăng hàm lượng chất thu được Từ những dẫn chứng nêu trên, có thể đi đến kết luận rằng tỉ lệ đồng dung môi 10% đã thể hiện rõ điểm mạnh trong việc chiết xuất các hợp chất phenolic từ lá cây hương thảo, cung cấp một sự cân bằng hợp lý giữa khả năng hòa tan và chất lượng chiết xuất, dẫn đến TPC cao nhất.

Định lượng hoạt chất có trong cao chiết phân đoạn 2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Carnosol và carnosic acid, những hợp chất phenolic diterpene có mặt trong hương thảo (Rosmarinus officinalis), được xem là nhân tố chủ chốt tạo nên khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ của loại thảo dược này Trong các nghiên cứu trước đây, người ta đã chỉ ra rằng carnosol và carnosic acid đóng góp hơn 90% hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hương thảo [46] Với mục tiêu đánh giá chính xác hàm lượng của các hợp chất này, kết quả của HPLC còn cho thấy được sự biến đổi của tỉ lệ đồng dung môi đối với hàm lượng của các hoạt chất carnosic acid và carnosol Thông tin này là cơ sở quan trọng để xác định tỉ lệ đồng dung môi tối ưu, từ đó tối đa hóa hiệu suất chiết xuất ở phân đoạn 2

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ đồng dung môi lên hàm lượng carnosic acid và carnosol

Qua quan sát Hình 3.4 , có thể thấy phương pháp HPLC cho thấy mẫu 10% có hàm lượng carnosic acid (530,94 ± 0,81 mg/g cao) cao hơn gần 1,15 lần so với mẫu sử dụng 5% ethanol làm đồng dung môi (461,13 ± 0,35 mg/g cao) Kết quả này có thể được giải thích bởi khi tăng độ phân cực của dung môi, các hợp chất có độ phân cực trung bình như carnosol và carnosic acid trong lá hương thảo có khả năng tương tác

H àm lượng t ro ng ca o chiết P Đ 2 (m g /g ) g ethanol / g nguyên liệu khô (g/g)

Carnosol Carnosic acid tốt hơn [33] Hàm lượng carnosic acid có sự thay đổi nghịch chiều khi tăng tỉ lệ đồng dung môi lên 15% và 20%, cụ thể giảm từ 520,78 ± 0,50 mg/g cao xuống 516,53 ± 0,13 mg/g cao Nguyên nhân của xu hướng thay đổi ngược nhau kể trên là vì trong quá trình chiết xuất, độ phân cực của dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác và lôi kéo các hợp chất có độ phân cực tương đồng ra khỏi nguyên liệu [183] Nhưng khi tăng đến một mức độ nào đó, môi trường được tạo ra không còn phù hợp cho sự tương tác với các hợp chất trong lá cây hương thảo, dẫn đến sự xuất hiện của các hợp chất không mong muốn trong cao chiết, làm giảm hàm lượng cuối cựng của carnosol và carnosic acid [184] Nghiờn cứu của Seủorỏns và đồng nghiệp đã chứng minh rằng việc bổ sung 5% ethanol (w/w) vào CO2 siêu tới hạn làm tăng đáng kể lượng carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid và các dẫn xuất methylated của chúng được chiết xuất [185] Sự hiện diện của các hợp chất trong dịch chiết sau khi bổ sung ethanol cho thấy hiệu quả rõ rệt của đồng dung môi này trong việc cải thiện khả năng chiết xuất các chất chống oxy hóa phân cực từ hương thảo.

Khả năng kháng peroxide hóa lipid trong dầu đậu phộng của cao chiết phân đoạn 2

Malondialdehyde (MDA), là một sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa lipid, thường được sử dụng như một chỉ số sinh học đánh giá mức độ stress oxy hóa lipid, phản ánh mức độ tổn thương của lipid do các gốc tự do gây ra [186, 187] Dầu đậu phộng, với thành phần hóa học đa dạng bao gồm nhiều loại acid béo (oleic, linoleic, palmitic), thường sản sinh MDA trong điều kiện oxy hóa [188] Cao chiết có khả năng phân tán tốt trong nền dầu đậu phộng, tạo ra hiệu quả kháng oxy hóa lipid đáng kể, nhờ đó dầu đậu phộng được chọn làm mô hình nghiên cứu khả năng kháng peroxide hóa lipid [189] Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa lipid của các mẫu cao chiết với các tỉ lệ đồng dung môi khác nhau trên nền dầu đậu phộng cho thấy hàm lượng MDA tạo thành càng thấp, hiệu quả ức chế peroxide hóa lipid càng cao

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi lên hàm lượng MDA

Kết quả tại Hình 3.5 cũng cho thấy rằng hàm lượng MDA giảm khi tăng tỷ lệ đồng dung môi từ 5% lên 10%, sau đó hàm lượng này lại tăng dần ở các tỷ lệ đồng dung môi cao hơn Sự thay đổi với xu hướng giảm dần này tương đồng với kết quả hàm lượng TPC trước đó Ở tỷ lệ thấp (5%), lượng dung môi chưa đủ để có thể tách các hợp chất chống oxy hóa trong nguyên liệu dẫn đến khả năng ức chế sản sinh MDA kém Kết quả tốt nhất thu được là ở thí nghiệm tại tỉ lệ đồng dung môi 10%, với hàm lượng MDA thấp nhất (6,02 ± 0,12 mg MDA/kg mẫu), thấp hơn 2,3 lần so với mẫu dầu không chứa cao chiết (13,90 ± 0,07 mg MDA/kg mẫu) do khi tăng tỉ lệ đồng dung môi, độ phân cực của dung môi cũng thay tăng theo Tuy nhiên carnosol và carnosic acid lại là hai chất có độ phân cực trung bình [21], điều này trực tiếp gây ra ảnh hưởng đến độ tương tác giữa dung môi và hoạt chất Vậy nên tăng tỉ lệ đồng dung môi làm giảm hàm lượng carnosol và carnosic acid - hợp chất chiếm phần lớn hoạt động chống oxy hóa trong lá hương thảo, dẫn đến giảm khả năng ức chế sản sinh MDA [190] Có thể nói, cao chiết càng chứa nhiều hợp chất chống oxy hóa gây càng góp phần hạn chế tăng sinh hàm lượng MDA - gây ra sự suy giảm của khả năng chống oxy hóa của cao chiết

TB AR S c ao c hiết PĐ 2 (m g M DA /k g m ẫu ) g ethanol / g nguyên liệu khô (%)

M Ospina và cộng sự (2017) cũng chứng minh kết quả tương tự khi khảo sát tỉ lệ đồng dung môi ethanol tăng dần từ 2 – 8% khả năng ức chế sản sinh TBARS tăng 2,5 lần [191] Điều này có thể được giải thích là do ethanol, với vai trò là một đồng dung môi, giúp tăng cường khả năng chiết xuất các hợp chất phenolic, được biết đến với đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ Việc tăng nồng độ ethanol dẫn đến chiết xuất nhiều hợp chất phenolic hơn, làm tăng khả năng ức chế TBARS Tuy nhiên ở một nghiên cứu khác của Castro-Vargas và cộng sự (2013) chỉ ra rằng sự gia tăng ethanol có thể tạo ra sự hình thành hai pha do độ bão hòa CO2, làm giảm chức năng dung môi của hỗn hợp CO2-ethanol [158]

Từ phân tích và so sánh trên, kết luận tỉ lệ đồng dung môi ethanol 10% là tối ưu nhất cho quy trình chiết xuất ScCO2 hoạt chất chống oxy hóa từ lá hương thảo, do cho kết quả hàm lượng TPC, MDA và HPLC tốt nhất, đồng thời đảm bảo hiệu suất thu cao

Tỉ lệ này được chọn và sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo

KHẢO SÁT ÁP SUẤT PHÂN ĐOẠN 1 CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT SIÊU TỚI HẠN

Sau khi lựa chọn được tỉ lệ đồng dung môi sử dụng cho quy trình chiết ở phân đoạn

2, áp suất là yếu tố tiếp theo được khảo sát ở hai phân đoạn Việc khảo sát áp suất của phân đoạn 1 được tiến hành trước phân đoạn 2 là vì việc điều chỉnh áp suất ở phân đoạn 1 làm thay đổi độ phân cực của dung môi, từ đó kéo theo các chất có độ phân cực tương tự và là tiền đề dẫn đến sự gia tăng hàm lượng carnosol và carnosic acid trong phân đoạn 2 [192] Mặc dù trong phân đoạn 1 hàm lượng carnosol và carnosic acid thu được tương đối thấp Tuy nhiên, nghiên cứu của Sanchez-Camargo và cộng sự đã chỉ ra rằng điều chỉnh áp suất chiết xuất ở bước đầu có thể giúp loại bỏ các thành phần kém phân cực, từ đó làm giàu đáng kể carnosic acid và carnosol trong bước thứ hai [25] Điều này chứng minh rằng việc tối ưu hóa các thông số quy trình ScCO2 có thể hỗ trợ cho việc thu được các chiết xuất hương thảo có hoạt tính sinh học cao hơn Ở nghiên cứu này, áp suất phân đoạn 1 được thử nghiệm theo thứ tự tăng dần từ 15 MPa đến 30 MPa trong điều kiện được trình bày tại Bảng 3.1

Bảng 3.1 Tóm tắt thông số vận hành trong khảo sát áp suất phân đoạn 1

Phân đoạn Áp suất (MPa) Nhiệt độ

Tỉ lệ đồng dung môi (% w/w)

Hiệu suất của sản phẩm

Kết quả về hiệu suất của sản phẩm phân đoạn 1 (PĐ1) và cao chiết phân đoạn 2 (PĐ2) nhìn chung có xu hướng tăng tỉ lệ thuận với áp suất phân đoạn 1 Kết quả được trình bày tại Hình 3.6

Hình 3.6 Hiệu suất chiết tinh dầu và cao chiết khi thay đổi áp suất phân đoạn 1

Trong nghiên cứu này, kết quả thu được cho thấy hiệu suất chiết xuất của sản phẩm phân đoạn 1 tăng rõ rệt khi áp suất tăng, đạt mức cao nhất là 3,96 ± 0,63% tại áp suất

30 MPa Kết quả này không chỉ cao hơn so với nghiên cứu của Carvalho Jr và cộng sự (2005) [193], trong đó hiệu suất chỉ đạt 3,3% khi ở cùng áp suất, mà còn phù hợp với xu hướng tăng hiệu suất chiết xuất khi áp suất tăng được báo cáo bởi Zermane và

H iệu su ất ( %) Áp suất phân đoạn 1 (MPa)

Sản phẩm phân đoạn 1 Cao chiết phân đoạn 2 cộng sự (2010) [1] Trong nghiên cứu của Zermane và cộng sự, việc tăng áp suất từ

10 MPa lên 22 MPa đã dẫn đến sự tăng hiệu suất từ 1,35% lên 3,52% Sự tăng hiệu suất chiết xuất khi áp suất tăng có thể được giải thích bởi khả năng thâm nhập vào cấu trúc vật liệu của các phần tử trong dung môi siêu tới hạn được cải thiện dưới áp suất lớn [194] Điều này làm tăng khả năng hòa tan và lôi kéo các chất ra khỏi vật liệu Đặc biệt, ở áp suất 30 MPa, các thành phần khó tan như sáp cây cũng bị hòa tan và loại bỏ, tạo ra không gian trống trong bã hương thảo sau quá trình chiết xuất Từ đó, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa hoạt chất và dung môi trong phân đoạn 2, góp phần nâng cao hiệu suất chiết xuất tổng thể Đối với phân đoạn 2, áp suất phân đoạn 1 có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất cao chiết phân đoạn 2 Trong Hình 3.6 cho thấy hiệu suất chiết xuất cao chiết đạt 2,62 ± 0,08% ở 15 MPa, mức thấp nhất trong các điều kiện thử nghiệm Điều này có thể được giải thích bởi ở áp suất này, độ phân cực chưa đủ lớn để hòa tan các hoạt chất, đồng thời hạn chế khả năng khuếch tán của dung môi vào nguyên liệu, từ đó làm giảm hiệu quả chiết xuất [195] Kết quả nói trên đồng thời chỉ ra rằng khi thay đổi áp suất từ 15 MPa lên 30 MPa, hiệu suất của tinh dầu và cao chiết đều tăng, giá trị này ở áp suất 30 MPa thể hiện hiệu quả vượt trội (5,22 ± 1,15%) Vì khi áp suất tăng khiến các phân tử CO2 nén càng gần lại với nhau, giúp thúc đẩy khả năng tương tác giữa C=O dẫn đến tăng độ phân cực của dung môi [68] Sự thay đổi độ phân cực này được đánh giá qua việc tăng khối lượng riêng của phân tử CO2 khi các phân tử càng bị ép, dẫn đến mật độ phân tử trên một đơn vị diện tích tăng theo [196] Điều này nhấn mạnh vai trò quan trọng của áp suất phân đoạn 1 trong việc tối ưu hóa quá trình chiết xuất.

Hiệu quả thu hồi hoạt chất tính trên nguyên liệu khô

Nghiên cứu này so sánh giá trị thu hồi carnosol và carnosic acid ở các mức áp suất khác nhau (15 MPa, 20 MPa, 25 MPa và 30 MPa) với mục tiêu là xác định áp suất phân đoạn 1 tối ưu để tính toán giá trị thu hồi hàm lượng hoạt chất (Recovery) trong bước tiếp theo Hiệu quả thu hồi hoạt chất không chỉ là một thông số quan trọng để đánh giá hiệu suất của cả quy trình mà còn là cơ sở để tính toán lợi ích về mặt kinh tế, từ việc giảm chi phí nguyên liệu, năng lượng đến tăng sản lượng và chất lượng sản phẩm cuối cùng

Hình 3.7 Hiệu suất thu hồi hàm lượng hoạt chất trên cao chiết khảo sát áp suất phân đoạn 1

Kết quả định lượng carnosol và carnosic acid bằng HPLC từ các mẫu cao chiết phân đoạn 2 ( Hình 3.7 ) cho thấy hiệu suất thu hồi các hoạt chất này phụ thuộc đáng kể vào áp suất phân đoạn 1 trong quy trình chiết xuất ScCO2 Đáng chú ý, hiệu suất thu hồi carnosic acid tăng rõ rệt khi áp suất phân đoạn 1 tăng từ 15 MPa lên 30 MPa, đạt giá trị tối đa 29,89 ± 0,25 mg/g lá khô ở áp suất 30 MPa Hiện tượng này có thể được giải thích bởi ở áp suất phân đoạn 1 cao, dung môi CO2 ở phân đoạn này có khả năng loại bỏ phần lớn tạp chất, tạo điều kiện cho cao chiết phân đoạn 2 đạt độ tinh khiết cao [197] Đồng thời, áp suất phân đoạn 1 cao cũng có thể làm thay đổi cấu trúc vật liệu thực vật, tạo không gian trống để CO2 ở phân đoạn 2 dễ dàng xâm nhập sâu hơn vào nguyên liệu, tăng khả năng tiếp xúc và hòa tan hoạt chất [198] Mặt khác, hiệu suất thu hồi carnosol không biến thiên theo xu hướng rõ ràng khi thay đổi áp suất, tuy nhiên vẫn đạt mức cao nhất ở 30 MPa Sự khác biệt này có thể liên quan đến độ phân cực khác nhau của carnosol và carnosic acid, dẫn đến khả năng tương tác với CO2 ở các mức áp suất khác nhau

H iệu quả t hu hồ i ( m g/g lá k hô ) Áp suất phân đoạn 1 (MPa)

Hàm lượng polyphenol tổng và khả năng kháng peroxide hóa lipid

Sau khi tính hiệu quả thu hồi cao chiết, các mẫu khảo sát được tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng đồng thời đánh giá khả năng chống oxy hóa lipid của cao chiết ( Hình 3.7 )

Hình 3.8 Hàm lượng polyphenol và MDA của cao chiết khi khảo sát áp suất phân đoạn 1

Kết quả tại Hình 3.8 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng (TPC) và mức độ oxy hóa lipid (TBARS) thay đổi tỉ lệ thuận với áp suất phân đoạn 1 Ở áp suất 15 MPa, hàm lượng TPC đạt 230,14 ± 4,71 mg GAE/g cao và TBARS là 6,02 ± 0,12 mg MDA/kg mẫu Khi áp suất được điều chỉnh đến 30 MPa, hàm lượng polyphenol đạt giá trị cao nhất (267,69 ± 5,80 mg GAE/g cao) và TBARS giảm xuống mức thấp nhất (5,30 ± 0,10 mg MDA/kg mẫu)

Xu hướng tăng dần của hàm lượng TPC khi áp suất tăng cho thấy áp suất cao giúp chiết xuất polyphenol hiệu quả hơn bằng cách phá vỡ các liên kết trong tế bào thực vật, với ngưỡng áp suất 30 MPa cho hiệu quả chiết xuất cao nhất Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của A del Pilar Sanchez-Camargo và cộng sự vào năm 2014, chứng minh rằng hàm lượng carnosic acid, một loại polyphenol chính trong hương

Dâu đậu phộng 15 MPa 20MPa 25 MPa 30 MPa

T P C ca o chiết P Đ 2 (m g G AE / g ca o ) T B ARS ca o chiết P Đ 2 (m g M DA/k g m ẫu) Áp suất phân đoạn 1 (MPa)

TBARS TPC thảo, tăng từ 20,4 mg/g ở 15 MPa lên 403 mg/g ở 30 MPa [25] Con số kể trên có thể dẫn đến một nhận định rằng việc tăng áp suất trong bước đầu tiên có thể thay đổi khả năng hòa tan của dung môi, từ đó chiết xuất được nhiều polyphenol hơn Điều này được thể hiện qua hệ số truyền khối KXA (KXA-15MPa = 0,67.10 -2 s -1 ; KXA-30MPa = 3.10 -

2s -1 ) của dung môi siêu tới hạn khi áp suất tăng [199], đồng thời giúp dung môi siêu tới hạn ở điều kiện áp suất 30 MPa thu lấy lượng lớn tinh dầu và các chất như nhựa cây, sáp tạo điều kiện thuận lợi cho nguyên liệu khi tiếp tục chiết xuất trong phân đoạn 2

Hàm lượng MDA thấp nhất thu được ở áp suất 30 MPa (5,30 ± 0,10 mg MDA/kg mẫu), thấp hơn 2,6 lần so với mẫu đối chứng (13,90 ± 0,07 mg MDA/kg mẫu), cũng là mẫu thể hiện khả năng chống oxy hóa tốt nhất Kết quả này tương đồng với hàm lượng carnosol và carnosic acid thu được (75,93 ± 5,98 mg/g và 572,33 ± 0,34 mg/g), cho thấy áp suất cao hơn tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất hai hoạt chất chống oxy hóa chủ yếu của hương thảo [160] Theo nghiên cứu của Rong Tsao và cộng sự năm 2010, các hợp chất polyphenol có khả năng kháng oxy hóa, nhưng hàm lượng polyphenol lớn không luôn đồng nghĩa với hoạt tính kháng oxy hóa tốt [200] Hiệu quả kháng oxy hóa phụ thuộc vào các nhóm -OH và sự liên kết giữa các hợp chất để ức chế gốc tự do [201] Trong quá trình chiết xuất siêu tới hạn, áp suất cao có thể phân chia polyphenol vào các phân đoạn khác nhau [202]

Kết quả này phản ánh sự phù hợp giữa hiệu quả chiết xuất polyphenol và khả năng chống oxy hóa của cao chiết hương thảo, cho thấy việc thay đổi áp suất phân đoạn 1 trong quá trình chiết ScCO2 hai bước không chỉ mang lại hiệu suất chiết xuất cao cho phân đoạn 1 mà còn làm tăng khả năng thu hồi hoạt chất cho phân đoạn 2 Với tất cả những dữ kiện đã trình bày bên trên, có thể dễ dàng kết luận rằng mức áp suất tối ưu nhất được chọn để sử dụng cho phân đoạn 1 là 30 MPa

KHẢO SÁT ÁP SUẤT PHÂN ĐOẠN 2 CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT SIÊU TỚI HẠN

Với tỉ lệ đồng dung môi là 10% và áp suất phân đoạn 1 là 30 MPa đã được chọn ra từ những thí nghiệm trước đó, áp suất phân đoạn 2 tiếp tục được kiểm nghiệm thông qua

4 trường hợp dưới các mức áp suất các khác nhau, lần lượt là: 15 MPa, 20 MPa, 25 MPa và 30 MPa như được trình bày trong Bảng 3.2 Thông số này là thông số quan trọng nhất trong cả quy trình chiết xuất bởi áp suất phân đoạn 2 ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân cực của dung môi trong quá trình chiết xuất hoạt chất trong phân đoạn này

Bảng 3.2 Tóm tắt thông số vận hành trong khảo sát áp suất phân đoạn 2

Phân đoạn Áp suất (MPa) Nhiệt độ

Tỉ lệ đồng dung môi (% w/w)

Định lượng hoạt chất có trong cao chiết

Các mẫu cao chiết được tiến hành định lượng carnosol và carnosic acid sử dụng phương pháp HPLC, kết quả được thể hiện trong Hình 3.9

Hình 3.9 Hàm lượng carnosol và carnosic acid trong cao chiết khảo sát áp suất phân đoạn 2

H àm lượng t ro ng ca o chiết P Đ 2 (m g /g ) Áp suất phân đoạn 2 (MPa)

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tăng áp suất phân đoạn 2 trong quá trình chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn không phải là một chiến lược hiệu quả để thu hồi carnosol và carnosic acid Sự gia tăng áp suất làm thay đổi khả năng hòa tan của dung môi, không còn phù hợp để chiết xuất chọn lọc hai hợp chất mong muốn Đồng thời, áp suất cao cũng thúc đẩy quá trình chiết xuất các tạp chất không mong muốn như chlorophyll, sáp, lipid và các hợp chất phenolic khác Điều này dẫn đến sự suy giảm đáng kể hàm lượng carnosol và carnosic acid trong dịch chiết, đồng thời ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng, độ tinh khiết của sản phẩm

Kết quả thực nghiệm ( Hình 3.9) đã chứng minh rõ xu hướng này cho thấy hàm lượng carnosol và carnosic acid giảm dần khi tăng áp suất từ 15 MPa đến 30 MPa Carnosol và carnosic acid cao nhất là mẫu có áp suất phân đoạn 2 là 15 MPa với hàm lượng lần lượt là 75,93 ± 5,98 mg/g và 572,32 ± 3,44 mg/g Những giá trị này cao hơn 1,22 lần so với mẫu áp suất 30 MPa (467,88 ± 5,34 mg/g và 62,00 ± 11,82 mg/g) Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc lựa chọn và kiểm soát chặt chẽ các thông số chiết xuất, đặc biệt là áp suất, để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi các hợp chất mục tiêu bằng dung môi siêu tới hạn.

Hàm lượng polyphenol tổng và khả năng kháng peroxide hóa lipid

Các mẫu cao chiết được định lượng polyphenol nhằm mục đích đánh giá sơ bộ hiệu quả của việc thay đổi áp suất ở phân đoạn 2 Kết quả khảo sát được trình bày như

Hình 3.10 Hàm lượng polyphenol và MDA của cao chiết khi khảo sát áp suất phân đoạn 2

Phân tích số liệu từ thí nghiệm cho thấy một mối tương quan đáng chú ý giữa áp suất phân đoạn 2 và thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cao chiết hương thảo thu được bằng phương pháp chiết xuất ScCO2 Cụ thể, khi áp suất tăng từ 15 MPa lên 30 MPa, hàm lượng TPC tăng nhẹ, từ 267,69 ± 5,80 mg GAE/g cao lên 282,92 ± 2,90 mg GAE/g cao Kết quả này phù hợp với nguyên lý đã được chứng minh trước đó, García-Risco và các cộng sự năm 2011, việc tăng áp suất không chỉ làm tăng khối lượng riêng của dung môi siêu tới hạn (D15MPa = 780,9 kg/m 3 và D30MPa

= 910,8 kg/m 3 ) mà còn làm cho các phân tử CO2 bị nén mạnh biến đổi tính chất của dung môi, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất các polyphenol có độ phân cực cao [199]

Tuy nhiên, khả năng chống peroxide hóa lipid cao chiết, được đánh giá thông qua chỉ số TBARS (hàm lượng MDA), không thể hiện sự gia tăng tương ứng Hiện tượng này có thể được giải thích bởi thực tế là các polyphenol chủ chốt đóng vai trò quyết định trong hoạt tính chống oxy hóa của hương thảo lại có độ phân cực trung bình Do đó,

Dầu đậu phộng 15 MPa 20MPa 25 MPa 30 MPa

T P C ca o chiết P Đ 2 (m g G AE / g ca o ) T B ARS ca o chiết P Đ 2 (m g M DA/k g m ẫu) Áp suất phân đoạn 2 (MPa)

TBARS TPC việc tăng áp suất không mang lại hiệu quả đáng kể trong việc chiết xuất các hợp chất này, dẫn đến sự suy giảm khả năng ức chế sản sinh MDA của cao chiết

Từ phân tích trên có thể đi đến nhận định rằng mặc dù áp suất 30 MPa mang lại hàm lượng TPC cao nhất, nhưng sự khác biệt này không đáng kể so với áp suất 15 MPa (chỉ cao hơn 1,05 lần) Ngược lại, khả năng kháng peroxid hóa lipid của cao chiết thu được ở 15 MPa (5,30 ± 0,10 mg MDA/kg mẫu) vượt trội hơn hẳn, gấp đôi so với ở

30 MPa (9,67 ± 0,09 mg MDA/kg mẫu) Do đó, có thể khẳng định rằng cao chiết hương thảo thu được ở áp suất 15 MPa thể hiện hoạt tính sinh học vượt trội hơn

Tóm lại, sau khi khảo sát quá trình chiết xuất hoạt chất từ lá cây hương thảo bằng phương pháp siêu tới hạn, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỉ lệ đồng dung môi phù hợp nhất để chiết xuất carnosol và carnosic acid là 10%, áp suất chiết xuất cho phân đoạn

1 là 30 MPa và phân đoạn 2 là 15 MPa

HIỆU QUẢ CHIẾT XUẤT SIÊU TỚI HẠN

Trong nghiên cứu này, quá trình chiết xuất bằng ScCO2 được thực hiện qua hai bước để thu được hai sản phẩm chính: sản phẩm phân đoạn 1 và cao chiết phân đoạn 2 Ban đầu, nguyên liệu thô được đưa vào buồng chiết của hệ thống ScCO2 với áp suất là 30 MPa, nhiệt độ được duy trì ở 40 o C và tốc độ dòng CO2 350 L/h hoạt động như một dung môi để hòa tan các thành phần hợp chất có độ phân cực kém, mang mùi hương đặc trưng từ lá hương thảo Phần bã còn lại được tiếp tục xử lý trong buồng chiết CO2 với tỉ lệ đồng dung môi ethanol là 10% để thu cao chiết và tốc độ dòng là

450 L/h, chứa các hợp chất không bay hơi như flavonoid và polyphenol

3.4.1 So sánh sản phẩm phân đoạn 1 và sản phẩm phân đoạn 2 từ phương pháp CO 2 siêu tới hạn

Trong quá trình khảo sát, mặc dù không sử dụng đồng dung môi ở phân đoạn 1, việc tăng áp suất chiết vẫn làm thay đổi độ phân cực của dung môi siêu tới hạn theo chiều hướng đi lên [192] Điều này có thể dẫn đến 1 phần carnosol và carnosic acid bị hòa tan vào sản phẩm phân đoạn 1 Để đánh giá ảnh hưởng này luận văn đã tiến hành phân tích hàm lượng carnosol và carnosic acid trong cả hai phân đoạn bằng phương pháp HPLC Kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Các thông số so sánh giữa sản phẩm phân đoạn 1 và phân đoạn 2

Tỉ lệ đồng dung môi (%Ethanol)

75,93 ± 5,98 Ở phân đoạn đầu của quá trình chiết xuất ScCO2, các hợp chất kém phân cực mang hương được tách ra Điều này phù hợp với đặc tính của ScCO2 vì các hợp chất có độ phân cực tương đồng với CO2 dễ dàng bị hòa tan và kéo theo ra khỏi nguyên liệu [203] Do đó, hàm lượng hoạt chất là không đáng kể so với cao hương thảo thu được ở phân đoạn 2, hàm lượng carnosic acid trong sản phẩm phân đoạn 1 (62,70 mg/g cao) kém 9,1 lần so với cao chiết trong phân đoạn 2 (572,32 mg/g cao) Kết quả phân tích cho thấy, việc thay đổi áp suất lên 30 MPa trong phân đoạn 1 không làm hòa tan đáng kể hàm lượng carnosol và carnosic acid Điều này là do độ phân cực của dung môi siêu tới hạn ở áp suất này vẫn chưa đủ để hòa tan hiệu quả các polyphenol Từ đó, có thể nhận định rằng lựa chọn tiếp tục tăng áp suất phân đoạn 1 là không mang lại lợi ích Chính vì vậy phương án tối ưu là tập trung vào việc điều chỉnh áp suất ở phân đoạn 2 để đạt hiệu quả chiết xuất tốt nhất Kết quả nghiên cứu nhằm khẳng định hiệu quả và tính chọn lọc cao của phương pháp chiết xuất CO2 siêu tới hạn từ lá hương thảo Phương pháp này vừa cho phép thu hồi hiệu quả các hoạt chất có hoạt tính sinh học mạnh như carnosol và carnosic acid trong phân đoạn 2, mà còn tách chiết thành công các hợp chất dễ bay hơi trong phân đoạn 1

Sự phân tách rõ ràng này tạo ra hai dòng sản phẩm có giá trị ứng dụng khác biệt: phân đoạn 1 giàu các hợp chất mang hương tiềm năng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm và hương liệu, trong khi phân đoạn 2 chứa các hoạt chất có giá trị cao trong lĩnh vực thực phẩm chức năng và dược phẩm Carnosol và carnosic acid hầu như không hòa tan trong phân đoạn 1 càng khẳng định vai trò của chiết xuất phân đoạn, giúp tối ưu hóa việc thu hồi các hoạt chất mục tiêu.

So sánh sản phẩm phân đoạn 1 của phương pháp CO 2 siêu tới hạn và tinh dầu từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

và tinh dầu từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp lôi cuốn hơi nước từ lâu đã là phương pháp phổ biến để sản xuất tinh dầu, được sử dụng dựa trên nguyên lý các hợp chất dễ bay hơi có thể được cuốn theo hơi nước khi chúng bị đun nóng [204] Khi hơi nước và các hợp chất dễ bay hơi được làm lạnh, chúng sẽ ngưng tụ và tách ra thành hai pha: pha dầu và pha nước [204] Trong nghiên cứu này, sản phẩm phân đoạn 1 của phương pháp chiết xuất ScCO2 được so sánh về hiệu suất và thành phần hóa học với tinh dầu từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Cả hai phương pháp đều được thực hiện trong 1 giờ và đều sử dụng cùng một nguồn nguyên liệu được nhắc đến ở mục 2.2.1 Sản phẩm từ cả hai phương pháp được phân tích bằng sắc ký khí-khối phổ (GC-MS) Việc so sánh hiệu quả chiết xuất từ hai phương pháp này không chỉ giúp xác định ưu điểm của chiết siêu tới hạn so với lôi cuốn hơn nước, mà còn đồng thời tìm ra một sản phẩm thay thế nhằm ứng dụng trong ngành công nghiệp hương liệu a Hiệu quả chiết xuất giữa 2 phương pháp

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các phương pháp chưng cất khác nhau cho tinh dầu có hàm lượng khác nhau và chất lượng khác nhau [205, 206] Sau khi sấy khô, lá hương thảo được chưng cất bằng lôi cuốn hơi nước dưới điều kiện tương tự như bài nghiên cứu của Lê và cộng sự [207], thời gian chưng cất được tính từ khi xuất hiện giọt tinh dầu đầu tiên cho đến 1 giờ sau Chiết xuất ScCO2 lá hương thảo cho hiệu suất sản phẩm ở phân đoạn 1 cao hơn so với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, vì chưng cất lôi cuốn hơi nước là phương pháp phân tách các chất dựa vào khả năng bốc hơi như monoterpen và sesquiterpen [208] Trong khi đó, ScCO2 có khả năng hòa tan các chất như một pha lỏng và có độ khuếch tán cao như một pha khí Điều này cho phép phương pháp siêu tới hạn hòa tan tốt các chất trong nguyên liệu dựa vào độ phân cực, có thể thay đổi linh hoạt qua việc điều chỉnh áp suất và nhiệt độ [209] Nhờ khả năng này, phương pháp siêu tới hạn có sự chọn lọc cao khi hòa tan các chất, mang lại hiệu quả chiết xuất vượt trội [74]

Tương tự với các báo cáo trên, hiệu suất chưng cất tinh dầu từ lá hương thảo sau 1 giờ đạt 2,15 ± 0,19% nhưng phương pháp chiết xuất ScCO2 lại cho hiệu suất gần gấp đôi (3,96 ± 0,63%) ở áp suất 30 MPa Điều này có thể vì ScCO2, chiết xuất dựa trên độ phân cực, các chất có độ phân cực kém hoặc không phân cực cũng có thể được trích ly như sáp, nhựa và diệp lục trên lá hương thảo Kết quả trên tương tự với nghiên cứu của Carvalho và cộng sự và Fornari và cộng sự, với hiệu suất lần lượt là 4% (w/w) ở 24,78 MPa và 40 o C sau 250 phút[193], 3,5% (w/w) ở 24,78 MPa, 40 o C và 270 phút [210] Bên cạnh đó, cùng điều kiện chưng cất lôi cuốn hơi nước, nghiên cứu Boutekedjiret và các đồng nghiệp của ông chỉ cho hiệu suất là 1,2% [211] Hiệu suất chiết tinh dầu từ lá hương thảo có thể bị ảnh hưởng bởi quá trình xử lý nguyên liệu thô, từ đó góp phần phá vỡ cấu trúc cũng như các túi chứa tinh dầu trên lá, làm tăng hiệu quả lôi cuốn các hợp chất dễ bay hơi [212]

Hình 3.11 Tinh dầu hương thảo thu được theo phương pháp (a) chưng cất lôi cuốn hơi nước và (b) CO 2 siêu tới hạn phân đoạn 1

Phương pháp siêu tới hạn không chỉ cho hiệu suất thu hồi tinh dầu cao hơn so với phương pháp lôi cuốn hơi nước, mà còn tạo ra sản phẩm có giá trị và màu sắc khác biệt ( Hình 3.11 ) Nghiên cứu của Donelian và cộng sự cho thấy ScCO2 đạt được hiệu suất chiết xuất ấn tượng 5,07%, cao hơn đáng kể so với mức 1,50% của lôi cuốn hơi nước [213] Hơn nữa, ScCO2 còn cho thấy khả năng chiết xuất đa dạng hơn, với số lượng hợp chất được xác định (56 hợp chất) vượt xa lôi cuốn hơi nước (18 hợp chất)

Sự khác biệt này xuất phát từ việc ScCO2 hoạt động ở nhiệt độ thấp, ngăn ngừa sự phân hủy nhiệt của các hợp chất dễ bay hơi Do đó, tinh dầu chiết xuất bằng ScCO2 có mùi hương gần với lá tươi, nhờ khả năng chiết xuất toàn diện hơn và giữ lại các hợp chất thơm tinh vi và nhạy cảm với nhiệt độ, những hợp chất mà phương pháp lôi cuốn hơi nước có thể làm mất đi hoặc biến đổi

Tóm lại, với hiệu suất vượt trội, chất lượng tinh dầu cao hơn và khả năng chiết xuất đa dạng các hợp chất, ScCO2 đã khẳng định là một phương pháp tiên tiến và hiệu quả hơn đáng kể so với phương pháp chưng cất hơi nước truyền thống trong việc chiết xuất các hợp chất mang hương dễ bay hơi từ lá hương thảo b So sánh thành phần Để xác định rõ hơn về thành phần cụ thể của hai sản phẩm, nghiên cứu này tiến hành phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Kết quả phân tích thành phần tinh dầu hương thảo bằng phương pháp chứng cất lôi cuốn hơi nước và chiết xuất siêu tới hạn được trình bày trong Hình 3.12

Hình 3.12 Phổ GC – MS của tinh dầu hương thảo từ phương pháp (a) chưng cất lôi cuốn hơi nước và (b) sản phẩm phân đoạn 1

Tinh dầu hương thảo thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, được xác định bao gồm 37 hợp chất khác nhau với các thành phần chính bao gồm: α-pinene (30,04%), eucalyptol (18,15%), verbenone (7,14%), borneol (4,43%), geraniol (3,47%) – Bảng 3.4 Nghiên cứu của Tran và cộng sự cũng cho thấy hàm lượng và thành phần khá tương tự gồm 30 hợp chất với thành phần cao nhất là α-pinene (25,99%) [214] Mặt khác, kết quả phân tích tinh dầu Rosmarinus officinalis L bằng phương pháp ScCO2 cho thấy có sự xuất hiện của 53 hợp chất, trong đó, các thành phần chính bao gồm: verbenone (19,35%), α-pinene (11,63%), eucalyptol (10,99%), geraniol (6,58%), borneol (6,23%) – Bảng 3.4 Kết quả phân tích cho thấy thành phần tinh dầu thu được tương đối tương đồng với nghiên cứu trước, với 55 hợp chất được xác định, trong đó verbenone chiếm 18,85% [215]

Bảng 3.4 Kết quả GC-MS của tinh dầu hương thảo từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết suất CO 2 siêu tới hạn

Thứ tự xuất hiện Tên chất

Tinh dầu (chưng cất lôi cuốn hơi nước)

Sản phẩm phân đoạn 1 (ScCO 2 )

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết xuất CO2 siêu tới hạn từ lá hương thảo cho ra hai loại sản phẩm tinh dầu với thành phần và tính chất khác nhau đáng kể Trong phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, các cấu tử nhẹ như α-pinene (t sôi

= 156 o C), β-pinene (t sôi = 167 o C) và eucalyptol (t sôi = 177 o C) có hàm lượng cao hơn, lần lượt chiếm 30,04%; 4,03% và 18,15% trong tinh dầu Điều này do nguyên lý chưng cất dựa vào sự bốc hơi, nơi các cấu tử nhẹ và có nhiệt độ sôi thấp dễ bay hơi và được tách ra trong thời gian ngắn (khoảng 1 giờ) Phương pháp này chủ yếu thu được các hợp chất có nhiệt độ sôi thấp, do đó sản phẩm có mùi nhẹ, dễ bốc nhưng thiếu độ sâu sắc đặc trưng của lá hương thảo

Ngược lại, sản phẩm từ quá trình chiết xuất CO2 siêu tới hạn chứa hàm lượng cao hơn ở các cấu tử nặng Cụ thể, borneol (nhiệt độ sôi 213 o C) chiếm 5,21% và geraniol (nhiệt độ sôi 230 o C) chiếm 6,58% trong sản phẩm phân đoạn 1 Đặc biệt, verbenone được coi là thành phần quan trọng trong tinh dầu của Rosmarinus officinalis L có giá trị sinh học cao như hoạt động chống viêm, chống nhiễm trùng và diệt sâu bọ [216- 218] Phương pháp CO2 siêu tới hạn cho hiệu quả chiết xuất hợp chất verbenone rất tốt, đạt hàm lượng 19,35%, gấp 2,7 lần so với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Sự khác biệt này xuất phát từ khả năng hòa tan của CO2 siêu tới hạn, cho phép chiết xuất hiệu quả các hợp chất có nhiệt độ sôi cao mà phương pháp chưng cất không thể thu được do thời gian ngắn và cơ chế bay hơi còn hạn chế Do đó, sản phẩm phân đoạn 1 có mùi hương đậm đà và phức tạp và có khả năng lưu hương lâu hơn, phản ánh đầy đủ các đặc trưng như lá hương thảo tươi

Nhìn chung, tinh dầu hương thảo thu được từ hai phương pháp đều có các thành phần chính tương tự nhau, tuy nhiên vẫn có sự khác biệt về tỉ lệ thành phần hợp chất Song, phương pháp ScCO2 không chỉ cho phép thu được tinh dầu hương thảo với thành phần phong phú hơn mà còn giữ được nhiều hợp chất có giá trị cao hơn, làm tăng tiềm năng ứng dụng trong các ngành công nghiệp cao cấp như mỹ phẩm và dược phẩm Trong khi đó, phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, dù thu được ít hợp chất hơn, vẫn duy trì được vai trò quan trọng trong các ứng dụng truyền thống nhờ chi phí thấp và quy trình thực hiện đơn giản.

Tiềm năng từ các phương pháp chiết xuất khác nhau

Trong nghiên cứu này, quy trình chiết xuất lá hương thảo bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn đã được khảo sát để tìm ra các điều kiện tối ưu nhằm chiết xuất hiệu quả hoạt chất carnosol và carnosic acid Quy trình này bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn 1 sử dụng ScCO2 100% ở áp suất 30 MPa để hòa tan các hợp chất kém phân cực và các hợp chất mang hương; giai đoạn 2 sử dụng ScCO2 với 10% ethanol (g/g nguyên liệu khô) ở áp suất 15 MPa để thu được dịch chiết có hàm lượng carnosol và carnosic acid cao Mặc dù CO2 ở phân đoạn 1 là dung môi không phân cực nhưng do chiết xuất ở áp suất cao nên một phần nhỏ carnosol và carnosic acid bị hòa tan, với hàm lượng carnosic acid đạt 62,70 mg/g và hàm lượng carnosol