Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Bước đầu nghiên cứu xử lý rơm rạ bằng Trichoderma SPP làm thức ăn nuôi trùn quế

Dé khắc phục điều đó, chúng tôi đã sử dụng các chủng nam mốc làTrichoderma được phan lập từ đất trong và phụ phẩm nông nghiệp dang phân hủy, cókhả năng phân giải cellulose và lignin cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-— w›lca

TRẢN ANH VŨ

Chuyén nganh: CONG NGHE SINH HOCMã số: 60 42 80

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, thang 12 nam 2013

TRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA -DHQG -HCM

Cán bộ hướng dan khoa học : TS TRAN HOANG DUNG

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYEN ĐỨC LƯỢNG

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS.TS DONG THỊ THANH THU

Cán bộ cham nhận xét 2 : PGS.TS NGUYEN THUY HUONG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Trường Dai học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 24 tháng 12 năm 2013

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS.TS NGUYEN ĐỨC LƯỢNG2 PGS.TS DONG THỊ THANH THU3 PGS.TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG4 TS HUỲNH NGỌC OANH

5 TS PHAN NGỌC HOAXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

_—======== NHIEM VU LUAN VAN THAC SIHọ và tên học viên: TRAN ANH VU Phái: Nam

-0Qo -Ngày tháng, năm sinh: 18/11/1985 Nơi sinh: Bình ĐịnhChuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 11310633

I TÊN DE TÀI: “BƯỚC DAU NGHIÊN CUU XỬ LY ROM RA BANGTRICHODERMA SPP LAM THUC AN NUOI TRUN QUE”

Il NHIEM VU LUẬN VAN:

- Phan lập các chung Trichoderma có kha năng phân giải cellulose va lignin cao va

nhân sinh khối bang phương pháp lên men bán rắn.- - Xác định các các điều kiện nuôi cay ban đầu đến sinh tổng hop enzyme cellulase,

lignin peroxidase va manganese peroxidase.

- _ Xác định các thành phan chủ yếu có trong rom ra.- _ Xác định yếu tô ảnh hưởng đến hàm lượng lignin khi xử lý rom ra bang dung dịchkiểm

- - Xác định các yếu tô thời gian, độ âm, và tỷ lệ chế phẩm VSV ảnh hưởng đến quá

trình phân hủy rơm rạ.

- Thi nghiệm phối trộn rơm ra sau xử lý với phân bò tươi để nuôi trun qué.Ill NGAY GIAO NHIỆM VỤ: thang 01 nam 2013

IV NGAY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: thang 11 năm 2013Vv CÁN BỘ HƯỚNG DAN: TS TRAN HOÀNG DŨNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

Lời dau tiên, con thành kính ghi on công lao dưỡng dục của ba mẹ va gia đình đã

cho con có được ngày hôm nay.

Em xin bảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Nguyễn Đức Lượng đã tậntình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm cho em trong thời gian học tập và hoàn thành

luận văn.

Em cũng vô cùng biết ơn thầy TS Trần Hoàng Dũng đã có những gợi ý quý báucũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và tận tình hướng dan, giúpđỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện luận văn nay

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, các cán bộ công táctại phòng Đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt

thời gian học tập nghiên cứu tại trường.

- Các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã dạy dỗ, truyền đạt nhiều kiếnthức bố ích và kỹ năng về chuyên ngành học cho em trong suốt thời gian học tập tại

trường.

Một lân nữa tôi xin được tỏ lòng tri ân của tôi đền tat cả mọi người.

Trân trọng

TRAN ANH VŨ

Ở việt Nam, rom ra sau mỗi vu thu hoạch lúa được sử dụng với rất nhiều mụcđích: dùng dé lót chuồng cho vật nuôi, dùng để trồng nam rơm, sử dụng làm chất đốt chocác hộ nhà nông, làm thức ăn cho gia súc, dùng sản xuất điện, làm đệm lót vận chuyềnhàng hóa dé vỡ, vận chuyển hoa quả hoặc đốt ngay tại ruộng Tuy nhiên việc xử lý rơmrạ trên thực tế lại chưa hiệu quả nên dễ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏecủa con người Dé khắc phục điều đó, chúng tôi đã sử dụng các chủng nam mốc làTrichoderma được phan lập từ đất trong và phụ phẩm nông nghiệp dang phân hủy, cókhả năng phân giải cellulose và lignin cao nhằm rút ngăn được thời gian phân giải và sửdụng chúng làm nguồn thức ăn nuôi trùn qué (Perionyx excavatus) Mục đích vừa cảithiện van dé môi trường và vừa góp phan đem lại hiệu quả kinh tế cho người nông dânnhư là biện pháp thực hiện chu trình khép kín trong sản xuất nông nghiệp.

Qua đánh giá các chỉ tiêu về hàm lượng cellulose va lignin cho thay rơm ra đượcTrichoderma spp phân giải hiệu quả nhất sau 30 ngày ủ, với ty lệ giống ban dau là 5% vàđộ am là 65%, tương ứng với hàm lượng cellulose 11.4% và lignin giảm 3.67% so vớiban đầu

Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở mức thức ăn: 80% phân bò tươi : 20% rơmrạ (qua ủ) trùn quế có sinh khối tăng lên nhiều nhất với HSST của trùn là 154.55% vàkhối lượng trùn tăng thêm 60g sau 30 ngày nuôi

In Vietnam, rice straw after each harvest is used for many purposes: using forlivestock bedding, cultivating straw mushroom, using as fuel for farmer, feeding cattle ,applying electric production, padding fragile goods , transporting fruit or burning directlyon field However, the treatment of rice straw, in fact, doesn’t get much efficiency andis causing environmental pollution and affecting human health To overcome these, weused the molds were 777choderma strains which were isolated from plant soil anddegrading agricultural wastes with high capability of cellulose and lignin degradation toreduce the degradation time Then, we used degraded rice straw as a food source ofearthworm (Perionyx excavatus) Our purposes were to improve environmental problemsand contribute to get economic efficiency for farmers in agricultural production withclosed cycle.

Through the criterial evaluation of cellulose and lignin contents showedTrichoderma spp were the most effective degradation after 30 days cultivation , with theinitial strain rate of 5 % and 65 % humidity, the correlatively contents of cellulose andlignin decreased 11.4 % and 3.67 % from initial materials

Research results also showed that in the food ratio: 80 % cow dung : 20 % ricestraw (through composting), earthworm biomass increased the highest rate with growthrate is 154.55 % and the earthworm weight increased 60g after 30 days cultivation.

Bảng 4.1: Sơ tuyến khả năng phân giải của enzyme cellulase và ligninase đối với cơ chất

Bảng 4.2: Kết quả xác định hoạt tính phân giải cellulose và lignin theo phương phápkhuếch tán enzyme trong thạch đĨĩa ¿6xx SE 3S 5 5111 1 183g cưng: 46Bảng 4.3: Ảnh hưởng thời gian nuôi cay đến hoạt tinh cellulase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 50

Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính lignin peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 51

Bảng 4.5: Ảnh hưởng thời gian nuôi cay đến hoạt tinh manganese peroxidase của ba

CHUNG THICHOACrING PP PP - aaaaaa 51

Bang 4.6: Ảnh hưởng độ pH đến hoạt tinh cellulase của ba chủng Trichoderma 53Bảng 4.7: Ảnh hưởng độ pH đến hoạt tính lignin peroxidase của ba chủng 7?ichoderma54Bảng 4.8: Ảnh hưởng độ pH đến hoạt tính manganese peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 54

Bảng 4.9: Ảnh hưởng độ am đến hoạt tinh cellulase của ba chủng Trichoderma 55Bảng 4.10: Ảnh hưởng độ âm đến hoạt tinh lignin peroxidase của ba chủng Trichoderma58Bảng 4.11: Ảnh hưởng độ am đến hoạt tính manganese peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 57

Bang 4.12: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tinh cellulase của ba chủng Trichoderma 58Bang 4.13: Anh hưởng nhiệt độ đến hoạt tinh lignin peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi ceccccccccccce cece eee e cece ee eee E LLL LEED EELS DEED E EE EE EEE EAU E Ầ 59

Bảng 4.14: Anh hưởng nhiệt độ đến hoạt tinh manganese peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 60

Bảng 4.15: Một số thành phần hóa học trong rơm ban đầu - 2s sex se £sesee: 62Bang 4.16: Sự thay đôi hàm lượng lignin theo nồng độ dung dịch nước vôi 63Bang 4.17: Sự thay đôi hàm lượng lignin theo thời gian xử lý dung dịch nước vôi 63Bảng 4.18: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự phân giải cellulose và lignin 64

Bảng 4.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm VSV đến sự phân giải cellulose và lignin 67Bảng 4.21: Thanh phần hóa học của rơm ban đầu và rơm sau xử lý 30 ngày 68Bang 4.22: Kết quả thu hoạch frủn QUẾ :-G- «6 SE E939 EEE E1 ve: 69

Hình 2.1: Cau trúc của celÏU]OS© ¿ ¿2E SE E233 SE EEEE3E1 8 1E 511311111111 ce 5

Hình 2.2 : Quá trình phân giải cellulose của hệ enzyme cellulase - - 6

Hình 2.3: Cấu trúc của lignin gỗ mm - 2 E338 SE SE E2 EEEE rrrkreeg 10Hình 2.4: Các đơn vị cau tạo chủ yếu của Ïïgnin c - St SE ceEsEskeeeeeeeeeree 11Hình 2.5: Liên kết pho biến trong phân tử lignin ¿<5 SE E+E£eEsEskeeeseeeeeree 12Hình 2.6: Khuan lạc và bào tử của Trichoderma sp sau 3 ngày nuôi cay trên môi trường

Hình 2.7: Trùn qué (Perionyx eXCdVđÍ€§) - St Tn TS TT TT HH HH gai 20Hình 4.1: Hình quan sát đại thé và vi thé của Trichoderma T5 (Hypocrea koningii) 47Hình 4.2: Hình quan sát đại thé và vi thé của Trichoderma T10 (Trichoderma harzianum)48Hình 4.3: Hình quan sát đại thé và vi thé của Trichoderma T11(Hypocrea jecorina) 49Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 50

Hình 4.5: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cây đến hoạt tính lignin peroxidase của ba

CHUNG THICHOACrING PP PP - aaaaaa 51

Hình 4.6: Biéu đồ anh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tinh manganese peroxidase của

D;890001115///6///27⁄/22./7/7 RE 52

Hình 4.7: Biểu đồ ảnh hưởng độ pH đến hoạt tinh cellulase của ba chủng Trichoderma 53Hình 4.8: Biểu đồ ảnh hưởng độ pH đến hoạt tinh lignin peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 54

Hình 4.9: Biểu đồ ảnh hưởng độ pH đến hoạt tinh manganese peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 55

Hình 4.10: Biểu đỗ ảnh hưởng độ âm đến hoạt tinh cellulase của ba chủng 7”ichoderma56Hình 4.11: Biểu đồ ảnh hưởng độ âm đến hoạt tinh lignin peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 57

Hình 4.12: Biểu đồ ảnh hưởng độ âm đến hoạt tính manganese peroxidase của ba chủng

TV IiCHOCCVINA vic ẼẺẼẺẼ8 58

Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lignin peroxidase của ba chủng

TÌCÍO(Í©FTW( c5 2c 0080930880980 1108035 1180 111105510 500v cv c0 CC E10 9 60

Hình 4.15 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính manganese peroxidase của ba chủng

TV ICH OAC ING wi 000n808e na Ầ 61

Hình 4.16: Sự thay đôi ham lượng lignin theo nồng độ dung dịch nước vôi 63Hình 4.17: Sự thay đôi hàm lượng lignin theo thời gian xử lý dung dịch nước vôi 64Hình 4.18: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự phân giải cellulose và

0 — ố.ốỐốỐốỐốỐốỐố 65

Hình 4.19: Ảnh hưởng của độ âm đến sự phân giải cellulose va lignin 66Hình 4.20: Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến sự phân giải cellulose và lignin 67Hình 4.21: Thành phan hóa học của phân gia SUC - ¿26+ E SE +E+E£#EsE+E+esesereree 69Hình 4.22: Biểu đồ biểu diễn khối lượng trùn tăng - + 6 + SE+EeE+eEeeseceree 70Hình 4.23: Biểu đồ biểu diễn hệ số tăng trưởng của trùn quỀ ¿- 5 6 2s ss£s£sxe: 70

CBD:CMC:DC:DNS:H jecorina:H koningii:HSST:

Lac:

LiP:

MnP:MT:

NT:P excavates:PGA:

T hazianum:T reesei:T viride:VSV:

CarbonhydrateCacboxy] metyl Cellulose

Nghiệm thứcPerionyx excavatesPotatoes Glucose AgarTrichoderma harzianumTrichoderma reeseiTrichoderma virideVi sinh vat

PHAN 1: MỞ ĐẦU - 1n 1112111 1115151 1111105 11x 111TT 7T HT TH TH HT HH HH Ha |PHAN 2: TONG QUAN TÀI LIỆU - S1 2S E2315151531111 1515111 1151311 11111 115111112E01151 1 tri |"819)/619)07.))8:(6)10: 01 OOEÔÓÔỒ 32.2 TONG QUAN VE CELLULOSE VÀ LIGNIN 2c 2221 1E E11111115111111EE 1s keeg 42.2.1 Tổng quan về cellUÏOSe: -.- 1 S2 St 1111 E3E51115515E1515511 111117111511 E111 1E tri 42.2.2 Tổng quan lignin c.cccccccceccsescecescscescscscesesvscececesveveceevsceevevssecavsseceseaveceeaveceeveees 102.3 TONG QUAN VE TRICHODERMA occceccsccsescsesssessvsesesecsssvscsesescssstevscsesevecsesevstsesteees 162.3.1 NQUON BOC 1 16

2.3.2 Vi tri phan loat 0LXliiii 16

2.3.3 Đặc điểm hình thai ccccccccccecescsceccscscesesvscecesesvscecevsceevevacacevsseeuseavaceeevsceeerses 17

2.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học - Q2 1Q 2101111111111 1 1111k se ra 18

;x.\9)I619)07.))014559:40))19)00 2ã 20c0 202.4.2 Đặc tính sinh học của trùn quê ¬——— 202.4.3 Đặc tính sinh ly của frùn QUẾ c1 1E 1115311 E11111 115115 811111111 HH gưyg 212.4.4 Đặc điểm sinh SAN ccccccccccccccccccccsssssccesesecseecescsssssccsesstvssessscssssascassssssescasesevsecaeeaee 22

2.4.5 Quy trình chăm sóc nuôi dưỡng - - E2 2S S2 123 111111111111 111111111 1x rr 22

2.4.6 Khai thác — chế biến ST S1 13813153113 155 155151151111 11 1111350311111 11 n1 HH ng 25

2.4.7 Biện pháp phòng và trị một số bệnh - ¿+ + s s23 SE EEEE 1E SEE5EEE5155 111111111 1E ExEtrrri 26

PHAN 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU i22 222 S xEEEEESErkrrsrsrred 28

3.1 VAT ¡0 28

3.2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CUU Lu cccccccccscscssssscesecescececsceccusvsvevecececiesvsvscasesevavaveceesens 31

3.2.1 Phương pháp vi sinh VậtK - 2-2 222222222222 2223 1151111111111 1 1111 và 313.2.2 Phurong phap hoa Ly ŨÚẮ£ỶŸÄŸẼ 333.2.3 Phương pháp hóa sinh - +5 + + + + c2 2 2222222332233 1115 155111111111 1 1111 ve 34

3.2.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm: (St T E13 11115111 1111111 E211 51 1E HH gui 42

3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu - St SE S1 12113 11111111 1551111 E111 EE SE TH tiện 44PHAN 4: KET QUA VA BIEN LUẬN - 2 1 1211211511 11111111155115511 111011118 HH tin 45

4.1 PHAN LẬP, TUYẾN CHỌN CÁC CHUNG TRICHODERMA CÓ KHẢ NANG PHAN

GIẢI CELLULOSE VÀ LININ - c2 1111 1511551 1511111 TT EE TT TH HH ryg 45

4.2 TUYẾN CHON CÁC CHUNG TRICHODERMA CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI

CELLULOSE VÀ LIGNIN CAO TREN MOI TRƯỜNG LEN MEN BAN RẮN 46

4.3 QUAN SAT ĐẶC DIEM HINH THAI 3 CHUNG TRICHODERMA DUOC CHON 47

PEROXIDASE CUA 3 CHUNG 7RJ/CHODERIMÍA Ác x11 51111111111 1111181111111 11kg 49

4.4.1 Ảnh hưởng của thời 81an: 2 St nx x1 1111 55115511 111111 E5 T111 E111 HH gưyg 494.4.2 Ảnh hưởng của pH: - + cSsS 3E 1153111515511 1111111 E111 1101111 E111 rat 534.4.3 Ảnh hưởng của độ ẩm: 1 tt S11 11 111111 5111511 111111 111111 E111 111g ưyg 554.4.4 Ảnh hưởng của nhiỆt đỘ: - cen 2-2 252222222222 223 1115115111111 11 111111111 ke 584.5 MOT SO THÀNH PHAN HOA HỌC TRONG ROM BAN ĐẦU c S-: 624.6 KHAO SAT SỰ THAY DOI HAM LUONG LIGNIN KHI XỬ LY BANG DUNG DICH

KEM 0 62

4.6.1 Sự thay đổi ham lượng lignin theo nông độ VOi ec eececesesceseceseseeseseceseevsceeereeees 624.6.2 Sự thay đồi hàm lượng lignin theo thời gian cccececeseecescececesesceeeseeveecereeves 63

4.7 THIẾT LẬP QUY TRÌNH XỬ LÝ ROM RA BANG HON HỢP 3 CHUNG

TRICHODERMA CHO SỰ SINH TRUONG CUA TRUN QUE (P EXC4⁄4TUS) 644.7.1 Anh hưởng của thời gian lên sự phân giải cellulose va lignin 5c scsscss2 644.7.2 Anh hưởng của độ ẩm lên sự phân giải cellulose và lignin 555cc sscszss2 654.7.3 Ảnh hưởng của tý lệ chế phẩm VSV lên sự phân giải cellulose và lignin 674.7.4 Thành phan hóa học trong rom ban dau và sau khi xử lý bang hỗn hợp 3 chủng

/⁄ 1.2.2.4, 700700577 eee E EEE EEE EEE EEUU EEE OU H eet bode bene ee teeny 68

4.8 NUOI TRUN QUE (P EXCAVATES) BANG ROM RA DA DUOC XỬ LY BẰNG 3CHUNG TRICHODERMA VA BO SUNG PHAN BO TƯƠI - 5225 ccccc2ccsxcee 69PHAN 5: KET LUẬN VA DE NGHỊ, 5225:2223: 23E21221211212122121121 2121212 tr 72SN 0nbà:aadađầđầđađađiaiaaaaaaaadaảdẢddŸẢẢẢ 725.2 DE NGHỊ, Sa H10 111 1511511111111 1555151515151 5xx HT HH an HH HH Ha 73

PHAN 1:

MO DAU

PHAN 1: MO DAUViệt Nam là một trong những nước có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sản xuấtnông nghiệp Với xu thế hội nhập nên kinh tế thế giới, bên cạnh việc mở rộng diện tíchđất sản xuất, nên nông nghiệp Việt Nam đã và đang ứng dụng các thành tựu khoa học tiêntiễn vào sản xuất nông nghiệp nhăm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nôngnghiệp dé đáp ứng nhu cau lương thực ngày càng tăng ở trong nước và xuất khẩu.

Năng suất sản phẩm nông nghiệp tăng thì sẽ kéo theo phụ phẩm cũng tăng theo Vìthông thường lượng phụ phẩm nông nghiệp luôn cao hơn sản phẩm thu hoạch được.Trong các loại phụ phẩm nông nghiệp như phụ pham từ cây bap, cây mía, đậu phông, matdừa, mùn cưa thì rơm rạ chiếm tỷ lệ lớn và dễ phân hủy ngoài tự nhiên nhất Nên trongphạm vi đề tài chúng tôi lựa chọn rơm rạ như là nguồn phụ phẩm chính dé tiễn hành các

thí nghiệm.

Theo Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, hiện ở Việt Nam cây lúa là cây lươngthực chính với sản lượng trung bình hàng năm khoảng 38 đến 40 triệu tấn trên diện tíchgieo trông khoảng 7,44 triệu ha Trong do, hai vùng trồng lúa trọng điểm của cả nước làĐồng bằng sông Cửu Long với diện tích là 3,87 triệu ha và Đồng bằng sông Hồng vớidiện tích 1,1 triệu ha Nông dân có tập quán canh tác lúa từ hai đến ba vụ trong năm Nếutrung bình một tan lúa cho ra 1 đến 1,2 tan rơm ra thì với sản lượng lúa hiện nay, ước tínhlượng rơm rạ thải ra có thé lên đến 40 đến 46 triệu tấn/năm

[http:/Awww.khoahoc.com.vn]

Thói quen của người nông dân là sau khi gặt xong lúa thì sẽ chất rơm thành đồngngoài đồng rồi đốt cả rơm và gốc rạ khi vào mùa khô và vào mùa mưa thì họ thường suốtphun rơm ngay cạnh bờ kênh, rạch Chỉ một số ít được sử dụng lại cho việc sản xuất nắmrơm, hoặc dùng cho che phủ đất cho cây trồng cạn, cho chăn nuôi đại gia súc Kết quả làkhông những gây ô nhiễm môi trường mà còn lãng phí một lượng rất lớn chất dinh dưỡngmà đất rất cần, cũng như sẽ gây tắc nghẽn giao thông đường thủy và gây ô nhiễm môi

trường, ảnh hưởng đền sức khỏe của con người.

Trùn qué (Perionyx excavatus) đã được nuôi khá phố biến ở các tỉnh ĐBSCLnhưng chủ yếu là sử dụng phân bò làm thức ăn cho trùn Điều này làm hạn chế việc mởrộng quy mô chuông trai do bị giới hạn về nguồn thức ăn Các phụ phẩm của rau, quacũng đã được sử dụng dé làm nguồn thức ăn bổ sung Tuy nhiên các loại phụ phâm cóchứa nhiều cellulose, lignin, tanin và là yếu tố chính gây ô nhiễm môi trường như xơ dừa,rơm rạ, lõi bắp lại chưa được xử lý thích hợp để nuôi trùn Nếu điều này được giảiquyết sẽ đem lại nguồn lợi lớn cho ba con nông dân, vừa giải quyết van dé môi trườngvừa có nguồn thức ăn phong phú cho trùn.

Thêm vào đó, Trichoderma spp có khả năng sản sinh ra lượng lớn enzyme

cellulase va các loại ligninase dé phân giải cellulose và lignin Do đó, nó có triển vọngcao trong việc sử dụng dé xử lý các phụ phẩm nông nghiệp làm thức ăn cho trun qué

Vì vậy mà cần có những phương pháp nghiên cứu khả thi và hiệu quả để tận dụngnguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào nay va dé tài "Bước đâu nghiên cứu xử lý phụphẩm nông nghiệp bằng Trichoderma spp làm thức ăn nuôi trim qué" được chọn nhằmnghiên cứu đánh giá tính khả thi của nó trong thực tế và những hiệu quả mà phế phẩm

nông nghiệp mang lại.

Trong phạm vi dé tài nay, chúng tôi cỗ gang giải quyết các van đề sau:

1 Phân lập các chủng Trichoderma có kha năng phan giải cellulose và lignin

cao và nhân sinh khối băng phương pháp lên men rắn

2 Xác định các các điều kiện nuôi cấy ban dau đến sinh tong hop enzyme

cellulase, lignin peroxidase va manganese peroxidase.

3 Xác định các thành phan chủ yếu có trong rom ra.4 Xác định yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng lignin khi xử lý rom ra bằngdung dịch kiềm

5 Xác định các yếu tô thời gian, độ âm, và ty lệ chế phẩm VSV ban đầu ảnhhưởng đến quá trình phân hủy rơm rạ

6 Thu nghiệm phôi trộn rơm ra sau xu lý với phân bò tươi dé nuôi trun quê.

PHẢN 2:

TONG QUAN TÀI LIEU

PHAN 2: TONG QUAN TÀI LIEU2.1 TONG QUAN ROM RA:

Cây lúa luôn giữ vi trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam Hình ảnhđất Việt thường được mô tả như một chiếc đòn gánh không 16 với hai đầu là hai vựa lúalớn là Đồng bằng sông Cửu Long và Đồng bằng sông Hong Việc sản xuất lúa gạo đã tạora một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rom ra và trâu Rom và trâu là hai trongsố nhiều nguồn biomass pho biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam (Tran Diệu Ly,

2008).

Theo H6 Sĩ Tráng (2004) các thành phan chính của rom, ra là những hydratcacbongồm: Cellulose (34% — 38%), hemicellulose (32% — 40%), lignin (12%), tro (14% —

18%) Rom ra thô chứa 44% cellulose, 22% hemicellulose, ca hai polysaccharide nay

đều là nguồn nguyên liệu khó phân hủy sinh học, nhưng nếu sử dung VSV phân giảithích hợp sẽ tạo nguồn phân hữu cơ sinh học rất tốt

Rơm ở Việt Nam được sử dụng với rất nhiều mục đích Ví dụ rơm được sử dụngtrong công nghệ phân bón Vì trong rơm có chứa rất nhiễu kali nên rơm thường đượcdùng để ủ phân chuồng Bón phân chuồng ủ rơm vừa làm tăng kali cho đất và giảm chỉphí vào phân bón Bon phân hữu co rất tốt cho đất, giúp phục hồi đất và chong khô canđất Ngoài ra, trong chăn nuôi, rơm được dùng dé lót chuồng cho vật nuôi (vi dụ như bòsữa) Lót chuồng bang rơm rất sạch sẽ và tránh duoc phan nao dịch bệnh cho vật nuôi.Rom sẽ thẫm nước tiểu của vật và sau đó được ủ, cuối cùng sẽ mang đi bón cây Dùngrơm lót chuồng dé bón ruộng chúng ta sẽ tận dụng được nito trong nước tiêu của vật nuôivà làm giàu nitơ cho đất Rơm còn được dùng để trồng nắm rơm sử dụng làm chất đốtcho các hộ nhà nông, chat dong trồng nam rơm, làm thức ăn cho gia súc, dùng làm vậtliệu xây dựng, làm bê tông siêu nhẹ, dùng sản xuất điện, làm đệm lót vận chuyền hànghóa dé vỡ, vận chuyền hoa quả, v.v (http//www.khoahoc.com.vn)

Phần rơm, rạ sót thường được cày lấp vào trong đất làm phân bón cho mùa vụ sau

Việc phân hủy gôc ra va rơm phụ thuộc vào độ âm của dat, nó ảnh hưởng trực tiếp đên

khối lượng khí metan CH, được giải phóng trong khi ủ Tuy có cung cấp cho đồng ruộngmột chút dinh dưỡng cho vụ tiếp theo, nhưng rất có thể chứa mâm sâu bệnh cho câytrồng, ảnh hưởng đến sản lượng do tác động bat lợi ngăn han bởi bất ôn định hàm lượng

nito.

Theo Viện Lúa Đồng bang sông Cửu Long, việc xử ly rom ra sau mỗi vu thuhoạch lúa trên thực tế lại chưa có cách làm hiệu quả nên dễ gây ô nhiễm môi trường, ảnhhưởng đến sức khỏe của con người (http://www.khoahoc.com.vn)

2.2 TONG QUAN VE CELLULOSE VÀ LIGNIN2.2.1 Tổng quan về cellulose:

2.2.1.1 Khái niệm:

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, trong bông nóchiếm trên 90%, còn trong gỗ 40 — 50% [20] Cellulose là một trong những sản phẩm bậcnhất, quan trọng nhất mà thực vật tổng hợp nên Các nghiên cứu phân đoạn trong cácđiều kiện lạnh cho thay chung ton tại dang sợi trong mang tế bào thực vật va vi sinh vật

[46].

2.2.1.2 Cầu tạo:Cellulose là một loại homopolyme của B — D glucose Các gốc B — D glucose được nốivới nhau qua liên kết B — D — 1,4— glocoside Mức độ polymer hóa của cellulose thay đổinhiều từ vài trăm đến 15000, trung bình là 3000 gốc đường Tùy theo từng loại thực vậtmà các phân tử cellulose có trọng lượng phân tử khác nhau rất nhiều, từ 50000 đến2500000 Nhờ phương pháp phân tích tia Rơnghen người ta biết rang cellulose có cau tạosợi Các sợi này liên kết thành những bó nhỏ gọi là các microfibrin có cấu trúc khôngđồng nhất, gồm những phan đặc (phan kết tinh) và những phần xốp hơn (phan vô định

hình)

Dang vô định hình rất dễ bị phân giải boi enzyme Dạng kết tinh có cau trúc rất chat,khó bi phân giải Tỷ lệ phần kết tỉnh càng cao thì gỗ càng chắc Dé phân giải trước hếtphải chuyển phân kết tinh về dạng vô định hình để enzyme có kha năng tiếp cận [12]

Cellulose là một trong những hop chat tự nhiên khá bền vững Nó không tan trongnước mả chỉ có thể phông lên do hấp thu nước, bị phân giải khi đun nóng với acid hoặckiềm ở nhiệt độ khá cao Cellulose bị phân giải ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40— 50°C nhờ các enzyme thủy phân cellulose, được gọi chung là cellulase.[10]

2.2.1.4 Hệ thống enzym cellulasePhân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiểu khí và từ nắm đãcho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzym này Hệ thống cellulase được phânloại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cau trúc của chúng Ba loại hoạt tính

enzym cellulase cơ bản [37], [41], [39]:

Endoglucanase hoặc 1,4 — B — D — glucan — 4 — glucanohydrolase (EC 3.2.1.4),

phân cắt tại vi tri vô định hình bên trong phân tử cellulose tao ra các chuỗi

oligosaccharide.

Exoglucanase, bao gồm 1,4 - B — D — glucan — 4 — glucanohydrolase

(cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4 — B -— D - glucan cellobiohydrolase

(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91) Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khửcủa chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay cellobiose Exoglucanase hoạttínhng chủ yếu trên vùng cellulose tỉnh thể

B - glucosidase hoặc B - glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21) Thuy phan

cellodextrin hòa tan va cellobiose thành glucose Cellulase là một cầu trúc nhiều don vibao gồm vị trí liên kết và thủy phân carbonhydrate (CBD) CBD là tiêu phan có trong cautrúc của cellulase và được phân chia thành 54 họ khác nhau Chức năng chủ yếu của CBDgan kết vùng xúc tác vào cellulose tinh thể Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùngcellulose tinh thé cho sự thủy giải hiệu quả Sự gắn kết cellulase thông qua CBD bênvững, cũng cho thấy khả năng xúc tác cắt đứt các tương tác không cộng hóa trị giữa cácchuỗi cellulose của vùng cellulose tinh thé [41] Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết vớivùng cellulose vô định hình [37] Mô hình thủy phân cellulose được dé nghị lần đầu bởiReese và các cộng sự, các CBD có vai trò làm “tróc” những đoạn cellulose từ bề mặt, gia

tăng sự thủy giải cellulose [41].

Hệ thống cellulase hoạt tínhng phối hợp để nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose.Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu quả thủy phân

cellulose cũng như hemicellulose va lignin trong tự nhiên [41].

Cellulase từ những nguồn khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH tối ưu,độ hòa tan và thành phần amino acid Khả năng chịu nhiệt cũng như cơ chất tôi ưu cũngthay đối theo nguồn thu nhận pH tối ưu thường khoảng 4 — 5 và nhiệt độ là 40 — 50°C

oH "(Be glucosidase) ~ Ae) Cc

Glucose cellobiose / cellotetrose

Hình 2.2 : Quá trình phan giải cellulose của hệ enzyme cellulase

(Nguồn: Bayer E.A, Chanzy H., Lamed R., Shoham Y.1998)

2.2.1.5 Cac chung sinh vật sinh cellulase

a Nam mocNhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vai vi sinh vậtcó khả năng phân hủy hiệu qua cellulose tinh thé [43] Các sinh vật phân hủy cellulosehiếu khí như vi khuẩn và nam, sử dung cellulose thông qua sản xuất số lượng lớn

cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cay, mặc du thỉnh thoảng cũng có sự hiện diện trên bề

mặt tế bào Hau hết các loài nam đều có khả năng sử dung cellulose như là nguồn cơ chấtcho sự phát triển Nhiều loài nam nguyên thủy, như lớp nam Chytridomycete ki khí, có

khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột của động vật nhai lại Khả năng thủy giải

cellulose cũng được tìm thay ở nhiều loài nam ki khí khác [41].Với xấp xi 700 loài nam Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống Mucor chothay có hoạt tính thủy giải cellulose Trái lại, ngành nam Ascomycete, Basidiomycete vàDeuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh cellulose Nhiéu giốngnam thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ như:

Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllumva Serpula (Basidiomycete); va Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum,Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium va Trichoderma (Deuteromycete) [41].

Nam móc thuộc giống Trichoderma va Aspergillus là hai loài sản xuất được số lượnglớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mai dùng trong công nghiệp Trichodermasản xuất ra lượng lớn endo — 8 — glucanase va exo — B — glucanase nhưng với mức độthấp B - glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo — B —glucanase và B - glucosidase nhưng với số lượng thấp exo - B - glucanase [43]

Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thê chuyển đổi hoàn toàn cellulose tựnhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose Sự phát triển của các loại namcũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi

trường, nước, pH, nhiệt độ và anh sáng, và không khí môi trường xung quanh [48].

Chung Aspergillus fumigatus cho thay khả năng sử dung cellulose tinh thể như là

nguồn carbon duy nhất Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong đó có 6 vạch

có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide Hoạt tính Cellulase tối ưu

tai 65°C va pH 2, cho thay đây là loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt va acid

[36].

b Vi khuẩn san xuất cellulaseTrong số các loài vi khuan, kha năng thủy giải cellulose được tìm thay ở hai bộ:Actinomycetales hiểu khí va Clostridiales ki khí Dựa vào các đặc điểm sinh lí, vi khuẩnthủy giải cellulose có thé thay bao gồm những nhóm sinh lí sau [41]:

o Vi khuẩn ki khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và Caldicellulosiruptor)o Vi khuan gram dương hiéu khí (Cellulomonas và Thermobifida)

o Vi khuẩn nhay hiếu khí (Cytophaga và Sporocytophaga)Thông thường, chi một vai loài trong những giống trên có hoạt tinh thủy giải

cellulose Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cay, nong do

muối va cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn ki khí sử dungcellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả năngthủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện do sự sai

hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum [47].

Các nhóm vi khuẩn ki khí và hiểu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy giảicellulose Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống cellulasephức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium thermocellum [47]

Mặc dù, các vi khuẩn ki khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Ce/lulomonas là giỗngvi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase Các vi khuẩn thủy giảicellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus, Micromonospora va

Thermobaa |41].

Gan đây, chủng Bacillus subtilis DR được phan lập từ suối nước nóng tạo ra mộtvài loại cellulase bền nhiệt Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loạiendocellulase CelDR bên nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này vẫn cònđến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút Chủng vi khuẩn này cho thấy có nhiều tiềm năngdùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt độ cao [43]

Chung vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp JXL có khả năng sửdụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose va

xylose Enzyme của Brevibacillus sp JXL có khả năng bền nhiệt rất cao, van giữ được

50% sau khi xử ly tai 100°C trong một gio.

c Xa khuẩn: [3][16]Khả năng sinh tong hop cellulase của xạ khuan đã được nghiên cứu từ rat lâu.Ngay từ năm 1930, Jensen đã phân lập được nhiều loài Micromonospora có khả năngthủy phân cellulose Krainsky (1914) nghiên cứu khả năng phân giải cellulose của một sốloài Streptomyces Sietsma va cộng sự (1968) nghiên cứu về enzyme cua chủngStreptomyces sp 0143 và nhận thay enzyme này tác động lên CMC, thích hợp nhất ở pH

rectes, Streptomyces termovulgaris.

Nhìn chung đã có khá nhiều nghiên cứu về Streptomyces, đánh giá, phân loại cácloài, nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản sinh cellulose cao nhất (Mc.Carthy và cộng sự,

1984; Goodfellow, 1971; Jones, 1975 va Willian, 1983)

Ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về xa khuẩn tong hợp cellulase như:Nguyễn Đình Quyến và cộng sự (1986) đã phân lập và định danh 30 chủng xạkhuẩn ưa nhiệt và ưa am, nhận thấy các chủng này có kha năng phân giải CMC và avicel.Trong đó có một chủng thể hiện hoạt tính exoglucanase khá mạnh

Phạm Văn Ty và cộng sự (1990) đã phân lập hàng trăm chủng xạ khuẩn ưa nhiệtvà ưa âm thuộc chi Streptomyces, trong đó có chủng Streptomyces L3 có hoạt tinh phângiải CMC và avicel mạnh nhất

Vũ Thị Thanh Bình và cộng sự (1990) đã phân lập được hàng trăm chủng xạ

khuẩn ưa nhiệt, trong đó có 10 chủng có khả năng tổng hợp cellulase trên các nguồncacbon là CMC, avicel, bông và giấy

Trịnh Thị Hồng (1997) đã phân lập được 8 chủng xạ khuẩn và 5 chủng nam mốccó khả năng phân giải cellulose, tác giả nhận thấy hiệu suất phân giải rơm của xạ khuẩnđạt 22% và khi nuôi chung với nam mốc thì hiệu suất phân giải rơm lên đến 29%.

Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (1999) nghiên cứu một số tính chất enzymecellulse của xạ khuẩn Actinomyces griseus và nhận thấy cellulase của xạ khuẩn hoạttínhng mạnh ở nhiệt độ 50°C và pH tối ưu là 7

2.2.2 Tổng quan lignin:Lignin là một trong những polymer có nguồn gốc sinh học pho biến nhất trong tựnhiên, chiếm khoảng 30% khối lượng gỗ khô ở cây lá kim, khoảng 20% ở cây lá rụng.lignin không tôn tại trong thực vật bậc thấp, như rong tảo, nam Lignin cùng vớihemicellulose va cellulose tạo nên thành tế bao gỗ Khối vật liệu composit nguồn gốc tự

nhiên này làm cho go có độ bên cơ cao và bảo đảm cho cây cứng cáp [13]

f

Cc

|

Ccor, OH

HO=O [CH,OH ais

CH CH,OH

CH oH

Meo CHOHOHMeo GH, 0H

GH, {OH OMe

roe ————ù

¿hon

ninh HONeo OMe

Meo

OMeie)CH,OH, CH,OH MeO

HC——O ¿Ho

MeO CH,OH CH,OH MeO

o—¢x HỆCHOH =o

Neo ị OMe

OH OH [0-C}

Hình 2.3: Cau trúc cua lignin gỗ mềm [Alder, 1977]

Theo Boudet năm 2000, Lignin cũng thực hiện các chức nang sinh hoc khác, bao

gom việc giup bảo vệ thực vật khỏi su tan công sinh học và hỗ trợ sự van chuyển nướcbằng cách đóng kín thành tế bao thực vat chống lại rò ri nước Mặc dù hàm lượng lignintong rất khác nhau giữa các loài thực vật, ước tính có tong cộng 30% cacbon hữu cotrong sinh khối thực vật trên toàn thế giới được chứa trong lignin [26]

Lignin là chất vô định hình có thành phần hóa học khác nhau ở các loài thực vật

khác nhau cũng như ở các bộ phận khác nhau trên cùng một cay [53] Lignin không tan

trong nước và trong acid vô cơ Trong môi trường kiềm, bisulfit Na, lignin bị phân giảimột phan và chuyển sang dang hòa tan có màu vàng hoặc nâu

Sự lên men ky khí không phân giải được nhân thơm, trong điều kiện có không khívi sinh vật có thể phân giải lignin nhưng rất chậm có thể mất nhiều ngày Lignin là chấtkết dính tự nhiên, cùng với hemicelluloses bảo vệ cellulose

Trong thực vật, lignin có vai trò liên kết các tế bào, làm tăng độ bền cơ học, tăng khảnăng chống chịu, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn chất độc và các tác động bên

p-coumaryl alcohol coniferyl alcohol synapyl alcohol

Hình 2.4: Các đơn vị cau tạo chủ yếu của lignin.Những monolignols được polymer hóa bởi một quá trình kết hợp triệt để liên kếtchúng băng các liên kết carbon- carbon hoặc ether Một liên kết có thể xảy ra ở vài vị tríkhác nhau trên mỗi đơn vi phenolic, tạo nên nhiều loại liên kết khác nhau Các loại liênkết phố biến nhất được tìm thay trong một phân tử lignin là B -O- 4, a -O- 4, B -5, 5-5,

4-O-5,B-T1, và B - B[ Dence va Lin, 1992; SJöström, 1993] Mac du đây là những

mối liên kết chính, ít nhất 20 loại liên kết khác nhau đã được xác định [Whetten ef al ,1998] Mối liên kết ether được biết như là liên kết chủ yếu trong lignin tự nhiên ước tínhchiếm khoảng một nửa đến hai phan ba tong số các mối liên kết lignin thực vật trong tựnhiên Monolignols có thé được trifunctionally liên kết, hình thành các điểm phân nhánhtrong polymer và tạo cho nó một cầu trúc mạng Với sự đa dạng của các mối liên kết đó,các phân tử lignin không thể được mô tả như một chuỗi các đơn vị xác định lặp lạithường xuyên , như polyme thông thường Ngược lai, lignin là polymer rất bất thường,

phức tạp [Dence va Lin, 1992; Sjéstré6m , 1993]

Ether Linkagespier a-O-5 2-0-5

Hình 2.5: Liên kết pho biến trong phân tử lignin

Phân húy lignin

Các vi sinh vật khác nhau phân giải lignin với mức độ khác nhau Trong số các vi

sinh vật, nim làm mục 26 phan giai lignin manh nhất, đặc biệt là nắm mun trắng Đa số

nắm mùn trắng làm mục gỗ băng cách đồng thời phân giải lignin, hemicelluloses,

cellulose Tuy nhiên cũng có những loài phân giải lignin đặc hiệu [12]

Những vi sinh vật phân giải lignin có hệ thống enzyme oxi hóa ngoại bảo phângiải liên kết giữa các monoligol hoặc mở vòng các đơn phân của lignin Hệ enzyme giữvai trò chủ yếu trong phân giải lignin là peroxidase nhân heme ngoại bảo, đó làmanganese peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP) kèm theo hệ thống tạo ra

H;Oz.[12]

Lignin peroxidase (LIP)

LiP (EC.1.11.1.14) có tên hệ thống 1,2-bis(3,4-dimethoxyphenyl) propane —

1,3-diol thuộc nhóm hydrogen — peroxidase oxidoreductase LiP xúc tác cho phản ứng [35]:

1,2-bis(3,4-dimethoxyphenyl) propane — 1,3-diol + H;O; > H;O + veratrylaldehyde +

1-(3,4-dimethoxy pheny])ethane-1,2-diol

LiP lần đầu tiên được phát hiện khi nuôi cay Phanerochaete chrysosporium(Glenn — Tien công bố năm 1983), là cau tử chủ yếu của hệ enzyme phân giải lignin [13]LiP không có cơ chất chuyên biệt, nó có thể oxi hóa lignin và những hợp chất liên quanđến lignin (có rượu hay không có rượu).[3 1]

Enzyme này làm xúc tác cho hàng loạt phản tng, trong đó có phan ứng phan hủy

liên kết ete B — O — 4 và liên kết Cụ - Cs, trong trường hop chất mô phỏng dime của lignin.LiP cũng xúc tiến quá trình decacboxyl hóa axit phenylaxetic, oxy hóa rượu có OH ở C,thành hợp chất C, — oxo, hydroxyl hóa, tạo thành quinon và xúc tác cho phản ứng mở

vòng thơm.

Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của LiP trong quá trìnhphân giải lignin và các thực vật chứa lignin Enzyme này có thể phân giải lignin trongdung dịch loãng, oxy hóa va phân giải hàng loạt dime và oligome tương ứng với các cautrúc của lignin trong điều kiện phòng thí nghiệm, xúc tác cho quá trình tạo ra các phần tử

MnP xúc tác phản ứng oxi hóa phụ thuộc H;Os, lignin, các dẫn xuất của lignin vàcác hợp chat lignin có vòng phenol Mn(ID là co chất phù hợp nhất của MnP Trước tiênMnP oxi hóa Mn(II) thành Mn(IID) Mn(IID sau đó được sử dụng dé oxi hóa co chất chứa

phenol Các acid hữu co, oxalate và malonate được tạo từ Phanerochaete chrysosporium

sẽ hoạt hóa hệ thong MnP bang cách tạo ra phức với Mn (II) 6n định với điện thé oxi

hóa khử cao va tách Mn(ITI) ra khỏi enzyme này Vì vậy ion Mn tham gia vào phản ứng ở

dạng cặp oxi hóa khử dễ dàng khuếch tán hơn là đóng vai trò cofactor của enzyme Đầutiên Mn (II) oxi hóa phenol để hình thành gốc phenol để hình thành gốc phenoxy trung

gian Sau đó, sự phân chia alkyl — phenyl C, - Cg, hoặc phan ứng benzylic carbinol tạo ra

Tất ca các laccase là glycoprotein Laccase là phenol oxidase thực thụ, có tinh đặchiệu rộng đối với các hợp chất thơm có chứa nhóm hydroxyl và amin Enzyme này oxyhóa hợp chất kiểu phenol cũng như các phan cau tric phenolic của lignin bằng cách táchmột điện tu, tạo thành sốc tự do Các sốc tự do sau đó có thê tái trùng hợp hoặc tiếp tục

depolyme hóa.

Laccase làm xúc tác cho phản ứng phân hủy nhóm metoxy cua don vi

phenylpropan Enzyme này cũng làm đứt liên kết Cụ - Cs Kawai nhận thay laccase cũng

xúc tac cho phản ứng pha vỡ vòng thơm theo cách tương tự như ở LiP.[13]

Giống như các peroxidase, laccase vừa là thành phan chính trong hệ enzyme phângiải lignin vừa tham gia tong hop lignin trong tế bao Ở Pleurotus florida, N.Das và cộngsự đã chứng minh được sự biểu hiện isozyme L2 cua Lac tham gia diéu hoa qua trinhtăng trưởng sợi nam [30] Vai trò xúc tác của Lac trong phan ứng khó được nhận biết vihai lý do: một là Lac có dai cơ chất xúc tác trùng với các enzyme oxidase — tyrosinase

khác như là monophenol monooxygenase (EC 1.14.18.1); Hai là Lac không có tính đặc

hiệu cơ chất cao nhưng có pho xúc tác rộng đối với các hợp chất thơm chứa nhóm

hydroxyl và amin như guaiacol và 2,6 — dimethoxyphenol [52].

Các enzyme khác:

Các enzyme trên (LiP, MnP va Lac) tham gia xúc tác vào quá trình đầu tiên phângiải lignin Để phân giải triệt để lignin cần có sự hỗ trợ của các enzyme khác Trước hết,để hoạt tínhng được, các enzyme trên đặc biệt là LiP, cần có hệ thống cung cấp H;O; Đócó thé là glucose oxidase, glyoxal oxidase, aryl alcohol oxidase Ngoài ra, MnP khi oxi

hóa NADP(H), NAD(H) cũng phat sinh H;O; Quá trình phan giải lignin là qua trình oxi

hóa — khử Do đó, các enzyme tham gia đều có thé oxi hóa cao cần các chất chuyển điệntử Nên vai trò của các enzyme vận chuyển điện tử như quinine oxidoreductase,

cellobiose dehydrogenase, cellobiose oxidase, cellobiose:quinone oxidoreductase là

không nhỏ Cac enzyme trên xúc tác khử quinine tránh ngộ độc cho tế bào, ngăn chặn sựtái trùng hợp các gốc tự do, sinh ra các gốc hydroxyl HO* để oxy hóa lignin, hòa tan

MnO, và các tác nhân tạo phức càng cua [12]

Gan đây, đã có thêm vai enzyme phân giải lignin mới được tìm thấy Trong đó

đáng chú ý hon ca là peroxidase không phụ thuộc mangan (Manganese IndependentPeroxidase - MIP) từ các loài thuộc họ Xylariaceae, chi Pleurotus và peroxidase đa năng

mang cả hai vị trí tiếp xúc với co chất của LiP và MnP [27] Tuy nhiên thông tin về

chúng vân còn sơ lược.

2.3 TONG QUAN VE TRICHODERMA2.3.1 Nguồn gốc

Trichoderma được tìm thầy khap moi noi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực Bac.

Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệtđới âm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thựcphẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nắm khác (Gary J Samuels,2004) Trichoderma tất it tim thay trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thựcvật Mỗi dòng nam Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ âm khác nhau

(Gary E Harman, 2000).

2.3.2 Vi trí phần loại [4]Theo Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau:

GIỚI: FungiNgành: AscomycotaBộ: HypocrealesHọ: Hypocreaceae

Giống: Trichoderma

Theo Agrios (1997), Harman (2002) hau hết Trichoderma spp có giai đoạn sinhsản vô tính (trường hop nay Trichoderma spp được phan loại thuộc lớp nam bất toan

Deuteromycetes, bộ Moniliales), nhưng vài loài Trichoderma spp cũng có khả năng sinh

sản hữu tính nên được phân vào lớp nam túi Ascomycetes, bộ Hypocreales, ho

Hypocreaceae.| 22|

2.3.3 Đặc điểm hình tháiTrichoderma là một loài nam bất toàn, sinh san vô tinh bằng đính bào tử từ khuẩnty Khuẩn ty của vi nam không mau, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuốinhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, khôngmau, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở dau cành nhờ chất nhay Bào tử hình cầu, hình eliphoặc hình thuôn Khuẩn lac nam có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàngxanh, luc xin đến lục đậm Các chủng cua Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh,chúng có thé đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 em sau 4 ngày nuôi cay ở 20°C.

Hình 2.6: Khuẩn lạc và bao tử của Trichoderma sp sau 3 ngày nuôi cay trên môi

trường PGA.

Khuan lạc tăng trưởng nhanh (5 — 9 cm) Sự hình thành khuân lạc kết lại thànhchùm hoặc tỏa rộng ra hơn, màu xanh xám Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc màu vàngnhạt Cuống bào tử thường không phân nhánh rộng và thường có sự sắp xếp lỏng lẻo.Nhánh thường ở dạng đôi, đơn hoặc mọc vòng, thường ngoằn ngoèo Bào tử hình câu tới

elip, mau hơi xanh tới xanh đậm, kích thước từ (4 — 4,8) x (3,5 — 4) um pH thích hợp củaTrichoderma là 4 — 6.5.

T viride có thé sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp KhiTrichoderma tăng trưởng trên nguồn cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡngthì ammonium nói chung là tốt hơn nitrate (Danielson và Davey, 1973) Thêm vào đó

một sô chủng như 7: reesei, không có khả năng sử dung nitrate.

Loài Trichoderma không được xem là tác nhân gây bệnh cho người và động vật.

Chi một số loài gây bệnh dưới điều kiện khác thường hiếm có, có đặc tinh gây di ứng.Trong đó giống T viride cũng được xem là an toàn cho việc sản xuất sinh khối làmprotein (Anaissie, 1989) Các loài Trichoderma tạo ra lượng enzym cellulase tương đối

cao.

2.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh họcĐa số các dòng nam Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.5 đến 9.5.Phát triển tốt ở pH 4,5 — 6,5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 —30°C Một vài dòng phát triển tốt ở 35° C Một số ít phát triển được ở 40° C (Gary J.Samuels, 2004) Theo Prasun K M và Kanthadai R (1997) hình thái khuẩn lạc và bảo tửcua Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở 35° C, chúng tạo ranhững khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 37°C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzym như chitinolytic (enzym

phân giải chitin), cellulolytic (enzym phân giải cellulose), day là 2 enzym chính phan giải

thành và mang tế bao, phá hủy khuẩn ty của các nam đối kháng với Trichoderma

Một vai loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nây mam Tuy nhiên cơ chếcủa tác động này chưa được biết (Gary J Samuels, 2004) [34]

Trong quá trình sinh sản vô tính cua Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng độtbiến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bảo và tác độngcủa điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trongkiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma Vi thế, sẽ tạo ra nhữngdòng thích nghỉ tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là nhữngdòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểmsoát mầm bệnh thực vật (Gary E Harman, 2000)

2.3.5 Ung dụng Trichoderma trong lĩnh vực xử lý môi trườngTrichoderma hazianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đấtrừng Sự tồn tại của các hợp chất choloroguaiacols, hợp chất AOX (các hợp chat halogen

thấm nước) trong chất thải của nhà máy sản xuất bột giấy ở hỗ Bonney, Đông Nam nướcUc và các sản phẩm phân giải của Trichoderma harzianum đã được các nhà khoa học

Van Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu.

Chất tây trang chlor của các nha máy sử dụng sulñt hóa bột giấy được tháo ra hỗmột cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước va cặn ban.Hợp chất chlorophenol Hợp chất chlorophenol này rất độc Trichoderma harzianum côkhả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối khoáng Loai nam nay cũng

có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn [59]

Trichoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học California)

có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen va pentachlorophenol Namnày phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quátrình sống của nó

Trichoderma harzianum CCT 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đấttrong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các chất gây ô nhiễm trong đấtvà dam lay

Một công trình nghiên cứu khác sử dung nam mốc Trichoderma reesei RUT-30 déxử lý chất thải sinh hoạt đô thị hứa hẹn một nên sản xuất enzyme cellulase rẻ tiền, đồng

thời giảm lượng rác thải [15]

Một nghiên cứu khác của Reeta Rani Singhania và cộng sự (2006) đã cho thấy cóthé sản xuất cellulose bang Trichoderma reesei NRRL 11460 trên cơ chất là các loại phụphẩm lignocellulosic khác nhau (bã san, bã mia, cám mì và rơm ra) bằng lên men rắn

Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu của Trần Thạnh Phong và cộng sự(2007) về việc thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma reesei VTT-D-80133 trênmôi trường bán rắn; Khưu Phương Yến Anh (2010), phân lập một số chủng nắm mốc cókhả năng chuyên hóa rom ra từ lúa làm phân hữu cơ trông trọt; Trần Thị Thanh Thuan(2009), nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bang Trichoderma viride và Aspergillus niger dé sanxuất phân bón hữu cơ khoáng tong hợp Các tác giả đã sử dụng các phụ phẩm nôngnghiệp để sản xuất enzyme cellulase hoặc làm phân bón vi sinh nhằm làm giảm lượng

phụ phẩm nông nghiệp, tăng hiệu quả kinh tế và hướng đến nên nông nghiệp bền vữngthân thiện môi trường Các nghiên cứu này đã mang lại những kết quả nhất định và chothay tiềm năng đáng kể trong việc xử lý phụ phẩm nông nghiệp.

2.4 TONG QUAN VE TRÙN QUE2.4.1 Trin qué:

Trùn qué có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, ho Megascocidae(họ cự dan), ngành ruột khoan Chúng thuộc nhóm trun ăn phân, thường sống trong môitrường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phan thé lớn vàkhông có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất

Trin qué là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vàonuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ Đây là loài trùn man đẻ, xuất hiện rải rac ở

vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vÌ vậy rat dé thu hoạch Kích thước trùn qué truong thanh

từ 10 — 15 cm, nước chiếm khoảng 80 — 85%, chất khô khoảng 15 — 20% Ham lượng cácchất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: protein: 68 — 70%, lipid: 7 — 8%, chất

đường: 12 — 14%, tro 11 — 12%.

Do có hàm lượng protein cao nên trun qué được xem là nguồn dinh dưỡng bồ sungquý giá cho các loại gia súc, gia cam, thủy hải sản Ngoài ra, trun quế còn được trong y

học, công nghệ chê biên thức ăn gia súc

2.4.2 Đặc tinh sinh học của trùn qué

Hình 2.7: Trin qué (Perionyx excavates)

Trùn qué hô hấp qua da, chúng có khả năng hap thu Oxy và thải CO; trong môitrường nước, điều nảy giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều lần, thậm chítrong nhiều tháng.

Hệ thông bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt Các cơ quan này bảo đảm choviệc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng Amoniac và Urer Trùn qué nuốt thức ănbằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tươngđương với trọng lượng cơ thể của nó Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vậtcộng sinh, chúng thải ra phân (Vermicas) ra ngoài rất giàu dinh dưỡng (hệ số chuyển hóaở đây vào khoảng 0,7), những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa nàytheo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạt tínhng ở “màng dinh dưỡng” trong một

thời gian dài Day là một trong những nguyên nhân làm cho phân trun có hàm lượng dinh

dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường

trong tự nhiên.

2.4.3 Đặc tinh sinh lý của trùn quéTrùn qué rat nhạy cam, chúng phan ứng mạnh với ánh sang, nhiệt độ và biên độnhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn qué nam trongkhoảng từ 20 — 30°C, ở nhiệt độ khoảng 30°C và độ am thích hop, chúng sinh trưởng vasinh sản rất nhanh Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt tinhng và có thé chết, hoặckhi nhiệt độ của luéng nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết Chúng có thé chết khi điềukiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thé ton tại trong môi trường nước có thôi

Oxy.

Trùn qué qué rất thích sống trong môi trường âm ướt và có độ pH ồn định Quacác thí nghiệm thực hiện, chúng thích hợp nhất vào khoảng 7,0 — 7,5, nhưng chúng cókhả năng chịu đựng được pho pH khá rộng, từ 4 — 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi

Trùn qué thích nghi với phô thức ăn khá rộng, chúng ăn bat ky chat thải hữu cơnào có thé phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cam ) Tuynhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp chochúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn

Trong tự nhiên, trùn quê thích sông nơi âm thâp, gân công rãnh, hoặc nơi có nhiêuchat hữu cơ dé phân hủy và thôi rữa như trong các đông phan động vật, các dong rác hoaimục, chúng rât ít hiện diện trên các đông ruộng canh tác dù nơi đây có nhiêu chât thảihữu co.[56]

2.4.4 Đặc điểm sinh sảnTrùn qué là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nam ở phía đầucủa cơ thé, có thé giao phối chéo với nhau dé hình thành kén ở mỗi con, kén được hìnhthành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 — 20 trứng, kén trùn di chuyển dân về phíađầu Kén áo hình dang thon dai, hai dau tam nhon lai gan giống như hạt bông cỏ, ban đầucó màu trắng đục, sau chuyển sang xanh nhạt rồi vàng nhạt Mỗi kén có thé nở từ 1 — 10

con.

Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có mau trang, dài khoảng 2 — 3mm, sau 5 — 7ngày cơ thé chúng sẽ chuyển dan sang mau đỏ và bắt đầu xuất hiện một văn đỏ thầm trênlung Khoảng từ 15 —30 ngày sau, chúng trưởng thành và bat đầu xuất hiện đai sinh dục;từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản Con trưởng thành khỏe mạnhcó màu man chin và có sắc ánh kim trên cơ thé

Thời gian sinh sản của trùn liên tục quanh năm và cứ diễn ra trung bình một tuầnmột lần, nếu không có yếu t6 bat lợi thì sự phát triển của trun qué luôn tăng theo cấp số

nhân.[ 60]2.4.5 Quy trình chăm sóc nuôi dưỡng

a Xây dựng chuông trại- Nhà nuôi trùn được lợp bằng mái lá.- Các lỗi đi được tráng nên kiên cô dé dé quét dọn và vận chuyển- Trong nhà nuôi trùn được chia ra các dãy luống nuôi, chiều cao trung bình 0,4 m,chiêu ngang từ 1,5 — 2 m dé dé quản ly, chăm sóc và khai thác

- Nền chuồng được tráng hồ non cho dé thẫm nước, mặt nền có độ dốc, có lỗ thoátnước dé tránh ngập ing Trường hợp tận dụng chuông trại sẵn có mà nền chuông khôngthấm nước hay không có lỗ thoát nước thì đồ nên cát cao từ 10 — 15 em, trải lưới cước(lỗ < 1 mm’) giúp thoát nước dé dàng

- Chuéng trại phải đảm bao được sự thong thoáng, hạn chế tôn lưu khí độc hạitrong chuông, tránh mưa tat gió lùa Chuông làm xa trục lộ giao thông, tránh tiếng Ôn.

- Che chăn bằng lưới đen xung quanh chuồng nuôi tạo bóng tối trong chuộng nuôi(không quá tối) dé trùn lên ăn cả ngày lẫn đêm, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào luống

nuÔi.

b Thả giốngCách chọn giống:Giống trùn chọn thả phải đảm bảo về hình dáng và kích thước đặc trưng củagiống, đa số trùn có màu đỏ đậm, chui xuống luống nuôi hoặc vận động không quá chậmkhi bị bắt Chọn sinh khối có nhiều kén và trùn con

Cách thả giống: Thả sinh khói (là 6 trùn bao gồm trin bố mẹ, trun con, kén và môitrường sống)

- Lay sinh khối thả vào luống trùn với mật độ thả: 20 — 25 kg/m”.- Sau 2 giờ thì tưới nước và sau 1 ngày có thé cho trùn ăn phân

- Dùng tay (có bao tay) hay xẻng nhỏ lẫy từng mang phân bỏ vào luống nuôi,

mảng phân đường kính 10 cm cao 2 cm, các mang phân cách nhau 10cm.

- Sau đó tưới nước đều trên ludng trùn dé giữ độ âm cho luống nuôi và mảng phânbò Nếu mang phân khô thì tốc độ ăn của trin sẽ giảm, do đó phải đảm bảo mảng phânluôn âm ướt

Cách phát hiện thức ăn dư: Kiểm tra luống trùn nhận thấy bề mặt phân luống trùncó mau đen nhạt (trùn ăn mạnh thì sau 3 — 4 ngày bề mặt luỗng trùn phủ màu trang vàngnhạt) Khi kéo mang phân trên bề mặt luống lên nhận thấy có rất it trùn tập trung dướimảng phân, mảng phân không tơi xốp hay độ tơi xốp thấp, nếu độ âm không đủ thì mảng

phân có thé cầm lên dé dàng (mảng phân được ăn hết thì rất xốp, không còn hình dangban đầu của mảng phân).

Nguyên nhân dư phân:

- Do bỏ phân cho trùn ăn quá nhiều ma lượng trùn trong luống lại ít, trùn ăn khônghết làm thức ăn dư thừa

- Do luỗống nuôi và mảng phân không đủ độ am can thiết làm ảnh hưởng tới khả

năng ăn cua trun.

- Do phân hoặc nước tưới lẫn tạp chất, hoá chất độc hại trùn không ăn.- Do tác động từ các yếu tố khác như: nhiệt độ môi trường nuôi, ánh sáng, tiếng ôn

Biện pháp can thiệp:

- Do thức ăn dư: hốt bớt phan phân cho ăn trong luống ra sau đó tưới nước lại, détrùn ăn hết phần phân dư Dùng bàn cao xới phan sinh khói trong luống trùn giúp tạo sự

thông thoáng thoát khí độc hại, sau đó cho ăn lượng phân ít hơn 2/3 hoặc một nửa so vớibình thường.

- Do độ am không phù hợp: kiểm tra nếu thấy trin ăn yếu do nguyên nhân độ âmthì cần điều chỉnh lại chế độ tưới cho phù hợp

- Do thức ăn lẫn hoá chất độc hại: lay hết phân đã cho ăn trong luống ra, dùng bancào xới phần sinh khối trong luống trùn giúp tạo sự thông thoáng thoát khí độc hại, tưới

nước, sau đó cho ăn lượng phân ít hơn 2/3 hoặc một nửa so với bình thường.

Cách tưới nước:- Kiêm tra luông nuôi xem độ âm đê điều chỉnh lượng nước tưới cho phù hợp