Dầu từ vi sinh vật cho dầu hiện đang được coi là ứng cử viên đầy hứa hẹn do đặc điểm không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ hoặc khí hậu, có hàm lượng chất béo cao, có thể được sản xuất từ nhiều
GIỚI THIỆU CHUNG
Đặt vấn đề
Hiện nay, khoảng 82% năng lượng thế giới đang sử dụng được khai thác từ các nguồn nhiên liệu hóa thạch như dầu mỏ, khí tự nhiên và than đá Bất lợi của việc sử dụng nguồn nhiên liệu này là gây ảnh hưởng xấu đến môi trường, bao gồm cả hiện tượng hiệu ứng nhà kính, mưa axit, ô nhiễm không khí…[1] Hơn nữa, việc cung cấp các nguồn tài nguyên hóa thạch là có giới hạn và đang cạn kiệt dần Điều này làm tăng chi phí khai thác, dẫn đến giá dầu tăng gây ảnh hưởng đến an ninh năng lượng Vì vậy, các nguồn tài nguyên tái tạo rất quan trọng trong việc thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch
Nói chung, nhiên liệu sinh học và cụ thể hơn là diesel sinh học là nguồn năng lượng tái tạo, không độc hại và có khả năng phân hủy sinh học cao Thành phần chính của diesel sinh học là các este metyl của axit béo, được tạo ra từ chất béo và dầu thực vật Tuy nhiên, việc sử dụng cây trồng nông nghiệp trong sản xuất diesel sinh học có thể gây ra giá lương thực cao hơn, cạnh tranh đất canh tác và ảnh hưởng đến diện tích trồng các loại thực phẩm thiết yếu khác Hơn nữa, chi phí nguyên liệu thô để sản xuất diesel sinh học chiếm tới 70-75% tổng chi phí sản xuất, tạo ra thách thức lớn cho sự phát triển và phổ biến rộng rãi Do đó, tìm kiếm nguồn nguyên liệu giá rẻ cho quá trình sản xuất diesel sinh học là rất quan trọng.
Gần đây, trong việc tìm kiếm nguồn dầu mới sản xuất dầu diesel sinh học ngày càng được quan tâm Trong số đó, dầu đơn bào (single cell oils, SCO) thu hút được sự chú ý trên toàn thế giới Dầu từ vi sinh vật cho dầu hiện đang được coi là ứng cử viên đầy hứa hẹn do đặc điểm không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ hoặc khí hậu, có hàm lượng chất béo cao, có thể được sản xuất từ nhiều nguồn với thời gian sản xuất ngắn và có thành phần axit béo tương tự với các loại dầu thực vật [4] Nấm men Yarrowia lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trọng lượng tế bào khô và được xem là một loại nấm men cho dầu [5] Sau khi qua biến đổi gen, chủng
Y lipolytica Po1g sinh trưởng tốt môi trường sucrose, glucose, xylose và có khả năng tổng hợp chất béo và protein có chất lượng tốt do không sinh ra các protease ngoại bào [6] Những đặc tính này làm cho Y lipolytica Po1g được quan tâm nhiều hơn trong các quá trình sản xuất protein và chất béo Tuy nhiên, chi phí sản xuất của SCO làm cho dầu vi sinh vật mang tính cạnh tranh kinh tế Kết quả là sản xuất dầu vi sinh từ chất thải và nguồn nguyên liệu tái tạo được quan tâm mạnh mẽ Để giảm chi phí sản xuất, nhiều phụ phẩm nông nghiệp được tận dụng làm nguyên liệu Các loại phụ phẩm nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần là lignocellullose, được cấu thành từ lignin, cellulose và hemicelluloses Phần carbohydrate (cellulose và hemicelluloses) có thể bị phá hủy bằng phương pháp thủy phân tạo thành đường, một nguồn carbon có giá trị trong quá trình lên men vi sinh vật [7]
Cám gạo là phụ phẩm nông nghiệp có giá trị thấp trong quá trình xay xát gạo được sản xuất với một lượng lớn trên thế giới Sản lượng gạo toàn cầu đã và đang tăng lên đều đặn từ năm 1960 đến nay và đạt trên 700 triệu tấn vào năm 2012
Việt Nam có sản lượng cám gạo khoảng 43 triệu tấn [8] Cám gạo chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, vitamin, chất béo và đặc biệt là hàm lượng polysaccharide lớn Polysaccharide này có thể phân hủy thành đường thông qua thủy phân, trở thành nguồn carbon thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật [9].
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu này là tận dụng nguồn phụ phẩm cám gạo đã tách béo (thu được trong quá trình chế biến dầu) thủy phân làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men nhằm thu được chất béo Nghiên cứu được thực hiện qua 2 giai đoạn:
- Giai đoạn thứ nhất: tiến hành thủy phân nhằm thu được đường Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân như nồng độ axit, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân, tỉ lệ cám gạo tách béo/dung dịch axit được khảo sát
- Sau đó loại bỏ các chất gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật như 5- hydroxymethylfurfural (HMF), furfural
- Giai đoạn thứ hai: Sử dụng dung dịch cám gạo tách béo thủy phân đã khử độc để nuôi cấy nấm men Y lipolytica Po1g Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nấm men cũng được khảo sát.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Vi sinh vật cho dầu
Một vài loài vi sinh vật có khả năng tích lũy chất béo trên 20% khối luợng tế bào khô, được gọi là vi sinh vật cho dầu Dầu đơn bào (SCO) là loại dầu thu được từ vi sinh vật, là nguyên liệu lựa chọn thay thế tiềm năng để sản xuất dầu diesel sinh học do chúng có chứa axit béo chủ yếu là C16 và C18, thành phần tương tự với các loại dầu thực vật [10] SCO được sản xuất bởi các vi sinh vật có dầu khác nhau đã được biết đến hơn 100 năm nay, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng tích lũy chất béo Một số loài vi sinh vật như nấm men, vi tảo đã được báo cáo là có khả năng sinh trưởng và tích lũy lượng chất béo đáng kể (Bảng 2.1) [11]
Bảng 2.1 Hàm lượng dầu cuả một số loài vi sinh vật
Acinetobacter calcoaceticus 27–38 Mortierella isabellina 86 Rhodococcus opacus 24–25 Humicola lanuginose 75 Bacillus alcalophilus 18–24 Mortierella vinacea 66
Nấm men tích dầu có khả năng tổng hợp và tích lũy dầu từ 25-80% trọng lượng khô, được gọi là vi sinh vật cho dầu Chúng tổng hợp axit béo hoặc triacylglycerol (TAG) và este steryl (SE), được bao bọc bởi một lớp phospholipid đơn và protein Trong số 600 loài nấm men, chỉ dưới 30 loài có khả năng tích lũy chất béo trên 25% trọng lượng sinh khối, chẳng hạn như Rhodotorulaspp và Cryptococcus curvatus, có thể tích lũy tới 40-70% chất béo.
Candida utilisare thường tích lũy chất béo 5-10% Các nấm men cho dầu nổi tiếng nhất bao gồm Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporonand Yarrowia [11] Những sinh vật này đã được sử dụng thương mại hóa cho nhiều mục đích khác nhau trong quá khứ Tuy nhiên, trong tương lai việc sử dụng thành công tiềm năng của loại SCO để sản xuất biodiesel sẽ phụ thuộc vào việc sử dụng các nguồn nguyên liệu có giá trị thấp như các phụ phẩm nông nghiệp hay trong chế biến các sản phẩm nông nghiệp [5].
Nấm men Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolytica, với tiền thân được gọi là Candida lipolytica, được phân loại lại và đổi tên thành Endomycopsis lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica, và cuối cùng được thống nhất là Y lipolytica [12] Y lipolytica là loại nấm đa hình, tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống mà nó phát triển ở dạng tế bào đơn, giả sợi hoặc dạng sợi có vách ngăn (Hình 2.1) Tuy nhiên dạng thường gặp là dạng sợi cú vỏch ngăn cú chiều dày từ 3-5 àm, những tế bào ở phần chồi dài khoảng 100 àm, trong khi mỗi đoạn chỉ dài từ 50 - 70 àm Mỗi đoạn cú một nhõn tế bào [13-14] Hầu hết các chủng của Y lipolytica không thể phát triển trên 32 °C, là loài vi sinh vật hiếu khí và không có khả năng gây bệnh Y lipolytica thường được tìm thấy trong các chất nền kỵ nước như ankan hoặc chất béo Loại nấm men này thường được phân lập từ các sản phẩm sữa như pho mát hoặc một số chất gây ô nhiễm từ các loại thực phẩm khác nhau (pho mát, sữa chua, và xúc xích) Chủng này cũng được phân lập từ đất, nước thải và môi trường dầu bị ô nhiễm [15] Ngoài ra, Y lipolytica còn có khả năng phân hủy tốt một số loại đường hexose như glucose, mannose và fructose
Hình 2.1 Hình thái tế bào của nấm men Y.lipolytica
Sở hữu cơ chế phức tạp và sự đa dạng của hệ gen, Y lipolytica có khả năng tích lũy chất béo ở mức cao, lên đến trên 50% khối lượng khô tế bào Do đặc điểm đáng kể này, Y lipolytica được coi là một chủng nấm men đầy hứa hẹn trong lĩnh vực sản xuất nhiên liệu sinh học từ dầu.
2.2.2 Sự tích lũy và tổng hợp chất béo của Y lipolytica
Sự tích lũy chất béo của tế bào nấm có thể được tăng cường bởi những chỗ lồi lõm trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho các cơ chất kị nước hấp thu từ môi trường [10] Những chất béo này tạo thành phần chất béo lưu trữ, chủ yếu là các triacylglycerol (triglycerides) và este steryl Quá trình tích lũy chất béo phụ thuộc chủ yếu vào sinh lý vi sinh vật, nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường như nhiệt độ và độ pH [5]
Ở vi sinh vật chứa dầu, quá trình tích lũy lipid bắt đầu khi nguồn carbon dư thừa và một yếu tố giới hạn khác trong môi trường phát triển, thường là nguồn nitơ Trong điều kiện thiếu nitơ, vi sinh vật tiếp tục đồng hóa nguồn carbon nhưng sự tăng trưởng tế bào dừng lại do nitơ cần thiết cho tổng hợp protein và axit nucleic Quá trình tích lũy lipid ở vi sinh vật chứa dầu là quá trình hai pha gồm pha tăng trưởng và pha tích lũy lipid, trong đó nguồn carbon dư thừa được chuyển thành triacylglycerol tích trữ trong tế bào.
Khả năng tích lũy chất béo của Y lipolytica đã được nghiên cứu với các nguồn carbon khác nhau như glycerol [17], glucose thương mại [18], bã mía thủy phân [19], ứng với hàm lượng chất béo từ 14% - 58.5% sinh khối và thành phần axit béo bao gồm: 14.7 – 23.1% axit palmitic (C16:0), 47.1 – 68.3% axit stearic (C18:0), 6.9 – 18.2% axit oleic (C18:1 ) và 2.2 – 8.9% axit linolenic (C18:2) Do thành phần axit béo không no nhỏ nên chất béo từ Y lipolytica có một tiềm năng lớn để được sử dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học [5, 20]
Chủng Po1g của nấm men Y lipolytica bắt nguồn từ một chủng tự nhiên là W29 (ATCC 20460) sau khi thực hiện biến đổi gen với gen URA3 trong chủng
W29 được loại bỏ và thay bằng gen SUC2 từ S cerevisiae, đồng thời loại bỏ các gen LEU2, XPR2 và AXP Vì chủng Y lipolytica Po1g có khả năng tiết ra chất béo và protein tốt và không sinh ra các protease ngoại bào khi sinh trưởng trong sucrose, glucose Những đặc tính vượt trội này làm cho Y lipolytica Po1g ngày càng được quan tâm nhiều hơn để sản xuất protein và chất béo [14].
Cám gạo
Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm khoảng 10% trọng lượng hạt lúa [21] Cấu trúc của hạt lúa được trình bày như Hình 2.3 Lượng protein trong cám gạo có thể đạt 12 - 14%, cao hơn so với protein trong hạt bắp Lượng chất béo trong cám gạo rất cao 15 - 22%, chất đạm trên 12%, chất sắt trên 14% Cám gạo là một loại phụ phẩm nông nghiệp giàu chất béo, carbohydrate và protein [22-23]
Hình 2.3 Các thành phần chính trong hạt thóc 2.3.1 Tinh bột cám gạo
Tinh bột là một nguồn sinh khối quan trọng đối với quá trình lên men vi sinh vật, nó là nguồn nguyên liệu ít tốn kém, phong phú, dễ dàng lên men, và có thể được tái tạo liên tục nhờ quá trình quang hợp [24]
Tinh bột trong cám gạo có chứa 10 – 55 %, tùy thuộc vào thiết bị xay xát và thành phần nội nhũ [25]
Nguyên liệu lignocellulose chủ yếu tạo thành celluloses, hemicelluloses và lignin Phần hydrocarbon (cellulose và hemicellulose) thường chiếm đến hai phần ba lignocelluloses, có thể chuyển hóa thành đường bằng các phương pháp hóa học hay vi sinh
Hemicellulose là một loại carbohydrate mạch nhánh có cấu trúc hỗn loạn Đặc tính này khiến hemicellulose trở nên dễ hòa tan và dễ phân hủy hơn cellulose Vai trò chính của hemicellulose là liên kết giữa các sợi cellulose và lignin, tạo nên sự bền vững cho cấu trúc của tế bào thực vật.
Cellulose là các polysaccharide phổ biến nhất trong tự nhiên và bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại của cellobiose Nó là một polymer glucan của các đơn vị D- glucopyranose, được liên kết với nhau bằng glucosidic Các phân tử cellulose tổng hợp với nhau do liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình (Hình 2.6)
Ngoài ra, trong thành phần của lignocelluloses còn có lignin Đây là phần không thể chuyển hóa thành đường Lignin là các polymer phức tạp bao gồm các đơn vị propan phenyl liên kết với nhau bằng các liên kết ether hoặc liên kết carbon- carbon (Hình 2.7)
Sau khi được trích ly chất béo, cám gạo tách béo (CGTB) có chứa một lượng tinh bột và polysaccharide đáng kể: tinh bột (46,7%), cellulose và hemicellulose (11,3%), chất béo (1,4%) [21] Các thành phần này được chuyển đổi thành các loại đường pentose và hexose bằng phương pháp thủy phân Một số tính chất và thành phần khác của CGTB được trình bày trong Bảng 2.2 Đây là một nghiên cứu của Sairam năm 2011 có sự so sánh giữa CGTB phòng thí nghiệm và CGTB thương mại
Từ nguồn dinh dưỡng này, CGTB được tận dụng như một nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất chất béo, góp phần giảm bớt chi phí cho quá trình sản xuất diesel sinh học
Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng và tính chất vật lý của CGTB (g/100g) [28]
Thành phần CGTB phòng thí nghiệm
CGTB thương mại Độ ẩm 13.3 11.1
Tỷ trọng (g/cc) 0.47 0.34 Độ hấp thụ nước
(ml/100g) 210 240 Độ hấp thụ chất béo (ml/100g) 180 210
Phương pháp thủy phân lignocellulose thành đường
Lignocellulose cần được chuyển hóa thành đường để vi sinh vật có thể sử dụng Quá trình chuyển hóa lignocellulose thành đường có thể lên men là vô cùng cần thiết trước khi được sử dụng trong các quá trình hóa sinh khác nhau Sản phẩm thủy phân của nguyên liệu chứa lignocellulose phần lớn bao gồm những loại đường có thể lên men như xylose, glucose và arabinose Các loại đường này là nguồn carbon lý tưởng cho quá trình sản xuất chất béo từ nấm men
2.4.1 Thủy phân bằng axit đậm đặc
Năm 1819, Braconnot lần đầu tiên phát hiện ra rằng cellulose có thể được chuyển hóa thành đường bằng axit đậm đặc Từ đó, H 2 SO 4 và HCl đậm đặc đã được sử dụng như tác nhân để xử lý nguyên liệu chứa lignocellulose Thủy phân bằng axit đậm đặc thường cho hiệu suất chuyển hóa đường cao hơn so với axit loãng
Bên cạnh đó, quá trình xử lý bằng axit đậm đặc có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp (40-50 °C) Tuy nhiên, nồng độ axit rất cao trong phương pháp này (30-70%), cùng với quá trình pha loãng và gia nhiệt trong quá trình thủy phân dễ gây ăn mòn thiết bị Do vậy, quá trình này đòi hỏi thiết bị phải được chế tạo bằng vật liệu chống ăn mòn đắt tiền như ceramic hoặc gạch lót carbon Quá trình trung hòa và thu hồi axit tốn nhiều năng lượng Chi phí đầu tư và bảo dưỡng cao dẫn đến quá trình này không hiệu quả về mặt kinh tế [29].
2.4.2 Thủy phân bằng axit loãng
Trong số các biện pháp depolymer hóa lignocellulose đã được nghiên cứu, thủy phân bằng axit loãng là phương pháp được sử dụng phổ biến và hiệu quả nhất [30], trong đó axit sử dụng có nồng độ từ 1-10% ở nhiệt độ từ 90-150 °C Các loại axit phổ biến là H 2 SO 4 [31-32], HCl [32-33] và H 3 PO 4 [34] Các axit trên giải phóng proton làm phá vỡ liên kết ether dị vòng giữa các phân tử đường trong mạch polymer hình thành bởi hemicellulose và cellulose Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng, pha lỏng quá trình thủy phân có thể bao gồm các loại đường (xylose, glucose và arabinose), và các hợp chất không mong muốn sinh ra từ sự phân hủy hemicellulose (oligomer từ các polymer, axit acetic) hoặc sự phân hủy các monosaccharide (furfural, HMF) [34]
Trong quá trình thủy phân phụ phẩm nông nghiệp, thông số quan trọng nhất là nồng độ axit vì nó quyết định đến sự phá hủy cấu trúc lignocellulose và sinh ra chất ức chế Ngoài ra, nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giảm khả năng phân hủy thành các sản phẩm không mong muốn Do đó, việc thiết lập các thông số này là cơ sở để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân, nhằm thu được lượng đường cao nhất và chất ức chế thấp nhất.
Có thể nói thủy phân bằng axit loãng được xem là biện pháp phù hợp nhất để thủy phân vật liệu chứa lignocellulose do có thể đạt tốc độ phản ứng và hiệu quả cao mà không có sự giảm cấp nhanh của các loại đường pentose và hexose Đặc biệt là không gây ra các vấn đề ăn mòn thiết bị và an toàn hóa chất
Thủy phân bằng enzyme là một kỹ thuật tiên tiến sử dụng enzyme gọi là Cellullase để phá vỡ cellulose trong sinh khối thành các monosaccharide đơn giản Quá trình này khác biệt so với các phương pháp thủy phân truyền thống sử dụng axit đặc hoặc axit loãng Enzyme Cellullase được phát hiện vào thời Thế chiến thứ II bởi các nhà khoa học Hoa Kỳ.
Cellulase thường là hỗn hợp của một số loại enzyme bao gồm endoglucanase, exoglucanases và β-glucosidase Khi hệ thống enzyme cellulase tương tác với chất nền cellulose, ba quá trình sẽ xảy ra liên tiếp (Hình 2.8) Trước tiên endoglucanase tấn công vào những vùng có độ kết tinh yếu của sợi cellulose hình thành các chuỗi tự do Tiếp theo, exoglucanase sự giải phóng các chất trung gian có thể hòa tan khỏi bề mặt phân tử cellulose Cuối cùng là sự thủy phân các chất trung gian thành glucose bởi β-glucosidase [38]
Hình 2.8 Sự tương tác của enzyme trên cellulose [39] Đường hóa bằng enzyme là quá trình thân thiện với môi trường, năng lượng tiêu tốn thấp do phản ứng ở nhiệt độ thấp và không phát sinh chất thải Đặc biệt là không gây ra các vấn đề về ăn mòn thiết bị và không sinh ra chất ức chế trong suốt quá trình thủy phân Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chi phí enzyme vô cùng đắt và thời gian phản ứng dài Đây chính là trở ngại lớn nhất khi mở rộng quy mô công nghiệp hóa quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme [40]
Bên cạnh đó, lượng enzyme sử dụng cho quá trình thủy phân sẽ bị giảm đáng kể do sự hiện diện của lignin như là chất hấp thụ enzyme Chính vì thế, đòi hỏi quá trình xử lý sơ bộ để phá vỡ cấu trúc tinh thể bên trong của cellulose và giảm hàm lượng lignin [41].
Chất ức chế
Quá trình thủy phân vật liệu lignocellulose bằng axit loãng không chỉ tạo thành các loại đường có thể lên men mà còn sinh ra một số sản phẩm phụ từ sự giảm cấp đường Các sản phẩm này có tính ức chế đối với vi sinh vật lên men Sự hình thành các chất ức chế này phụ thuộc vào nguyên liệu, phương pháp và điều kiện thủy phân [37] Các chất ức chế chính trong sản phẩm thủy phân lignocellulose là hợp chất phenolic, axit, furan aldehydes như thể hiện ở Hình 2.9
Hình 2.9 Một số chất ức chế phổ biến [42]
Phương pháp khử độc
Quá trình thủy phân vật liệu lignocellulose bằng axit loãng không chỉ tạo thành các loại đường có thể lên men mà còn sinh ra một số hợp chất có tính ức chế như các sản phẩm của sự giảm cấp đường và lignin Sự hiện diện của chúng là yếu tố chính hạn chế các quá trình chuyển hóa sinh học để tận dụng sản phẩm thủy phân Huang và cộng sự đã chứng minh các vi sinh vật cho dầu sinh trưởng kém và cho hàm lượng chất béo rất thấp (14.8%) khi nuôi cấy Trichosporon fermentans trong sản phẩm thủy phân rơm rạ chưa được khử độc Vì vậy, việc lựa chọn biện pháp khử độc sản phẩm thủy phân hiệu quả nhất là yếu tố quan trọng để cải thiện hiệu quả của quá trình lên men [43] Dưới đây là một số phương pháp tiêu biểu nhằm khử độc chất ức chế trong sản phẩm thủy phân
Sử dụng kiềm, đặc biệt là xử lý bằng Ca(OH)2 (vôi hóa, làm vôi quá mức) là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất để cải thiện khả năng lên men của sản phẩm thủy phân lignocellulose bằng axit loãng Không những vậy, phương pháp này còn được chứng minh là một trong những biện pháp khử độc tốt nhất hiện nay.
Trong phương pháp này, Ca(OH)2 được thêm một cách từ từ vào sản phẩm thủy phân để tăng pH lên đến khoảng 10-11 và giữ ở điều kiện này từ 30-60 phút, sau đó điều chỉnh đến pH thích hợp cho nuôi cấy bằng H2SO 4 hoặc HCl [45, 47]
Trong khi axit acetic nhìn chung không bị ảnh hưởng bởi sự vôi hóa, nồng độ các dẫn xuất furan và hợp chất phenolic giảm 45.8% và 35.87% tương ứng như thể hiện ở Bảng 2.3 [32] Persson và các đồng nghiệp giải thích cơ chế khử độc các dẫn xuất của furan (HMF và furfural) và hợp chất phenolic được chuyển thành các hợp chất ít độc hơn trong môi trường kiềm [48]
Bảng 2.3 So sánh hiệu quả loại bỏ chất ức chế của một số biện pháp khử độc [32]
Phương pháp Kết quả loại bỏ chất ức chế (%)
Xử lý bằng nhựa trao đổi ion 63.4 75.8 0
Xử lý bằng than hoạt tính 38.7 57 46.8
Mặc dù cho kết quả khử độc khá hiệu quả, chi phí thấp, các loại đường cũng có thể bị giảm cấp trong suốt quá trình vôi hóa Đây cũng là nhược điểm chính của phương pháp này Sự giảm cấp đường cũng như hiệu quả quá trình khử độc phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và thời gian khử độc Hàm lượng đường mất đi tăng lên cùng với sự tăng pH cũng như nhiệt độ Nguyên nhân do có sự hình thành ion phức giữa glucose và Ca 2+ trong môi trường base [49] Phản ứng tạo phức dừng lại khi pH được điều chỉnh xuống khoảng 5-6 [50]
Carbon hoạt tính có các trung tâm hoạt động tồn tại trong cấu trúc xốp và mao quản nên thường được sử dụng rộng rãi để loại bỏ các tạp chất trong pha lỏng hay pha khí Quá trình khử độc sản phẩm thủy phân lignocellulose bằng than hoạt tính được đánh giá là phương pháp có hiệu quả kinh tế cao do khả năng hấp phụ các chất ức chế mà không ảnh hưởng đến hàm lượng đường trong sản phẩm thủy phân [32]
Hiệu quả của xử lý bằng than hoạt tính phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như độ pH, nhiệt độ, thời gian tiếp xúc và hàm lượng than hoạt tính.
Do đó, phương pháp này cũng được ứng dụng để xử lý các chất ức chế trong sản phẩm lignocellulose thủy phân vì sự hấp thụ chất ức chế khá nhạy với sự thay đổi pH Nếu các chất tan được loại bỏ là axit yếu hoặc base yếu, pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hấp thụ của chúng Ngoài ra, thời gian tương tác là một yếu tố không kém phần quan trọng trong xử lý bằng than hoạt tính vì trong suốt quá trình hấp thụ, bề mặt của than sẽ liên tục bị che phủ bởi chất bị hấp thụ và bị mất hoạt tính sau một thời gian.
Nhựa trao đổi ion là phương pháp khử độc ưu việt được sử dụng để loại bỏ các hợp chất furan và phenolic trong sản phẩm thủy phân, cung cấp môi trường lên men hiệu quả tương tự như chất nền không có chất ức chế Chandel và các đồng nghiệp quan sát thấy nhựa trao đổi ion có thể giảm bớt 63.4% hợp chất furan và 75.8% hợp chất phenolic từ sản phẩm thủy phân bã mía [32] Sử dụng nhựa trao đổi ion giúp làm giảm tổng chi phí của quá trình khử độc do hiệu quả khử độc cao, và có thể được tái sử dụng nhiều lần Tuy nhiên, khử độc bằng nhựa trao đổi ion làm mất đi 26% khối lượng đường trong sản phẩm thủy phân [46] Đây là nhược điểm lớn nhất so với các phương pháp đã đề cập ở trên
Các enzyme hoặc vi sinh vật đặc thù có thể được sử dụng để tác động đến các chất độc hiện diện trong sản phẩm thủy phân và làm thay đổi thành phần của chúng Trong đó, Laccase là enzyme được sử dụng phổ biến nhất để khử độc sản phẩm thủy phân bằng axit loãng Xử lí bằng Laccase có thể loại bỏ chọn lọc và gần như hoàn toàn các hợp chất của phenol Sản phẩm thủy phân được khử độc với
Laccase loại bỏ đến 77.5% hợp chất chứa phenol vì thế làm tăng sự tiêu thụ glucose và năng suất ethanol [51] Tuy nhiên nó không làm thay đổi hàm lượng axit acetic và các hợp chất của furan Cơ chế của sự khử độc bằng enzyme có lẽ liên quan đến phản ứng oxy-polymer hóa của các hợp chất chứa phenol có khối lượng phân tử thấp [32].
Phương pháp trích ly chất béo
Trích ly bằng dung môi được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp hóa chất để sản xuất các hợp chất hóa học tinh khiết khác nhau, từ dược phẩm và y sinh đến phân tích kim loại nặng và các hợp chất hữu cơ trong hóa phân tích Trích ly bằng dung môi chủ yếu dựa trên độ tan tương đối của chất cần tách trong hai dung môi không trộn lẫn như nước và dung môi hữu cơ Kỹ thuật này phụ thuộc vào sự hòa tan chọn lọc của một hoặc một số cấu tử trong dung môi phù hợp Ưu điểm của kỹ thuật này là chi phí thấp Tuy nhiên, trích ly bằng dung môi là quá trình không liên tục, hiệu suất kém và cần nhiều nhân công [52]
Trích ly Soxhlet là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất để trích ly rắn- lỏng, đặc biệt được sử dụng nhiều với các mẫu có hàm lượng chất béo cao hoặc tách các hợp chất quan trọng Kỹ thuật này cho phép loại bỏ hoặc tách các hợp chất ra khỏi phần không hòa tan trong dung môi hoặc tách khỏi các hợp chất có thể ảnh hưởng đến quá trình phân tích tiếp theo Thông thường, nguyên liệu rắn được đặt trong ống hình trụ bằng cellulose (cellulose thimble) Bộ chiết Soxhlet được gắn với thiết bị ngưng tụ ở phía trên và đặt lên bình chứa dung môi trích ly Dung môi được gia nhiệt đến nhiệt độ sôi Các chất cần trích ly sẽ hoàn tan trong dung môi và chảy xuống bình chứa Ưu điểm của phương pháp trích ly Soxhlet là sự tương tác giữa mẫu trích ly và dung môi lặp đi lặp lại, giúp tách hoàn toàn chất phân tích ra khỏi mẫu thay vì phải sử dụng nhiều dung môi như phương pháp trích ly truyền thống
Hiệu suất trích ly tương đối cao do nhiệt độ của hệ thống cao hơn nhiệt độ phòng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác và lôi cuốn chất cần phân tích của dung môi Quy trình thao tác đơn giản, sau trích ly không cần công đoạn lọc và dung môi có thể được thu hồi và tái sử dụng Hạn chế của kỹ thuật này là thời gian trích ly tương đối dài, năng suất không cao, không có sự khuấy trộn trong quá trình trích và có thể dẫn đến sự phân hủy nhiệt của một số hợp chất nhạy với nhiệt độ [52-53]
Ngoài ra còn các phương pháp khác dùng để trích ly như: trích ly bằng chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn, trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm…
Trích ly bằng chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn là một trong những phương pháp thay thế cho trích ly thông thường Ưu điểm của chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn là sự linh động của các phần tử rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số khuếch tán cao giống như đang ở trạng thái khí nên nó có thể thấm vào những lỗ xốp của vật liệu rắn một cách hiệu quả hơn, góp phần làm tăng vận tốc truyền khối so với các dung môi lỏng thông thường [52] Tuy nhiên chi phí thiết bị cũng như vận hành thiết bị thường rất đắt tiền
Trong phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm, các bọt khí hình thành trong dung môi giúp tăng hiệu quả trích ly Sự nổ vỡ của các bọt khí tạo ra tia dung môi tốc độ cao hướng vào thành tế bào, tăng sự xâm nhập của dung môi và tiếp xúc giữa pha rắn và lỏng Từ đó, quá trình truyền khối được tăng cường, phá vỡ cấu trúc tế bào và giải phóng các chất nội bào vào dung dịch.
THỰC NGHIỆM
Phương tiện nghiên cứu
Axit sulfuric 98% (H 2 SO 4 ), Trung Quốc 3,5-dinitrosalicyli cacid (DNS), Meck, Đức Potassium Sodium tartrate tetrahydrate, Trung Quốc D(+)-glucose anhydrous, Meck, Đức
Sodium hydroxide (Na(OH)), Trung Quốc Canxi hydroxide (Ca(OH) 2 ), Trung Quốc Peptone, Ấn Độ
Yeast extract, Ấn Độ Bacto Technical Aga, Mỹ Urê, Trung Quốc n-hexane 99 %, Việt Nam Methanol 99.7 %, Việt Nam Axit béo chuẩn phân tích GC, Sigma Aldrich, Mỹ Hexane 99.4%, Merck
Bể điều nhiệt MPC controller (Huber) được sử dụng để thủy phân CGTB trong giai đoạn khảo sát các điều kiện thủy phân và chuẩn bị môi trường CGTBTP để tiến hành nuôi cấy
Máy quang phổ UV/VIS, Cary 50, Varian, Mỹ dùng để đo mật độ quang của dung dịch CGTBTP bằng phương pháp DNS và độ đục của sinh khối
Máy đo pH Mettler Toledo S220, Mỹ được sử dụng trong quá trình khử độc và đo pH ban đầu của môi trường nuôi cấy nấm men
Tủ sấy Memmert, Đức dùng để sấy nguyên liệu CGTB và sinh khối sau khi nuôi cấy nấm men
Tủ khử trùng Autoclave HVE50, Nhật Bản được sử dụng để khử trùng tất cả các dụng cụ và môi trường CGTBTP trước khi nuôi cấy
Thiết bị cô quay Buchi Vac V-500, Germany dung để cô quay thu hồi dung môi ở điều kiện chân không
Tủ ấm lắc JSSI-100C, Mỹ được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy nấm men Y lipolytica Po1g
Tất cả các thao tác chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy đều được thực hiện trong Tủ cấy vô trùng Clean bench
Bộ chiết Soxhlet được sử dụng trích ly chất béo từ sinh khối khô thu được từ quá trình nuôi cấy nấm men
Máy Máy sắc ký khí Shimadzu GC-2010 plus, Japan được sử dụng phân tích thành phần chất béo thu được.
Phương pháp nghiên cứu
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng thành phần dinh dưỡng trong CGTB để nuôi cấy nấm men Y lipolytica Po1g CGTB được thủy phân với H2SO 4 loãng Sau đó lọc để loại bỏ phần bã rắn, thu được dung dịch CGTBTP Do trong dung dịch thủy phân có sự tồn tại của các chất ức chế làm ảnh hưởng đến quá trình lên men nên phần dung dịch này được tiến hành khử độc bằng Ca(OH) 2 , điều chỉnh đến pH 6.5 với H2SO 4 , sử dụng dung dịch CGTBTP đã khử độc làm chất dinh dưỡng lên men vi sinh vật Thí nghiệm được tiến hành theo Hình 3.1
Xác định nồng độ sinh khối
Xác định hàm lượng lipid CGTB
Thủy phân với H 2 SO 4 loãng
DD CGTBTP đã khử độc
Tế bào nấm men Y.lipolytica Po1g
Nuôi cấy sơ bộ trong YPD
Cám gạo tách béo được cung cấp từ công ty TNHH Wilmar Agro Việt Nam (tiền thân là Chi nhánh Công ty TNHH Dầu Thực vật Cái Lân) tại Cần Thơ Cám gạo thô được tách dầu bằng phương pháp trích ly, sử dụng dung môi hexane cho ra sản phẩm CGTB Giá trị dinh dưỡng và chỉ tiêu chất lượng của CGTB được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Giá trị dinh dưỡng và chỉ tiêu chất lượng của CGTB
Thông tin dinh dưỡng: Đạm tối thiểu 14%
Vitamin B1 tối thiểu 30mg/kg Xơ tối đa 8%
Chỉ tiêu chất lượng: Độ ẩm tối đa 12%
Hàm lượng dầu tối đa 3%
3.2.2 Thủy phân CGTB bằng axit sulfuric
Quá trình thủy phân được thực hiện dựa theo phương pháp của Chandel [32], thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại để khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân đến nồng độ đường tổng như: thời gian thủy phân, nồng độ axit, nhiệt độ thủy phân, tỉ lệ CGTB/DDA Phần dung dịch CGTBTP ở mỗi thí nghiệm được lọc loại bỏ bã rắn và xác định nồng độ đường tổng bằng máy UV-VIS theo phương pháp DNS [54-55]
Bảng 3.2 Các yếu tố cần khảo sát trong quá trình thủy phân
Yếu tố khảo sát Yếu tố cố định Khoảng khảo sát
Thời gian (giờ) Nồng độ axit, nhiệt độ, tỉ lệ 2 – 8 Nồng độ axit (% v/v) Thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ 2 – 5 Nhiệt độ ( o C) Nồng độ axit, thời gian, tỉ lệ 60 – 100 Tỉ lệ (g/mL) Nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian 1/4 – 1/12
3.2.3 Khử độc dung dịch cám gạo tách béo thủy phân
Trong dung dịch CGTBTP có các thành phần gây ức chế sự phát triển của nấm men và quá trình lên men như furfural, HMF Xử lý dung dịch thủy phân này bằng phương pháp vôi hóa làm giảm các chất ức chế và cải thiện quá trình lên men
Với Ca(OH) 2 được thêm từ từ vào dung dịch CGTBTP đến pH 9-10, sau đó trung hòa đến pH 6.5 bằng H 2 SO 4 sử dụng máy đo pH (Melter Toledo, Mỹ) Sau khi khử độc dung dịch này được lọc chân không để loại bỏ kết tủa và được bảo quản ở 4 o C chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy nấm men
Hình 3.3 Quá trình khử độc sản phẩm CGTBTP
Trung hòa với H 2 SO 4 CGTBTP pH 9-10 Điều chỉnh pH 6.5 CGTBTP đã khử độc
3.2.4 Nấm men Yarrowia lipolytica Po1g
Trong quá trình lên men, chủng nấm men Yarrowia lipolytica Po1g của YEASTERN Biotech Co Ltd., được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Kỹ thuật Sinh học, Đại học Khoa học Công nghệ Quốc gia Đài Loan, đã được sử dụng Những tế bào nấm men này được bảo quản ở 4 độ C trên môi trường YPDA gồm chiết xuất nấm men 10 g/L, peptone 10 g/L, D-glucose 20 g/L và agar 20 g/L.
Hình 3.4 Nấm men Y lipolytica Po1g
3.2.5 Quá trình len men Yarrowia lipolytica Po1g 3.2.5.1 Nuôi cấy sơ bộ
Nấm men được nuôi sơ bộ trong môi trường YPD có chứa yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L, D-glucose 20 g/L trong 24 giờ, ở 26 o C, tốc độ lắc 160 vòng/phút Sau khi nuôi cấy sơ bộ, nấm men được nuôi cấy nhân rộng trong môi trường CGTBTP
3.2.5.2 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy trong môi trường CGTBTP
Các thí nghiệm được thực hiện trong bình tam giác 500ml có chứa 300 ml dung dịch CGTBTP và nấm men đã được nuôi sơ bộ với tỉ lệ 1:10 (v/v), trong điều kiện nhiệt độ 26 o C, tốc độ lắc 160 vòng/phút Các quá trình nuôi cấy được thực hiện trong tủ nuôi cấy vi sinh JSSI 100C (JSR, Mỹ) Tất cả dụng cụ và môi trường sử dụng trong quá trình nuôi cấy đều được khử trùng bằng thiết bị khử trùng Autoclave (HVE50, Nhật Bản) ở 121 o C trong 20 phút trước khi sử dụng Các yếu tố khảo sát trong quá trình lên men được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 3.3 Các yếu tố khảo sát trong quá trình nuôi cấy
Yếu tố khảo sát Khoảng khảo sát
Nguồn carbon Đường mía; D-glucose; CGTBTP
Phương pháp nuôi cấy Có BS nguồn carbon; không BS nguồn carbon
Các tế bào sinh khối được thu bằng cách ly tâm với tốc độ 5500 rpm trong 15 phút Phần sinh khối này được rữa lại 2 lần với nước cất và sấy khô ở 50 o C đến khối lượng không đổi Sinh khối sau khi sấy khô và nghiền nhỏ được trích ly bằng phương pháp chiết Soxhlet Quá trình chiết sử dụng 150ml hệ dung môi methanol và hexan với tỉ lệ 1:1 (v/v) Sau khi trích ly hỗn hợp được cô quay để loại bỏ dung môi, phần dầu thu được trữ ở 4 o C
Hình 3.6 Chiết Soxhlet 3.2.7 Khử sáp và nhựa trong dầu thô
Chất béo thô được khử sáp và nhựa theo phương pháp kết tinh eceton lạnh
Chất béo thô được hòa tan trong aceton ở 60 o C khoảng 1 giờ, khi dung dịch trong suốt Phần dung dịch này được làm nguội và trữ ở 4 o C trong 24 giờ để kết tinh các loại sáp và phospholipid Sau đó lọc để loại bỏ phần không hòa tan Phần chất thu được trữ trong tủ mát đến khi phân tích.
Phương pháp phân tích
Nồng độ đường tổng của dung dịch thủy phân được xác định bằng phương pháp DNS, phản ứng tạo phức màu giữa đường khử và axit dinitrosalicylic.
Thuốc thử DNS được thực hiện với 1 g 3,5-dinitrosalicylic axit, 30 g potassium sodium tartrate và 1.6 g sodium hydroxide pha loãng trong 100 mL nước cất và chứa trong chai màu nâu 3mL thuốc thử DNS được pha với 1mL mẫu dung dịch CGTBTP pha loãng, chứa trong các ống nghiệm có bọc giấy bạc Các ống nghiệm chứa mẫu được ngâm trong bể điều nhiệt ở 90 o C khoảng 15 phút Sau đó ngâm tiếp tục trong bể nước lạnh 15 phút Sử dụng máy quang phổ UV-VIS Cary 50 (Varian, Mỹ) ở bước sóng 540 nm để đo hàm lượng đường khử trong mẫu cần khảo sát, kết quả được tính toán dựa trên đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS (Phụ lục 1)
Hình 3.7 Phản ứng tạo phức giữa thuốc thử DNS và đường khử 3.3.2 Xác định hàm lượng nấm men
Các tế bào nấm men phát triển được thu bằng cách ly tâm và cân để xác định khối lượng Nồng độ sinh khối của nấm men Y.lipolytica Po1g ở các thí nghiệm khác nhau được xác định bằng phép đo mật độ quang của các mẫu, dựa trên đường chuẩn sinh khối của tế bào nấm men (Phụ lục 2)
Nấm men Y.lipolytica Po1g được lên men trong môi trường YPD trong 24 giờ, sau đó ly tâm và thu hồi sinh khối Sinh khối này được rữa lại 2 lần với nước cất Các mẫu tế bào được pha loãng với các nồng độ khác nhau và đo độ hấp thu bằng máy UV-VIS ở bước sóng 600 nm Nếu mật độ tế bào quá cao sẽ làm mất độ chính xác của độ hấp thu Vì vậy, khi xác định mật độ tế bào bằng máy đo UV-VIS, dung dịch huyền phù tế bào cần phải pha loãng đến những nồng độ thích hợp để có được độ hấp thu chính xác
3.3.3 Xác định thành phần chất béo
Thành phần chất béo được xác định bằng phương pháp sắc ký khí (GC) Mẫu dầu sau khi xử lý khử sáp và nhựa được loại bỏ hết dung môi Tiếp theo, mẫu được chuẩn bị với nồng độ 20 mg/mL trong dung môi ethyl acetate Điều kiện phân tích sử dụng như sau: nhiệt độ buồng tiêm và đầu dò là 365 ºC; nhiệt độ cột bắt đầu ở 80 ºC, tăng dần lên 365 ºC với tốc độ 15 ºC/phút, và giữ ở nhiệt độ cuối trong 10 phút Tổng thời gian phân tích là 29 phút.
3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu và chọn các thông số thí nghiệm
Các thông số thí nghiệm được sử dụng trong quá trình thủy phân và nuôi cấy nấm men được lựa chọn cẩn thận dựa trên các nghiên cứu trước đây về thủy phân lignocellulose và nuôi cấy nấm men Y lipolytica Những tài liệu tham khảo này cung cấp thông tin quan trọng về các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân và nuôi cấy để đảm bảo hiệu quả chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành các sản phẩm giá trị gia tăng.
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ghi nhận giá trị trung bình Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng chức năng Data analysis của phần mềm Excel (Microsoft Excel 2007, Microsoft, Mỹ) để xác định giá trị trung bình và sai số ngẫu nhiên.
Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sự phát triển sinh khối và tích lũy chất béo của nấm men
Sử dụng CGTBTP có NĐĐT 30 g/L, nhiệt độ 26 o C, pH 6.5, nuôi cấy trong thời gian 4 ngày, để tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ bổ sung lên sự sinh trưởng và tích lũy chất béo của nấm men Kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng các nguồn nitơ khác nhau ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối và hàm lượng chất béo (Hình 4.17) Việc sử dụng urê làm nguồn nitơ không ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ sinh khối (11.21g/L) nhưng làm giảm lượng chất béo tích lũy (7.35%) Y.lipolytica Po1g sinh trưởng và tích lũy chất béo tốt hơn khi nguồn nitơ là peptone (13.54 g/L, 14.4%) Nghiên cứu của Zhu và các đồng nghiệp (2008) cũng cho kết quả tương tự khi nuôi cấy Trichosporon fermentans trong môi trường có nguồn nitơ là urê thấp hơn so với peptone [58] Vì vậy, urê không phải là nguồn nitơ tốt cho quá trình tích lũy chất béo từ Y.lipolytica Po1g trong môi trường CGTBTP
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy là cần thiết cho sự tổng hợp protein và axit nucleic để phát triển tế bào Tuy nhiên, nguồn nitơ bị hạn chế và tỉ lệ carbon/nitơ là yếu tố chi phối quá trình tích lũy chất béo [5] Do có sự bổ sung peptone và urê làm tăng nồng độ nitơ trong môi trường nên vi sinh vật sẽ đồng hóa carbon tiếp sinh sản tế bào mới thay vì tích lũy chất béo Khi nguồn nitơ hạn chế nguồn carbon sẽ được chuyển hóa để tổng hợp chất béo gây ra sự tích lũy chất béo trong tế bào Do thành phần của cám gạo có chứa protein nên không cần bổ sung thêm lượng nitơ bên ngoài vào môi trường nuôi cấy Kết quả tốt nhất thu được khi không bổ sung nitơ vào môi trường nuôi cấy, nồng độ sinh khối là 11.73 g/L với lượng chất béo tích lũy được 25.41%
Hình 4.16 Chất béo từ Y.lipolytica Po1g ở các nguồn nitơ urê, peptone và không bổ sung thêm nitơ
Hình 4.17 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển sinh khối và hàm lượng chất béo tích lũy
Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và tích lũy chất béo của nấm men
So sánh sự phát triển của nấm men Y lipolytica Po1g trong môi trường CGTBTP đã khử độc với các nguồn carbon khác nhau như CGTBTP chưa khử độc (30 g/L), D-glucose (30 g/L), đường mía (30 g/L) Thí nghiệm được tiến hành trong thời gian nuôi cấy 4 ngày, không bổ sung nguồn nitơ, pH 6.5, nhiệt độ 26 o C
N ồ n g đ ộ si n h k h ố i , g /L H à m lư ợn g ch ấ t b éo , % Nồng độ sinh khối
Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng khi sử dụng nguồn carbon là CGTBTP đã khử độc thu được nồng độ sinh khối cao nhất là 11.73 g/L và chiếm 25.4% chất béo
Trước khi khử độc trong môi trường CGTBTP có chứa các chất ức chế HMF, furfural làm ức chế sự phát triển của nấm men nên sinh khối thu được thấp nhất (4.12g/L) và không tích lũy được chất béo Khi sử dụng nguồn carbon là D- glucose, sinh khối và chất béo (7.27 g/L, 19.44%) thấp hơn so với CGTBTP đã khử độc là do trong môi trường CGTBTP ngoài đường glucose còn có đường xylose và arabinose Kích thước các phân tử đường xylose nhỏ đủ để dễ dàng thẩm thấu qua màng tế bào của nấm men, dẫn đến sự tăng trưởng tế bào trong môi trường xylose nhanh hơn trong môi trường glucose Nấm men có thể tận dụng cả hai loại đường glucose và xylose [19] Ngoài ra, khi sử dụng đường mía làm nguồn carbon thu được sinh khối và hàm lượng chất béo là 8.28 g/L, 20.8% Điều này cho thấy rằng nấm men Y.lipolityca Po1g cũng có khả năng sinh trưởng trong môi trường sucrose
Hình 4.18 Chất béo từ Y.lipolytica Po1g ở các nguồn carbon D-glucose, đường mía, CGTBTP khử độc
Hình 4.19 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển sinh khối và hàm lượng chất béo tích lũy
Ảnh hưởng của môi trường pH đến sự phát triển và tích lũy chất béo của nấm men
Ngoài nguồn carbon, nguồn nitơ thì môi trường pH cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối và quá trình tích lũy chất béo Khảo sát pH trong môi trường axit (pH 4), môi trường trung tính (pH 6.5) và môi trường bazơ (pH 9) sử dụng CGTBTP có NĐĐT 30 g/L, không bổ sung nguồn nitơ, nhiệt độ nuôi cấy là 26 o C, thời gian nuôi cấy 4 ngày
Kết quả cho thấy ở pH 4 cho nồng độ sinh khối là cao nhất (16.87 g/L), pH 6.5 cho nồng độ sinh khối thấp hơn (11.73 g/L) nhưng chất béo thu được là cao nhất (25.41%) Trong môi trường bazơ pH 9 nấm men không phát triển (4.65 g/L) Theo báo cáo của Barth (1997) cũng cho thấy rằng, hầu hết các chủng Yarrowia lipolytica phát triển tốt trong môi trường pH 3.5 – 4 và sự sinh trưởng bắt đầu giảm khi pH trên 7 và ngừng phát triển khi pH trên 8 Tuy nhiên, khi sử dụng nguồn carbon là glucose khoảng pH thích hợp để nấm men tích lũy chất béo là 6.5 [14]
Nồng độ sinh khối Hàm lượng chất béo
Hình 4.20 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển sinh khối và tích lũy chất béo
Hình 4.21 Chất béo từ Y.lipolytica Po1g ở pH 4 và pH 6.5
Ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung đến sự phát triển và tích lũy chất béo của nấm men
Hầu hết các nghiên cứu về sự sinh trưởng và quá trình tích lũy chất béo của nấm men đều được thực hiện trong mô hình nuôi cấy theo mẻ (batch) Tuy nhiên, một số nghiên cứu về mô hình nuôi cấy thì chứng minh được rằng hệ thống nuôi cấy có bổ sung nguồn carbon (Fed-batch) là hệ thống nuôi cấy tốt nhất so với nuôi cấy liên tục và nuôi cấy theo mẻ [5]
Nồng độ sinh khốiHàm lượng chất béo
Thí nghiệm này được thực hiện trong bình tam giác 500 mL có chứa 300 mL CGTBTP đã khử độc Điều kiện nuôi cấy và nguồn carbon tương tự như nuôi cấy theo mẻ Sau 4 ngày của mẻ nuôi đầu tiên, một nửa dịch lên men được lấy ra, một nửa còn lại được bổ sung thêm nguồn carbon là CGTBTP đã khử độc, phần dịch lên men này có chứa các tế bào giàu chất béo có khả năng đẩy nhanh quá trình sinh trưởng tế bào ở mẻ thứ hai Kết thúc thí nghiệm ở ngày thứ 7 thu được sinh khối có nồng độ 20.6 g/L, hàm lượng chất béo 29.4% cao hơn so với quá trình nuôi cấy theo mẻ (11.73 g/L, 25.41%) Một nghiên cứu khác của Anschau cũng đã báo cáo rằng qua nhiều mẻ nuôi trong mô hình Fed-batch, lượng sinh khối thu được tương đương nhau nhưng hàm lượng chất béo thu được là tăng đáng kể [59]
Hình 4.22 Ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung đến sự phát triển và tích lũy chất béo của nấm men
Nghiên cứu này cho thấy rằng nuôi cấy có bổ sung nguồn carbon thu được hàm lượng chất béo tốt hơn nuôi cấy theo mẻ Ngoài ra còn tiết kiệm được hóa chất, giảm lượng YPD sử dụng để nuôi cấy sơ bộ
Bacth Fed-batch N ồ n g đ ộ s in h k h ố i, g /L H à m l ư ợn g c h ấ t b éo , %
Nồng độ sinh khốiHàm lượng chất béo
Kết quả phân tích thành phần chất béo
Thành phần chất béo thô thu được bao gồm: 52.37% chất béo phân cực (chủ yếu là các photpholipid), 41.93% chất béo trung tính và 5.7 % là sáp Các nghiên cứu khác cũng báo cáo với kết quả tương tự, thành phần chính của chất béo được tích lũy từ nấm men Y.lipolytica là chất béo phân cực chiếm hơn 50% lượng chất béo thu được [9, 19, 60]
Thành phần chất béo trung tính nuôi cấy từ nấm men Y.lipilytica Po1g trong môi trường CGTBTP đã khử độc với điều kiện NĐĐT 30g/L, không bổ sung nguồn nitơ, pH ban đầu là 6.5 được phân tích bằng sắc kí khí (GC) và được trình bày trong bảng Bảng 4.1và Hình 4.23 Kết quả cho thấy thành phần chủ yếu của chất béo là axit béo tự do và các glyceride Trong đó, 82.53% chất béo trung tính là các axit béo tự do (FFA) và mono-acylglycerides (MAG) 11.45%, di-acylglycerides (DAG) 1.41%, tri-acylglycerides (TAG) 3.05%, 1.56% các thành phần khác
Bảng 4.1 Thành phần chất béo từ nấm men Yarrowia lipolytica Po1g được nuôi cấy trong môi trường CGTBTP
Axit béo tự do (FFA) 82.53
Ngoài ra ảnh hưởng của các nguồn nitơ và carbon đến thành phần chất béo cũng được đánh giá sơ bộ
Bảng 4.2 Thành phần chất béo từ nấm men Y lipolytica Po1g trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau
Nấm men được nuôi cấy trong điều kiện pH 6.5, nhiệt độ 26 o C, với NĐĐT là 30 g/L
Thành phần cấu trúc mạch carbon của chất béo trung tính cũng được phân tích bằng sắc ký ghép phối phổ (GC/MS) Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và cho thấy thành phần cơ bản trong chất béo tích lũy từ nấm men Y.lipolytica Po1g là axit oleic (C18:1) 56.02%, axit palmatic (C16:0) 27.42%, axit stearic (C18:0) 9.05% và một số thành phần khác Kết quả cho thấy thành phần chất béo thu được tương tự với dầu thực vật Vì vậy, có thể kết luận đây là nguồn chất béo lý tưởng trong việc sản xuất dầu diesel sinh học
Bảng 4.3 Thành phần mạch carbon cấu trúc nên chất béo của nấm men
Hình 4.23 Sắc ký đồ của thành phần chất béo từ Y.lipolytica trong môi trường
CGTBTP (1)và thành phần axit béo cấu trúc nên chất béo (2)
FFA: axit béo tự do; MG: monoglyceride; DG: diglyceride; TG: triglyceride
4.13 So sánh sự phát triển của nấm men Yarrowia lipolytica trong các nguồn carbon khác nhau
Nấm men Y lipolytica sinh trưởng trong môi trường carbon khác nhau sẽ ảnh hưởng đến nồng độ sinh khối và hàm lượng chất béo (Bảng 4.4)
Bảng kết quả so sánh cho thấy hàm lượng chất béo thu được từ CGTBTP trong nghiên cứu này (25.4%) thấp hơn so với nguồn carbon là bã mía thủy phân
[19], chất béo công nghiệp [60], glycerol công nghiệp [17] có hàm lượng chất béo từ (43 – 58.5%) Tuy nhiên kết quả này (CGTBTP, 25.4%) cao hơn nhiều so với nguồn carbon là rơm lúa mì (4.6%) [61] và methanol (4.9%) [62] Mặt khác, CGTB vừa có thể sử dụng làm nguồn carbon, vừa là nguồn cung cấp nitơ, đây cũng là một lợi thế khi sử dụng nguồn nguyên liệu này Điều này cũng cho thấy rằng CGTBTP là nguồn nguyên liệu có thể sử dụng để sản xuất chất béo từ vi sinh vật cho dầu
Bảng 4.4 Hàm lượng sinh khối và chất béo của nấm men Yarrowia lipolytica phát triển trên các chất nền khác nhau
Nấm men Nguồn carbon Sinh khối (g/L) Chất béo
Y lipolytica Chất béo công nghiệp 8.7 44 [60]
Y lipolytica Glycerol, axit béo tự do - 20 [64]