Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt NamNghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ

DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG

HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM

Chuyên nghành : Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số : 9720210 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2023

Công trình được hoàn thành tại:

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phương Thiện Thương TS Nguyễn Thị Liên

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Duy Thuần Phản biện 2: PGS.TS Lê Đình Chi Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Văn Minh

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Vào hồi: 8 giờ 30 ngày 30 tháng 5 năm 2023

Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của luận án

Dược liệu đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người Tổ chức y tế thế giới ước tính khoảng 80% dân số trên thế giới hiện nay có sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe Những thập kỷ gần đây xu thế quay trở lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng phổ biến làm tăng đáng kể nhu cầu về dược liệu trên toàn thế giới

Tại Việt Nam, “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” theo quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 và “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030” theo quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tướng Chính phủ hướng đến tăng tỷ lệ thuốc sản xuất trong nước lên 80%, trong đó thuốc từ dược liệu chiếm 30%; 100% nguyên liệu sản xuất thuốc dược liệu được tiêu chuẩn hóa

Hy thiêm Siegesbeckia orientalis (L.) thuộc họ Cúc – Asteraceae và Vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ Sim –

Myrtaceae được coi là các vị thuốc quý, được nhân dân ta sử dụng lâu đời Đây cũng là các vị thuốc đã được đưa vào DĐVN V, danh mục thuốc thiết yếu Tuy nhiên các chuyên luận trong DĐVN V còn đơn giản, chưa có định tính, định lượng các chất đánh dấu như xu hướng chung Vối chưa thấy được đưa vào Dược điển các nước, trong khi Hy thiêm đã được đưa vào Dược điển Hồng Kông và Trung Quốc với yêu cầu định lượng chất đánh dấu kirenol bằng HPLC Tuy nhiên một số nghiên cứu chỉ ra rằng Hy thiêm Việt Nam không chứa hoặc chứa rất ít kirenol, trong khi chứa một lượng đáng kể darutosid một diterpenoid được chứng minh có tác dụng tương đương kirenol trong chống viêm, làm lành vết thương Một số nghiên cứu chỉ ra 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1) là thành phần flavonoid chính trong Vối, được chứng minh có tác dụng chống viêm, phục hồi tế bào gan, làm giảm hấp thu glucose trên tế bào cơ và tế bào tạo mỡ nuôi cấy

Xuất phát từ thực tế đó luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất

chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam” được thực hiện với một số mục

tiêu nghiên cứu như sau:

- Chiết xuất và tinh chế darutosid từ dược liệu Hy Thiêm, CO1 từ dược liệu Vối đạt độ tinh khiết ≥ 95% và khối lượng ≥ 2,0 gam đủ cho xây dựng qui trình thiết lập chất chuẩn gốc

- Xây dựng được qui trình thiết lập chất chuẩn gốc từ nguyên liệu darutosid, CO1 tinh chế được

- Ứng dụng chất chuẩn thiết lập được để xây dựng qui trình xác định các chất trên trong một số dược liệu Hy Thiêm, Vối thu hái được ở Việt Nam

2 Những đóng góp mới của luận án

- Đã xây dựng được quy trình chiết xuất, tinh chế nguyên liệu darutosid hàm lượng trên 95% từ dược liệu Hy Thiêm thu hái một số vùng tại Việt Nam ở quy mô ≥ 10 kg/lô

- Đã xây dựng được quy trình phân lập, tinh chế methoxy-3՛,5՛-dimethylchalcon (CO1) hàm lượng trên 95% từ dược liệu Vối (nụ Vối) thu hái một số vùng tại Việt Nam ở quy mô ≥ 10 kg/lô

2՛,4՛-dihydroxy-6՛ Đã xây dựng được qui trình thiết lập chất chuẩn gốc từ nguyên liệu darutosid tinh chế được Thu được 90 lọ chuẩn gốc darutosid hàm lượng 95,16 ± 0,05 % (nguyên trạng), theo dõi độ ổn định tới 9 tháng

- Đã xây dựng được qui trình thiết lập chất chuẩn gốc từ nguyên liệu CO1 tinh chế được Thu được 80 lọ chất chuẩn gốc CO1 hàm lượng 96,52 ± 0,05 % (nguyên trạng), theo dõi độ ổn định tới 30 tháng

- Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong dược liệu Hy Thiêm bằng phương pháp HPLC và ứng dụng phương pháp này để xác định hai chất này trong một số mẫu dược liệu Hy Thiêm thu hái được tại Việt Nam

- Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định tính, định lượng CO1 trong dược liệu Vối (nụ Vối và lá Vối) bằng phương pháp HPLC và ứng dụng phương pháp này để xác định CO1 trong một số dược liệu Vối thu hái được tại Việt Nam

3 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 131 trang, 41 hình và 49 bảng Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); Đối tượng nội dung và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Kết quả nghiên cứu (64 trang); Bàn luận (20 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 103 tài liệu tham khảo và 240 trang phụ lục

NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có: - Vai trò của chất chuẩn trong kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm từ dược liệu Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược liệu

- Tổng quan về đối tượng nghiên cứu dược liệu Hy thiêm

(Siegesbeckia orientalis L., có tài liệu là Sigesbeckia orientalis L.) và dược liệu Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry): vị trí

phân loại, đặc điểm thực vật học và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tiêu chuẩn hóa chất lượng

- Từ tổng quan trên, định hướng lựa chọn chất đánh dấu darutosid trong KTCL dược liệu Hy thiêm và CO1 trong KTCL dược liệu Vối

- Tổng quan về chiết xuất, phân lập, tinh chế darutosid và CO1 từ Hy thiêm và Vối

- Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn hóa học gồm: chất chuẩn hóa học gốc (PCRS) và chất chuẩn hóa học thứ cấp (SCRS) Khái niệm về chất đánh dấu sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, yêu cầu về chất lượng, độ tinh khiết Tổng quan về hướng dẫn về thiết lập chất chuẩn theo ISO 17034 và ISO Guide 35

- Tổng quan về xác định các đặc tính (characterization) của chất chuẩn gốc hóa học: Theo hướng dẫn của Int’P, EP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính của chất chuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…; xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc hóa học bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạp chất liên quan bằng kỹ thuật HPLC/DAD, xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp cắn sau nung hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp với hợp chất dạng tinh thể bằng kỹ thuật DSC Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo theo ISO Guide 35, ISO 13528

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

08 mẫu dược liệu Hy thiêm, 08 mẫu dược liệu nụ Vối và 08 mẫu dược liệu lá Vối được thu hái ở các địa phương và thời điểm khác nhau

Bảng 2.1 Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng trong nghiên cứu

Hy thiêm Địa điểm, thời gian thu hái

HT1 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 6/2019 HT2 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2020

(Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) Đã được định danh tại Viện Dược liệu - Phụ lục 1 HT3 Thành phố Thanh Hóa, tháng 4/2020

(Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT4 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2021

(Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) HT5 Thành phố Thanh Hóa, tháng 5/2021

(Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT6 Huyện Thạch Hà – Hà Tĩnh, tháng 6/2020 HT7 Thành phố Hòa Bình, tháng 6/2021 HT8 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2022

(Vùng trồng của Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa)

Bảng 2.2 Mẫu Dược liệu nụ Vối và lá Vối dùng trong nghiên cứu

Lá Vối Nụ Vối Địa điểm, thời gian thu hái

- Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Dược liệu, Viện KHCN Việt Nam -Hàn Quốc, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất darutosid từ Hy thiêm và CO1 từ nụ Vối và làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

- Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất darutosid và CO1: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS, NMR

- Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bay hơi của các chất darutosid và CO1

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid và CO1

- Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid và CO1 - Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng darutosid trong Hy thiêm; CO1 trong nụ Vối và lá Vối

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng định tính, định lượng darutosid trong 08 mẫu Hy thiêm; CO1 trong 08 mẫu nụ Vối, 08 mẫu lá Vối

2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc của chất tinh khiết

- Chiết xuất bằng cách ngâm lạnh với ethanol 96% Dịch chiết được cất thu hồi dung môi, phân tán lại trong nước và lắc phân đoạn với các dung môi n-hexan, ethyl acetat Thu được cao ethyl acetat

- Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel pha thuận và pha đảo RP18 gradient dung môi

- Tinh chế các chất tinh khiết bằng sắc ký cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo RP18 (với chất darutosid) và sắc ký lỏng điều chế (với chất CO1) gradient dung môi

- Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích

- Xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều (1NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR)

H-2.3.2 Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng

- Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy,…

- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan (TCLQ) bằng HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phép thử tro sulfat và tạp chất bay hơi bằng TGA

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng

 Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn và bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn theo hướng dẫn ISO Guide 35  Đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng ống

 Xác định độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC/DAD tại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP và ISO 17025 (Khoa Vật lý đo lường – Cơ sở 1 và Khoa Thiết lập chất chuẩn, Khoa Nghiên cứu phát triển – Cơ sở 2, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) Mỗi PTN nhận 6 ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hành phân tích TCLQ Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftb Khi Ftn < Ftb, kết quả trung bình của 3 PTN khác nhau không có ý nghĩa, giá trị TCLQ được lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN  Độ tinh khiết sắc kí (%) = 100 (%) – hàm lượng TCLQ (%)  Xác định tạp bay hơi bằng TGA, tạp vô cơ bằng phương pháp tro

sulfat  Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA

bằng phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance):

Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100

 Xác định độ không đảm bảo đo: Độ không đảm bảo đo của hàm lượng TCLQ bằng HPLC/DAD Mỗi chất chuẩn được gửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu Xác định độ không đảm đo (loại A) của mỗi PKN:

𝑢𝑆= 𝑆

√𝑁 (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) Độ không đảm bảo đo tổng hợp của 3 PKN (uTH) được theo công thức tính độ không đảm bảo đo loại A của hướng dẫn ISO Guide 35

𝑢𝑇𝐻=𝑠(𝑦)√𝑝= 1

Chọn uTH lớn hơn là độ không đảm bảo đo của giá trị hàm lượng TCLQ và độ tinh khiết sắc ký

Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp bay hơi bằng TGA Mỗi chất chuẩn được tiến hành phân tích 6 mẫu trên 6 ống Xác định độ không đảm đo (loại A):

𝑢𝑆= 𝑆

√𝑁 (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) Độ không đảm bảo đo lan truyền của kết quả tro sulfat theo công thức:

𝑢𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử= 𝑢𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜= √𝑢𝑠12 + 𝑢𝑠22𝑢ℎà𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜= 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜 × √𝑢𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜

2𝑚𝑡𝑟𝑜

+𝑢𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử2

Độ không đảm bảo đo mở rộng ở độ tin cậy 95% công bố là UCRS = 2 x uCRS

2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong Hy thiêm

2.3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết

Khảo sát sự phù hợp của phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc trên dược liệu Hy thiêm thu hái ở Việt Nam Sau khi được chiết theo Dược điển Trung Quốc, bã dược liệu được chiết thêm một lần nữa, cô cạn dịch chiết trên cách thủy, thêm 2 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm sắc ký HPLC Ghi lại diện tích của các pic quan tâm (nếu xuất hiện), từ đó tính hiệu suất chiết Điều chỉnh phương pháp chiết nếu hiệu suất chiết thấp

2.3.3.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC

Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC với các tiêu chí độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác, độ chính xác trung gian, độ đúng, giới hạn pháp hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) theo hướng dẫn của ICH Q2(R1)và AOAC

Áp dụng phương pháp đã xây dựng trong định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm thu hái ở các vùng miền và thời điểm khác nhau

2.3.4 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối

2.3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết

Khảo sát chiết bằng dung môi methanol và ethyl acetat bằng cách lắc siêu âm hoặc đun hồi lưu cách thủy Kiểm tra đến khi dịch chiết không cho phản ứng tạo màu xanh đen với dung dịch sắt (III) clorid 5% Kiểm tra lại bằng HPLC Lựa chọn dung môi và phương pháp chiết nhanh, đơn giản, tiết kiệm

2.3.4.2 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC

Khảo sát sự phù hợp của quy trình định lượng TCLQ trong nguyên liệu thiết lập chuẩn CO1 trong định tính, định lượng CO1 trong Vối nụ và Vối lá, điều chỉnh quy trình (nếu cần) cho phù hợp với đối tượng mẫu là dược liệu Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của ICH Q2(R1) và AOAC

Áp dụng phương pháp đã xây dựng trong định tính, định lượng CO1 trong Vối nụ và Vối lá thu hái ở các vùng miền và thời điểm khác nhau

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

3.1.1 Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc darutosid

Hy thiêm (đã được định danh) được chiết xuất dưới dạng cao ethyl acetat và tinh chế theo sơ đồ bên:

Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HRESI-MS, IR, 1D và 2D-NMR trùng khớp với dữ liệu phổ của chất darutosid phân lập từ loài

Siegesbeckia orientalis

L., cho phép xác định

chất tinh chế được chính là hợp chất darutosid

Hình 3.2 Sơ đồ tinh chế darutosid

3.1.2 Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc CO1

- Nụ Vối (đã được định danh) được chiết xuất, phân lập theo sơ đồ sau:

Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất, phân lập CO1 từ nụ Vối

- Phân đoạn CO1 (6 g) được tinh chế bằng HPLC điều chế với điều kiện sắc ký như sau:

 Cột Shimadzu Shim-pack VX-ODS (10) 250 × 20.0 mm  Pha động: hỗn hợp dung môi ACN – nước (7:3)

 Tốc độ dòng: 5 ml/phút Loại dung môi: Cất quay chân không ở 50oC thu được hợp chất CO1 (2,8 g) ở dạng tinh thể màu vàng, dùng để thiết lập chất chuẩn

Xác định độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp quét nhiệt lượng vi sai (DSC) Kết quả chất tinh chế có độ tinh khiết 96,02% Kết quả này không dùng để xác định giá trị ấn định của chất chuẩn thiết lập được mà để khẳng định và bổ trợ thêm cho kết quả kiểm tra tạp bằng các phương pháp cân bằng khối lượng

Chất tinh chế được tiến hành đo phổ ESI-MS, IR, 1D và 2D-NMR

trùng khớp với dữ liệu phổ của chất CO1 phân lập từ loài Cleistocalyx

operculatus, cho phép xác định chất tinh chế được chính là hợp chất CO1

Hình 3.6 Công thức cấu tạo của

3.2.1.1 Xây dựng và TĐPP HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu darutosid

- Xây dựng phương pháp HPLC xác định độ TKSK và TCLQ của darutosid

- Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký:

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần đối với dung dịch thử: Hệ số kéo đuôi pic chính (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic chính không ít hơn 50.000; Độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng TKSK không được lớn hơn 2,0%; Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic chính không được lớn hơn 1,0 %

- Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của nguyên liệu darutosid theo hướng dẫn của ICH

A Mẫu trắng B Mẫu thử

Hình 3.16: SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong darutosid

3.2.1.2 Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng

Dựa trên kết quả thực nghiệm định tính xác định cấu trúc darutosid, kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu darutosid, kết quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu darutosid xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu darutosid

Tính chất: Bột vô định hình màu trắng, rất khó tan trong nước, tan trong

methanol

Định tính

- Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS): Trong khoảng bước sóng từ

200 – 400 nm không thể hiện rõ cực đại hấp thụ, hấp thụ cao nhất ở 200 nm và hầu như không hấp thụ quang ở bước sóng lớn hơn 240 nm

- Phổ hồng ngoại (IR): Trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có các đỉnh đặc trưng trong khoảng: 3386, 2938, 2873, 1637, 1458, 1385, 1370, 1079, 1028, 920, 881 (± 20 cm-1)

- Phổ khối (MS): Phổ HR-ESI-MS của mẫu thử phải có pic ion m/z

529,30265 [C26H44O8+ HCOO]-

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trong dung môi CD3OD:

 Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δH ppm: 5,18; 4,35; 3,87; 3,73 – 3,66; 3,58; 3,48; 3,43 – 3,35; 3,33 – 3,29; 3,25; 3,18; 2,29; 2,10 – 1,94; 1,79; 1,72; 1,68 – 1,63; 1,62 – 1,53; 1,46 – 1,34; 1,22 – 1,09; 1,06; 0,98 – 0,89; 0,88; 0,85 (± 0,5 ppm)  Có các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC ppm: 139,9; 129,5;

101,9; 86,0; 78,3; 77,7; 77,5; 75,2; 71,9; 64,3; 63,0; 56,2; 52,1; 39,4; 39,0; 38,5; 38,1; 37,1; 33,3; 29,2; 24,4; 23,4; 23,1; 19,4; 17,3; 15,3 (± 0,5 ppm)

Mất khối lượng do làm khô (Tạp chất bay hơi): Không quá 3,0% Cắn sau nung (Tạp chất vô cơ): Không quá 0,2%

Tạp chất liên quan: Tổng tạp không lớn hơn 5,0%

3.2.2 Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng

3.2.2.1 Xây dựng và TĐPP HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1

- Xây dựng phương pháp HPLC xác định độ TKSK và TCLQ của CO1

- Pha động: