Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng hy thiêm và vối việt nam

Những đóng góp mới của luận án được tóm tắt như sau: 1. Về chiết xuất, phân lập, tinh chế các hợp chất từ dược liệu làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Đã xây dựng được quy trình chiết xuất, tinh chế darutosid hàm lượng trên 95% từ Hy thiêm ở quy mô lớn (>10 kgmẻ) để thiết lập chất chuẩn. Đã xây dựng được quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 2′,4′dihydroxy6′methoxy3′,5′dimethylchalcon (CO1) hàm lượng trên 95% từ nụ Vối ở quy mô lớn (>10 kgmẻ) để thiết lập chất chuẩn. 2. Về thiết lập chất chuẩn gốc Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc. Đã xây dựng thường quy kỹ thuật và thực hiện thiết lập 90 lọ chất chuẩn gốc darutosid hàm lượng 95,16 ± 0,05% theo nguyên trạng. Theo dõi độ ổn định trong 9 tháng. Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc. Đã xây dựng thường quy kỹ thuật và thực hiện thiết lập 80 lọ chất chuẩn gốc CO1 hàm lượng 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng. Theo dõi độ ổn định trong 30 tháng. 3. Về kiểm nghiệm dược liệu Đã xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC. Sử dụng darutosid là chất đánh dấu dùng cho định tính, định lượng trong kiểm nghiệm Hy thiêm là đóng góp mới của Luận án, khác với quy định của Dược điển Trung Quốc và Tiêu chuẩn chất lượng về dược liệu của Hồng Kông. Luận án đưa ra đề xuất này để phù hợp với dược liệu Hy thiêm được trồng và thu hái ở Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả cho việc tổ chức nuôi trồng, sản xuất và quản lý chất lượng của dược liệu Hy thiêm và sản phẩm có Hy thiêm trong nước. Đã xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và trong lá Vối bằng H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GĨP PHẦN HỒN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GĨP PHẦN HỒN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Phương Thiện Thương TS Nguyễn Thị Liên HÀ NỘI, NĂM 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu thiết lập số chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu để góp phần hồn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm Vối Việt Nam” cơng trình nghiên cứu tơi với hướng dẫn khoa học PGS.TS Phương Thiện Thương TS Nguyễn Thị Liên Các kết trình bày luận án trung thực công bố phần báo khoa học nhóm nghiên cứu Luận án chưa công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu khoa học tác giả khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, nhận giúp đỡ tận tình có hiệu nhiều tập thể cá nhân, thầy, cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Cho phép tơi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS Phương Thiện Thương – Phó Viện trưởng Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam – Hàn Quốc, TS Nguyễn Thị Liên – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, người thầy định hướng, hướng dẫn tơi q trình thực luận án Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa/Phòng Viện tạo điều kiện môi trường nghiên cứu, sở vật chất, trang thiết bị, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để hồn thành luận án Bộ Khoa học Cơng nghệ cấp kinh phí cho Nhiệm vụ Khoa học Công nghệ cấp Bộ, mã số 01.2020M001, đồng nghiệp Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc phối hợp hỗ trợ trình thực nghiên cứu Cơng trình nghiên cứu hoàn thành với nỗ lực thân ủng hộ gia đình, bạn bè, xin cảm ơn người sát cánh bên tôi, động viên khích lệ tơi hồn thành nghiên cứu Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2022 NCS Nguyễn Thị Phương Thảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1.1.1 Sự cần thiết phải có chất đối chiếu kiểm nghiệm dược liệu 1.1.2 Hướng dẫn Tổ chức Y tế giới lựa chọn chất đánh dấu dược liệu 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.2.1 Hy thiêm 1.2.1.1 Vị trí phân loại 1.2.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.1.3 Thành phần hóa học 1.2.1.4 Tác dụng sinh học 10 1.2.1.5 Tiêu chuẩn hóa dược liệu Hy thiêm 11 1.2.1.6 Hợp chất darutosid 12 1.2.2 Vối 13 1.2.2.1 Vị trí phân loại 13 1.2.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố 13 1.2.2.3 Thành phần hóa học 14 1.2.2.4 Tác dụng sinh học 18 1.2.2.5 Tiêu chuẩn hóa dược liệu Vối 19 1.2.2.6 Hợp chất 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5' –dimethylchalcon (CO1) 20 1.3 TỔNG QUAN VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN HÓA HỌC 22 1.3.1 Định nghĩa, phân loại chất chuẩn hóa học 22 1.3.2 Thiết lập chất chuẩn hóa học 23 1.3.2.1 Yêu cầu hàm lượng với chất đánh dấu dược liệu 23 1.3.2.2 Thiết lập chất chuẩn hóa học gốc 24 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 32 2.1.1 Dược liệu Hy thiêm 32 2.1.2 Dược liệu nụ Vối Vối 32 2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 33 2.2.1 Vật tư, hóa chất 33 2.2.2 Thiết bị 34 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc hợp chất 36 2.3.2 Tiêu chuẩn chất lượng phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu để thiết lập chuẩn 36 2.3.2.1 Xây dựng liệu nhận dạng 37 2.3.2.2 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan HPLC/DAD 37 2.3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc 38 2.3.3 Thiết lập chất chuẩn gốc 39 2.3.3.1 Đóng lọ 39 2.3.3.2 Kiểm tra độ đồng q trình đóng gói 40 2.3.3.3.Xác định giá trị ấn định công bố chứng với chuẩn gốc định lượng 40 2.3.3.4 Xác định độ không đảm bảo đo 43 2.3.3.5 Dán nhãn bảo quản ống chuẩn 44 2.3.3.6 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn thiết lập 44 2.3.4 Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid HPLC 45 2.3.4.1 Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu 45 2.3.4.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng HPLC 45 2.3.5 Xây dựng quy trình định tính, định lượng CO1 Vối nụ Vối HPLC 46 2.3.5.1 Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu 46 2.3.5.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng HPLC 46 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47 3.1 CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 47 3.1.1 Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc darutosid 47 3.1.1.1 Chiết xuất, tinh chế 47 3.1.1.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế 49 3.1.2 Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc CO1 52 3.1.2.1 Chiết xuất, tinh chế 52 3.1.2.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất CO1 tinh chế 56 3.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 59 3.2.1 Nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn gốc định lượng 59 3.2.1.1 Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chuẩn darutosid 59 3.2.1.2 Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng 68 3.2.2 Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng 70 3.2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết nguyên liệu CO1 70 3.2.2.2 Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn định lượng 78 3.3 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 80 3.3.1 Kiểm tra chất lượng, đóng lọ đánh giá đồng q trình đóng gói 80 3.3.2 Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng 81 3.2.2.1 Xác định độ tinh khiết sắc ký 81 3.2.2.2 Xác định tạp chất bay 84 3.2.2.3 Xác định tạp chất vô 85 3.2.2.4 Giá trị ấn định độ không đảm bảo đo 85 3.3.3 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn thiết lập 86 3.3.3.1 Chất chuẩn darutosid 87 3.3.3.2 Chất chuẩn CO1 88 3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM, NỤ VỐI VÀ LÁ VỐI 89 3.4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm HPLC 89 3.4.1.1 Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu 89 3.4.1.2 Thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid HPLC 90 3.4.1.3 Khảo sát hàm lượng kirenol darutosid Hy thiêm 100 3.4.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 nụ Vối Vối HPLC 100 3.4.2.1 Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu 100 3.4.2.2 Thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 HPLC 102 3.4.2.3 Khảo sát hàm lượng CO1 nụ Vối Vối 109 CHƯƠNG BÀN LUẬN 111 4.1 VỀ CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 111 4.1.1 Lựa chọn hợp chất Vối Hy thiêm cần phân lập 111 4.1.1.1 Lựa chọn hợp chất Hy thiêm 111 4.1.1.2 Lựa chọn hợp chất Vối 112 4.1.2 Về chiết xuất tinh chế chất 113 4.1.3 Về xây dựng liệu nhận dạng 115 4.2 VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 116 4.2.1 Định tính, xác định cấu trúc chất chuẩn gốc 116 4.2.2 Xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc định lượng 116 4.2.2.1 Xác định tạp chất bay 117 4.2.2.2 Xác định tạp chất vô 117 4.2.2.3 Xác định tạp chất hữu 118 4.3 VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 121 4.3.1 Đóng lọ đánh giá đồng 121 4.3.1.1 Đóng lọ 121 4.3.1.2 Đánh giá đồng 122 4.3.2 Xác định giá trị ấn định 123 4.3.3 Theo dõi độ ổn định 125 4.4 VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM 126 4.4.1 Định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid Hy thiêm HPLC 126 4.4.2 Định tính, định lượng CO1 nụ Vối Vối HPLC 128 4.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC Tên tiếng Anh Association of Official Analytical Chemists Tên tiếng Việt Hiệp hội nhà phân tích hóa học ASEAN Association of South East Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á Asian Nations CO1 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy3′,5′-dimethylchalcone 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon CRS Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học DAD Diode Array Detector Đầu dò dãy diod quang DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DSC Differential Scanning Calorimetry Phương pháp quét nhiệt vi sai EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu ESI-MS Electrospray Ionisation Mass Spectrum Khối phổ ion hóa tia điện GACP Good Agricultural and Collection Practices Thực hành tốt trồng trọt thu hái GC Gas Chromatography Sắc ký khí GMP Good manufacturing practice Thực hành sản xuất tốt GTAĐ Giá trị ấn định HL Hàm lượng HPLC High-Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HR-LC- High Resolution Liquid ESI-MS Chromatography Electrospray Ionisation Mass Spectrum Sắc ký lỏng khối phổ ion hóa tia điện phân giải cao ICH International Conference on Harmonisation Hội nghị quốc tế hòa hợp Int’P International Pharmacopeia Dược điển Quốc tế IR Infrared spectroscopy Quang phổ hồng ngoại ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KL Khối lượng KHCN Khoa học Công nghệ KNV Kiểm nghiệm viên KTCL Kiểm tra chất lượng LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng NIST National Institute of Standard and Technology Viện Quốc gia Tiêu chuẩn Công nghệ Hoa Kỳ NSX Nhà sản xuất PCRS Primary Chemical Reference Standard PHPLC Preparative High-Performance Sắc ký lỏng điều chế Liquid Chromatography PTN Chất chuẩn hóa học gốc Phịng thí nghiệm RS Reference Substance Chất chuẩn đối chiếu RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCRS Secondary Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học thứ cấp S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu đường Spic Diện tích pic TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TCLQ Tạp chất liên quan TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lượng TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TKSK USP Tinh khiết sắc ký United State Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV-VIS Ultravioliet – Visible Spectrophotometer Quang phổ tử ngoại – khả kiến WHO Tổ chức Y tế Thế giới World Health Organization Mẫu Lượng cân mẫu thử (g) Diện tích pic (mAu.s) HLTB (%) % RSD LV 3,37 1,0785 1835739 3,29 1,0016 1779556 3,37 3,34 ± 0,05 1,35 1,0133 1966386 3,72 1,0757 1999600 3,56 1,0312 1959802 3,64 HLTB (%) % RSD 3,64 ± 0,08 2,15 1,0135 946299 1,79 1,0336 970219 1,80 1,0523 955532 1,74 HLTB (%) % RSD LV 1,72 1821398 % RSD LV 9,46 ± 0,16 1,0266 HLTB (%) LV CO1 (mg/g) 1,77 ± 0,03 1,77 1,1008 3083333 5,41 1,1484 3112562 5,24 1,1052 2980082 5,21 HLTB (%) % RSD 5,28 ± 0,11 2,08 Nồng độ dung dịch chuẩn: 9,9503 μg/ml Chuẩn Diện tích pic chuẩn (trung bình lần tiêm): 1852950 mAu.s; %RSD = 0,58 Hệ số đuôi: T ≈ 0,9 Số đĩa lý thuyết: N ≈ 73.000 -PL271- Mẫu NV Lượng cân mẫu thử (g) Diện tích pic (mAu.s) Mẫu sử dụng để thẩm định phương pháp (xem HLTB (%) Phụ lục 10) % RSD NV 1,37 951870 7,12 0,6312 954036 7,16 0,6297 952414 7,16 % RSD Mẫu sử dụng để thẩm định phương pháp (xem Phụ lục 10) HLTB (%) % RSD LV 6,87 ± 0,09 (n=12) 0,6325 HLTB (%) LV CO1 (mg/g) 7,15 ± 0,02 1,61 3,34 ± 0,01 (n=12) 1,35 0,4607 794906 3,34 0,4612 797711 3,35 0,4592 797245 3,36 HLTB (%) % RSD 3,35 ± 0,01 0,31 Nồng độ dung dịch chuẩn: 9,8692 μg/ml Chuẩn Diện tích pic chuẩn (trung bình lần tiêm):1833310 mAu.s; % RSD = 0,39 Hệ số đuôi: T ≈ 1,1 Số đĩa lý thuyết: N ≈ 95.000 NV 1,0072 1811712 8,40 0,9717 1743710 8,38 1,0052 1802752 8,38 HLTB (%) % RSD -PL272- 8,39 ± 0,01 0,16 Diện tích pic CO1 (mg/g) Mẫu Lượng cân mẫu thử (g) NV 0,9072 1457496 7,40 0,8152 1323829 7,48 0,8022 1303527 7,49 (mAu.s) HLTB (%) % RSD LV 0,63 1,0727 1744970 3,09 1,0474 1727474 3,13 1,0527 1715478 3,09 HLTB (%) % RSD LV 7,46 ± 0,05 3,11 ± 0,02 0,75 1,0072 1305032 2,45 1,0132 1296845 2,42 1,0197 1316225 2,44 HLTB (%) % RSD 2,44 ± 0,02 0,63 Như mẫu khảo sát, hàm lượng CO1 nụ Vối dao động khoảng 6,87-10,32 mg/g; Vối dao động khoảng 1,77 – 5,28 mg/g -PL273- Định lượng mẫu NV1, NV2, NV3, NV4, LV1, LV2, LV3, LV4 Mẫu chuẩn -PL274- Mẫu thử NV1 -PL275- Mẫu thử NV2 -PL276- Mẫu thử NV3 -PL277- Mẫu thử NV4 -PL278- Mẫu thử LV1 -PL279- Mẫu thử LV2 -PL280- Mẫu thử LV3 -PL281- Mẫu thử LV4 -PL282- Định lượng mẫu NV5, NV6, LV5, LV6 SKĐ mẫu chuẩn, mẫu thử NV5, mẫu thử LV5: xem Phụ lục 10 Mẫu thử NV6 -PL283- Mẫu thử LV6 -PL284- Định lượng mẫu NV7, NV8, LV7, LV8 Mẫu chuẩn -PL285-