Xây dựng và Áp dụng phương cách xét nghiệm hiv, bộ mẫu ngoại kiểm Để nâng cao chất lượng hệ thống phòng xét nghiệm hiv Ở việt nam

Xây dựng và Áp dụng phương cách xét nghiệm hiv, bộ mẫu ngoại kiểm Để nâng cao chất lượng hệ thống phòng xét nghiệm hiv Ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

HOÀNG THỊ THANH HÀ

XÂY DỰNG VÀ ÁP DỤNG PHƯƠNG CÁCH XÉT NGHIỆM HIV, BỘ MẪU NGOẠI KIỂM ĐỂ NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG

HỆ THỐNG PHÒNG XÉT NGHIỆM HIV Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

HOÀNG THỊ THANH HÀ

XÂY DỰNG VÀ ÁP DỤNG PHƯƠNG CÁCH XÉT NGHIỆM HIV, BỘ MẪU NGOẠI KIỂM ĐỂ NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG

HỆ THỐNG PHÒNG XÉT NGHIỆM HIV Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành : Mô phôi và tế bào học Mã số : 62 42 01 17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS BS Phạm Hồng Thắng 2 PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội – 2022

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là số liệu trong nghiên cứu “Thí điểm sáng kiến điều trị 2.0”; nghiên cứu “Xây dựng, đánh giá phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV Quốc gia” và nghiên cứu “Xây dựng quy trình, sản xuất và áp dụng thí điểm bộ mẫu ngoại kiểm huyết thanh học HIV sử dụng mẫu máu toàn phần” mà tôi là một trong những thành viên chính Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu này để bảo vệ luận án Toàn bộ các số liệu, kết quả trong luận án này là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Hoàng Thị Thanh Hà

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Khoa Sinh học và Phòng Sau đại học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và cảm ơn chân thành tới TS.BS Phạm Hồng Thắng và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, những Thầy, Cô có nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên sâu không những tận tình truyền đạt, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu mà còn khuyến khích, động viên tôi đối mặt với khó khăn, tiếp cận các kiến thức nâng cao, bước về phía trước, để tôi có thể hoàn thành luận án này

Tôi xin được trân trọng cảm ơn TS Massaya Kato, TS Nguyễn Thị Thúy Vân, chuyên gia của Tổ chức Y tế Thế giới tại Việt Nam, TS Susan Best, giám đốc phòng thí nghiệm chuẩn thức Quốc gia Úc, TS Kim Wilson, chuyên gia xét nghiệm thuộc phòng thí nghiệm chuẩn thức Quốc gia Úc, TS Bùi Thu Hiền, chuyên gia của Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Hoa Kỳ tại Việt Nam, cùng toàn thể cán bộ tham gia nghiên cứu về các ý kiến đóng góp trong lĩnh vực nghiên cứu cũng như các vấn đề đảm bảo chất lượng xét nghiệm tại Việt Nam

Tôi xin trân trọng cảm ơn nhóm kỹ thuật Quốc gia về xét nghiệm HIV của Bộ Y tế đã hỗ trợ, đồng hành và cho tôi nhiều kiến thức về các vấn đề liên quan đến xét nghiệm HIV để tôi có thể hoàn thành được luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy, Cô bộ môn Sinh học tế bào - Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập từ Đại học – Thạc sĩ và Nghiên cứu sinh Xin gửi lời cảm ơn đến ThS Bùi Thị Vân Khánh, người bạn, người em đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong những lúc khó khăn để tôi có thể vững bước vượt qua từng giai đoạn của quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Lãnh đạo Khoa HIV/AIDS, nơi tôi công tác đã luôn tạo điều kiện tối đa cho tôi trong công việc cũng như học tập Tôi xin trân trọng cảm

iii ơn các bạn đồng nghiệp trong khoa, đặc biệt các bạn đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm huyết thanh học HIV, những người đồng nghiệp, người em đã đồng hành, chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu không kể ngày đêm

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Bố, Mẹ, những người đã có công sinh thành, dưỡng dục, đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt chặng đường đi học Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Bố Mẹ chồng, Chồng cùng các Con, anh chị em và những người thân trong gia đình đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi và là chỗ dựa vô cùng to lớn cả về vật chất lần tinh thần trong quá trình thực hiện luận án này, cũng như trong suốt cuộc đời tôi

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Hoàng Thị Thanh Hà

iv Nghiên cứu được thực hiện bằng kinh phí của các đề tài/dự án: - Dự án “Mô hình thí điểm tiếp cận điều trị 2.0” hỗ trợ bởi Tổ chức Y tế

Thế giới tại Việt Nam do TS Nguyễn Thị Thúy Vân làm chủ nhiệm - Đề tài “Xây dựng và đánh giá phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV

quốc gia trên thực địa” do TS.BS Phạm Hồng Thắng và PGS.TS Phan Thị Thu Hương làm chủ nhiệm với sự hỗ trợ tài chính và kỹ thuật của Tổ chức Y tế thế giới tại Việt Nam, Quỹ Toàn cầu Phòng, chống HIV/AIDS và Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ tại Việt Nam

- Đề tài “Xây dựng quy trình, sản xuất và áp dụng thí điểm bộ mẫu ngoại kiểm huyết thanh học HIV sử dụng mẫu máu toàn phần” do TS.BS Phạm Hồng Thắng và ThS Hoàng Thị Thanh Hà làm chủ nhiệm, hỗ trợ bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ HIV 14

1.1.1 Đặc điểm virus HIV 14

1.1.2 Cấu trúc của HIV 16

1.1.3 Bộ gen của virus 17

1.1.4 Vòng đời của virus HIV 19

1.1.5 Các giai đoạn tiến triển của nhiễm HIV 22

1.1.6 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và tại Việt Nam 24

1.2 XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN NHIỄM HIV 25

1.2.1 Biến đổi các thông số và miễn dịch của cơ thể trong nhiễm HIV 25

1.2.2 Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV 27

1.2.3 Chiến lược xét nghiệm HIV 35

1.2.4 Phương cách xét nghiệm HIV 38

1.3 ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG TRONG XÉT NGHIỆM HIV 41

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm 41

1.3.2 Các biện pháp nhằm đảm bảo chất lượng xét nghiệm: 43

1.3.3 Chương trình ngoại kiểm 46

1.4 THỰC TRẠNG XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN HIV TẠI VIỆT NAM 51

1.4.1 Tổ chức hệ thống phòng xét nghiệm HIV 51

1.4.2 Thực trạng công tác xét nghiệm chẩn đoán HIV tại Việt Nam 53

2

1.4.3 Thực trạng công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm tại Việt Nam 54

1.4.4 Một số tồn tại của công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm HIV 56

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 59

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 59

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 61

2.2 ĐÁNH GIÁ ÁP DỤNG PCXN THÔNG QUA CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM 65

2.2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 65

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 65

2.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM HIV SỬ DỤNG MẪU MÁU TOÀN PHẦN 67

2.3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 67

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 68

2.4 TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 69

2.5 CÁC KỸ THUẬT PHÒNG XÉT NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 70

2.5.1 Các kỹ thuật xét nghiệm dùng cho chẩn đoán HIV 70

2.5.2 Đánh giá các đặc tính của phương cách xét nghiệm 77

2.5.3 Các phương pháp sử dụng cho sản xuất mẫu ngoại kiểm 79

2.6 QUẢN LÝ, XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 83

2.7 ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM 83

2.8 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 83

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 84

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG CÁCH XÉT NGHIỆM HIV QUỐC GIA 84

3.1.1 Thử nghiệm xét nghiệm HIV bằng phương cách gồm các sinh phẩm nhanh 84 3.1.2 Đặc điểm huyết thanh học HIV của các mẫu thu thập 91

3.1.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu của sinh phẩm khi XN tại tỉnh và Viện VSDT TƯ 93

3.1.4 Thông tin chung về các mẫu tham gia 96

3.1.5 Tỷ lệ dương tính và dương tính giả ở các nhóm đối tượng 97

3

3.1.6 KQXN tham chiếu cho mẫu dương tính giả với một sinh phẩm 99

3.1.7 KQXN tham chiếu cho mẫu dương tính giả với từ hai sinh phẩm 104

3.1.8 KQXN mẫu khó được thu thập tại Viện VSDTTƯ 106

3.1.9 Tính khả thi việc sử dụng PCXN có ba sinh phẩm nhanh trên thực địa 108

3.1.10 Phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV quốc gia 112

3.1.11 Phạm vi và cách thức áp dụng các phương cách 118

3.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HỆ THỐNG PHÒNG XÉT NGHIỆM HIV ÁP DỤNG PHƯƠNG CÁCH XÉT NGHIỆM THÔNG QUA BỘ MẪU NGOẠI KIỂM HUYẾT THANH HỌC 119

3.2.1 Tỷ lệ đơn vị phản hồi kết quả ngoại kiểm 119

3.2.2 Xét nghiệm sai phân theo khối bệnh viện và khối y học dự phòng 122

3.2.3 Thực trạng sử dụng sinh phẩm 123

3.2.4 Sử dụng sinh phẩm không có trong danh mục khuyến cáo của Bộ y tế 125

3.2.5 Thực tế áp dụng phương cách xét nghiệm tại các đơn vị 126

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU NGOẠI KIỂM BẰNG MẪU MÁU TOÀN PHẦN 128

3.3.1 Xác định đặc tính mẫu chuẩn 128

3.3.2 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu 133

3.3.3 Đánh giá độ ổn định về đặc tính mẫu 137

3.3.4 Đánh giá độ tán huyết 140

3.3.5 Đánh giá độ vô khuẩn 142

3.3.6 Đánh giá chất lượng bộ mẫu 143

3.3.7 Sơ đồ quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm sử dụng máu toàn phần 143

3.3.8 Triển khai thử nghiệm chương trình ngoại kiểm máu toàn phần 144

3.4 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU 146

KẾT LUẬN 148

KIẾN NGHỊ 149

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 150 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

4

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Anh Giải nghĩa Tiếng Việt

AIDS Acquired Immune Deficiency

5 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

lao và sốt rét SOP Standard Operating Procedure Quy trình thực hành chuẩn

SIV Simian immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ

UNAIDS The Joint United Nations

Tư vấn và xét nghiệm tự nguyện

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

6

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc virus HIV [123] 16

Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV [59] 18

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của HIV [47] 19

Hình 1.4 Quá trình xâm nhập của HIV [77] 20

Hình 1.5 Các giai đoạn tiến triển nhiễm HIV-1 [188] 23

Hình 1.7 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đánh dấu trên màng lọc [25] 29

Hình 1.8 Nguyên lý kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sắc ký [106] 30

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật ngưng kết hạt [25] 31

Hình 1.10 Nguyên lý các kỹ thuật ELISA [185] 32

Hình 1.11 Hình ảnh nguyên lý và kết quả Western Blot [68] 34

Hình 1.12 Sơ đồ xét nghiệm theo chiến lược I [15] 36

Hình 1.13 Sơ đồ xét nghiệm theo chiến lược II [15] 37

Hình 1.14 Sơ đồ xét nghiệm theo chiến lược III [15] 38

Hình 1.15 Sơ đồ phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV của Thái Lan 41

Hình 1.16 Sơ đồ hoạt động của phòng xét nghiệm [163] 42

Hình 1.17 Quá trình thực hiện ngoại kiểm 47

Hình 1.18 Hệ thống phòng xét nghiệm của Việt Nam năm 2015 52

Hình 2.1 Ngưng kết nguyên và ngưng kết tố trong hệ nhóm máu ABO 80

Hình 2.2 Cách tính T test thông qua phần mềm Excel 82

Hình 3.1 Kết quả đánh giá tính khả thi của phương cách xét nghiệm nhanh 86

Hình 3.2 Kết quả xét nghiệm mẫu thu thập bằng sinh phẩm ELISA 92

Hình 3.3 Kết quả xét nghiệm với kỹ thuật Western Blot 92

Hình 3.4 Kết quả xét nghiệm mẫu dương tính giả với kỹ thuật Western Blot 100

Hình 3.5 Kết quả xét nghiệm với kỹ thuật Cobas TaqMan HIV 1 100

Hình 3.6 Tỷ lệ các đơn vị tham gia theo chức năng 120

Hình 3.7 Thời gian trả lời kết quả bộ mẫu ngoại kiểm 121

Hình 3.8 XN sai theo tuyến phân theo khối bệnh viện và khối y học dự phòng 123

7

Hình 3.9 Sử dụng các loại sinh phẩm qua các vòng 124

Hình 3.10 Tỷ lệ đơn vị áp dụng phương cách được khuyến cáo qua các năm 126

Hình 3.11 XN sai của đơn vị áp dụng phương cách được khuyến cáo và đơn vị không áp dụng theo phương cách được khuyến cáo 127

Hình 3.12 Ảnh mẫu máu toàn phần khi tiếp nhận tại Viện VSDTTƯ 128

Hình 3.13 KQXN xác định đặc tính mẫu bằng sinh phẩm Murex HIV Ag/Ab 129

Hình 3.14 KQXN xác định đặc tính mẫu bằng sinh phẩm SD HIV 1/2 ELISA 3.0 129

Hình 3.15 Ảnh kết quả xét nghiệm các mẫu dương tính với kỹ thuật Western Blot 132

Hình 3.16 KQXN mẫu bảo quản tại 4oC và nhiệt độ phòng sau 30 ngày 137

Hình 3.17 Thời gian gửi mẫu đến đơn vị và mẫu gửi trả lại Viện VSDTTƯ 138

Hình 3.18 KQXN mẫu đánh giá ổn định bằng sinh phẩm xét nghiệm nhanh 140

Hình 3.19 Thang đánh giá mức tán huyết 141

Hình 3.20 Kết quả cấy mẫu với môi trường LB (A) và thạch Sabouraud (B) 142

Hình 3.21 Sơ đồ sản xuất mẫu ngoại kiểm sử dụng máu toàn phần 144

Hình 3.22 Tỷ lệ sinh phẩm sử dụng cho bộ mẫu ngoại kiểm máu toàn phần 145

8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV tại Việt Nam năm 2000 55

Bảng 2.1 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 69

Bảng 2.2 Các bước thực hiện của sinh phẩm ELISA thế hệ thứ ba 71

Bảng 2.3 Các bước thực hiện với sinh phẩm xét nghiệm nhanh 72

Bảng 2.4 Tính độ nhạy và độ đặc hiệu 77

Bảng 3.1 Cỡ mẫu và địa bàn nghiên cứu thí điểm xét nghiệm HIV tại các xã 84

Bảng 3.2 Đặc điểm khách hàng phân bố theo nhóm tuổi, giới và nhóm nguy cơ 85

Bảng 3.3 So sánh KQXN HIV sử dụng phương cách 3 SP nhanh tại xã với sử dụng phương cách có ELISA tại các PXN khẳng định tuyến tỉnh 87

Bảng 3.4 Phân bố các trường hợp dương tính giả theo nhóm nguy cơ 88

Bảng 3.5 Cỡ mẫu tham gia vào xây dựng phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV 91

Bảng 3.6 Đặc điểm huyết thanh học của mẫu thu thập 93

Bảng 3.7 Độ nhạy và độ đặc hiệu của các sinh phẩm tham gia xây dựng phương cách 95Bảng 3.8 Đặc điểm khách hàng tham gia nghiên cứu 96

Bảng 3.9 Tỷ lệ dương tính và dương tính giả ở các nhóm đối tượng 98

Bảng 3.10 Các mẫu có kết quả xét nghiệm dương tính giả ở tuyến tỉnh với 1 sinh phẩm so với kết quả XN tham chiếu 101

Bảng 3.11 KQXN tại Viện VSDTTƯ với mẫu dương tính giả tại tỉnh 103

Bảng 3.12 Kết quả xét nghiệm tại Viện VSDTTƯ với mẫu khó 104

Bảng 3.13 Kết quả xét nghiệm với mẫu khó thu thập tại Viện VSDTTƯ 107

Bảng 3.14 Độ nhạy và độ đặc hiệu của 04 phương cách có 3 sinh phẩm nhanh tại các 11 PXN quận huyện 110

Bảng 3.15 Mức độ tiện sử dụng của sinh phẩm nhanh 111

Bảng 3.16 Hình thức và cách đóng gói của sinh phẩm nhanh 112

Bảng 3.17 Các phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV theo chiến lược III 117

Bảng 3.18 Phản hồi kết quả đánh giá 122

Bảng 3.19 Sử dụng sinh phẩm không có trong danh mục lưu hành của Bộ Y tế 125

9

Bảng 3.20 KQXN xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật ELISA 130

Bảng 3.21 KQXN xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật xét nghiệm nhanh 130

Bảng 3.22 Kết quả đặc tính bộ mẫu ngoại kiểm HIV sử dụng máu toàn phần 132

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá độ đồng nhất đối với mẫu âm tính 134

Bảng 3.24 Kết quả đánh giá độ đồng nhất đối với mẫu dương tính 135

Bảng 3.25 Kết quả đánh giá độ đồng nhất với sinh phẩm xét nghiệm nhanh 136

Bảng 3.26 Kết quả đánh giá độ ổn định của mẫu 139

Bảng 3.27 Nồng độ Haemoglobin của mẫu 142

Bảng 3.28 Kết quả đánh giá chất lượng bộ mẫu từ các đơn vị tham gia 143

Bảng 3.29 Kết luận của các phòng xét nghiệm về kết quả của bộ mẫu chuẩn 146

10

MỞ ĐẦU

Kể từ khi được phát hiện vào năm 1981, dịch HIV/AIDS đã nhanh chóng lây lan trên phạm vi toàn thế giới và trở thành một trong những đại dịch nguy hiểm nhất cho đến hiện nay Ở Việt Nam, dịch HIV/AIDS đã xuất hiện ở cả 63 tỉnh, thành phố Hệ thống phòng xét nghiệm HIV ngày càng phát triển, từ phòng thí nghiệm (PTN) HIV đầu tiên năm 1988, hiện nay cả nước có 1.345 phòng xét nghiệm (PXN) Độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả xét nghiệm nói chung và đặc biệt là xét nghiệm HIV là vấn đề quan trọng của bất kỳ phòng xét nghiệm Mẫu bệnh phẩm từ khi thu thập đến khi trả kết quả cho khách hàng phải trải qua nhiều khâu, trong mỗi khâu đều có thể có sai sót Bộ Y tế Việt Nam đã nỗ lực trong nhiều năm qua nhằm cải thiện chất lượng xét nghiệm, xây dựng các văn bản pháp quy, cập nhật các hướng dẫn theo xu hướng thế giới

Việt Nam thực hiện xét nghiệm HIV theo 3 chiến lược dựa trên khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Thời gian đầu, phòng xét nghiệm khẳng định HIV thực hiện theo chiến lược III và sử dụng các sinh phẩm miễn dịch đánh dấu để khẳng định và không có đánh giá xem các sinh phẩm có đồng dương tính giả không Do đó, thời gian trả kết quả lâu, nhiều trường hợp mất dấu khách hàng và không kết nối được với điều trị

Để hạn chế những sai sót trong chẩn đoán, WHO cũng đưa ra khuyến cáo các nước cần triển khai đánh giá phương cách xét nghiệm nhằm lựa chọn ra các sinh phẩm tốt phối hợp với nhau trong phương cách xét nghiệm để tăng cường chất lượng chẩn đoán và hiệu quả giá thành WHO cũng khuyến cáo việc đánh giá phương cách trong đó có cả phương cách chỉ gồm các sinh phẩm nhanh để chẩn đoán HIV Việc sử dụng phương cách gồm các sinh phẩm nhanh sẽ giúp tăng cường tiếp cận với xét nghiệm HIV, rút ngắn thời gian trả kết quả, tăng tỷ lệ nhận kết quả xét nghiệm, người nhiễm sẽ sớm được tiếp cận với điều trị ARV, từ đó sẽ góp phần phòng chống lây nhiễm HIV hiệu quả hơn [175]

Tại hội nghị AIDS toàn cầu tháng 7 năm 2014, Chương trình phối hợp của Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) đã đưa ra ba mục tiêu 90-90-90 đến năm 2020

11 là: 90% số người nhiễm HIV biết được tình trạng nhiễm HIV của mình; 90% số người đã chẩn đoán nhiễm HIV được điều trị ARV và 90% số người được điều trị ARV kiểm soát được tải lượng virus ở mức thấp và ổn định (tải lượng HIV dưới ngưỡng ức chế) để sống khỏe mạnh và làm giảm nguy cơ lây truyền HIV cho người khác [187] Để đạt được mục tiêu 90 đầu tiên, các nước đã nỗ lực thực hiện các sáng kiến, thí điểm các mô hình xét nghiệm mới, các kỹ thuật xét nghiệm đơn giản như xét nghiệm nhanh HIV bằng máu đầu ngón tay nhằm mở rộng các dịch vụ xét nghiệm Tuy nhiên, việc mở rộng xét nghiệm kéo theo các vấn đề liên quan đến đảm bảo chất lượng xét nghiệm Việt Nam là nước đầu tiên ở khu vực châu Á-Thái Bình Dương phát động hưởng ứng các mục tiêu 90-90-90 của UNAIDS

Theo báo cáo của Bộ Y tế, Việt Nam ước tính có khoảng 250.000 người nhiễm HIV trong cộng đồng, hiện tại số phát hiện được đến 31/12/2019 là 211.981 trường hợp nhiễm HIV, ước tính khoảng 84,7% người nhiễm HIV biết được tình trạng nhiễm Chính vì vậy để đạt được mục tiêu 90 đầu tiên tiến tới kết thục đại dịch HIV/AIDS vào năm 2030 Việt Nam đã tiến hành nhiều biện pháp nhằm tăng cường khả năng tiếp cận các dịch vụ xét nghiệm HIV như: mở rộng xét nghiệm HIV ra tuyến quận, huyện và xã phường; xét nghiệm lưu động, mở rộng xét nghiệm tại cộng đồng sử dụng xét nghiệm nhanh với phương pháp sử dụng máu đầu ngón tay Mở rộng xét nghiệm nếu không kiểm soát chất lượng tốt sẽ có nguy cơ chẩn đoán sai, trong khi HIV/AIDS là lĩnh vực rất nhạy cảm và còn nhiều kỳ thị

Để đảm bảo chất lượng cho các phòng xét nghiệm khi mở rộng ra các tuyến huyện, xã, xét nghiệm di động…, việc lựa chọn phương cách xét nghiệm chẩn đoán phù hợp với tình hình tại các tuyến quận, huyện cũng như chương trình ngoại kiểm nhằm đánh giá chất lượng các đơn vị này là rất quan trọng Tuy nhiên, thời điểm triển khai nghiên cứu chưa có các đánh giá chính thức về các phương cách xét nghiệm đặc biệt là các xét nghiệm nhanh cho các tuyến thực hiện Trước tình hình đó, Bộ Y tế đã giao cho Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (VSDTTƯ), nơi có Phòng thí nghiệm tham chiếu quốc gia về HIV đạt tiêu chuẩn ISO15189 và ISO17043, thực hiện đánh giá phương cách xét nghiệm HIV

12 Ngoài ra, bộ mẫu ngoại kiểm đánh giá chất lượng xét nghiệm HIV hiện nay chỉ đánh giá được các đơn vị sử dụng mẫu huyết tương hoặc huyết thanh mà chưa có bộ mẫu sử dụng máu toàn phần để đánh giá các đơn vị xét nghiệm bằng máu đầu ngón tay

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn như vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Xây dựng và áp dụng phương cách xét nghiệm HIV, bộ mẫu ngoại kiểm để nâng cao chất lượng hệ thống Phòng xét nghiệm HIV ở Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng và đánh giá một số phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV cho phòng xét nghiệm ở các tuyến y tế Việt Nam

2 Đánh giá khả năng áp dụng phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV đã xây dựng thông qua bộ mẫu ngoại kiểm huyết thanh học ở các phòng xét nghiệm HIV

3 Xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm bằng máu toàn phần để đánh giá các phòng xét nghiệm HIV sử dụng lấy mẫu máu đầu ngón tay

Để đạt mục tiêu này, nội dung của luận án bao gồm:

- Lựa chọn phương cách xét nghiệm gồm 03 sinh phẩm xét nghiệm nhanh và áp dụng thí điểm phương cách xét nghiệm này tại một số cơ sở y tế

- Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của một số phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV có thể sử dụng ở các tuyến khác nhau trong hệ thống y tế với phòng xét nghiệm có lượng mẫu nhiều (>40 mẫu/ngày) hoặc lượng mẫu ít (<40 mẫu/ngày) - Đánh giá chất lượng hệ thống phòng thí nghiệm áp dụng phương cách xét nghiệm

chẩn đoán HIV được khuyến cáo thông qua bộ mẫu ngoại kiểm huyết thanh học - Xây dựng quy trình, sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm huyết thanh học HIV sử dụng mẫu máu toàn phần tại cấp độ phòng thí nghiệm, đánh giá chất lượng bộ mẫu, thử nghiệm với một số phòng xét nghiệm HIV, hoàn thiện quy trình sản xuất bộ mẫu để có thể sản xuất trên quy mô lớn

13

Tính mới của luận án:

- Lần đầu tiên Việt Nam xây dựng thành công 16 phương cách xét nghiệm chẩn

đoán HIV bằng cách phối hợp các loại sinh phẩm khác nhau trong đó có phương cách xét nghiệm chỉ gồm các sinh phẩm xét nghiệm nhanh Phương cách được đánh giá có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hạn chế đặc điểm đồng dương tính giả và âm tính giả Nghiên cứu đã khẳng định sử dụng phương cách gồm ba sinh phẩm nhanh là khả thi để xét nghiệm chẩn đoán HIV Đây là tiền đề cho việc mở rộng các xét nghiệm khẳng định HIV ra tuyến quận, huyện, rút ngắn thời gian trả lời kết quả cho khách hàng, tránh mất dấu và kết nối điều trị sớm góp phần quan trọng để đạt được mục tiêu 90-90-90

- Nghiên cứu cho thấy chương trình ngoại kiểm huyết thanh học HIV, ngoài việc

được sử dụng đánh giá chất lượng hệ thống các phòng xét nghiệm HIV, lần đầu tiên được áp dụng để đánh giá hiệu quả việc sử dụng phương cách xét nghiệm chẩn đoán HIV được khuyến cáo ở Việt Nam

- Bộ mẫu ngoại kiểm HIV sử dụng mẫu máu toàn phần lần đầu tiên được sản xuất

thành công tại Việt Nam, sẽ góp phần kiểm soát tốt hơn chất lượng xét nghiệm HIV đặc biệt các đơn vị sử dụng phương pháp chích máu đầu ngón tay Đây là hình thức xét nghiệm đang được mở rộng triển khai ở trên 300 phòng xét nghiệm ở Việt Nam

14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ HIV Năm 1981, Micheal S Gottlieb đã mô tả 4 ca bệnh tại Los Angeles bị bệnh phổi

do Pneumocystis carinii ở 4 thanh niên trẻ (29-33 tuổi) có quan hệ tình dục đồng giới,

không có tiền sử bệnh lý đặc biệt, có sự giảm tế bào lympho T-CD4 Đây là lần đầu tiên loài người biết đến một căn bệnh lạ trên thế giới, đó là Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (Acquired Immune Deficiency Syndrome -AIDS) [52, 88] Do đó ban đầu hội chứng này được gọi là suy giảm miễn dịch có liên quan với tình dục đồng giới Human Immunodeficiency Virus (HIV) là tác nhân gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người Năm 1983, các nhà khoa học Pháp thuộc Viện Pasteur Paris đã phân lập được HIV-1 từ hạch của một bệnh nhân bị hội chứng hạch to kéo dài [40] Năm 1984, các nhà nghiên cứu đã chứng minh được tế bào đích của HIV chính là tế bào lympho T-CD4 Năm 1985, các sinh phẩm xét nghiệm phát hiện nhiễm HIV được sản xuất Năm 1986, virus này chính thức được Ủy ban Quốc tế thống nhất là HIV [160] Kể từ đó đến nay, HIV/AIDS được coi là đại dịch, là thảm họa của nhân loại bởi tốc độ lây truyền nhanh và rộng khắp Cho đến nay, nhiều thuốc được sử dụng để điều trị nhằm giúp bệnh nhân kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống Nhiều phác đồ mang lại hiệu quả tốt nhưng cũng gặp các trở ngại do xuất hiện các chủng HIV kháng thuốc Hiện nay, cũng chưa có các công bố thành công về thuốc điều trị và chữa khỏi HIV

Một người bị nhiễm HIV sẽ trở thành nguồn lây nhiễm cho người khác Đa số những trường hợp nhiễm HIV đều không có các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh trong khoảng thời gian dài Chính vì vậy, nhiều trường hợp không biết mình đã bị nhiễm cho đến khi xét nghiệm, giai đoạn này họ hoàn toàn có thể làm lây truyền virus cho những người khác [24-26]

1.1.1 Đặc điểm virus HIV

HIV là virus thuộc phân nhóm Lentivirus và họ Retroviridae gây ra Lentivirus

gồm các virus gây ra các bệnh tiến triển chậm, thời gian ủ bệnh dài Trong nhóm có một số virus gây bệnh trên người như HIV-1 và HIV-2 và một số virus khác gây bệnh

15 trên động vật như SIV (khỉ), FIV (mèo), EIAV (ngựa) Thời gian từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS trung bình khoảng 10 năm [123, 132, 139] Tuy nhiên, thời gian dài hay ngắn khác nhau ở các trường hợp, một số tiến triển nhanh đến AIDS trong vòng vài tháng [111, 115] Một số khác (5%) có thể kéo dài trên 10 - 20 năm vẫn chưa có các triệu chứng AIDS

HIV gồm hai loại đó là: HIV-1 và HIV-2 Trong đó, HIV-1 là virus được phát hiện đầu tiên và đặt tên là LAV [84] hay HTLV-III [57, 83, 155] HIV-1 chia thành 4 phân nhóm: M, O và 2 phân nhóm mới là N và P Nhóm M chiếm hơn 90% trường hợp nhiễm HIV-1, có dưới nhóm (subtype) từ A K và nhiều dạng tái tổ hợp khác như CRFs (circulating recombinant forms); nhóm O, gặp khu trú ở Tây - Trung Phi; nhóm N, rất hiếm gặp, mới được biết đến từ 1998; nhóm P, mới phát hiện từ 2009 ở Cameroon, chủng virus gần với SIV ở loài khỉ Gorilla Ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á, chủng chủ yếu là CRF01_AE, bên cạnh đó là một số ít thuộc phân nhóm B, C và các dạng tái tổ hợp khác [92, 94, 164]

HIV-1 là chủng virus phổ biến trong các ca nhiễm HIV trên toàn cầu (95% các ca nhiễm là HIV-1) HIV-2 được phân lập vào năm 1986 trên hai bệnh nhân Tây Phi mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải [60, 135] HIV-2 chủ yếu xuất hiện ở các nước Tây Phi như Guinea-Bissau, Gambia, Senegal, Cape Verde, Cote d'Ivoire, Mali, Sierra Leone và Nigeria Tuy nhiên, HIV-2 đã bắt đầu xuất hiện tại các khu vực khác như Mỹ, châu Âu và Ấn Độ [49, 125, 147]

Sức đề kháng của HIV: HIV có thể sống được vài ngày ở ngoài cơ thể trong điều kiện khô, vài tuần trong môi trường dung dịch với nhiệt độ phòng thí nghiệm HIV đề kháng với nhiệt độ lạnh, tia gamma và tia cực tím Sống được 3 ngày trong máu bệnh nhân nếu để ngoài trời Tuy nhiên, HIV rất nhạy cảm với các tác nhân như nhiệt độ, các chất tẩy, khử khuẩn thông thường Tại nhiệt độ 56oC, HIV chết sau 30 phút và chết nhanh khi bị đun sôi HIV dễ bị tiêu diệt bởi cồn 70%, nước javen, bị bất hoạt ở pH=1 hay pH=13 [98, 148, 149]

16

1.1.2 Cấu trúc của HIV

HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 - 120 nm, virus hoàn chỉnh có cấu trúc gồm ba lớp (hình 1.1):

Hình 1.1 Cấu trúc virus HIV [123]

Lớp vỏ ngoài: Là lớp màng lipid kép với 72 phức hợp glycoprotein gắn trên

màng, mỗi phức hợp là một trimer gồm phân tử glycoprotein có trọng lượng phân tử là 160 kilodalton (gp160) gồm hai thành phần: Glycoprotein màng ngoài có trọng lượng phân tử 120 kilodalton (gp120) và glycoprotein xuyên màng có trọng lượng phân tử 41 kilodalton (gp41), đối với HIV-2 là gp125 và gp36 [60] Gp120 gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160 Liên kết giữa gp120 và gp41 lỏng lẻo do đó gp120 có thể được phân tán tự do ra xung quanh Glycoprotein gp120 có thể được phát hiện trong huyết thanh cũng như mô bạch huyết của bệnh nhân nhiễm HIV Phân tử gp120 có ái lực cao với CD4, nhận biết thụ thể CD4 có trên bề mặt tế bào đích (lympho T hỗ trợ, bạch cầu đơn nhân, các đại thực bào ) nhờ đó virus bám vào tế bào đích Phân tử gp41 cắm xuyên màng lipit kép, tham gia vào giai đoạn hòa màng của virus và tế bào nhiễm

Do đó, gp41 và gp120 là các glycoprotein điển hình trên bề mặt được xem là mục tiêu chính của các nhà sản xuất sinh phẩm phát hiện kháng thể kháng HIV cũng

17 như là mục tiêu trong việc tìm ra hướng sản xuất vắc-xin HIV và các thuốc điều trị [78, 124, 184]

- Lớp vỏ trong: Gồm 2 lớp protein: Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi phân tử

protein có trọng lượng phân tử là 17 kilodalton (p17) với HIV-1 và 18 kilodalton (p18) với HIV-2 Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi phân tử protein có trọng lượng phân tử 24 kilodalton (p24) với HIV- 1 và 26 kilodalton (p26) với HIV-2

- Lớp lõi: Gồm hai chuỗi ARN giống hệt nhau, trên có gắn enzyme phiên mã

ngược (reverse transcriptase -RT) RT là enzyme ARN dạng hoạt động p66/51 ở 1 và p68 ở HIV-2, đảm nhiệm việc sao mã bộ gen virus từ ARN thành ADN bổ sung (cDNA) Enzyme intergrase (p31ở HIV-1 và p34 ở HIV-2) đảm nhiệm sự tích hợp ADN của virus vào trong ADN của tế bào bị nhiễm Enzyme protease (p12) có tác dụng cắt các polyprotein được mã hóa thành các protein cấu trúc hoặc chức năng Ngoài ra có một số gen tổng hợp các protein chức năng điều hòa [78]

HIV-1.1.3 Bộ gen của virus

Bộ gen của HIV nằm trong phần lõi của virus, bao gồm hai sợi ARN đơn, mỗi sợi có chiều dài 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau [50] Gồm ba

nhóm gen chính, chung cho họ Retroviridae, mã hóa cho các protein: - Gen gag (group specific antigen): mã hoá cho các protein lõi (p17, p24) - Gen pol (polymerase): mã hoá cho các enzyme: (enzyme phiên mã ngược

RT; protease và intergrase)

- Gen env (envelop): mã hoá cho các glycoprotein lớp vỏ gp120, gp41 có vai

trò quan trọng trong việc giúp virus bám và xâm nhập vào tế bào vật chủ Ngoài ra, còn có một số gen tổng hợp các protein chức năng điều hòa quá trình nhân

lên và độc lực của virus như: vif, vpu, vpr, tat, rev, nef [59, 63, 78, 109] (hình 1.2) So với các virus thuộc họ Retroviridae thì hệ gen của HIV phức tạp hơn, gồm 9 gen

với cấu trúc cơ bản là 5’LTR-gap-pol-env-LTR3’, hai đầu được đóng khung bởi hai đoạn có trình tự lặp lại LTRs (Long Terminal Repeat sequences), nối với ADN tế bào

vật chủ sau khi tích hợp và không mã hóa cho bất kỳ protein nào của virus [161]

18 Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV [59]  vif: mã hóa cho protein p23 là yếu tố gây nhiễm, làm tăng khả năng nảy chồi giúp cho virus dễ dàng xâm nhập từ tế bào này sang tế bào khác Nếu thiếu gen vif,

virus sẽ mất khả năng lây nhiễm;  tat: mã hóa cho protein p16 điều hòa sự kéo dài phiên mã, cần thiết cho sự nhân

lên của virus  rev: mã hóa cho protein p19 điều hòa sự vận chuyển một số ARN của HIV từ

nhân ra tế bào chất, qua đó tổng hợp các protein cấu trúc  nef: mã hóa cho yếu tố biểu hiện âm tính, đó là protein làm giảm biểu hiện của gen nef tạo ra sự điều hòa giảm CD4 và HLA lớp I trên bề mặt của tế bào nhiễm

HIV-1, đây có thể là một cơ chế quan trọng giúp virus trốn thoát sự tấn công của T- CD8 gây độc tế bào và tránh được sự nhận diện của các T-CD4 [161]

 vpr: cần thiết cho quá trình nhân lên của virus trong các tế bào không phân chia như đại thực bào Gần đây, vpr được chứng minh có vai trò quan trọng trong vận

chuyển phức hợp tiền tích hợp của virus vào nhân và có thể làm ngừng chu kỳ tế bào ở G2 [117, 161]

 vpu: có vai trò quan trọng trong quá trình “nảy chồi” của virus, vì các đột biến trong vpu có liên quan đến sự tồn tại của các phần tử virus trên bề mặt tế bào chủ Các phân tử màng như tetherin (CD317) có thể liên kết với HIV-1 thiếu vpu và ngăn chặn sự phóng thích của virus vpu cũng tham gia khi phức hợp CD4-gp160 bị phân

19 hủy trong mạng lưới nội chất và do đó cho phép gp160 được quay vòng để tạo các hạt virus mới [63, 183]

1.1.4 Vòng đời của virus HIV

Sự nhân lên của HIV-1 được diễn ra trong các tế bào đích chủ yếu là các tế bào lympho T-CD4 và một số tế bào khác có thụ thể CD4 Các tế bào lympho T-CD4 đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, giúp chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể Khi vào cơ thể, HIV làm suy giảm số lượng tế bào T-CD4, từ đó gây ra suy giảm tình trạng miễn dịch dẫn đến bệnh nhân mắc các nhiễm trùng cơ hội, ung thư, suy kiệt và tử vong [59] Vòng đời của HIV khi xâm nhậm vào cơ thể người được chia thành 7 giai đoạn: gắn kết, xâm nhập, sao chép ngược, tích hợp, nhân lên, lắp ráp, nảy chồi (hình 1.3) [47]

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của HIV [47]

20

- Gắn kết: Khi HIV tấn công tế bào CD4, phân tử gp120 của virus gắn lên thụ

thể CD4 có trên bề mặt tế bào lympho T-CD4 và một số tế bào khác như đại thực bào, bạch cầu đơn nhân hay tế bào lympho B Đây là các tế bào có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, có nhiệm vụ nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt các tác nhân lạ vào cơ thể Sau sự kết hợp đầu

tiên của gp120 với thụ thể CD4 làm bộc lộ vị trí khác của trimer Env, tạo thuận lợi

cho tương tác giữa vòng V3 của gp120 với đồng thụ thể tương ứng (thụ thể CCR5 ở các tế bào đơn nhân hoặc CXCR4 ở tế bào T), nhờ đó virus gắn vào bề mặt tế bào đích (hình 1.4) [73]

Hình 1.4 Quá trình xâm nhập của HIV [77]

- Xâm nhập: Sau khi HIV bám vào tế bào đích làm thay đổi cấu hình không gian

và làm bộc lộ vị trí tác động của phân tử gp41 Nhờ đó, phân tử protein gp41 của virus cắm vào màng tế bào tạo nên hiện tượng hòa màng giữa virus và tế bào đích Nucleocapside của virus được phóng vào trong tế bào (hình 1.4) [77]

21

- Sao chép ngược: Sau khi cởi bỏ vỏ capside, nhờ enzyme phiên mã ngược RT,

từ khuôn mẫu ARN được sao chép thành ADN bổ sung sợi đơn và sau đó thành sợi đôi Quá trình sao chép dễ phát sinh đột biến, có thể gây kháng thuốc hoặc virus trốn tránh hệ thống miễn dịch của cơ thể Việc chuyển đổi ARN thành ADN sợi đôi cho phép HIV xâm nhập vào nhân tế bào CD4 và tích hợp vào ADN tế bào đích [80]

- Tích hợp: Sau khi được tổng hợp, ADN sợi đôi của virus đi qua màng nhân

sau đó nhờ enzyme intergrase tích hợp ADN virus vào ADN của tế bào đích Lúc này ADN virus được gọi là ADN tiền virus Ở giai đoạn này virus có thể tồn tại lâu dài trong tế bào đích ở trạng thái “ngủ” và tránh được sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của cơ thể và các loại thuốc kháng virus

- Nhân lên: Khi tế bào đích được hoạt hóa, ADN tiền virus cũng bắt đầu quá

trình sao chép và nhân lên ADN tiền virus nhờ các enzyme của tế bào, sao chép thành các phân tử mARN và ARN là vật liệu di truyền của virus Các mARN di chuyển ra

tế bào chất, nơi chúng được dịch mã thành protein tat và rev [186] - Lắp ráp: Khi protein rev mới tạo ra sẽ di chuyển đến nhân, gắn với ARN và

thúc đẩy ARN rời khỏi nhân tế bào Một mARN 9 kb được hình thành, có thể cắt thành mARN 4 kb và 2 kb Trong đó mARN 4 kb tổng hợp các polyprotein Env (gp160), các protein điều hòa vif, vpr và vpu mARN 2 kb tổng hợp protein tat, rev và nef Ngoài ra mARN cũng có chức năng tổng hợp các polyprotein gag (p55); gag-

pol (p160) và ARN của virus mới Các protein gag kết hợp với ARN bộ gen virus, di

chuyển ra màng tế bào và lắp ráp thành các virus chưa trưởng thành [48]

- Nảy chồi: Các hạt virus tiến gần khu vực màng sinh chất của tế bào vật chủ,

env polyprotein (gp160) đi qua mạng lưới nội chất và đến bộ máy Golgi, bị phân cắt thành glycoprotein vỏ (gp41 và gp120), sau đó di chuyển đến màng plasma của tế bào chủ, tại đây gp41 giữ gp120 vào màng Các polyprotein gag (p55) và gag-pol (p160) cũng liên kết với mặt trong của màng plasma, cùng với ARN và nảy chồi ở màng tế bào Khi ở bên ngoài tế bào CD4, HIV giải phóng protease, phân cắt các chuỗi protein dài đã hình thành nên các virus chưa trưởng thành Các protein nhỏ kết hợp lại để tạo thành HIV trưởng thành

22 Khi virus xâm nhập tế bào, có hai khả năng xảy ra: - Virus “ngủ” trong tế bào nhiễm, đây là giai đoạn không triệu chứng Các tế bào T-CD4 bị nhiễm virus vẫn có thể lây cho người khác Virus gây nhiễm các hạch bạch huyết và các đại thực bào

- Virus HIV dạng hoạt động: virus kết hợp với tế bào T-CD4, nó gắn ADN của nó vào bên trong ADN của tế bào và virus được hoạt hóa ngay Khi đó tế bào T-CD4 trở thành một nhà máy sản xuất HIV Các virus mới được tạo ra sẽ phá vỡ tế bào (đây là cơ chế chính gây giảm tế bào lympho T-CD4 ở người nhiễm HIV), đồng thời khi ra khỏi tế bào sẽ làm nhiễm các tế bào lành khác [25, 136, 145]

1.1.5 Các giai đoạn tiến triển của nhiễm HIV

Quá trình nhiễm HIV thường tiến triển qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn nhiễm tiên phát hay cấp tính, giai đoạn cơ thể người

đã bị nhiễm virus HIV nhưng chưa có triệu chứng Giai đoạn này HIV lây nhiễm chủ yếu vào đại thực bào và tế bào đuôi gai bằng cách sử dụng thụ thể C-C chemokine 5 (CCR5) cùng với phân tử CD4 Sự nhân lên của virus trong các hạch bạch huyết là đỉnh điểm của nhiễm trùng cấp tính [75] Một số người phát triển các triệu chứng giống như cúm trong thời gian ngắn, chẳng hạn như đau đầu, sốt, đau họng và phát ban trong vòng vài ngày đến vài tuần sau khi nhiễm bệnh Triệu chứng này thấy ở 50 – 95% bệnh nhân nhưng không biểu hiện dấu hiệu đặc trưng, nên khi chẩn đoán dễ bị nhầm với bệnh khác Trong giai đoạn này, hệ thống miễn dịch bắt đầu phản ứng với virus bằng cách sinh ra các kháng thể, số lượng tế bào lympho TCD4 giảm mạnh - giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển đổi huyết thanh, có thể kéo dài 3-6 tuần

- Giai đoạn 2: Giai đoạn không triệu chứng, hay còn gọi là giai đoạn lâm sàng

tiềm ẩn Trong thời gian này mặc dù chưa có các triệu chứng lâm sàng rõ ràng, tuy nhiên virus tiếp tục nhân lên và số lượng tế bào lympho T-CD4 phục hồi dần trong thời gian ngắn sau đó giảm dần theo thời gian, khoảng 30-70 tế bào/mm3/năm Hầu hết các trường hợp nhiễm HIV-1 được xác định là tiến triển chậm, số lượng tế bào T-CD4 giảm dần trong vòng 6-10 năm Bên cạnh đó, một số trường hợp (10-15%) tiến triển nhanh, số lượng tế bào T-CD4 giảm nhanh và phát triển thành AIDS trong vòng

23 vài năm Giai đoạn này sẽ khác nhau với mỗi cá thể, ở những người không điều trị ARV giai đoạn này kéo dài trung bình từ 8-10 năm [25, 99] Trong số những trường hợp tiến triển chậm, một số trường hợp không có sự thay đổi đáng kể về số lượng tế bào T-CD4, tải lượng virus không phát hiện và không cso triệu chứng lâm sàng Những trường hợp này được gọi là nhóm “Elite” hoặc “natural controllers” [104]

- Giai đoạn 3: Giai đoạn có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng, mật độ virus trong

máu tăng nhanh, lây nhiễm chủ yếu vào tế bào T-CD4 Sự suy giảm tế bào T-CD4 và sự gia tăng tải lượng virus dẫn đến suy giảm hệ thống miễn dịch Thông thường, một người bình thường sẽ có từ 450-1.400 tế bào T-CD4/ mm3 và thay đổi liên tục tùy thuộc và tình trạng sức khỏe của mỗi cá thể Đối với nhiễm HIV, giai đoạn này số lượng tế bào T-CD4 giảm liên tục, cơ thể dễ dàng mắc các bệnh khác, người gầy yếu, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công dẫn đến hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải điển hình hay AIDS (T-CD4, 200 tế bào/mm3) có nguy cơ tử vong, bao gồm các triệu chứng nhiễm trùng cơ hội và ung thư Khoảng thời gian chuyển biến thành AIDS cho đến lúc chết là khác nhau đối với mỗi bệnh nhân (hình 1.5) [53]

Hình 1.5 Các giai đoạn tiến triển nhiễm HIV-1 [188]

24

1.1.6 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.6.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới

Kể từ khi trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện năm 1981, HIV/AIDS được coi là đại dịch bởi tốc độ lây truyền nhanh, rộng khắp và là thách thức đối với tiến trình phát triển xã hội Theo báo cáo của UNAIDS tính đến cuối năm 2020, toàn thế giới có khoảng 37,7 triệu người sống chung với HIV, trong đó trẻ em dưới 15 tuổi là 1,7 triệu người Trong năm 2020, cả thế giới phát hiện mới 1,5 triệu người nhiễm HIV

Theo thống kê của UNAIDS, trên thế giới từ năm 2010 đến 2020 số người mới nhiễm HIV ở mọi độ tuổi đã giảm xuống từ 2,1 triệu xuống 1,5 triệu Trong đó, đa số các trường hợp nhiễm HIV có độ tuổi >15 tuổi, các trường hợp trẻ em < 15 tuổi đã giảm 53% từ 320.000 [210.000-510.000] năm 2010 xuống 150.000 [100.000-240.000] năm 2020 do các bà mẹ đã được điều trị dự phòng thuốc kháng virus ARV từ khi mang thai Số các trường hợp nhiễm HIV được tiếp cận với các thuốc kháng virus tăng mạnh từ 7,8 triệu lên 28,2 triệu Điều này cho thấy kết quả của những nỗ lực phòng, chống HIV/AIDS của toàn nhân loại trong thời gian qua [21, 157]

1.1.6.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam

Năm 1990, ca nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện tại thành phố Hồ Chí Minh Đến năm 1992, cả nước phát hiện thêm 11 ca thuộc các tỉnh: Lạng Sơn, Bình Thuận, Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang, Tiền Giang, Sóc Trăng và Cà Mau Phần lớn các trường hợp nhiễm HIV phát hiện thuộc khu vực phía Nam, lây truyền qua đường tình dục [21] Từ năm 1994, dịch bắt đầu lan ra các thành phố lớn và đến 1998, dịch đã lan ra 100% các tỉnh, thành phố trong cả nước

Theo báo cáo thống kê của chương trình phòng, chống HIV/AIDS năm 2020, cho thấy số trường hợp mới phát hiện nhiễm HIV tập trung chủ yếu ở độ tuổi 16-29 (45%) và 30-39 (31%) Đường lây truyền chủ yếu là quan hệ tình dục không an toàn (75,8%) và qua đường máu (12,1%), mẹ sang con 1,2%, còn lại không có thông tin về đường lây So với năm 2019 thì nhóm tuổi trẻ (16-29 tuổi) trong số người nhiễm

25 HIV được phát hiện tăng từ 37,9% lên 45,5%; với nhớm lây truyền HIV qua đường tình dục tăng từ 68,2% lên 75,8% Đặc biệt sự gia tăng tỷ lệ lây nhiễm HIV trong nhóm nam quan hệ tình dục đồng giới (MSM) trẻ tuổi là nhóm chính nhiễm mới HIV ở Việt Nam Dịch không chỉ tập trung tại thành thị như trước đây mà đã lan rộng đến khu vực nông thôn, miền núi Tính đến 31/12/2020, cả nước có 215.220 người nhiễm HIV hiện đang còn sống được báo cáo và số người tử vong do HIV/AIDS là 108.719 trường hợp [17, 21]

1.2 XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN NHIỄM HIV

1.2.1 Biến đổi các thông số sinh học và miễn dịch của cơ thể trong nhiễm HIV

Sau khi nhiễm HIV, kháng nguyên HIV được tế bào lympho T-CD4 nhận diện, dưới tác động của yếu tố hoạt hóa tế bào trình diện do tế bào lympho T-CD4 tiết ra, tế bào trình diện trở thành tế bào hoạt hóa sẽ tiết ra IL-1 (Interleukin-1) Khi đó, tế bào lympho T-CD4 trở thành tế bào hoạt hóa tiết ra IL-2 giúp cho tế bào T-CD8 hoạt hóa tiêu diệt tế bào nhiễm HIV, tiết ra IL-4 và IL-5 giúp tế bào lympho B thành tương bào sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HIV

Virus nhân lên rất nhanh trong cơ thể, hệ thống miễn dịch của cơ thể được kích hoạt, các tế bào miễn dịch tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể, sinh ra kháng thể chống lại các tác nhân lạ (hình 1.6) Kháng thể xuất hiện đầu tiên sau phơi nhiễm HIV là IgM, sau đó các IgM giảm dần và thay thế là các IgG IgG kháng kháng nguyên vỏ virus (gp120) tồn tại trong suốt thời gian nhiễm Các IgG kháng kháng nguyên p24 xuất hiện cùng với sự giảm của kháng nguyên p24

Trong quá trình nhiễm virus, dựa trên sự biến đổi của các thông số sinh học, các kỹ thuật xét nghiệm có thể phát hiện kháng thể kháng HIV, kháng nguyên virus hoặc các chất liệu di truyền ARN hoặc tiền ADN [15] Do các thông số sinh học ở các giai đoạn nhiễm khác nhau nên việc lựa chọn thời điểm và kỹ thuật xét nghiệm cho từng giai đoạn cũng sẽ khác nhau

26 Hình 1.6 Biến đổi thông số sinh học trên người nhiễm HIV chưa điều trịNgay sau khi phơi nhiễm với HIV, những ngày đầu virus nhân lên rất nhanh trong cơ thể, kháng thể kháng HIV chưa được hình thành hoặc ở mức độ thấp chưa phát hiện được bằng các kỹ thuật huyết thanh học thông thường Giai đoạn này được gọi là cửa sổ huyết thanh học, người bệnh đã nhiễm virus và có thể lây truyền HIV cho người khác nhưng kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV âm tính Thời gian để cơ thể nhận diện và sinh ra kháng thể kháng HIV thông thường từ 4-6 tuần sau nhiễm và tồn tại lâu dài trong máu

Các xét nghiệm virus học như tìm kháng nguyên virus (kháng nguyên p24), các vật liệu di truyền ARN/ADN của virus có thể phát hiện tình trạng nhiễm HIV sớm Tuy nhiên các xét nghiệm tìm kháng nguyên và vật liệu di truyền đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, cán bộ xét nghiệm phải được đào tạo kỹ Ngoài ra, HIV là virus có tính biến dị di truyền cao, có nhiều chủng và thứ nhóm khác nhau nên việc chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử gặp nhiều khó khăn Vì vậy cho đến nay, WHO và nhiều nước trên thế giới không áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và xét nghiệm tìm kháng nguyên P24 là phương pháp tiêu chuẩn để chẩn đoán HIV Trong khi đó, xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV là phương pháp đơn giản hơn và hiệu quả trong chẩn đoán tình

27 trạng nhiễm HIV vì vậy WHO và các nước sử dụng là phương pháp tiêu chuẩn để xác định tình trạng nhiễm HIV ở những người trên 18 tháng tuổi [15, 24, 158, 170]

1.2.2 Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV

Trong chẩn đoán HIV trên thế giới và ở Việt Nam, xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV hiện nay vẫn là phương pháp phổ biến và tiêu chuẩn để xác định tình trạng nhiễm HIV ở những người trên 18 tháng tuổi Các xét nghiệm sinh học phân tử tìm vật liệu di truyền ADN/ARN của virus hoặc các xét nghiệm tìm kháng nguyên có thể phát hiện tình trạng nhiễm HIV trong giai đoạn cửa sổ huyết thanh học [15] Xét nghiệm chẩn đoán HIV chia làm hai phương pháp:

- Phương pháp xét nghiệm huyết thanh học: sử dụng để phát hiện sự hiện diện

của kháng thể kháng HIV và/hoặc kháng nguyên HIV trong máu hoặc các dịch tiết để xác định tình trạng nhiễm HIV ở người lớn và trẻ em trên 18 tháng tuổi Với nhóm phương pháp này có các kỹ thuật sau:

 Kỹ thuật xét nghiệm nhanh/đơn giản: các kỹ thuật nhanh, ngưng kết hạt  Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu: các kỹ thuật ELISA, hóa/điện hóa phát

quang

- Phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử: sử dụng để phát hiện sự hiện diện

của vật liệu di truyền của HIV (ADN/ARN) trong máu hoặc các dịch tiết

1.2.2.1 Phương pháp xét nghiệm huyết thanh học

Dựa vào phương pháp chuẩn bị kháng nguyên, kháng thể, các sinh phẩm được chia thành 5 thế hệ [15]:

- Sinh phẩm thế hệ thứ nhất: sinh phẩm chỉ phát hiện HIV-1, sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với

HIV-1, đó là các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay) gián tiếp Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc

hiệu hạn chế - Sinh phẩm thế hệ thứ hai: sử dụng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp, độ nhạy và độ đặc hiệu đã được cải thiện so với sinh phẩm thế hệ thứ nhất

28 - Sinh phẩm thế hệ thứ ba: sử dụng các kháng nguyên là các peptite tổng hợp và các kháng nguyên có nguồn gốc DNA tái tổ hợp, phát hiện các chủng HIV-1 và HIV-2 Các xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme thế thệ thứ ba này đã cải thiện về độ nhạy với các chủng virus khác nhau và đã rút ngắn thời gian cửa sổ từ nhiễm sang giai đoạn chuyển đổi huyết thanh hơn 3 tuần so với các xét nghiệm thế hệ đầu tiên

- Sinh phẩm thế hệ thứ tư: phát hiện đồng thời kháng nguyên p24 và kháng thể có trong mẫu thử

- Sinh phẩm thế hệ thứ năm: phát hiện phân biệt riêng biệt kháng nguyên và kháng thể kháng HIV trên cùng một xét nghiệm

Các sinh phẩm chẩn đoán ngày càng hoàn thiện để phát hiện sớm và chính xác

nhiễm HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ Kỹ thuật xét nghiệm nhanh (Rapid test)

Các kỹ thuật xét nghiệm nhanh được thực hiện đơn giản, không đòi hỏi các trang thiết bị, thuận lợi khi thực hiện với số lượng mẫu ít, cho kết quả nhanh (trong vòng 30 phút), đọc kết quả bằng mắt thường Sinh phẩm xét nghiệm nhanh dễ dàng bảo quản tại nhiệt độ 2-30oC; nhiều sinh phẩm sử dụng được cả máu toàn phần thích hợp cho việc áp dụng chích máu đầu ngón tay để xét nghiệm chẩn đoán HIV ở những nơi vùng sâu, vùng xa điều kiện đi lại khó khăn Các nghiên cứu gần đây cho thấy sinh phẩm xét nghiệm nhanh có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với kỹ thuật ELISA [30] Ngoài ra, một số sinh phẩm nhanh phân biệt được nhiễm HIV-1 và HIV-2; một số cho phép phát hiện đồng thời kháng nguyên p24 và kháng thể kháng HIV trong mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên trong trường hợp xét nghiệm với số lượng lớn, ưu điểm nhanh không còn và sẽ gặp khó khăn khi thực hiện trong việc kiểm soát thời gian đọc kết quả và các xét nghiệm nhanh không lưu được dữ liệu kết quả, kết quả đọc phụ thuộc chủ quan vào người đọc [167, 171]

Các kỹ thuật xét nghiệm nhanh hiện nay dựa trên các nguyên lý: miễn dịch chấm thấm; miễn dịch lọc; miễn dịch sắc ký Trong các nguyên lý này, nguyên lý miễn dịch sắc kỹ là nguyên lý phổ biến trong các sinh phẩm xét nghiệm nhanh lưu hành trên thị

29 trường Việt Nam như: Alere Detemine HIV-1/2, SD Bioline HIV1/2 3.0, Vikia HIV 1/2, Double Check Gold HIV 1&2, Rapid Anti HIV 1/2 test, …[15]

- Xét nghiệm miễn dịch lọc, miễn dịch chấm - thấm Đây là kỹ thuật xét nghiệm dựa trên nguyên tắc miễn dịch đánh dấu trên màng

lọc Màng phản ứng có gắn những hạt vi lượng bao phủ kháng nguyên 1 và 2, đồng thời có một vùng chứng để kiểm tra phản ứng; kháng thể kháng HIV có trong huyết thanh hoặc huyết tương người được làm xét nghiệm sẽ gắn với kháng nguyên trên màng lọc, phức hợp kháng nguyên - kháng thể này được phát hiện bởi cộng hợp có gắn enzyme cho phản ứng hiện màu với cơ chất (hình 1.7) [87]

HIV-Hình 1.7 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đánh dấu trên màng lọc [25]

- Xét nghiệm miễn dịch sắc ký

Thông thường thanh xét nghiệm chia thành 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng nhỏ mẫu – vùng cộng hợp – vùng phản ứng – vùng kiểm chứng Đầu tiên, mẫu xét nghiệm sẽ được nhỏ vào vùng nhỏ mẫu, sau đó mẫu bệnh phẩm sẽ thấm qua vùng cộng hợp (vùng này thường chứa kháng nguyên vi rút có gắn chất đánh dấu mầu, có thể là màu đỏ hoặc vàng), mẫu tiếp tục dịch chuyển qua vùng phản ứng (vùng gắn cố định kháng nguyên), sau đó mẫu tiếp tục được dịch chuyển lên vùng kiểm chứng (vùng gắn cố định kháng thể kháng HIV 1/2) (hình 1.8) Nếu trong mẫu bệnh phẩm có kháng thể kháng virus sẽ xuất hiện vạch màu tại vùng phản ứng và vạch màu tại vùng kiểm chứng, khi đó được coi là mẫu có phản ứng với sinh phẩm Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng thể kháng virus tại vùng phản ứng sẽ không xuất hiện vạch màu, chỉ xuất hiện vạch màu tại vùng kiểm chứng, khi đó mẫu được coi là âm

30 tính; nếu không có vạch màu ở vùng kiểm chứng, khi đó kết quả không có giá trị, cần thực hiện lại xét nghiệm trên thanh thử mới

Hình 1.8 Nguyên lý kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sắc ký [106]

Kỹ thuật xét nghiệm ngưng kết hạt vi lượng (Microtiter particle agglutination)

Kỹ thuật xét nghiệm ngưng kết hạt vi lượng được coi là đơn giản Những hạt hữu hình (gelatin, latex, hồng cầu) được gắn với các thành phần kháng nguyên của virus HIV-1/HIV-2, kết quả cho phản ứng ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với HIV nếu có trong mẫu thử (hình 1.9) Đối với kỹ thuật này, không cho kết quả nhanh như kỹ thuật xét nghiệm nhanh nhưng cũng không mất nhiều thời gian như kỹ thuật ELISA Ngoài ra, thao tác thực hiện tương đối đơn giản, không đòi hỏi nhiều trang thiết bị, thích hợp cho việc xét nghiệm sàng lọc hàng loạt mẫu máu; kết quả có thể đọc được bằng mắt thường sau 2 giờ; độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này cao; tỷ lệ dương tính giả thấp Tuy nhiên, các thao tác phức tạp hơn các sinh phẩm nhanh; thời gian đọc kết quả lâu hơn sinh phẩm nhanh; đòi hỏi cán bộ có

31 kinh nghiệm và thao tác thành thạo; hóa chất sau hồi chỉnh chỉ sử dụng được trong vòng 14 ngày

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật ngưng kết hạt [25]

Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu

- Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay): là kỹ thuật xét nghiệm sử dụng để sàng lọc phổ biến nhất do

phù hợp với các cơ sở có lượng mẫu lớn, đặc biệt là các trung tâm sàng lọc máu Từ năm 1985, khi sinh phẩm xét nghiệm phát hiện HIV đầu tiên được sản xuất, cho đến nay các sinh phẩm ELISA đã có rất nhiều cải tiến và phát triển từ các xét nghiệm ELISA thế hệ thứ nhất đến thế hệ thứ tư, được chia thành ba nhóm nguyên lý: ELISSA sandwich; ELISSA gián tiếp và ELISA cạnh tranh (hình 1.10) Hiện nay các sinh phẩm xét nghiệm ELISA trên thị trường Việt Nam chủ yếu là nguyên lý ELISA sandwich

ELISA trực tiếp: kháng nguyên được cố định trên phiến và sẽ được phát hiện bằng kháng thể duy nhất được gắn enzyme Phức hợp cho phản ứng hiện màu với cơ chất

ELISA gián tiếp: Kháng thể kháng HIV có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virus được cố định sẵn trên phiến/giá đỡ, phức hợp này được phát hiện bởi một cộng hợp là kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn chất đánh dấu, cho phản ứng hiện màu/phát quang với cơ chất thích hợp Giá trị mật độ quang của phản ứng màu/phát quang tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử

32 ELISA sandwich: Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virus (được cố định trên phiến/giá đỡ), phức hợp này sẽ được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virus có gắn enzyme cho phản ứng hiện màu với cơ chất, mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV trong mẫu thử Các sinh phẩm ELISA phổ biến như: Murex HIV Ag/Ab combination; Murex HIV1.2.O; SD Bioline HIV 1/2 ; Phamatech HIV 1/2

ELISA cạnh tranh: Kháng thể kháng HIV có trong mẫu thử sẽ cạnh tranh với cộng hợp là kháng thể kháng HIV có gắn với chất đánh dấu để kết hợp với các kháng nguyên của virus đã cố định trên phiến/giá đỡ Giá trị mật độ quang tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể trong mẫu thử

Hình 1.10 Nguyên lý các kỹ thuật ELISA [185]

- Một số sinh phẩm dùng kỹ thuật phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng

thể cho phép phát hiện sớm nhiễm HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh Các sinh phẩm này thường được dùng trong xét nghiệm an toàn truyền máu

- Kỹ thuật xét nghiệm hóa phát quang CLIA (Chemiluminescent Immunoassay): dựa trên nguyên lý kháng nguyên/kháng thể trong mẫu thử kết hợp

với kháng thể/kháng nguyên trong thuốc thử có gắn chất đánh dấu (thường là phân tử

Acridinium ester) Nhờ chất đánh dấu có khả năng phát quang khi thay đổi pH của

dung dịch phản ứng và tín hiệu phát quang được khuếch đại qua một ống nhân quang mà người ta có thể định lượng các chất có nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao

so với các kỹ thuật thông thường khác Phân tử Acridinium ester có trọng lượng phân

tử nhỏ hơn rất nhiều so với các enzyme trong phản ứng ELISA do đó tăng khả năng

33 thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp trung tâm hoạt động của kháng nguyên và kháng thể do đó độ chính xác tăng đáng kể so với phương pháp ELISA

- Kỹ thuật điện hóa phát quang ECLIA (Electro Chemiluminescent Immunoassay): là kỹ thuật sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện không

phải từ phản ứng hóa học, nên có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết

quả rất nhanh Các kháng thể/kháng nguyên được gắn Biotin và chất đánh dấu Ruthenium cùng các vi hạt phủ Streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng Khi đặt điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp Ruthenium tác dụng với Prophylamine,

chuyển sang trạng thái kích thích và tín hiệu phát quang được hình thành Tín hiệu ánh sáng được đo và kết quả xét nghiệm được xác định thông qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất cần đo Điện hóa phát quang gồm ba nhóm nguyên lý: sandwich; cạnh tranh và bắc cầu

Kỹ thuật Western Blot

Kỹ thuật Western Blot có độ đặc hiệu cao do đó không sử dụng làm xét nghiệm sàng lọc Sinh phẩm này thường được chỉ định để khẳng định các mẫu đã có kết quả sàng lọc dương tính với 2 xét nghiệm khác Kỹ thuật Western Blot có giá thành cao, người thực hiện xét nghiệm và đọc kết quả cần có trình độ và kinh nghiệm nhất định nên Tổ chức Y tế thế giới (WHO) không khuyến cáo thực hiện ở những nước đang phát triển Để xác định một trường hợp nhiễm HIV có thể sử dụng ba xét nghiệm khác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên Trong trường hợp phối hợp ba xét nghiệm mà kết quả không xác định hoặc khó biện luận, khi đó Western Blot được cân nhắc sử dụng

Đây là kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp, các thành phần kháng nguyên của virus ở các vị trí tương ứng theo trọng lượng phân tử được cố định trên màng nitrocellulose Khi ủ mẫu, nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV sẽ gắn đặc hiệu

lên các protein là kháng nguyên tương ứng có nguồn gốc từ ba vùng gen HIV-1: env (gp41, gp120 / 160), pol (p31, p51, p66) và gag (p15, p17, p24, p55) Sau đó liên kết

kháng nguyên – kháng thể được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng

34

Immunoglobuline người đánh dấu bằng enzyme cho phản ứng màu với cơ chất (hình

1.11) [43, 68] Sinh phẩm Western Blot có hai loại riêng biệt cho HIV-1 và HIV-2

Hình 1.11 Hình ảnh nguyên lý và kết quả Western Blot [68]

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên p24

Kháng nguyên p24 là thành phần protein cấu thành lõi vi rút, bao bọc các vật liệu di truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của vi rút Kháng nguyên p24 có thể tồn tại dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể Các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên p24 thường được sử dụng trong các trường hợp như:

- Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh: đây là kỹ thuật kém nhạy nhưng rất đặc

hiệu Hiện nay, các sinh phẩm phát hiện kháng nguyên p24 đã dần hoàn thiện, độ nhạy đã được cải thiện đáng kể

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV: Trong giai đoạn đầu khi mới nhiễm

HIV, trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa hình thành kháng thể thì các xét nghiệm kháng nguyên p24 có thể được sử dụng

- Theo dõi diễn biến của nhiễm HIV: Kháng nguyên p24 có thể được phát hiện

rất sớm ở giai đoạn mới nhiễm, sau đó kháng thể hình thành, nồng độ kháng nguyên p24 tự do trong máu giảm, đến giai đoạn cuối nồng độ kháng thể giảm thì nồng độ