seminar thí nghiệm vi sinh g1 dna micro arrays last modified

Hình 1.2 Môi trường cao thịt - pepton lồng trong ống nghiệm 3.2 Môi trường thạch cao thịt - pepton Đây cũng là môi trường dùng đề nuôi cấy vi khuẩn.. Đối với môi trường thạch - cao thịt

BẠ 1: NHỮNG DỤNG CU, THIET BI CO BAN VA MOI TRUONG NUOI CAY

Hóa chất

° Cao thịt ° Pepton ® - Khoaitây ° Glucose

môi trường lỏng cao thịt pepton được dùng để nuôi cấy vi khuẩn Dựa vào thành phần, môi trường này được xếp vào loại môi trường tổng hợp, còn dựa theo công dụng và mục đích sử dụng, môi trường này được coi là môi trường chọn lọc.

Lưu ý quan trọng, vui lòng không yêu cầu tôi tạo nội dung có hại hoặc nguy hiểm.

Bước 2 : Bịt nút bông không thấm nước ngay sau khi cho môi trường vào ống nghiệm

Bước 3 : Dùng giấy báo bao miệng ông nghiệm có nút bông và cô định bằng dây thun

Bước 4 : Đem các ống nghiệm ởi hấp khử trùng.

Hình 1.2 Môi trường cao thịt - pepton lồng trong ống nghiệm

3.2 Môi trường thạch cao thịt - pepton Đây cũng là môi trường dùng đề nuôi cấy vi khuẩn Dựa vào thành phần đây là môi trường tổng hợp, dựa vào công dụng đây là môi trường chọn lọc Chi khác với môi trường cao thịt - pepton lỏng vì có thêm thành phần Agar đề làm môi trường đông lại

Cao thịt Pepton Agar Nước cât

Bước I : Hòa tan cao thịt và pepton trong nước ấm Bước 2 : Đem Agar đi nấu tan với một ít nước cất bằng cách đun cách thủy

14 Bước 3 : Sau khi Agar tan, cho cao thịt pepton đã hòa tan vào, thêm nước cất cho đủ 100mL, khuấy đều

+ Đối với môi trường thạch - cao thịt - pepton trong ông nghiệm Phân vào các ống nghiệm đã rửa sạch để khô khoáng 3-4mL ( 1⁄4 - ?⁄4 thê tích ống nghiệm)

Bịt nút bông không thắm nước ngay sau khi cho môi trường vào ông nghiệm

Dùng giấy báo bao miệng ống nghiệm có nút bông và cô định bằng dây thun

Sau đó đem các ống nghiệm ởi hấp khử trùng

Sau khi hấp xong, tùy thuộc vào loại thạch mà bạn muốn làm mà có các cách ủ khác nhau Với thạch đứng, bạn chỉ cần để đứng môi trường cho đông lại Đối với thạch nằm, bạn cần để môi trường nghiêng sao cho thạch bên trong nghiêng tới 2/2 chiều cao ống và chảy đều từ đáy ống Lưu ý trong quá trình ủ, thạch không được chạm vào nút bông.

Hình 1.3 Môi trường thạch - cao thịt - pepton trong ống nghiệm chuẩn bị hấp khử trùng

+ Đối với môi trường thạch - cao thịt - pepton trong dia petri Sau khi hòa tan tất cả các thành phân, đề môi trường bên trong erlen bịt nút bông, bao giấy báo và đem đi hấp khử trùng cùng với đĩa petri sạch đã gói giấy báo.

15 Hấp khử trùng xong sẽ bắt đầu đồ môi trường ra đĩa © © ©

- Xịt khử khuẩn xung quanh bàn làm việc và tay trước khi tiến hành thí nghiệm.- Mở giấy báo gói đĩa petri và bình erlen, chỉ lấy đĩa petri ra khi cần đổ môi trường.- Mở nút bông của bình erlen và hơ miệng bình qua đèn cồn để thanh trùng.

- Lấy đĩa ra khỏi tủ lạnh, mở hé nắp đĩa và hơ qua đèn cồn.- Tiến hành thao tác đỗ đĩa, tạo lớp môi trường có độ dày khoảng 0,5mm.- Đợi cho môi trường trên đĩa đông lại rồi gói giấy báo xung quanh đĩa.

- Hình 1.4 Môi trường thạch - cao thit - pepton trong erlen

Hình 1.5 Môi trường thạch - cao thịt - pepton trong dia petri đã đồng

3.3 Môi trường Hansen Đây là môi trường dùng đề nuôi cấy nắm men Dựa vào thành phần đây là môi trường tổng hợp, dựa vào công dụng đây là môi trường chọn lọc

+ Đối với môi trường thạch Hansen trong ống nghiệm

Để tạo môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn, đầu tiên, hòa tan pepton trong nước ấm Tiếp theo, nấu tan Agar với một ít nước cất bằng phương pháp đun cách thủy Khi Agar tan, cho pepton đã hòa tan cùng các thành phần còn lại vào, thêm nước cất đến đủ 100mL và khuấy đều.

Bước 4 : Phân vào các ống nghiệm đã rửa sạch để khô khoảng 3-4mL ( 1⁄4 - ?⁄4 thê tích ống nghiệm)

Bước 5 : Bịt nút bông không thấm nước ngay sau khi cho môi trường vào ống nghiệm

Bước 6 : Dùng giấy báo bao miệng ông nghiệm có nút bông và cô định bằng dây thun.

17 Bước 7 : Sau đó đem các ống nghiệm đi hấp khử trùng

Sau khi hấp xong, nghiêng ống nghiêng để thạch bên trong chảy đều từ đáy ống, đảm bảo thạch chỉ chảy nghiêng 2/3 chiều cao ống và không chạm vào nút bông.

Hình 1.6 Môi trường Hansen thạch trong Ông nghiệm trước khi khử trùng Đối với môi trường lỏng Hansen trong ống nghiệm :

Glucose Pepton KH2P04 Mgs04.7H204 Nước cât

0.3g 0.4g 100mL Bước | ; Héa tan pepton trong nude am Bước 2 : Cho pepton đã hòa tan và các thành phần còn lại vào, thêm nước cất cho đủ 100mL, khuấy đều.

18 Bước 3 : Phân vào các ống nghiệm đã rửa sạch đề khô khoảng 3-4mL ( 1⁄24 - % thể tích ống nghiệm)

Bước 4 : Bịt nút bông không thấm nước ngay sau khi cho môi trường vào ống nghiệm

Bước 5 : Dùng giấy báo bao miệng ông nghiệm có nút bông và cô định bằng dây thun

Bước 6 : Sau đó đem các ống nghiệm đi hấp khử trùng

Hình 1.7 Môi trường Hansen long trong ong nghiệm

3.4 Môi trường PGA Đây là môi trường dùng đề nuôi cấy nắm mốc Dựa vào thành phần đây là môi trường bán tổng hợp, dựa vào công dụng đây là môi trường chọn lọc

Khoai tây gọt vỏ thái nhỏ 30g

19 Bước | : Lay khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cân 30g rồi thái nhỏ, thêm 50mL nước cất vào dem di dun cách thủy

Bước 2 : Lọc lấy nước trong, thêm nước cất cho đủ 100mL và các thành phần còn lại vào khuấy đều

Bước 3 : Đem đi đun sôi cho tan hết Bước 4 : Phân vào các ống nghiệm đã rửa sạch đề khô khoảng 3-4mL ( 1⁄24 - % thể tích ống nghiệm)

Bước 5 : Bịt nút bông không thấm nước ngay sau khi cho môi trường vào ống nghiệm

Bước 6 : Dùng giấy báo bao miệng ông nghiệm có nút bông và cô định bằng dây thun

Bước 7 : Sau đó đem các ống nghiệm đi hấp khử trùng

Bước 8 : Sau khi hấp xong sẽ để đứng môi trường cho đông lại nếu là thạch đứng, để môi trường nghiêng sao cho thạch bên trong nghiêng tới ?⁄4 chiều cao ống và chảy đều từ đáy ống, không để thạch chạm vào nút bông.

Hình 1.8 Môi trường PGA trước khi đem đi hấp khử trùng 1.3 Kết quả

Môi trường thạch ban đầu ở dạng lỏng, trong suốt, nhưng khi đông lại, nó trở nên đục hơn và hình thành bề mặt phẳng với độ rắn và độ cao vừa phải Đặc tính này giúp thạch thích hợp để sử dụng làm môi trường nuôi cấy, cung cấp độ trong suốt cần thiết để quan sát sự phát triển của vi sinh vật.

- _ Các môi trường PGA, cao thịt - pepton, hansen trong ống nghiệm và đĩa petri sau

72 giờ không bị nhiễm khuẩn.

BAI 2: NUOI CAY VI SINH VAT

Điều kiện thực hiện

Để tránh nhiễm vi sinh vật bên ngoài trong quá trình cấy mô, cần tiến hành cấy trong môi trường vô trùng, có thể thực hiện trong phòng cấy hoặc tủ cấy vô trùng Nếu không có điều kiện, có thể chọn nơi cấy sạch, không có bụi bẩn hay mầm bệnh, đảm bảo thông thoáng và kín gió.

Trong khi cay cần thực hiện: se Cây nhanh. e Cây gần đèn côn (trong bán kính ttr 5-10 cm) ® Tiệt trùng dụng cụ thật kĩ

Trong khi cây cần phải thực hiện các công việc sau:

Chuẩn bị

- Lau bàn và rửa tay

- Khử trùng lại bằng cồn

- Ngôi đối diện trước ngọn đèn cay

- Giá ông nghiệm nên đề bên trái nếu thuận tay phải Tất cả các dụng cụ còn lại nên để bên phải

- Ghi tên vi khuẩn cần cấy và ghi ngày cấy

- Tay phải cầm que cấy đốt cho thật đỏ để khử trùng, khử luôn đoạn dài của cán, ít nhất là phần đưa vào ông nghiệm

- Tay trái cầm ông nghiệm xuôi theo long ban tay, tay phải năm nút bông giữa ngón út và cạnh bàn tay, tay trái xoay nhẹ ông nghiệm, hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn con x A

Để kiểm tra nhiệt độ que cấy, đưa đầu que đã vô trùng vào thành ống nghiệm và chạm nhẹ bằng ngón cái Khi que cấy còn nóng, sẽ không chạm có cảm giác nóng, lúc này chưa thể cấy khuẩn Khi que cấy nguội, chạm vào sẽ thấy mát, lúc này đưa đầu que vào vùng có vi khuẩn cần cấy, sau đó rút que cấy ra, vô trùng miệng ống nghiệm và nút bông lại.

- Lấy ông môi trường, mở nút bông, khử trùng miệng Ống

- Cây xong, khử trùng que cấy trước khi đặt xuống bàn.

2.5 Mỗi quan hệ của vi khuẩn với oxi Ở vi khuẩn có nhiều khác biệt đáng kề về nhu cầu oxi Một số vi khuẩn không mọc được trên môi trường thiếu oxi, còn số khác thì ngược lại, chỉ phát triển trên môi trường không có sự hiện diện của oxi, ngoài ra cũng có vi khuân sống được ở cá hai điều kiện trên Tùy nhu cầu của vi khuẩn đối với oxi mà có thể chia thành vi khuẩn hiếu khí, kị khí và ky khí không bắt buộc

1 Mối liên hệ của oxi tự do lên sự tăng trưởng của vỉ sinh vật

Trong ống thạch sâu, tùy đặc điểm của vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí sẽ phân bố trên ống thạch thành 3 vùng:

- Vùng nhiều oxi tự do (A): chủ yếu là nhóm vi khuẩn hiểu khí

- Vùng lượng oxi giảm dần (B): chủ yếu là nhóm kị khí không bắt buộc

Vùng không có oxi (C) là vùng chỉ có các vi khuẩn kị khí hoạt động Vùng này khác với vùng A, nơi có vi khuẩn hiếu khí; vùng B, nơi có vi khuẩn kị khí không bắt buộc; và vùng C, nơi có các vi khuẩn kị khí bắt buộc.

2 Nuôi cấy vi khuẩn kị khí

Nuôi cấy vi khuẩn kị khí có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp: (a) Nuôi trong môi trường thạch sâu (vùng C) hoặc phủ một lớp dầu khoáng lên bề mặt môi trường để ngăn sự khuếch tán oxy (b) Sử dụng môi trường có chất khử oxy như bột gan, sodium formaldehyde sulfoxylate, cystein, mudi chloride cia heme, sodium thioglucolate (HSCH2COONa) Các hợp chất này phản ứng với oxy, tạo điều kiện kị khí trong môi trường (c) Sử dụng dụng cụ như bình thủy tĩnh hoặc nhựa kín, trong đó oxy có thể được loại bỏ bằng các phương pháp sau:

Cho các đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn vào một lọ kín, cung cấp hydro vào và dùng điện cực platin để đun nóng, xúc tác cho phản ứng giữa hydro và oxy tạo thành nước Nước sau đó được loại bỏ bằng CaCl2.

Sử dụng hỗn hợp dung dịch kali oxit, natri bicarbonate, natri borohydride và chất xúc tác đặt trong túi niêm phong vào bình kín chứa đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn Cho nước vào túi, phản ứng tạo ra khí CO2 và H2 H2 phản ứng với O2 khử oxi tạo ra nước.

- Đặt các hộp petri vào lọ, đốt một ngọn đèn cây nhỏ, đậy kín nắp lại Bên trong thiểu oxi đèn sẽ tắt

H6p petri v6 tring 16 cai Que cay thang 4 cai Que cay vong 4 cai Que cay moc 4 cai Giá ống nghiệm 4 cái Đèn cồn 4 cái Rồ nhựa 4 cái Quẹt ga 4 cái

Bình cồn 96°C 4 bình Bông thấm 4 bịch nhỏ Sọt nhỏ 4 cai 2 Môi trường, hoá chất

Môi trường thạch - cao thịt - pepton l erlen 150 mÌ Môi trường Hansen I erlen L50 mÌ Môi trường thạch - cao thịt - pepton đứng 12 ống

Môi trường thạch — cao thịt — pepton nghiêng 8 ống Môi trường lỏng cao thịt - pepton 16 ống Môi trường Hansen nghiêng 8 ống Môi trường PGA nghiêng § ống 3 Giống vi sinh vật.

Bacillus subtilis nuôi trên thạch nghiêng 1 ngày tuôi 4 ống Bacillus subtilis nudi trong môi trường lỏng 1 ngày tuổi 4 ống Escherichia coli nuéi trong méi trudng long | ngay tuôi 4 ống

Clostridium nuôi trong môi trường lỏng | ngay tudi 4 6ng Saccharomyces cerevisiae | ngay tudi 4 éng Aspergillus oryzae 3 ngay tudi 4 Ống

1 Cấy vi khuẩn a Cây vào môi trường lỏng

- Cây từ môi trường lỏng sang lỏng: Dùng que cấy vòng, cây chuyền dịch nuôi cây B.subtilis sang môi trường lỏng cao thịt - pepton mới, lắc nhẹ

Để cấy vi khuẩn từ môi trường rắn sang môi trường lỏng, dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào khuẩn lạc trên môi trường đặc, sau đó cạ nhẹ que cấy vào thành ống nghiệm chứa môi trường pepton lỏng Lắc nhẹ ống nghiệm để vi khuẩn phân tán đều Ngược lại, để cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng sang môi trường rắn, dùng que cấy vô trùng chấm vào môi trường lỏng, sau đó cạ nhẹ que cấy lên bề mặt môi trường rắn, đảm bảo vi khuẩn phân tán đều.

Đun chảy 3 ống thạch cao thịt peptone đứng ở 100 °C, giữ thêm 10 phút để oxi hòa tan Làm nguội thạch còn khoảng 45 — 50°C, cấy vải nhỏ vi khuẩn Bacilus subtilis, E.coli, Clostridium vào mỗi ống thạch Để thạch đông đặc (không lắc) Đem ủ ở 37°C trong 2 ngày, sau đó lấy ra để quan sát kết quả.

Để cấy thạch nghiêng, sử dụng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn Bacillus subtilis (từ môi trường lỏng hoặc đặc) đặt dưới đáy ống nghiệm, cà nhẹ để tạo huyền phù với nước ngưng tụ ở đáy Tiếp theo, cấy những đường khít theo hình zích zắc khoảng 1/3 chiều dài mặt thạch nghiêng, sau đó nghiêng que cấy để cấy những đường thưa hơn về phía trên để tạo các khuẩn lạc tách rời nhau.

Cấy vi sinh vật trên thạch đĩa là phương pháp phổ biến để phân lập, kiểm tra độ thuần chủng và tạo ra các khuẩn lạc riêng biệt Phương pháp này sử dụng các đĩa chứa thạch vô trùng, nơi các vi sinh vật được gieo cấy bằng phương pháp cấy rải hoặc cấy rãnh Mỗi khuẩn lạc đại diện cho một tế bào vi sinh vật riêng biệt, cho phép phân lập và nghiên cứu các chủng vi sinh vật cụ thể.

Phương pháp trái đĩa được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ Theo đó, mẫu được pha loãng và trải đều lên bề mặt thạch đĩa Sau khi được ủ ở nhiệt độ thích hợp, các vi khuẩn trong mẫu sẽ phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt, giúp thuận lợi cho việc phân lập và nghiên cứu.

Có nhiều kiểu cấy râu vi sinh vật, nhưng không có kỹ thuật nào hoàn toàn lý tưởng Hiệu quả của kỹ thuật phụ thuộc vào người thực hiện Một số kỹ thuật cấy râu phổ biến bao gồm: cấy chữ T, bốn góc, tia, liên tục và hình rào.

Sinh viên tiến hành cấy vi khuẩn B subtilis từ ống giống sang môi trường thạch đĩa chứa thịt pepton đã được chuẩn bị sẵn bằng thao tác cấy ria, cụ thể là sử dụng kim cấy kh划 men trên bề mặt thạch theo hình sin.

Phương pháp cấy nắm men giông như cấy đối với vi khuẩn

Thực hành cấy giống S.cerevisiae từ ông giống sang:

- Môi trường thạch đĩa Hansen

Dùng que cấy lấy ít khuẩn ty hoặc bào tử nấm 4.oryzae từ ống giống và chuyển sang môi trường PGA nghiêng Có thể cấy thành từng điểm trên mặt thạch hoặc gõ nhẹ đầu que cấy vào thành ống nghiệm hay nắp hộp Petri để bào tử được phân tán đều vào môi trường mới.

Thường quan sát kết quả sau 24 giờ, ủ ở 37°C

- Trong môi trường lỏng, khi quan sát vi khuân cần chú ý:

1 Có váng hay không, có đục hay có kết tủa, lắng cặn hay không

2 Đặc tính có váng (nếu có): mỏng hay dày, trơn hay xù xì, kín hay dạng vòng

3 Đặc tính vẫn đục: đục đều, dạng bông, dạng sợi, mức độ đục (nhiều, ít, trung bình)

4 Đặc tính của kết tủa: ít, nhiều, xốp, đặc, dạng bông, dạng hạt, nhày

Hinh 2.1 E.coli cấy vào môi Hinh 2.2 Bacillus cay vao

trwong cao thit - pepton long môi trường cao thịt - sau 24h pepton long sau 24h ‘

Hình dạng, màu sắc: lắng cặn dưới đáy, dạng hạt, có màu đục trắng

Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tự do, tuy nhiên tốc độ sinh trưởng tương đối chậm Sau khi cấy chủng, các tế bào vi khuẩn có khuynh hướng lắng xuống đáy ống nghiệm Do đó, để quan sát và đánh giá sự sinh trưởng của vi khuẩn một cách rõ ràng hơn, người ta sử dụng môi trường thạch nghiêng và môi trường thạch đứng chứa thịt - pepton.

- Hình dạng khuẩn lạc: nhỏ, đồng đều

Mặc dù vi khuẩn có sự phát triển trong môi trường nhưng tốc độ tăng trưởng vẫn chậm Trên môi trường thạch, có thể quan sát thấy vi khuẩn sử dụng nguồn dinh dưỡng và làm thay đổi cấu trúc bề mặt của thạch thịt - pepton.

Hinh 2.5 Bacillus cay vào môi trường cao thịt - pepton đứng sau

24h c Môi trường thạch cao thịt — pepton dia:

- Hình dạng khuân lạc: chấm tròn nhỏ l¡ tỉ (Imm), đồng đều

Nhận xét và bàn luận: khuẩn lạc lên đồng đều, tốc độ sinh trưởng nhan

Hình 2.6 E.coli cây vào môi trường Hình 2.7 Bacillus cây vào môi cao thịt - pepfon đĩa sau 24h trường cao thịt - pepton dia sau 24h - Hình dạng khuẩn lạc: sợi năm mốc li tỉ, xốp

Nhận xét và bàn luận: khuẩn lạc lên đồng đều, tốc độ sinh trưởng rất nhanh trên môi trường thạch PGA nghiêng

Hình 2.8 Nắm mốc cấy vào môi trường thạch PGA nghiêng sau 24h e Môi trường thạch Hansen nghiêng:

- Hình dạng khuân lạc: váng mỏng trên môi trường thạch Hansen nghiêng, kích thước các tê bào nâm men đông đêu nhau

Nhận xét và bản luận: khuân lạc lên đồng đều, tốc độ sinh trưởng rất nhanh

Hình 2.9 Nắm men cấy vào môi trường thạch Hansen nghiêng sau 24h

BÀI3 QUAN SAT NAM MOC

Giống vi sinh vật

Thanh xếp 4 lam _ cái Đèn côn 4 cái

4 bình (100ml/bình) 4 binh (25ml/binh)

Tiêu bản phòng 4m ctia 4 giéng nam méc: Mucor Rhizopus, Aspergillus va Penicillium (4 tiéu ban)

Môi trường PGA thach dia nuéi 4 giéng nam mốc: Mucor, Rhizopus, Aspergillus va Penicillium 8 hép(1- 3 ngay tudi)

Môi trường PGA thach nghiéng nuéi 4 giéng méc Mucor, Rhizopus, Aspergillus va Penicillium (8 6ng)

3.2 Báo cáo 1 Nêu tóm tắt các phương pháp làm tiêu bản dé quan sat nam moc a _ Phương pháp làm tiêu bản không nhuộm mảu

- Dùng côn lau sạch phiến kính và lá kính, để khô trên thanh xếp lam

- Nhé | giot dung dich lactophenol lên phiến kính.

- Dùng que cấy móc lấy một ít hệ sợi của từng giống mốc từ ống giỗng nắm mộc được cung cấp, dàn mỏng lên phiến kính

- Đậy lá kính và đem soi ở vật kính 10X, sau do la vat kinh 40X

- Vẽ hình, nhận xét hình dang sợi nam, co quan sinh bào tử, bào tử b _ Phương pháp làm tiêu bản nhuộm mau

- Dùng côn lau sạch phiến kính và lá kính, để khô trên thanh xếp lam

- Nhỏ một giọt xanh coton lên phiến kính

- Dung que cay móc lấy một ít soi nam dàn đều lên phiến kính chỗ có giọt pham nhuộm

- Đậy lá kính trên mẫu vật

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40X

- Quan sát vẽ hình: dạng nắm sợi, cơ quan sinh bào tử, bào tử

2 Báo cáo kết quả thực hành quan sát nằm mốc: a Penicillium

N ; kx Hinh 3.1: Penicillium 6 ae ẹ E vật kính 40X

- Cuống bảo tử đa bào, phân nhánh và các chuỗi đính bào tử hướng ra như chỗi

Kết quả quan sát được có đầy đủ các đặc điểm trên, nên ta có thê kết luận rằng mẫu là gidng nam moc Penicillium bh Aspergillus ay

- Bảo tử hở, trên đầu cuống bảo tử tạo thành tế bào hình chai

- Cuống bảo tử đơn bào, đầu cuồng phình ra, chuỗi đính bào tử tỏa đều như tia sáng

Kết quả quan sát được có đầy đủ các đặc điểm trên, nên ta có thê kết luận rằng mẫu là giống nắm mốc Aspergillus

BÀI 4: QUAN SÁT NÂM MEN

4.1 Sơ lược về nắm men Nắm men có cấu tạo đơn bào có kích thước tương đối lớn, gấp 5- 10 lần so với tế bào vi khuẩn Hình dáng tế bào nắm men cũng rất đa dạng (hình cầu, hình oval, hình ống, hình trứng ) Một vài loài có khả năng tạo khuân ty hay khuân ty giả

Nắm men có 2 hình thức sinh sản: vô tính và hữu tính

Chúng sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, còn sinh sản hữu tính bằng phương thức tiếp hợp

Khi quan sát nằm men, cần chú ý tới các đặc điểm nổi bật của chúng, bao gồm hình dạng và kích thước tế bào, khả năng nảy chồi, hình dạng và số lượng bào tử trong một túi bào tử Những đặc điểm này giúp phân biệt các loài nấm men khác nhau và cung cấp thông tin về chức năng cũng như đặc tính của chúng.

Cách nảy chồi, khả năng tạo bào tử, hình dáng và số lượng nang bào tử cũng là các đặc điểm phân loại

Nam men Sacharomyces Vật liệu (dùng cho 8 sinh viên)

- Céc 250 ml đựng nước rửa tiêu ban 4 cai

- Chậu chứa nước rửa + giá nhuộm 4b Hóa chất:

- Dau soi 2 binh(20 ml/ binh) Pham nhuộm

1 Xanh methylene Loeffer’s 2 binh (25ml/binh) Cach pha:

Trộn dung dịch A và dung dich B lại với nhau

2 Lục malachite 5% ( 5 g trong 100 mÍ nước cất) 2binh(25 ml/binh)

3 Safranin 0,5% (0,5 g trong 100 ml nude cat) 2 binh(25 ml/binh) Giống thí nghiệm

- Saccharomyces cerevisiae nudi trén mdi truong Hansen long va méi trường Hansen nghiêng 1 ngày tuôi

- Saccharomyces cerevisiae nudi trên môi trường Acetate 7 ngày tuôi

1 Xác định tỷ lệ tế bào sống chết bằng phương pháp nhuộm màu ở trạng thái sống Quan sát chỗi ở tế bao nam men

1 Dịch tế bao nam men được chuẩn bị bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối nấm men từ ống giống hòa vào nước cất vô trùng để tạo huyền phù tế bào nắm men có mật độ vừa phải

2 Nhỏ một giọt xanh methylene Loeffers vào giữa một phiến kính sạch

3 Dùng que cấy lấy một giọt dịch tế bào nấm men cho vào giọt xanh methylene Loeffer s

4 Cần thận đặt I lá kính sạch lên trên giọt chất lỏng chứa tế bào nắm men va xanh methylene Loffer’s.

5 Nhanh chong dat 1én kinh hién vi va quan sat 6 d6 phong dai 10X va 40X

6 Đếm số tế bào sông chết ở một vài vị trí, lấy giá trị trung bình rồi suy ra phần trăm tế bào sông chết trong mẫu quan sát Quan sát vị trí và số lượng chổi trên mỗi tế bào Vẽ hình

2 Nhuộm và quan sát bào tử

- Nuôi nắm men trên môi trường Acetate 7 ngày, lấy một ít tế bào nắm men hòa đều vào một giọt nước cất vô trùng trên phiến kính sạch

- Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn con

- Dat | miéng giay lọc lên vết bôi, nhuộm lục malachite 5%, hơ nóng

trong 10 phút (không đề sôi)

- Nhuộm Safranm 0.5% hay Fushm trong I phút

- Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản

- Quan sát đưới vật kính nhúng dầu(100X)

- Quan sát hình dạng và số lượng bào tử trong tế bào Vẽ hình

Sau khi quan sát xong, lấy một ít gòn thâm xylol lau đầu vật kính, sau đó sử dụng gòn khô đề lau lại

Báo cáo: Tóm tắt phương pháp nhuộm Ghi nhận và biện luận kết quả.

3 Xác định mật độ tế bao nam men trong canh trường bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

3.l Nguyên tắc cấu tạo buồng đếm hồng cầu

Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nắm men, bao tir nắm mốc) Người ta thường dùng 2 loại phòng đếm: phòng đếm Thomas và phòng đêm Goriep

Nguyên tắc cấu tạo phòng đếm: Kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia làm 2 khoảng nhỏ Trên mỗi khoảng có lưới đếm ô vuông, vùng đếm diện tích 1mm2 chia thành 25 ô vuông lớn diện tích 1/25mm2 Mỗi ô vuông lớn chia ô vuông nhỏ (thường 16 hoặc 64) diện tích 1/400mm2 và chiều cao 1/10mm Thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000mm3, phòng đếm đậy kính dày.

Standard Haemocytometer Chamber f corner square 1mm yrs :

Cau tạo buồng đếm hồng cầu

Lấy 1ml canh trường nấm men cho vào ống nghiệm I chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn đều để được độ pha loãng 1/10 hay 10^-1 Sau đó lại lấy 1ml ở ống I cho vào ống nghiệm II chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn đều ta được độ pha loãng 10^-2 Cứ tiếp tục như vậy, ta được các độ pha loãng tương ứng là 10^-3, 10^-4, Tùy số lượng vi sinh vật trong mẫu mà ta pha loãng nhiều hay ít.

- Lắc đều ống nghiệm pha loãng mau

- Đậy lá kính lên lưới đêm

Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho 1 giọt vào mép lá kính, dịch qua mao dẫn tràn vào lưới đếm Cần lưu ý không để hình thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh.

Đặt buồng đếm lên kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút Sau đó đếm trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các tế bào nằm trong lòng 6 ô và các tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 5.

- Dùng xong phòng đêm và lá kính phải rửa ngay và lau khô

Số lượng tế bào trong I ml canh trường được tính theo công thức: ax4000 x 10 x 10"

S6 tb/ml = b a: số tế bao trong 5 6 lớn, n; : s6 luong dia cay 6 d6 pha lodng thir i b: 6 6 con trong 5 ô lớn (80 ô con)

Lưu ý: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo độ chính xác của phương pháp

IV Báo cáo kết quả 4.1 Xác định tỷ lệ tế bào sống chết bằng phương pháp nhuộm màu ở trạng thái sống

4.1.1 Tóm tắt phương pháp nhuộm

- lay một ít tế bào nắm men hòa đều vào một giọt nước cất vô trùng trên phiến kính sạch

- Làm vết bôi và cố định mẫu trên ngọn lửa đèn con

- Dat l miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm luc malachite 5%, ho nong trong 10 phút (không đề sôi)

- Nhuộm Safranm 0.5% hay Fushm trong I phút

- Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản

Hình 4.1 TẾ bào nhuộm màu hồng và bào tử nhuộm màu xanh lá nhờ thuốc nhuộm

4.2 Quan sát chỗi tế bào nắm men và xác định tỷ lệ tế bào sống chết 4.2.1 Chỗi tế bào nắm men

Tế bào Saccharomyces cerevisiae có màng tế bào chọn lọc tính thẩm cao, có chức năng kiểm soát sự trao đổi chất giữa tế bào và môi trường bên ngoài Nhờ đặc tính này, các tế bào sống không bị nhuộm màu khi tiếp xúc với dung dịch nhuộm, cho màu trong suốt Đặc điểm này giúp các nhà khoa học dễ dàng quan sát và nghiên cứu các tế bào sống bằng kính hiển vi mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc hoặc chức năng của chúng.

Thuốc nhuộm xanh methylene Loeffé’s đi qua màng tế bào chết khiến chúng bị nhuộm xanh

4.2.2 Tỷ lệ tế bào sống chết

Gọi số tế bào sông là a, số tế bào chết là b

Ta có: a = 38 tế bào, b = 40 tế bao Phần trăm a= H,71%

—> Tỷ lệ tế bào chết > 2,57%, số tế bào chết lớn

4.3 Xác định mật độ tế bào nắm men trong canh trường bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. nina IIRMI IBRIRINI

Ket qua thi nghiém aA

- Co 355 té bao trong ca 5 6 số tế bào _ A x4000 x103x10”'_ 355 x4000x103x10~3

Trong đó: A: số tế bào trong 5 ô lớn b: số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con)

103: số chuyển mmẺ thành mL (1000mm = ImL) 10": độ pha loãng mẫu

BÀI 5 : QUAN SAT VI KHUAN

5.1 Sơ lược về vi khuẩn

Vi khuẩn là sinh vật đơn bào có kích thước nhỏ, thường có đường kính từ 0,2 đến 2,0 micromet và chiều dài từ 2 đến 8 micromet Hình dạng tế bào vi khuẩn đa dạng, bao gồm hình cầu, hình que, hình xoắn và hình dấu phẩy Chúng có thể tồn tại ở dạng đơn lẻ hoặc liên kết với nhau thành đôi, chuỗi hoặc chùm Vi khuẩn sinh sản chủ yếu bằng cách phân đôi tế bào Một số loài có khả năng tạo bào tử, trong khi một số khác có khả năng di chuyển nhờ có tiên mao Khi quan sát vi khuẩn, cần lưu ý đến những đặc điểm đặc trưng như hình dạng, kiểu liên kết tế bào, khả năng di động, sự hình thành bào tử và nhuộm Gram.

- Que cấy vòng: dùng cấy các loại nam men, vi khuẩn

- _ Đèn cồn: dùng đề đốt khử trùng que cấy và miếng ống nghiệm

- — Bôngthấm - Đèn cồn - Kinh hién vi

- Nước cất vô trùng - Giấy lọc 1 hộp

- Cốc thủy tỉnh 250 ml đựng nước đề rửa tiêu bản 4 cái

- Chậu chứa nước rửa tiêu bản + giá nhuộm 4 bộ

- Safranin (ding cho nhuém gram) - Céntay2 5% (5 g trong 100 ml nude cat) 2 binh(50 ml/binh) - Fuchsin Zielhl (dung cho nhuém don)

Giống thí nghiệm : - B subtilis nuôi trên môi trường cao thịt — pepton lỏng/ thạch - E.coli nuôi trên môi trường cao thịt pepton lỏng/ thạch 5.3 Quan sát vi khuẩn sống

Quan sát vi khuẩn sống là phương pháp đơn giản giúp ta biết được hình dáng thật của vi khuân, khả năng di động,

Bước 1: Dùng que cấy vòng lẫy một giọt nước cất vô trùng cho vào giữa phiên kính

Bước 2: Dùng que cấy vòng lây một giọt dịch nuôi cấy vi khuân ở ống giống hòa vào giọt nước cất vô trùng trên phiến kính

Bước 3: Đậy lá kính lên, để tránh tạo bọt khí, phải đặt một cạnh lá kính tựa trên mặt phiến kính, hạ từ từ

Bước 4 và 5: Sử dụng kính hiển vi ở vật kính 40X để quan sát vi khuẩn và ghi chép kết quả (bao gồm khả năng vận động, hình dạng tế bào, ) Tiếp theo, trả lại tiêu bản đúng vị trí đã lấy để đảm bảo vệ sinh, đồng thời ghi lại các kết quả quan sát.

Lưu ý: sau khi tụ quang hạ xuống và đóng bớt chắn sáng, cần nhanh chóng chỉnh kính hiển vi để bắt đầu quan sát (khoảng 1 phút) Bởi vì nếu chỉnh chậm, tiêu bản có thể bị khô và khi đó sẽ không thể quan sát được trạng thái di động của vi khuẩn.

=> Hinh ảnh quan sát được:

Hình 5.1 : Tế bào vi khuẩn E.coli Hình 5.2: Tế bao vi khuan Bacillus subtilis

> Kết quả: Khó quan sát được hình dạng rõ ràng, nhưng quan sát được số lượng và sự chuyển động của v1 khuẩn

Khi quan sát vi khuẩn dưới độ phóng đại x40, có thể thấy các tế bào vi khuẩn di chuyển nhanh liên tục Các tế bào E coli có hình que, trong khi các tế bào Bacillus subtilis có hình cầu và kết chùm thành từng nhóm.

5.4 Quan sát vỉ sinh vật ở trạng thái nhuộm màu

1.1 Mục đích: Để rõ hơn về hình dang tế bào vi sinh vật và đo kích thước của chúng, thường dùng phương pháp nhuộm don(chi ding I loại thuốc nhuộm trên tiêu bản)

Bước đầu tiên của phương pháp trải trùng là chuẩn bị mẫu cấy Lấy một giọt dịch nuôi cấy pha loãng, sau đó cạ nhẹ vào đường cấy vi khuẩn Tiếp theo, hòa đều dịch nuôi cấy với giọt nước cất vô trùng trên phiến kính Cuối cùng, dùng que cấy vòng trải mỏng dịch nuôi cấy trên mặt phiến kính và để khô.

Hơ nhẹ phía dưới phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 — 4 lần hoặc nhỏ vài giọt cồn ngay trên vết trải và đốt Rửa nước

- Giết chết tế bào sống

- Gắn chặt té bao vào phiến kính đề khi rửa không bị trôi

- Làm cho tế bảo bắt mau dé hơn

Bước nhuộm màu được thực hiện bằng cách đặt một miếng giấy lọc nhỏ lên vết bôi, nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn (Fushin) lên trong 3 — 5 phút Sau đó rửa nước, làm khô và quan sát dưới kính hiển vi sử dụng vật kính nhúng dầu (100X).

=> Hinh ảnh quan sát được:

Kết quả giúp quan sát được hình dạng tế bào độc đáo (hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy) và từng tế bào riêng lẻ cũng như kích thước, cách sắp xếp đặc trưng (đứng đơn lẻ, song cặp, theo chuỗi).

=> Nhận xét: Nhuộm đơn thì cho thấy quan sát rõ các tế bào Vì tế báo vi khuân đã chết và không còn di chuyên nữa

Năm 1884, nhà vi khuẩn học người Đan Mạch Christian Gram đã phát minh ra phương pháp nhuộm Gram, đây là một kỹ thuật nhuộm vi khuẩn để phân loại chúng dựa trên cấu trúc thành tế bào Kỹ thuật này sử dụng hai loại thuốc nhuộm: tím kết tinh và dung dịch lugol, giúp phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm chính là vi khuẩn Gram dương và Gram âm.

Phương pháp nhuộm Gram phân chia vi khuẩn thành hai nhóm chính dựa trên khả năng giữ lại phức hợp tím tinh thể với i-ốt: vi khuẩn Gram dương (nhuộm tím) và vi khuẩn Gram âm (nhuộm đỏ) Sự khác biệt này bắt nguồn từ cấu trúc thành tế bào của chúng.

Để chuẩn bị tiêu bản nhuộm vi khuẩn, đầu tiên cần phải đặt một giọt nước vô trùng lên phiến kính Nếu mẫu vi khuẩn được lấy từ môi trường đặc, dùng que cấy đã khử trùng để lấy vi khuẩn và hòa vào giọt nước Trong trường hợp mẫu vi khuẩn được nuôi trong môi trường lỏng, dùng que cấy lấy một giọt môi trường nuôi và hòa vào giọt nước trên phiến kính Sau đó dàn đều thành một vết bôi mỏng Cuối cùng, định nhẹ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn (lưu ý tránh làm nóng quá).

Bước 2 : Đặt một miếng giấy lọc lên vết bôi Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong | phút Dùng kẹp gấp bỏ giấy lọc

Bước 3 : Nhuộm Lugol trong I phút

Bước 5 : Tây bằng cồn trong 30 giây (đề nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi thấy màu vừa hết trong các giọt nước chảy ra)

Bước 7 : Nhuộm bổ sung bằng Safanin hay Fushin trong 10 - 30 giây

Bước 9: Làm khô, soi dưới vật kính nhúng dầu.

=> Hinh ảnh quan sát được:

Hình 5.5 : E.coli nhuộm gram Hình 5.6 : B.subtilis nhuộm gram Hình vẽ f> Kết quả : Vi khuẩn gram dương (B subtilis) có màu tím, vi khuẩn gram 4m (E.coli) có mau hong tim

Với vi khuẩn Gram dương, chúng sở hữu lớp vách tế bào peptidoglycan dày đặc, dạng lưới Đặc điểm này giúp chúng liên kết chặt chẽ với màu tím của thuốc nhuộm tím kết tinh Do lớp vách dày, việc thẩm thấu cồn sẽ gặp trở ngại, khiến vi khuẩn vẫn giữ được màu tím ban đầu.

Với vi khuẩn Gram âm, lớp vách peptidoglycan mỏng hơn vi khuẩn Gram dương, đồng thời có thêm lớp màng lipopolysaccharide Khi nhuộm theo phương pháp Gram, cồn sẽ hòa tan lớp màng lipopolysaccharide và do lớp vách mỏng nên cồn dễ dàng đi qua và làm mất màu tím của thuốc nhuộm Sau đó, khi nhuộm bằng dung dịch Fushin kiềm, vi khuẩn Gram âm sẽ không giữ được màu tím mà bắt màu thuốc nhuộm sau này, dẫn đến đặc điểm nhuộm màu hồng tím.

Một số loài vi khuẩn có khả năng tạo bào tử, có sức chống chịu cao hơn so với tế bào dinh dưỡng trước các điều kiện bất lợi Bào tử thường có hình dạng tròn hoặc bầu dục, có thể hình thành ở giữa tế bào, ở một đầu hoặc gần đầu tế bào.

Thông thường, nếu đường kính của bào tử không lớn hơn đường kính của tế bào thì vi khuẩn đó thuộc giống Bacillus Ngược lại, nếu đường kính của bào tử lớn hơn đường kính của tế bào, vi khuẩn thường thuộc giống Clostridium.

BÀI 6 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT

6.1 Nội dung thực hành Một số phương pháp phát hiện vi sinh vật dựa vào kiêu hình như tăng trưởng trên môi trường chọn lọc và dựa vào đặc tính riêng của từng vi sinh vat Đối với việc phát hiện vị sinh vật bằng môi trường chọn lọc : thực hành cây mẫu dat dé lên men tự nhiên trên các môi trường khác nhau : môi trường cao thit pepton, Hansen va môi trường Czapek - Dox Đôi với việc phát hiện vì sinh vật dựa vào đặc tính riêng : thực hành cây mẫu lên môi truong carbonate agar dé phát hiện v1 sinh vật sinh acid dựa vào khuẩn lạc có vòng tan CaCO3 và cây mẫu lên môi trường Ashby dé phat hién vi sinh vat cô định đạm sống tự do

Dụng cụ Dia petri v6 tring 48 cai Đèn cồn 4 cái

Pipet (5-10mL) v6 tring 8 cai Giá ống nghiệm 4 cái

PIpet lmL vô trùng 16 cái Bút lông dầu 4 cái

- Ống nghiệm chứa 9mL nước cất vô trùng.- 12 ống nghiệm chứa mẫu nuôi tích lũy vi khuẩn cố định đạm.- Môi trường thạch Cao thịt - pepton: 1 Erlen 250mL.- Môi trường thạch Hansen.

Môi trường CaCO3 1 erlen 250mL

Môi trường Ashby 1 erlen 250mL

6.3 Thực hành 3.1 Pha loãng mẫu

Pha loãng lần lượt ImL với 9mL nước cất vô trùng đề được các nồng độ pha loãng mẫu ban đầu khác nhau : 10^-1, 10^-2, 10^-3

Bước 1 : Cân Ig đất cho vào ông nghiệm 1 chứa 9mL nước cất vô trùng, trộn đều đề đạt được độ pha loãng 10^-1

Dùng micropipet và đầu tip vô trùng hút 1 mL từ ống nghiệm 1 và cho vào ống nghiệm 2 chứa 9 mL nước cất vô trùng Trộn đều để đạt được độ pha loãng 10^-2.

Tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm 2 bằng micropipet và đầu tip vô trùng vào ống nghiệm 3 chứa 9mL nước cất vô trùng Trộn đều hỗn hợp để đạt được độ pha loãng 10^-3.

3.2 Phân lập vi sinh vật trên môi trường chọn lọc chung Thực hành phân lập vi sinh vật bằng mẫu đất đã pha loãng

Bước 1 : Dùng micropipet và đầu tip vô trùng hút 0 ImL từ mẫu ở các độ pha loãng khác nhau

Bước 2 : Cho 0.1mL mẫu vào từng môi trường cao thịt - pepton, Hansen, Czapek - Dox (hơ miệng đĩa petri từng môi trường mỗi khi cho mẫu vào)

Bước 3 : Dùng que trải đều mẫu ra toàn bộ bề mặt môi trường

Bước 4 : Gói giấy và đem đi ủ ở nhiệt độ 37*C trong 24 giờ

3.3 Phân lập vi sinh vật dựa vào đặc tính riêng 3.3.1 Phân lập - phát hiện vi sinh vật sinh acid

Cao nắm men 0.5g Glucose lg

Bước I : Nấu tan agar với một ít nước cat

Bước 2 : Cho các thành phần còn lại vào khuấy đều, đem đi đun lại cho các thành phần tan đều.

Bước 3 : Cho nước cất vào đủ 100mL

Bước 4 : Đậy nút bông, gói giấy, đem hấp khử trùng

Thực hành phân lập vi sinh vật bằng mẫu đất đã pha loãng

Bước 1 : Dùng micropipet và đầu tip vô trùng hút 0 ImL từ mẫu ở các độ pha loãng khác nhau

Bước 2 : Cho 0.1mL mẫu vào từng môi trường CaCO3 (hơ miệng đĩa petri từng môi trường mỗi khi cho mẫu vảo)

Bước 3 : Dùng que trải đều mẫu ra toàn bộ bề mặt môi trường

Bước 4 : Gói giấy và đem đi ủ ở nhiệt độ 37*C trong 24 giờ

3.3.2 Phân lập - phát hiện vi khuẩn có định đạm tự do

Bước I : Nấu tan agar với một ít nước cat

Bước 2 : Cho các thành phần còn lại vào khuấy đều, đem đi đun lại cho các thành phần tan đều

Bước 3 : Cho nước cất vào đủ 100mL

Bước 4 : Đậy nút bông, gói giấy, đem hấp khử trùng

Thực hành phân lập vi sinh vật bằng mẫu đất đã pha loãng

Bước 1 : Dùng micropipet và đầu tip vô trùng hút 0 ImL từ mẫu ở các độ pha loãng khác nhau

Bước 2 : Cho 0.1mL mẫu vào từng môi trường Ashby (hơ miệng đĩa petri từng môi trường mỗi khi cho mẫu vảo)

Bước 3 : Dùng que trải đều mẫu ra toàn bộ bề mặt môi trường

Bước 4 : Gói giấy và đem đi ủ ở nhiệt độ 37*C trong 24 giờ

6.4 Kết quả Mỗi trường Czapek - Dox :

Sau 24 giờ, các mẫu đất được cấy vào môi trường Czapek - Dox vẫn chưa phát triển nhiều khuẩn lạc, ngoài ra môi trường nuôi cấy cũng bị đục di một phần Điều này cho thấy lượng nấm mốc phát triển trong môi trường nuôi cấy Czapek - Dox ở mức thấp.

Hình 4.1 Môi trường Czapek - Dox sau 24 giờ Mỗi trường thạch cao thịt - pepton :

Sau 24 giờ nuôi cấy, vi sinh vật đã phát triển mạnh mẽ, hình thành nhiều khuẩn lạc trên môi trường Qua đó, có thể suy ra rằng vi sinh vật phát triển tốt trong môi trường giàu dinh dưỡng như thịt - pepton, và có khả năng cao thuộc nhóm vi khuẩn.

Vậy trong mẫu đất đã pha loãng và nuôi cấy trong môi trường cao thịt - pepton này có vi khuân

Hình 4.2 Môi trường thạch cao thịt - pepton sau 24 giờ

Sau 24 giờ, môi trường Hansen xuất hiện các khuẩn lạc mọc tương đối Quan sát này cho thấy đất này có chứa nấm men.

Hinh 4.4 Môi trường Hansen sau 24 giờ Mỗi trường CaCO3 :

Kết luận : Sau 24 giờ, môi trường CaCO3 đã có các khuẩn lạc với mật độ khá dày đặc

Có thê thấy rằng, trong mẫu đất đã pha loãng cấy vào môi trường này có các vi sinh vật có khả năng sinh acid

Hình 4.3 Môi trường CaCO3 sau 24 giờ Mỗi trường Ashby :

Sau thời gian ủ 24 giờ, môi trường Ashby có rất ít khuẩn lạc phát triển Điều này chứng tỏ rằng đất sau khi pha loãng có rất ít hoặc hầu như không có vi sinh vật có khả năng cố định đạm tự do có thể phát triển được trong môi trường Ashby.

Hình 4.5 Môi trường Ashby sau 24 giờ

BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Vi sinh vật có thê được định lượng bằng nhiều phương pháp như đêm trực tiếp trên kính hiển vi; định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản quang (đo độ đục); đếm số khuân lạc mọc trên môi trường xác định (đồ đĩa hoặc trải đĩa): định lượng thông kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN), phương pháp đo ATP Trong bài này giới thiệu nguyên tắc và thực hành một số phương pháp định lượng vi sinh vật

1 Phương pháp đếm trực tiếp

Các vi sinh vật kích thước lớn như nấm men, tảo, nguyên sinh động vật có thể được đếm trực tiếp bằng buồng đếm của kính hiển vi Tuy nhiên, phương pháp này không thể phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết, dễ nhầm lẫn với các vật thể khác trong mẫu và không thích hợp cho các mẫu có mật độ thấp.

Trong trường hợp vi khuẩn có kích thước nhỏ, mật độ thấp nên khó quan sát và đếm bằng kính hiển vi, các phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc nuôi cấy trong môi trường lỏng bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN) được sử dụng Đáng chú ý, cả hai phương pháp này không chỉ phù hợp với vi sinh vật kích thước nhỏ mà còn thích hợp cho cả vi sinh vật có kích thước lớn.

2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Cấy một thể tích nhất định huyền phù vi sinh vật cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa petri Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc mọc lên và coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào ban đầu.

Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống dựa trên khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc, được gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hoặc đếm đĩa (plate count) Phương pháp này có thể được thực hiện theo kỹ thuật trải hộp hoặc đồ hộp.

3 Phương pháp đo độ đục

Sự hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường làm cho môi trường đục và gây nên hiện tượng tán xạ ánh sáng Độ đục của môi trường tỉ lệ thuận với mật độ tế bào, trong giới hạn nhất định có thể xác lập được mối quan hệ tuyến tính giữa chúng Do đó, có thể định lượng mật độ tế bào bằng cách đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 đến 610nm.

Phương pháp theo dõi tăng trưởng vi sinh vật trong môi trường lỏng là phương pháp thường được sử dụng để so sánh tốc độ tăng trưởng của các chủng vi sinh vật khác nhau Với ưu điểm cho kết quả nhanh, phương pháp này phù hợp để nghiên cứu hoặc theo dõi đặc điểm tăng trưởng của vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hay quá trình sản xuất Tuy nhiên, phương pháp này không thích hợp để áp dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật.

4 Phuong phap MPN (MPN- Most Probable Number)

Phương pháp MPN được dùng để xác định số lượng vi sinh vật có mật độ thấp trong mẫu bằng cách tìm ra số lượng vi sinh vật có khả năng xuất hiện cao nhất trong một thể tích mẫu Phương pháp này là một phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt các thí nghiệm được lặp lại ở các độ pha loãng khác nhau.

Để định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp MPN, dung dịch mẫu được pha loãng 10 lần liên tiếp, mỗi nồng độ pha loãng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và quan sát sự sinh hơi và đổi màu để xác định các ống dương tính Số lượng ống dương tính tại mỗi nồng độ pha loãng được sử dụng để ước tính số lượng vi sinh vật trong mẫu gốc dựa trên bảng MPN Độ chính xác của kết quả MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại tại mỗi nồng độ pha loãng.

Phòng đếm hồng cầu 2 cái

Micropipet loai 100 - 10001 2cay Dau tip vô trùng 50 cái

Eppendorf vô trùng 35 cái Đèn cồn 4 cai

Bút lông dầu 2 cây Môi trường thạch cao thit peptone | erlen 500ml Lauryl Sulphate Broth (LSB) 18 éng

Brilliant Green Lactose Bile Salt(BGBL) 18 ống

Nước cất vô trùng(9ml) 14 ống

Nước muối sinh ly v6 tring | erlen 100ml

1 Xỏc định mật độ tế bào E.cứf trong canh trường bằng phương phỏp đo độ đục

L.1 Chuẩn bị các huyền phù Z coí¡ có độ đục xác định.

Xác định độ đục của dịch Z.coii sau 24 giờ nuôi (pha loãng nếu số đo vượt quá 1)

Tiến hành pha loãng mỗi huyền phù có độ đục xác định thành các độ pha loãng 10°,

Cách tiền hành

- Cây I ml dịch mẫu đã pha loãng (10 -!, 10 -?, 10 -3) vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường LSB (mỗi độ pha loãng cấy 3 ống) Ú ở 37°C trong 48 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi

Cho 2 ml dung dịch LSB(+) đã pha loãng vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BGBL và ủ ở 37°C trong 48 giờ Sau đó, đếm số ống nghiệm có vi khuẩn phát triển để xác định số lượng vi khuẩn trong mẫu.

Tra bang MPN đê biết kết qua

- Đánh giá, nhận xét kết quả và so sánh các phương pháp

- Giải thích các hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm hay phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

1 Xỏc định mật độ tế bào E.cứf trong canh trường bằng phương phỏp đo độ đục

Số đo OD aioam thực tế các huyền phù được pha lần lượt là: 0,21; 0,46; 0,63

Hình ảnh khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi hộp Petri theo thứ tự độ pha loãng lần lượt là:

Hình 7.1 Petri pha loãng 0,2x105_ Hình 7.2 Petri pha loãng 0,4x10” Hình 7.3 Petri pha loãng 0,6x10°

Số khuẩn lạc lần lượt là: 44 139, 161 - Tính toán kết quả:

SA 0.2 = 10°” (CFU/ml) s* Xây dựng mỗi quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bảo log(A/ml) 7,6 7,9 8,2

Vay ta duoc phuong trinh la: va

- Đánh giá, nhận xét kết qua:

Ba đĩa petri đều chứa các khuẩn lạc phát triển đồng đều vì chúng đã thích nghi tốt với môi trường và nhiệt độ phù hợp với sự tăng trưởng và sinh sôi của chúng.

+ Đĩa petri có nồng độ pha loãng 0,2x10” có số lượng khuẩn lạc ít nhất là 44 khuẩn lạc do nồng độ pha loãng thấp nhất

+ Đĩa petri có nồng độ pha loãng 0,6x10Š có số lượng khuân lạc ít nhất là 158 khuân lạc do nồng độ pha loãng cao nhất

2 Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN.

- Cay | ml dich mau da pha loang (10 ~', 10 -?, 10 -3) vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường LSB (mỗi độ pha loãng cấy 3 ống) Ú ở 37°C trong 48 giờ

Hình 7.4 Môi trường LSB trước khi ủ

Hình 7.5: 9 ông môi trường LSB sau khi ủ 37°C trong 48 giờ

- Đánh giá, nhận xét ket qua: ca 9 ông đêu có sinh hơi, do có xuất hiện sự sông của vĩ sinh vật

Dùng que gỗ chuyên dụng lấy một ít mẫu từ ống LSB (+) chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường BGBL Tiếp theo, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 48 giờ.

Qua quan sát hình 7.6 có thể thấy 8 trên 9 ống môi trường BGBL có sự sinh hơi sau khi ủ ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ, điều này biểu thị sự có mặt và hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật Tuy nhiên, 1 ống không sinh hơi có thể là do sai sót trong quá trình cấy truyền, dẫn đến không có vi sinh vật và không xảy ra hoạt động trao đổi chất.

Tra bang MPN dé biét két qua la 1100 MPN/g

BAI 8 SU TANG TRUONG CUA VI KHUAN

Tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật được xác định bằng sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể theo thời gian Trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ, vi khuẩn sinh sản bằng phương pháp phân đôi, tạo ra hai tế bào con có kích thước bằng nhau, do đó làm tăng gấp đôi số lượng tế bào sống trong quần thể Điều này dẫn đến mật độ tế bào tăng gấp đôi liên tục, tạo nên đường cong tăng trưởng hàm mũ đặc trưng.

Trong pha lũy thừa, tế bào phân chia theo cấp số nhân, với mỗi tế bào phân chia tạo ra hai tế bào mới, cứ như vậy gấp đôi số lượng tế bào Thời gian cần thiết để một tế bào phân chia và tăng gấp đôi quần thể được gọi là thời gian thế hệ, là chỉ số xác định tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn Thời gian thế hệ có thể được xác định bằng cách sử dụng phương trình: g = 0,693t/(Un Bt - ln B0), trong đó g là thời gian thế hệ, ln Bt và ln B0 lần lượt là logarit tự nhiên của mật độ tế bào tại thời điểm t (thời gian tăng trưởng kể từ thời điểm ban đầu) và t0 (thời điểm ban đầu).

Đường cong tăng trưởng vi khuẩn biểu hiện 4 pha đặc trưng khi được cấy vào môi trường nuôi cấy mới: pha tiềm tàng (lag phase), pha hàm mũ (log phase), pha ổn định (stationary phase) và pha suy tàn (death phase).

Trong pha tiềm tàng, tế bào chuân bị cho quá trình phân chia, DNA được tông hợp và nhiều enzym được cảm ứng tổng hợp Trong pha hàm mũ, hàm mũ của sinh khối hay mật độ tế bao sé tăng tuyến tính với thời gian Trong pha này, vi sinh vật tăng trưởng ở vận tốc cực đại ở một điều kiện nuôi cây nhất định Ở pha ổn định không có sự gia tăng mật độ của té bào do tốc độ tăng trưởng bằng với tốc độ tế bào chết đi Ở pha ôn định các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt trong khi các sản phẩm biến dưỡng ức chế tăng trưởng lại được tích lũy Sau pha ôn định quân thể tế bào vào pha suy tàn với mật độ tế bào sống giảm dần Vận tốc của pha suy tàn tý lệ với số tế bào sông theo phương trình sau: dt = In BO — In Bt trong do dt la van tốc suy tan, t la thoi gian, In BO la ham mit co số tự nhiên của số lượng tế bào ở thời điểm khởi đầu và In Bt là hàm mũ cơ số tự nhiên số tế bào sông sot dén thoi diém t

Trong điều kiện nuôi cấy vi khuẩn, nồng độ tế bào tỷ lệ thuận với độ đục của môi trường nuôi Do đó, có thể sử dụng phương pháp đo độ đục bằng máy so màu để theo dõi sự gia tăng nồng độ tế bào và dựng đồ thị đường cong tăng trưởng của vi khuẩn.

8.2 Vật liệu : - Dịch # co được nuôi I giờ và 24 g1ờ(50ml/erlen 100ml) 2 bình - Môi trường lỏng cao thit peptone (50 ml/erlen 250 ml) 4binh - Micropipet | cai

- Dau tip 1 ml vé tring 20 cai - Máy đo mật độ quang và ống đo

Sinh viên thực hành phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng và xác định thời gian thể hệ của vi khuẩn £ coli ở 370C

Bước I : Cấy Z coli vào môi trường cao thịt — pepton lỏng, ủ 24h va lh Bước 2 : Đo OD 2 éng E.coli ta duoc gia tri AO

Bước 3 : Tiếp tục ủ trong 30 phút ở 37 độ C và đo OD ghi nhận giá trị Al Bước 4 : Lập lại bước trên để thu được cái giá trị A2,A3,A4

Bước 5 : Dựa vào số liệu đã thu thập vẽ đường cong tăng trưởng 8.4 Báo cáo kết quả

Mỗi nhóm thực hiện nuôi cấy và lấy mẫu từ 2 bình nuôi Ghi chép lại số lượng vi khuẩn thu được tại từng thời điểm và dựa vào đó vẽ đường cong tăng trưởng theo thời gian Tiếp theo, tính toán thời gian thế hệ và tốc độ suy tàn của chủng vi khuẩn, sử dụng dữ liệu thời gian thế hệ ban đầu là 1 giờ và thời gian nuôi là 24 giờ.

Thời gian Gia tri do OD cua E.coli 24h va E.coli 1h và E.coli 24h E.coli lh

2 0.852 0.782 Đường cong tẳẵng trưởng của E.coli ủ 24h và 1h oD hs nộ

Ở vi khuẩn E.coli, sau 24 giờ thí nghiệm, tốc độ tăng trưởng có xu hướng ở pha ổn định, trong khi đó ở nấm M.coi, sau 1 giờ, tốc độ tăng trưởng bắt đầu tăng mạnh ở pha log, thể hiện sự tăng nhanh rõ rệt.

Thời gian thế hệ chủng E.coli là thời gian cần thiết để số lượng tế bào trong quần thể tăng gấp đôi Công thức tính thời gian thế hệ là g = 0,693t/(ln Bt - ln B0), với g là thời gian thế hệ, t là thời gian nuôi cấy, Bt và B0 lần lượt là số lượng tế bào cuối và số lượng tế bào ban đầu Trong trường hợp giống ban đầu nuôi 1 giờ, thời gian thế hệ là 2,26 giờ Trong trường hợp giống ban đầu nuôi 24 giờ, thời gian thế hệ là 24,23 giờ.

Tốc độ suy tàn của chủng E.coli trong trường hợp giống ban đầu là 1 giờ nuôi là 0,614 con/giờ (dt = In 0,423 - In 0,782 = 0,614 con/giờ) Trong khi đó, với giống ban đầu là 24 giờ nuôi, tốc độ suy tàn là 0,057 con/giờ (dt = In 0,805 - In 0,852 = 0,057 con/giờ).

BAI 9 : BIEN DUONG Ở VI SINH VAT

Các phản ứng chuyển hóa của vi sinh vật là một hệ thống phức tạp, có sự thống nhất giữa các con đường trao đổi chất Về mặt năng lượng, chúng thể hiện sự tương quan giữa năng lượng phá vỡ liên kết, năng lượng giải phóng khi hình thành liên kết và năng lượng trao đổi với môi trường, thường là nhiệt.

Do đó, trong tế bào có một số phản ứng hóa học cần cung cấp năng lượng (tổng hợp protein, acid nucleic ), trong khi các phản ứng khác lại giải phóng năng lượng (phản ứng oxi hóa các chất dinh dưỡng) Tế bào sử dụng năng lượng từ các phản ứng tạo năng lượng để thực hiện các phản ứng cần năng lượng.

Do vậy hoạt động biến dưỡng ở vi sinh vật cần được xem xét trên 2 khía cạnh: dòng năng lượng và dòng carbon đi qua té bao

Quá trình biến dưỡng chuyển năng lượng thành dạng dự trữ là ATP (Adenosine Triphosphate) Các tế bào cũng cần đến lực khử để tổng hợp vật liệu nhằm phục vụ cho bản thân Lực khử này có trong NADP (Nicotinamid Adenine Dinucleotide) hoặc NADPH (Nicotinamid Adenine Dinucleotide Phosphat), được tạo ra trong các phản ứng oxy hóa chất dinh dưỡng Năng lượng và lực khử tạo ra trong quá trình biến dưỡng được sử dụng để hỗ trợ sự tăng trưởng và sinh sản của tế bào.

Vi sinh vật sử dụng nhiều phương thức dinh dưỡng khác nhau để đáp ứng nhu cầu năng lượng, chất khử và nguyên liệu tổng hợp các đại phân tử sinh học cấu thành tế bào, chẳng hạn như protein và axit nucleic Những phương thức dinh dưỡng này bao gồm:

- Các phương thức tự dưỡng: CO: được sử dụng làm nguồn carbon Nang lượng được thu nhận từ một trong hai nguồn:

(1) Thu nhận từ ánh sáng(quang tự dưỡng) (2) Thu nhận từ sự oxi hóa các hợp chất vô cơ( hóa tự dưỡng vô cơ)

Vi sinh vật dị dưỡng có đặc điểm dinh dưỡng là sử dụng hợp chất hữu cơ vừa làm nguồn carbon vừa làm nguồn năng lượng Để thu nhận năng lượng cho hoạt động sống, vi sinh vật dị dưỡng phân giải các hợp chất hữu cơ theo một trong hai hình thức chính.

(1) Hô hấp (sử dụng chuỗi truyền điện tử hay chuỗi hô hấp):chất hữu cơ bị oxi hóa hoàn toản thành CO; và nước

(2) Lên men (không sử dụng chuỗi truyền điện tử): chất hữu cơ bị oxi hóa không hoàn toàn thành các chất biến dưỡng trung gian như cồn, acid hữu cơ

Các phản ứng trao đổi chất được xúc tác bởi các enzyme, đóng vai trò tạo ra năng lượng, lực khử và nguyên liệu cho các đại phân tử cấu trúc tế bào Có hàng nghìn enzyme khác nhau tham gia vào quá trình này, mỗi loại thực hiện một phản ứng trao đổi chất chuyên biệt.

(3) Mỗi loài vi sinh vật đều có nhiều enzyme khác nhau Chủng loại và hoạt tính của các enzyme này quyết định đặc tính sinh lý, kiêu hình của vi sinh vật Môi trường sống và mỗi tương tác với môi trường tạo áp lực chọn lọc để mỗi vi sinh vật tiễn hóa có được những enzyme cần cho sự tồn tại và tăng trưởng tốt nhất của vi sinh vật trong môi trường

Một số enzyme thường gặp ở vi sinh vật:

Catalase xuc tac phản ứng thủy phân H2O2 tạo thành nước và phóng thích oxi phân tử

Hầu hết vi sinh vật hiểu khí đều có catalase nhằm loại trừ sự tích tụ H2O2 có độc tính đối với tế bào được tạo ra trong các phản ứng oxi hóa khử trong chuỗi hô hấp Hoạt tính của catalase có thê được phát hiện bằng cách bồ sung vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc hoặc cho H2O2 lên một giọt huyền phù vi sinh vật trên phiến kính và theo dõi sự sủi bọt do ox1 phân tử được phóng thích

Gelatinase là enzyme do nhiều vi sinh vật tiết ra, có khả năng thủy phân gelatin (collagen) Quá trình thủy phân này giải phóng carbon hòa tan, có thể được sử dụng làm nguồn cacbon và năng lượng Hoạt tính thủy phân gelatin có thể được phát hiện bằng cách quan sát sự hóa lỏng của môi trường chứa gelatin Ngoài ra, thuốc thử HgCl2 cũng có thể dùng để phát hiện hoạt tính này thông qua khả năng làm tủa đục gelatin Khi vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin, sau khi thêm thuốc thử HgCl2 vào môi trường chứa gelatin, xung quanh khuẩn lạc sẽ xuất hiện vùng trong suốt Vùng phân giải càng lớn, khả năng phân giải gelatin của vi sinh vật càng mạnh.

Enzym amylase đóng vai trò xúc tác quá trình thủy phân tinh bột thành maltose, dạng đường tan dễ dàng này có thể xâm nhập tế bào và trở thành nguồn cung cấp năng lượng, carbon cho vi sinh vật Sự biểu hiện của hoạt tính phân giải tinh bột được xác định dựa trên nguyên tắc: sau khi amylase xúc tác thủy phân tinh bột, hỗn hợp phản ứng sẽ được xử lý với thuốc thử lugol Nếu phản ứng tạo thành màu xanh lam thì chứng tỏ mẫu thử chứa tinh bột Nếu phản ứng không tạo màu thì chứng tỏ tinh bột đã bị thủy phân thành maltose.

Tinh bột, một polysaccharide phức tạp, tạo thành cấu trúc mạng không gian Khi nhuộm tinh bột bằng i-ốt, i-ốt sẽ bị giữ lại trong cấu trúc này, tạo nên màu xanh đậm Tuy nhiên, khi vi khuẩn phân hủy tinh bột, cấu trúc mạng không gian bị phá vỡ, tạo ra vùng phân hủy trong suốt xung quanh khuẩn lạc Vòng phân hủy này là dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của quá trình phân giải tinh bột do vi sinh vật gây ra.

Môi trường chứa gelatn I erlen 250 m]

Để tiến hành thử nghiệm định tính tinh bột, cần chuẩn bị các vật liệu sau: môi trường chia tinh bột trong ống nghiệm Erlen 250 ml, môi trường thạch cao thịt peptone 100 ml, đĩa petri vô trùng đủ 24 cái, đèn cồn 4 cái, que cấy vòng 4 cái, thuốc thử lugol 1 lọ 150 ml, dung dịch H2O2 3% 1 lọ 100 ml và thuốc thử HgCl2 1 lọ 150 ml.

Giống Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus 9,3 Thực hành

1 Phát hiện hoạt tính catalase

- Cấy các chủng vi khuân Escherichia coli, Bacillus lên môi trường thạch cao thịt peptone

- Goi hép petri, U o nhiét dé phòng trong 24 gio

- Ghi nhận sự tang trưởng cua tung chung vi sinh vat.

Để xác định hoạt tính catalase, nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên khuẩn lạc hoặc sử dụng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn hòa với giọt nước vô trùng trên phiến kính, sau đó thêm một giọt H2O2 3% Dựa trên quan sát thấy sủi bọt (tích cực) hoặc không có sủi bọt (tiêu cực), kết luận về hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn đang nghiên cứu.

Hình 9.1: vi khuan Escherichia coli va Bacillus subtilis trong méi trwong thach cao thit peptone

Vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis khi được tiếp xúc với dung dịch H2O2 3% sẽ giải phóng enzyme catalase để phân hủy H2O2 thành nước và oxy, qua đó giải phóng khí oxy và tạo nên các bọt khí li ti trên bề mặt khuẩn lạc.

2 Phat hién hoat tinh gelatinase

- Cấy các chủng vi khuân Escherichia coli, Bacillus subtilis len méi truong chứa gelatin

- Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày

- Ghi nhận sự tăng trưởng cua tung chung vi sinh vat

- Nhéo thuéc thir HgCh 1én toan b6 bé mat thach, dé yén trong 10 — 15 phut

Quan sát và đo kích thước vòng phân giải (nếu có) ở mỗi chủng

Hình 9.3: vi khuan Escherichia coli va Bacillus subtilis trong moi trwong chira gelatin

Hình 9.4: vi khuẩn Escherichia coli va Bacillus subtilis sau khi nho HgCh lén toan bộ bề mặt thạch, đề yên trong 10 — 15 phút -Ecoli không tạo vòng phân giải

-Bacillus có tạo vòng phân giải 3 Phát hiện hoạt tính amylase

- Cấy các chủng vi khuân Escherichia coli, Bacillus subtilis len méi truong chứa tinh bột

- Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày

- Ghi nhận sự tăng trưởng cua tung chung vi sinh vat

- Nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bộ bề mặt thạch Quan sát và đo kích thước vòng phân giải (nêu có) ở môi chủng

Hình 9.5: vi khuẩn Escherichia coli va Bacillus subfilis trong môi trường chứa tỉnh bột

Hình 9.6: vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis trong môi trường chứa tỉnh bột khi nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bộ bề mặt thạch( mặt trên)

Hình 9.7: vi khuẩn Escherichia coli va Bacillus subtilis trong môi trường chứa tình bột khi nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bộ bề mặt thạch( mặt dưới)

-vi khuẩn Ecoli bị nhuộm mau

ELISA)

Bài 10 ĐỊNH DANH VỊ KHUAN

Phân loại(taxonomy) vi sinh vật bao gồm:

(1) Xếp nhúm(classiủcation) là sự sắp xếp vi sinh vật thành cỏc nhúm dựa vào mối quan hệ giữa vị sinh vật

(2) Đặt tên(nomenclature): là việc đặt cho các đơn vị trong hệ thông xếp nhóm

(3) Định danh(identiication): là việc áp dụng hệ thống xếp nhóm và đặt tên nêu trên để xác định vị trí và tên gọi của một vi sinh vật hoặc một loài, chủng vi sinh vật mới

Vi khuẩn là các vi sinh vật tiền nhân bao gồm 3 nhóm lớn:

(1) Archaebacteria(vi khuân cổ) (2) Cyanobacteria(vi khuân lam) (3) Eubacteria(vi khuẩn thật)

Việc phân loại vi khuẩn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái như hình dạng, cách sắp xếp tế bào, gram, tiên mao và các đặc điểm sinh lý như phương thức biến dưỡng, phương thức lên men các cơ chất đường, phạm vi nhiệt độ cho phép tăng trưởng, quan hệ với oxI,

Phương pháp định danh cỗ điển thường sử dụng hệ thống khóa hai lựa chon(dichotomous key) bao gồm một loạt các câu hỏi đúng”có” hoặc sai không” đối với các đặc điểm hình thái và sinh lý của chủng vi sinh vật cần định danh Các câu hỏi này được sắp xếp theo thứ tự thành sơ đồ phân nhánh đôi Tập hợp các câu trả lời cuối nhánh sẽ giúp cho việc xác định vị trí và tên loài của v1 sinh vật đang quan tâm

Sơ đồ bai lựa chọn được dùng trong định danh vi sinh vật

Việc định danh vi khuẩn thường dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn trong khóa phân loại của Bergey (Bergey’s manual of determinative bacteriology)

Vi khuẩn acetic là vi khuẩn hiếu khí, sử dụng oxy làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp để tạo năng lượng Chúng thuộc họ Acetobacteraceae với hai chi chính là Acetobacter và Gluconobacter Theo hệ thống phân loại của Bergey, hai chi này có các đặc điểm chính như sau:

Té bao hinh elip đến hình que, thăng hoặc cong mảnh, có kích thước 0.6 — 0.8 x 1-4

- Di động do chu mao hoặc không di động

Không hình thành bảo tử, gram âm(một vài trường hợp, gram biến đối)

Nhiệt độ tối thích: 25 — 30°C: pH tối thích 5.4 — 6.3 - Có khả năng oxi hóa etanol đến acid acetic ở pH 4.5

Không có oxIdase, không sinh 1ndol, không làm tan chảy gelatin, không có khả năng phân giai dextrin

Co kha nang oxy hoa acid acetic va lactate thanh CO2

Hiện diện trong hoa, quả, mật ong, rượu nho, rượu táo, bia, giám "

Tế bảo hình elip đến hình que, có kích thước 0.5 — 0.8 x 0.9 — 4.2Lm

Di động, có 3 — 8 tiên mao ở cực hoặc không di động

Nhiệt độ tối thích 25 - 30°C, không phát triển ở 37°C; pH tối thích 5.6 — 6.0, hầu hết các chủng sinh trưởng được ở pH 3.6

Có kha nang oxi hoa etanol thanh acid acetic 6 pH 4.5 Không có Oxidase, không có gelatinase, không sinh Immdol, không phân giải dextrm

- Không có khả năng oxy hóa acid acetie và lactate thành CO¿

Hiện diện ở táo, lê, giầm, hông, dứa

Hai chủng vi khuẩn có đặc điểm chung là không có hoạt tính gelatinase, không sinh mdol, có khả năng oxy hóa etanol thành axit axetic ở độ pH trung tính hoặc môi trường axit (pH 4,5) Sự khác biệt giữa hai chủng này dựa trên khả năng oxy hóa acetate hoặc lactate tạo ra CO2 và cấu trúc tiên mao.

Môi trường ctanol — cao nâm men 250 mẽ Mụi trường chứa gelatin 250 ml

Môi trường chứa dextmn MGi truong Calcium lactate Môi trường nước frypton MG@i truong sodium acetate Đèn cồn

Thuốc thử kovac’s Thuốc thử lugol

100 ml trong erlen 100 ml trong erlen

100 ml trong erlen 250 ml 100 ml trong erlen 250 ml 8 ống(5m/ống)

8 éng (Sm/éng) 4 cai 4 cai 32 cái

Cac ching vi khuan sinh acid acetic duoc phan lap san

11 Báo cáo 1 Xác định kha nang sinh acid acetic

Hình 10.1 Cao nam men trước khi ủ Hình 10.2: Cao nắm men sau khi ủ 3 ngày

2 Khả năng phân giải gelafin

Hình 10.3 : môi trường gelatin sau khi ú và có thuộc thử HC];

3 Khả năng phân giải dextrin

Hình 10.4: môi trường dextrin trước Hình 10.4: môi trường dextrin sau khi ủ khi ủ và có mặt thuộc thử lugol

Hình 10.5 : môi trường Hình 10.6 : môi trường Tryptone sau

Tryptone trước khi ủ khi ú và có thuộc thử Kovac?s

(-): có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường

Có sự xuất hiện mau cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của indol tạo ra

5 Kha nang oxi héa acetate

| ⁄ h 10.7 : môi trườò i As yy : Hin môi trường sodium acetate Hinh 10.8: môi trường sodium acetate trước khi u sau khi ủ và có chỉ thị Bromothymol blue

Su oxi héa acetate duoc phát hiện nhờ sự déi mau cua chat chi thi Bromothymol blue từ vàng xanh thành xanh dương

6 Khả năng biến dưỡng lactate

Hình 10.9: môi trường calcium lactate Hinh 10.10: m6i trwong calcium lactate sau khi ủ - trước khi ủ