Seminar thí nghiệm vi sinh baì 1 những dụng cụ, thiết bị cơ bản và môi trường nuôi cấy vi sinh vật

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG SEMINAR THÍ NGHIỆM VI SINH NHÓM 8-4 Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Phạm Minh Tân 1/ Nguyễn Ngọc Khánh Nghi - 62101147 2/ Dương Minh Châu - 62101089 3/ Huỳnh Gia Tuệ - 62101207 4/ Nguyễn Thị Cẩm Vy 6210055 5/ Nguyễn Thị Thanh Vy 62100555 Khóa :25 TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 04 NĂM 2023 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG SEMINAR THÍ NGHIỆM VI SINH NHÓM 8-4 Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Phạm Minh Tân 1/ Nguyễn Ngọc Khánh Nghi - 62101147 2/ Dương Minh Châu - 62101089 3/ Huỳnh Gia Tuệ - 62101207 4/ Nguyễn Thị Cẩm Vy 6210055 5/ Nguyễn Thị Thanh Vy 62100555 Khóa :25 TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 04 NĂM 2023 i CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng nhóm tơi hướng dẫn khoa học thầy Phạm Đình Chương Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận nhóm tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung báo cáo Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền gây q trình thực (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Tác giả ii LỜI MỞ ĐẦU iii LỜI CẢM ƠN Trước tiên với tình cảm sâu sắc chân thành nhất, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn đến tất cá nhân tổ chức tạo điều kiện hỗ trợ, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trường đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Phạm Minh Tân Khoa Khoa học Ứng dụng truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trường Nhờ có lời hướng dẫn, dạy bao thầy cô nên đề tài nghiên cứu em hoàn thiện tốt đẹp Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy – người trực tiếp giúp đỡ, quan tâm, hướng dẫn em hoàn thành tốt báo cáo thời gian qua Bài báo cáo thực tập thực khoảng thời gian gần tuần Bước đầu vào thực tế em hạn chế cịn nhiều bã ngỡ khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ để kiến thức em lĩnh vực hồn thiện đồng thời có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức Em xin chân thành cảm ơn! iv MỤC LỤC Nội dun g LỜI MỞ ĐẦU LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC .4 DANH MỤC HÌNH ẢNH .13 Bài 1: NHỮNG DỤNG CỤ, THIẾT BỊ CƠ BẢN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 15 1.1 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật 15 1.2 Thực hành 16 1.3 Kết 25 Bài 2: NUÔI CẤY VI SINH VẬT 26 2.1 Định nghĩa 26 2.3 Điều kiện thực 26 2.4 Phương pháp cấy 27 2.5 Mối quan hệ vi khuẩn với oxi 28 2.6 Vật liệu: .29 2.7 Thực hành 30 2.8 Báo cáo 32 Bài QUAN SÁT NẤM MỐC 41 3.1 Sơ lược nấm mốc 41 3.2 Báo cáo 43 BÀI : QUAN SÁT NẤM MEN 46 4.1 v Sơ lược nấm men 46 4.2 Thực hành 47 BÀI : QUAN SÁT VI KHUẨN 54 5.1 Sơ lược vi khuẩn 54 5.2 Vật liệu 54 5.3 Quan sát vi khuẩn sống 55 BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT 63 6.1 Nội dung thực hành 63 6.2 Vật liệu 63 6.3 Thực hành 64 6.4 Kết 65 BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 69 7.1 Nguyên tắc 69 7.2 Vật liệu 70 7.3 Thực hành .71 7.4 Báo cáo 74 BÀI SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN 78 8.1 Khái niệm .78 8.2 Vật liệu : .79 8.3 Thực hành .79 8.4 Báo cáo kết 80 BÀI : BIẾN DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 82 9.1 Khái niệm 82 9.2 Vật liệu 84 9.3 Thực hành 84 9.4 Bài 10 vi Kết luận .90 ĐỊNH DANH VI KHUẨN 92 10.1 Khái niệm 92 10.2 Vi khuẩn acetic 93 10.3 Vật liệu 94 10.4 Báo cáo 95 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Nội dung BAÌ 1: NHỮNG DỤNG CỤ, THIẾT BỊ CƠ BẢN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT .12 Hình 1.1 : Đầu tip trước vô trùng .13 Hình 1.2 Môi trường cao thịt - pepton lỏng ống nghiệm .15 Hình 1.3 Môi trường thạch - cao thịt - pepton ống nghiệm chuẩn bị hấp khử trùng .16 Hình 1.4 Mơi trường thạch - cao thịt - pepton erlen 17 Hình 1.5 Mơi trường thạch - cao thịt - pepton đĩa petri đông 18 Hình 1.6 Mơi trường Hansen thạch ống nghiệm trước khử trùng 19 Hình 1.7 Mơi trường Hansen lỏng ống nghiệm 20 Hình 1.8 Mơi trường PGA trước đem hấp khử trùng 22 BÀI 2: NUÔI CẤY VI SINH VẬT 23 Hình 2.2 Bacillus cấy vào môi trường cao thịt - pepton lỏng sau 24h 34 Hình 2.1 E.coli cấy vào môi trường cao thịt - pepton lỏng sau 24h .34 Hình 2.5 Bacillus cấy vào môi trường cao thịt - pepton đứng sau 24h 35 Hình 2.4 Bacillus cấy vào môi trường cao thịt - pepton nghiêng sau 24h 35 Hình 2.3 E.coli cấy vào môi trường cao thịt - pepton đứng nghiêng sau 24h 35 Hình 2.6 E.coli cấy vào môi trường cao thịt - pepton đĩa sau 24h 36 Hình 2.7 Bacillus cấy vào môi trường cao thịt - pepton đĩa sau 24h 36 Hình 2.8 Nấm mốc cấy vào môi trường thạch PGA nghiêng sau 24h 36 Hình 2.9 Nấm men cấy vào môi trường thạch Hansen nghiêng sau 24h 37 BÀI QUAN SÁT NẤM MỐC 38 Hình 3.1: Penicillium vật kính 40X 41 Hình 3.3 : Aspergillus vật kính 40X 42 Hình 3.2: Aspergillus vật kính 10X 42 BÀI : QUAN SÁT NẤM MEN 43 Hình 4.1 Tế bào nhuộm màu hồng bào tử nhuộm màu xanh nhờ thuốc nhuộm .48 Hình 4.2 Tế bào Saccharomyces cerevisiae 49 BÀI : QUAN SÁT VI KHUẨN 51 Hình 5.2 : Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 53 Hình 5.1 : Tế bào vi khuẩn E.coli 53 Hình 5.4 : B.subtilis nhuộm đơn 54 Hình 5.3 : E.coli nhuộm đơn 54 viii Hình 5.5 : E.coli nhuộm gram .56 Hình 5.6 : B.subtilis nhuộm gram 56 Hình 5.7 : B.subtilis nhuộm bào tử .58 Hình 5.8 : E.coli nhuộm bào tử .58 BÀI PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT .60 Hình 4.1 Mơi trường Czapek - Dox sau 24 63 Hình 4.2 Môi trường thạch cao thịt - pepton sau 24 63 Hình 4.4 Mơi trường Hansen sau 24 64 Hình 4.3 Mơi trường CaCO3 sau 24 64 Hình 4.5 Mơi trường Ashby sau 24 65 BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 66 Hình 7.3 Petri pha loãng 0,6x10-5 71 Hình 7.2 Petri pha loãng 0,4x10-5 71 Hình 7.1 Petri pha loãng 0,2x10-5 71 Hình 7.4 Mơi trường LSB trước ủ 73 Hình 7.5: ống môi trường LSB sau ủ 37℃ 48 .73 Hình 7.6 ống môi trường BGBL trước ủ .74 Hình 7.6: ống môi trường BGBL sau ủ 37℃ 48 74 BÀI : SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN .75 BÀI : BIẾN DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 79 Hình 9.1: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường thạch cao thịt peptone .82 Hình 9.2: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis sủi bọt nhỏ giọt dung dịch H2O2 3% lên huyền phù vi khuẩn môi trường thạch cao thịt peptone ( có hoạt tính catalase) 83 Hình 9.3: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa gelatin 84 Hình 9.4: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis sau nhỏ HgCl2 lên toàn bề mặt thạch, để yên 10 – 15 phút 85 Hình 9.5: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột 86 Hình 9.6: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bề mặt thạch( mặt trên) 86 Hình 9.7: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bề mặt thạch( mặt dưới) 87 Bài 10 : ĐỊNH DANH VI KHUẨN .89 Hình 10.2: Cao nấm men sau ủ ngày 92 Hình 10.1 Cao nấm men trước ủ .92 Hình 10.3 : mơi trường gelatin sau ủ có thuốc thử HgCl2 92 Hình 10.4: mơi trường dextrin sau ủ có mặt thuốc thử lugol 93 79 - Thử hoạt tính catalase cách nhỏ giọt dung dịch H 2O2 3% lên khuẩn lạc dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn hòa với giọt nước vơ trùng phiến kính cho giọt H2O2 3% Dựa vào tượng có sủi bọt(+) khơng(-) kết luận hoạt tính catalase chủng Hình 9.1: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường thạch cao thịt peptone 80 Hình 9.2: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis sủi bọt nhỏ giọt dung dịch H2O2 3% lên huyền phù vi khuẩn môi trường thạch cao thịt peptone ( có hoạt tính catalase) 81 - Phát hoạt tính gelatinase Cấy chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis lên mơi trường chứa gelatin - Gói hộp petri, ủ nhiệt độ phòng ngày - Ghi nhận tăng trưởng chủng vi sinh vật - Nhỏ thuốc thử HgCl2 lên toàn bề mặt thạch, để yên 10 – 15 phút Quan sát đo kích thước vịng phân giải (nếu có) chủng Hình 9.3: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis mơi trường chứa gelatin 82 Hình 9.4: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis sau nhỏ HgCl2 lên toàn bề mặt thạch, để yên 10 – 15 phút -Ecoli khơng tạo vịng phân giải -Bacillus có tạo vịng phân giải Phát hoạt tính amylase - Cấy chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis lên môi trường chứa tinh bột - Gói hộp petri, ủ nhiệt độ phịng ngày - Ghi nhận tăng trưởng chủng vi sinh vật - Nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bề mặt thạch Quan sát đo kích thước vịng phân giải (nếu có) chủng 83 Hình 9.5: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột Hình 9.6: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bề mặt thạch( mặt trên) 84 Hình 9.7: vi khuẩn Escherichia coli Bacillus subtilis môi trường chứa tinh bột nhỏ thuốc thử lugol lên toàn bề mặt thạch( mặt dưới) -vi khuẩn Ecoli bị nhuộm màu -Vi khuẩn Bacillus khơng bị nhuộm màu thuốc thử có hoạt tính phân giải tinh bột 9.4 Kết luận Tóm tắt nguyên tắc cách xác định hoạt tính enzym Hoạt tính enzyme xác định nhiều phương pháp khác nhau, ba số catalase, gelatinase amylase Catalase loại enzyme phân hủy hydro peroxide thành nước oxy Hoạt tính catalase đo cách thêm hydro peroxide vào mẫu có chứa enzyme đo tốc độ sản xuất oxy máy đo quang phổ Tốc độ tạo oxy cao hoạt tính catalase mẫu cao Gelatinase loại enzyme thủy phân gelatin, loại protein tìm thấy 85 mơ động vật Hoạt tính gelatinase xác định cách thêm môi trường chứa gelatin vào mẫu có chứa enzyme quan sát phân hủy gelatin Mức độ thủy phân gelatin định lượng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn đo độ đục, điện di xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) Amylase loại enzyme phân hủy tinh bột thành glucose Hoạt tính amylase xác định cách thêm môi trường chứa tinh bột vào mẫu có chứa enzyme đo tốc độ sản xuất glucose xét nghiệm glucose Tốc độ tạo glucose cao hoạt tính amylase mẫu cao Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ chất, nồng độ enzyme có mặt chất ức chế chất kích hoạt Do đó, điều quan trọng phải kiểm soát yếu tố thực xét nghiệm hoạt động enzyme để thu kết xác tái sản xuất Kết kết luận hoạt tính amylase, gelatinase catalase chủng Escherichia coli loại vi khuẩn gram âm tạo catalase không tạo gelatinase amylase Vi khuẩn thường sử dụng sinh vật mẫu nghiên cứu vi sinh di truyền Bacillus subtilis loại vi khuẩn gram dương tạo catalase, amylase gelatinase Hoạt động catalase Bacillus subtilis quan trọng tồn mơi trường giàu oxy, việc sản xuất amylase gelatinase cho phép vi khuẩn phân hủy tinh bột gelatin để lấy dinh dưỡng 86 10.1 Khái niệm Bài 10 ĐỊNH DANH VI KHUẨN Phân loại(taxonomy) vi sinh vật bao gồm: (1) Xếp nhóm(classification) xếp vi sinh vật thành nhóm dựa vào mối quan hệ vi sinh vật (2) Đặt tên(nomenclature): việc đặt cho đơn vị hệ thống xếp nhóm (3) Định danh(identification): việc áp dụng hệ thống xếp nhóm đặt tên nêu để xác định vị trí tên gọi vi sinh vật loài, chủng vi sinh vật Vi khuẩn vi sinh vật tiền nhân bao gồm nhóm lớn: (1) Archaebacteria(vi khuẩn cổ) (2) Cyanobacteria(vi khuẩn lam) (3) Eubacteria(vi khuẩn thật) Việc phân loại vi khuẩn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái hình dạng, cách xếp tế bào, gram, tiên mao…và đặc điểm sinh lý phương thức biến dưỡng, phương thức lên men chất đường, phạm vi nhiệt độ cho phép tăng trưởng, quan hệ với oxi,… Phương pháp định danh cổ điển thường sử dụng hệ thống khóa hai lựa chọn(dichotomous key) bao gồm loạt câu hỏi đúng”có” sai”khơng” đặc điểm hình thái sinh lý chủng vi sinh vật cần định danh Các câu hỏi xếp theo thứ tự thành sơ đồ phân nhánh đôi Tập hợp câu trả lời cuối nhánh giúp cho việc xác định vị trí tên lồi vi sinh vật quan tâm Chủng cần định danh - + - + - K j i h + - g f + e a c b Sơ đồ hai lựa chọn dùng định danh vi sinh vật 87 Việc định danh vi khuẩn thường dựa đặc điểm hình thái sinh lý vi khuẩn khóa phân loại Bergey (Bergey’s manual of determinative bacteriology) 10.2 Vi khuẩn acetic Vi khuẩn acetic thuộc nhóm hiếu khí, thu lượng nhờ q trình hơ hấp với oxi chất nhận điện tử sau cùng, xếp chung vào họ Acetobacteriaceae gồm giống Acetobacter Gluconobacter Theo khóa phân loại Bergey, hai giống Acetobacter Gluconobacter có đặc điểm sau: + Giống Acetobacter - Tế bào hình elip đến hình que, thẳng cong mảnh, có kích thước 0.6 – 0.8 x – m - Di động chu mao không di động - Khơng hình thành bào tử, gram âm(một vài trường hợp, gram biến đổi) - Nhiệt độ tối thích: 25 – 300C; pH tối thích 5.4 – 6.3 - Có khả oxi hóa etanol đến acid acetic pH 4.5 - Khơng có oxidase, khơng sinh indol, khơng làm tan chảy gelatin, khơng có khả phân giải dextrin - Có khả oxy hóa acid acetic lactate thành CO2 - Hiện diện hoa, quả, mật ong, rượu nho, rượu táo, bia, giấm… + Giống Gluconobacter - Tế bào hình elip đến hình que, có kích thước 0.5 – 0.8 x 0.9 – 4.2m - Di động, có – tiên mao cực khơng di động - Nhiệt độ tối thích 25 - 300C, khơng phát triển 370C; pH tối thích 5.6 – 6.0, hầu hết chủng sinh trưởng pH 3.6 - Có khả oxi hóa etanol thành acid acetic pH 4.5 - Khơng có Oxidase, khơng có gelatinase, khơng sinh indol, khơng phân giải dextrin - Khơng có khả oxy hóa acid acetic lactate thành CO2 - Hiện diện táo, lê, giấm, hồng, dứa… 88 Như hai giống có đặc tính chung như: khơng có hoạt tính gelatinase, khơng sinh indol, oxi hóa etanol thành acid acetic pH trung tính mơi trường acid(pH 4.5) Hai giống phân biệt dựa vào khả oxi hóa acetate lactate tạo CO2 nước cấu tạo tiên mao 10.3 Vật liệu Môi trường etanol – cao nấm men 100 ml erlen 250 ml Môi trường chứa gelatin 100 ml erlen 250 ml Môi trường chứa dextrin 100 ml erlen 250 ml Môi trường Calcium lactate 100 ml erlen 250 ml Môi trường nước trypton ống(5m/ống) Môi trường sodium acetate ống (5m/ống) Đèn cồn Que cấy vòng Petri vô trùng 32 Thuốc thử kovac’s Thuốc thử lugol Thuốc thử HgCl2 Các chủng vi khuẩn sinh acid acetic phân lập sẵn 89 11 Báo cáo Xác định khả sinh acid acetic Hình 10.1 Cao nấm men trước ủ Khả Hình 10.2: Cao nấm men sau ủ ngày phân giải Hình 10.3 : mơi trường gelatin sau ủ có thuốc thử HgCl2 gelatin Khả phân giải dextrin Hình 10.4: mơi trường dextrin trước ủ 90 Hình 10.4: mơi trường dextrin sau ủ có mặt thuốc thử lugol Khả sinh indol Hình 10.5 : mơi trường Tryptone trước ủ (-): có lớp màu vàng thuốc thử bề mặt môi trường Hình 10.6 : mơi trường Tryptone sau ủ có thuốc thử Kovac’s Có xuất màu cam Skatol tiền chất Methyl hóa indol tạo Khả oxi hóa acetate Hình 10.7 : môi trường sodium acetate trước ủ 91 Hình 10.8: mơi trường sodium acetate sau ủ có thị Bromothymol blue Sự oxi hóa acetate phát nhờ đổi màu chất thị Bromothymol blue từ vàng xanh thành xanh dương Khả biến dưỡng lactate Hình 10.9: mơi trường calcium lactate trước ủ 10.4 Kết luận Hình 10.10: mơi trường calcium lactate sau ủ Chủng vi khuẩn khảo sát khơng phải vi khuẩn sinh acid acetic Vì không thuộc giống Acetobacter Gluconobac 92 93