TỔNG QUAN
Hợp chất bán tổng hợp có tác dụng kháng vi sinh vật
1.1.1 Đại cương về hợp chất bán tổng hợp
Bán tổng hợp là phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng sản phẩm tự nhiên làm nguyên liệu để tạo ra các hợp chất mới.Với nguyên liệu ban đầu là các hợp chất tự nhiên, thông qua quá trình biến đổi hóa học để tạo ra các phân tử có cấu trúc và đặc tính mong muốn [18] Hướng đi này đã được khai phá sâu rộng hơn trong những thập kỉ gần đây bởi triển vọng đầy hứa hẹn của chúng trong ứng dụng hóa dược, sinh học phân tử và khoa học dược phẩm Từ năm 1940 đến năm 2019, có 363 thuốc có nguồn gốc tự nhiên được phê duyệt, trong đó 286 hợp chất là sản phẩm bán tổng hợp từ tự nhiên Nhóm các hợp chất này tập trung vào các thuốc kháng vi sinh vật và chống ung thư với 54% các thuốc kháng khuẩn được cấp phép là các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, con số này đối với thuốc chống ký sinh trùng là 45% và chống ung thư là 25% [42] Có thể thấy các hợp chất tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong dược phẩm và vẫn là những lựa chọn tiềm năng, lý tưởng để phát triển thuốc mới, đặc biệt là thuốc kháng khuẩn.
Với số lượng phong phú, đa dạng với nhiều cách sắp xếp cấu trúc các nhóm chức khác nhau, số lượng trung tâm lập thể nhiều, tỷ lệ dị nguyên tử khác nhau, khung cấu trúc vòng lõi đa dạng, có khả năng ứng dụng cao trong thiết kế và bán tổng hợp chất tương tự với đặc tính dược lý và hoạt tính sinh học đáng chú ý [45]. Aspirin nguyên chất bán tổng hợp đầu tiên, dựa trên một hợp chất tự nhiên salicin được phân lập từ Salix alba, được Bayer công bố vào năm 1899 Trong những thập kỷ gần đây, nhiều thuốc bán tổng hợp từ nguyên liệu tự nhiên cũng được nghiên cứu và ứng dụng: nitisinone có nguồn gốc từ sản phẩm tự nhiên leptospermone (Callistemon citrinus) được sử dụng trong điều trị bệnh chống huyết khối, apomorphine là một hợp chất bán tổng hợp có nguồn gốc từ morphine (Papaver somniferum) được sử dụng trong bệnh Parkinson [64].
Không thể phủ nhận vai trò của tổng hợp hữu cơ trong nghiên cứu phát triển thuốc Hóa học tổ hợp được chứng minh là khá thành công trong nhiều lĩnh vực khác nhau, tuy nhiên, đối với kháng sinh, các chiến dịch sàng lọc rất lớn nhằm vào hàng chục mục tiêu đã không mang lại kết quả khả quan [42] Bên cạnh đó, các hợp chất hầu hết các nguyên liệu ban đầu được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ đều có nguồn gốc từ dầu mỏ, các nguyên liệu không thể tái tạo, độc hại, dễ cháy, tiềm ẩn rủi ro cho sức khỏe con người và môi trường Để hạn chế sử dụng các nguồn tài nguyên thiên nhiên không thể tái tạo nhiều nhóm nghiên cứu về tổng hợp hữu cơ đã phải đối mặt với vấn đề tìm kiếm các giải pháp thay thế tự nhiên, dựa trên các nguồn sinh khối thay cho các nguồn thu được từ dầu mỏ Một trong những hướng nghiên cứu phổ biến hiện nay, tiềm năng ứng dụng tinh dầu và các dẫn xuất của chúng được chú ý như là nguyên liệu ban đầu cho các hóa chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng virus và chống ung thư [11, 36, 57].
Các thành phần dễ bay hơi của tinh dầu (như linalool, eugenol, limonen…) về cơ bản là các dẫn xuất terpen và phenolic có trọng lượng phân tử thấp, đồng thời sự có mặt của các liên kết không bão hòa, các nhóm chức (cacbonyl, hydroxyl, epoxid…) và cấu trúc đa dạng làm cho tinh dầu trở thành những nguyên liệu ban đầu tiềm năng để dẫn xuất hóa từ đó thu được các hợp chất kháng vi sinh vật bán tổng hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, y học, chất bảo quản thực phẩm [40].
1.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật
Từ lâu, hoạt tính kháng vi sinh vật các chất từ thực vật đã được biết đến và chứng minh qua các nghiên cứu Một số hợp chất quan trọng có thực vật thể hiện nhiều hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như tanin, eugenol, piperin…[37] Các hợp chất bán tổng hợp từ tinh dầu cũng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật tốt và có thể vượt trội hơn chất gốc Một số hợp chất bán tổng hợp từ flavonoid, citral, oleanolic đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn tốt:
Karim Chouạb và cộng sự (2015) đã tổng hợp dẫn xuất ester của oleanolic acid. Hoạt tính kháng khuẩn của dãy các dẫn xuất được đánh giá bằng kỹ thuật khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy tác dụng chống lại 9 chủng vi sinh vật gây bệnh khác nhau ở người (05 chủng nấm men, 02 chủng vi khuẩn Gram (-) và 02 chủng vi khuẩn Gram (+)) Tất cả các dẫn chất bán tổng hợp trong thử nghiệm đều bước đầu cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật, trong đó dẫn xuất (2a,3b)-2,3-Bis(pivaloyloxy)olean-12-en- 28-oic acid có hoạt tính mạnh nhất [14].
Goldbeck và cộng sự (2014) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 3-(p- chlorophenyl) thio citronellal tổng hợp từ citral Kết quả chỉ ra rằng hợp chất 3-(p- chlorophenyk) thio citronellal là một chất kháng khuẩn mạnh và hiệu quả chống lại vi khuẩn gram (+) S typhimurium, S aureus, L monocytogenes, S dysenteriae, E coli và P fluorescens Kết quả cũng cho thấy tế bào vi sinh vật chết nhanh hơn khi được xử lý bằng chất tổng hợp 3-(p-chlorophenyl) thio citronellal [22].
Gontijo và cộng sự (2012) đã phân lập bioflavonoid tự nhiên morelloflavone từ bioflavonoid theo ba dãy phản ứng khác nhau Ba dẫn chất này thể hiện các hoạt tính diệtLeishmanicidal amazonensi, chống phân giải protein và chống oxy hóa cũng như độc tính tế bào thấp Ba dẫn xuất bán tổng hợp thể hiện hoạt tính diệt L. amazonensichống lại các chất kích thích củaL amazonensis cao hơn khi so sánh với hợp chất tự nhiên gốc, trong khi các hợp chất gốc lại cho thấy đặc tính chống oxy hóa cao hơn [23].
1.1.3 Hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần của thực vật.
Các xét nghiệm đánh giá kháng kháng sinh ban đầu được phát triển để kiểm tra tính kháng của vi sinh vật tự do [44] Trên thực tế, vi khuẩn không chỉ tồn tại ở dạng phù du mà có thể tồn tại dưới nhiều kiểu hình, quần thể phức tạp Đặc biệt, biofilm là một mô hình thường gặp, có vai trò trong lây truyền và hình thành các chủng kháng của vi khuẩn gây bệnh Trên thực tế có 65-80 % các trường hợp nhiễm vi khuẩn ở các nước phát triển có liên quan đến biofilm [46] Vậy nên, để đánh giá sâu hơn về hoạt tính kháng khuẩn, bên cạnh nghiên cứu hoạt tính của hợp chất trên vi sinh vật tự do, khảo sát trên các mô hình biofilm cũng được quan tâm, nghiên cứu.
Biofilm là cộng đồng vi sinh vật nằm trong chất nền ngoại bào gồm các hợp chất cao phân tử ngoại bào: polysaccharid, AND ngoại bào và protein, lipid Những chất cao phân tử này được sắp xếp như một ma trận và được đánh giá là có khả năng bảo vệ vi khuẩn khỏi các tác nhân của môi trường như nhiệt, ẩm, miễn dịch của vật chủ cũng như các chất diệt khuẩn [19] Vi khuẩn trong biofilm có sức đề kháng với điều kiện ngoại cảnh cao hơn so với vi khuẩn ở dạng tự do Các vi khuẩn trong biofilm kém đáp ứng với kháng sinh được cho là liên quan chủ yếu đến hiệu ứng cản trở của chất nền ngoại bào biofilm, điều này giảm khả năng tiếp xúc của thuốc với các VSV trong biofilm [46].
Tụ cầu vàngStaphyococcus aureus là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng mắc phải tại cộng đồng, đồng thời là gánh nặng đáng kể cho hệ thống chăm sóc sức khỏe Tụ cầu vàng có khả năng sinh biofilm trên các bề mặt sinh học và bề mặt nhân tạo Điều này đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại dai dẳng của các bệnh nhiễm trùng mạn tính cũng như kháng kháng sinh [8, 43] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng biofilm của tụ cầu vàng có thể phát triển tốt trong bề mặt các thiệt bị y tế như van tim nhân tạo, ống thông, khớp giả,…gây nên các tình trạng nhiễm khuẩn mạn tính và tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm trong bệnh viện [48].
Tương tự như như các biofilm khác, biofilmStaphylococcus aureuscũng có hai thành phần riêng biệt là nước (khoảng 97%) và chất hữu cơ bao gồm các hợp chất cao phân tử và vi khuẩn Các hợp chất cao phân tử chiếm khoảng 50 đến 90% tổng chất hữu cơ của biofilm và 10–25% bao gồm các vi khuẩn [30] Thành phần polysaccharid do VSV tổng hợp ra có liên quan trực tiếp đến sự hình thành chất nền của biofilm Thành phần chính của polysaccarid này là polysaccharid bám dính tế bào, là trung gian kết dính giữa các tế bào vi khuẩn và liên quan đến khả năng bám dính của vi khuẩn với các bề mặt [8].
Các thành phần protein và AND ngoại bào có nguồn gốc từ sự tự ly giải của VSV chết trong biofilm Trong số các protein bề mặt liên quan đến sự hình thành biofilm của S.aureus, quan trọng nhất là protein SasG và Bap, 2 enzym tương ứng liên quan đến khả năng tự trùng hợp và hình thành các sợi kết nối giữa các vi sinh vật; cũng như quá trình lắp ráp biofilm [60] Ngoài ra, đặc tính dính cao của AND ngoại bào thúc đẩy sự tương tác giữa AND ngoại bào và các phân tử bề mặt khác và góp phần hình thành chất nền biofilm [53].
1.1.3.2 Sự giảm đáp ứng của vi sinh vật trong biofilm đối với các yếu tố bên ngoài
Khả năng chống chịu với kháng sinh của vi khuẩn trong biofilm có thể đạt được thông qua các cơ chế liên quan đến một số yếu tố sau.
Sự giảm khuếch tán của kháng sinh qua biofilm: Các dữ liệu thực nghiệm về sự khuếch tán một số kháng sinh qua các loại màng biofilm hầu hết đều cho thấy sự xâm nhập của kháng sinh vào quần thể vi sinh vật giảm [39] Sự giảm khuếch tán của kháng sinh trong chất nền ngoại bào biofilm đã được chứng minh là có thể góp phần vào khả năng chống chịu của vi khuẩn trong biofilm với kháng sinh Các chất nền ngoại bào biofilm được thiết lập như những cái bẫy để bắt và vô hiệu hóa kháng sinh Các polysaccarid cô lập kháng sinh, enzym trong biofilm cụ thể là β-lactamase được tiết ra, có thể làm suy giảm hoạt tính kháng sinh và AND ngoại bào làm tăng khả năng chống chịu và kháng thuốc của biofilm [25, 39] Chính điều kiện giảm khuếch tán này sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn tiếp xúc với một lượng nhỏ kháng sinh không đủ để tiêu diệt mà có thể vô tình trở thành yếu tố nguy cơ cho các kiểu hình kháng kháng sinh.
Môi trường thay đổi có thể dẫn đến sự hiện diện của các vi khuẩn dai dẳng:Môi trường khắc nghiệt trong biofilm (nồng độ oxy, độ pH giảm, nhiệt độ cao, thiếu chất dinh dưỡng, mật độ vi sinh vật cao), thúc đẩy các vi khuẩn chuyển sang các kiểu hình giảm đáp ứng với kháng sinh Các vi sinh vật trong biofilm có xu hướng chuyển sang kiểu hình “dai dẳng” hoặc “dung nạp”, đặc trưng cho một phần hoặc tất cả quần thể vi khuẩn không đáp ứng với điều trị bằng kháng sinh Đây chính là hai kiểu hình tiền đề cho sự hình thành kiểu hình “kháng kháng sinh” [39, 53].
1.1.3.3 Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
Eugenol và các sản phẩm chuyển hóa của nó có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là ứng dụng trong hương liệu, y dược và cũng là nguyên liệu ban đầu để tổng hợp một số chất Eugenol là thành phần đầu tiên của tinh dầu đã được chứng minh có hoạt tính sát trùng và giảm đau trong nha khoa, mà ngày nay vẫn được ứng dụng Các hoạt tính sinh học phong phú của eugenol đang được khai phá và chứng minh qua rất nhiều nghiên cứu trong những thập kỉ gần đây.
1.2.1 Đặc điểm và hoạt tính sinh học của eugenol
Eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol, C10H12O2) là một phenylpropanoid lần đầu phân lập vào năm 1929 Đây là một hợp chất tự nhiên được tìm thấy ở một số họ thực vật bao gồm họ Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae và Myristicaceae, và là thành phần quan trọng của tinh dầu đinh hương (Syzygium aromaticum) (82,4%) [34], tinh dầu trầu không (Piper betle) (77,24%)[1], hương nhu trắng (Ocimum gratissimum) (54,42%) [9] Eugenol có thể được chiết xuất từ tự nhiên hoặc được điều chế tổng hợp bằng cách kết hợp guaiacol với allyl clorua hoặc được sản xuất thông qua quá trình biến đổi sinh học có liên quan đến các vi sinh vật như Escherichia coli vàBacillus cereu.
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol)
Về đặc tính hóa lý, eugenol là một hợp chất dễ bay hơi không màu hoặc màu vàng nhạt và có độ hòa tan trong nước thấp (khoảng 2460 mg/L ở 25 °C), hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ, mùi nồng và hương vị nồng [26] Tuy có những hoạt tính sinh học đáng chú ý nhưng eugenol có độ ổn định hóa học thấp và nhạy cảm với quá trình oxy hóa và các tương tác hóa học khác nhau Do khả năng hòa tan hạn chế và tính chất dễ bay hơi của eugenol nên nó được cho là có hiệu quả tốt hơn khi sử dụng đường uống Tuy nhiên, eugenol được hấp thụ và chuyển hóa nhanh ở gan nên sinh khả dụng tương đối thấp [75] Do đó, “đóng gói” eugenol dường như là giải pháp tốt nhất để ngăn chặn sự hấp thu sớm, cải thiện khả năng hòa tan trong nước và tăng cường hoạt động [72] Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến hành thử nghiệm nhiều phương pháp để “đóng gói” eugenol có thể kể đến như ứng dụng công nghệ nano [35], sử dụng cyclodextrin [32] hay chitosan [67].
Eugenol đã được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học như giảm đau, chống oxy hóa, kháng virus, kháng nấm, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư [15, 26, 72] Eugenol là một chất chống oxy hóa và chất ức chế monoamine oxidase (MAO) phổ biến, đồng thời nó cũng được biết là có đặc tính bảo vệ thần kinh [33]. Eugenol cũng có thể giúp sửa chữa các tổn thương do oxy hóa, loại bỏ các phân tử bị hư hỏng và ngăn ngừa các đột biến có thể phát triển thành ung thư Khả năng chống oxy hóa của eugenol là do cấu trúc của nó, cho phép nó cố định các gốc phenoxy bằng cách nhận các nguyên tử hydro [63].
Hiện nay, eugenol được dùng phổ biến trong nha khoa như chất chống viêm, giảm đau, sát trùng bên ngoài Có bằng chứng cho rằng có tác dụng ức chế các kênh natri điện áp (VGSC) trong các tế bào thần kinh cung cấp chính của răng trong nhiều nghiên cứu khác nhau, bao gồm một nghiên cứu dựa trên mô hình chuột [28].
Về hoạt tính kháng khuẩn, eugenol đã chứng minh đặc tính kháng khuẩn chống lại nhiều loài khác nhau như Cơ chế và khả năng kháng vi sinh vật được phân tích kỹ hơn thông qua một vài nghiên cứu dưới đây.
1.2.2 Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng biofilm của eugenol
Eugenol cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh mẽ trên nhiều chủng cả Gram (-), Gram (+) và một vài chủng nấm thường gặp.
Một nghiên cứu của Thosar và cộng sự (2013) đã cho thấy các chủng E.coli
ATCC 25922, E.faecalis ATCC 29212, S.aureus ATCC 29213, C.albicans ATCC
90028 nhạy cảm với eugenol với giá trị MIC – MBC lần lượt là 1 μl/mL - 1 μl/mL, 1 μl/mL - 1 μl/mL, 0.4 μl/mL – 0.4 μl/mL, MIC – MFC là 0.1 μl/mL - 0.1 μl/m [61]. Đối với các chủng kháng thuốc, eugenol cũng cho thấy hiệu quả kháng khuẩn tích cực Trong nghiên cứu của Abdullah và cộng sự (2015), đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu đinh hương (thành phần chính là eugenol) trên bốn chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) (A.baumanni, P aeruginosa, S aureus và E. faecalis) bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kết quả cho thấyA baumanni nhạy cảm nhất với tinh dầu đinh hương (thành phần chính là eugenol) nồng độ 10% với đường kính ức chế là 28 ± 2,3 mm, tiếp theo làE faecalis (25 ± 2,6mm) CònP. aeruginosvàS aureusít nhạy cảm hơn với đường kính ức chế là 20 ± 2,8 mm [5]. Hiện nay, vẫn chưa có kết luận rõ ràng về cơ chế cho hoạt tính kháng khuẩn của eugenol Tuy nhiên, có nhiều bằng chứng về các cơ chế đã được các nhà khoa học phát hiện trong thời gian gần đây Một vài cơ chế đã được tổng hợp lại trong bài tổng quan của A Marchese và cộng sự (2017) Theo đó, eugenol có thể tác động đến vi sinh vật thông qua: thay acid béo màng tế bào vi khuẩn, thay đổi hình thái và phá vỡ màng tế bào, tác động đến kênh vận chuyển ion-ATP, sản xuất các gốc oxy hóa tự do nội bào và ức chế một vài enzym của vi khuẩn [47].
Ngoài ra, khả năng kháng biofilm của eugenol cũng đã được một số nhà nghiên cứu đánh giá Trong nghiên cứu của Mahmoud và cộng sự (2023) tiến hành đánh giá tác dụng của eugenol đối với sự hình thành biofilm H pylori, kết quả cho thấy khi sử dụng eugenol nồng độ 25 và 50 àg/mL cho tỉ lệ ức chế hỡnh thành biofilm lần lượt là 49,32% và 73,21% [17].
Trước đó, năm 2015 Yadav và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu in vitro và in vivo để chứng minh tác động của eugenol đến biofilm ở cả hai chủng tụ cầu nhạy với methicilin (MSSA) và tụ cầu kháng methicilin (MRSA) Ở nồng độ 0,5 MIC, eugenol được phát hiện làm giảm hơn 50% biofilm của cả hai chủng thử nghiệm Trong thí nghiệm in vivo với chủng S aureus 29213 gây viêm tai giữa ở chuột Kết quả cho thấy niêm mạc của chuột không được điều trị bằng eugenol sưng tấy và chứa đầy biofilm trong khi niêm mạc của chuột được điều trị phát hiện không đáng kể biofilm [69].
1.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật của các dẫn xuất bán tổng hợp từ eugenol
Eugenol là một monoterpene phenolic tự nhiên, thuộc nhóm hợp chất phenylpropanoid Cấu trúc của eugenol chứa ba vị trí hoạt động: nhóm hydroxyl, allyl và thơm, khiến eugenol trở thành nguyên liệu ban đầu quan trọng để tổng hợp tổng hợp các sản phẩm tự nhiên có giá trị và các loại thuốc mới Tuy nhiên, việc ứng dụng, xử lý và bảo quản eugenol có thể phức tạp do tính dễ bay hơi, không ổn định và độ hòa tan trong nước thấp Việc kết hợp eugenol vào các đại phân tử hay còn gọi là “đóng gói” phân tử eugenol thì bán tổng hợp để tạo thành các chất mới là một chiến lược hiệu quả nhằm khai thác thành phần hoạt tính của nó và phát triển và sử dụng lâu dài hoạt chất dễ bay hơi này [38].
Nghiên cứu của Da Silva và cộng sự (2018) báo cáo rằng các dẫn xuất eugenol trong nghiên cứu này có tiềm năng kháng khuẩn cao hơn eugenol: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chống lại vi khuẩn được tỡm thấy là 500 àg/mL đối với cỏc dẫn xuất và
1000 àg/mL đối với eugenol Cỏc dẫn xuất được hỡnh thành bằng quỏ trỡnh este húa nhóm hydroxyl (-OH) với các dẫn xuất axit cacboxylic khác nhau hoặc bằng cách thêm các nhóm chức vào liên kết đôi của nhóm allyl [72].
Sandra Milena Leal Pinto và cộng sự (2019) đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol cho kết quả isoeugenol và methyl isoeugenol có khả năng ức chế lớn nhất đối với nấm da T mentagrophytes, với MIC lần lượt là 62,5 và 500 μg/mL và MFC lần lượt là 125 và 500 μg/mL, O-ethyl eugenol và O-butyl eugenol có MIC là 125 – 250 μg/mL và MFC từ 250 –500 μg/mL được xác định với ba loài nấm da: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes và Trichophy tontonsurans Trong số các dẫn xuất này, methyl isoeugenol ở nồng độ 300 và 100 μg/mL, được phát hiện là ức chế hoàn toàn (100 %) sự phát triển xuyên tâm của sợi nấm của cả ba loài sau 20 ngày điều trị [56].
Trong nghiên cứu gần đây của Simone Carradori và cộng sự (2023), một số dẫn chất của eugenol đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn chất gốc trên ba chủng H pylori Eugenol có giá trị MIC nằm trong khoảng từ 32 đến 64 àg/mL và giỏ trị MBC cao hơn (64–128 àg/mL) Trong khi đú cú bảy trờn ba mươi dẫn chất cho thấy cú hiệu quả tương đổi tốt MIC từ 2-8 àg/mL và MBC từ 2-16 àg/mL Nghiờn cứu cho thấy hiệu quả của việc thay đổi cấu trỳc phõn tử eugenol đến hoạt tính kháng khuẩn cũng như mức độ ảnh hưởng theo từng loại cấu trúc [13].
Một số chất bán tổng hợp từ eugenol được sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu chuyển hóa eugenol, hợp chất được tách từ tinh dầu hương nhu trắng Việt Nam trải qua quá trình đồng phân hóa eugenol tạo isoeugenol Licarin A là sản phẩm của quá trình oxy hóa isoeugenol trong điều kiện nhiệt độ 50℃, xúc tác CuO nanorods, dung môi ethanol trong thời gian 4 giờ Sau đó licarin A được kết tinh phân đoạn lạnh trong ethanol Các nghiên cứu bán tổng hợp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hình 1.2 Quy trình bán tổng hợp một số hợp chất từ eugenol
Isoeugenol và licarin A đều là những sản phẩm có hoạt tính sinh học phong phú, có tính ứng dụng cao trong hương liệu, phụ gia thực phẩm và đặc biệt là nguyên liệu cho hóa dược Hoạt tính sinh học của những dẫn chất này cũng đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu.
1.3.1 Một số nghiên cứu nước ngoài
Isoeugenol (2-methoxy-4-propenyl-phenol) là phenylpropanoid có thể được phân lập từ tự nhiên hay bán tổng hợp Isoeugenol thường được tổng hợp sinh học bằng enzym của vi sinh vật Trong nghiên cứu này, isoeugenol là sản phẩm đồng phân hóa của eugenol.
Isoeugenol có mùi thơm dịu, không hắc như eugenol nên được ứng dụng trong lĩnh vực hương liệu và phụ gia thực phẩm Ngoài ra nó còn được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp các hợp chất có tác dụng hấp thụ tia UV, giảm đau, sát trùng, thuốc bảo vệ thực vật, hoặc làm chất ổn định, chất chống oxy hóa Hoạt tính kháng khuẩn của isoeugenol cũng đã sớm được nghiên cứu từ những năm 1980 và cho thấy hoạt tính chống lại cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) [24, 29, 70].
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của isoeugenol
Trong nghiên cứu của Lyvia Rosa và cộng sự (2019) về khả năng kháng khuẩn của isoeugenol trên S aureus (ST-116 và ATCC-13150) đã cho thấy hoạt tính kìm khuẩn của chất này đối với tất cả cỏc chủng thử nghiệm với giỏ trị MIC là 512 àg/mL và MBC > 4096 àg/mL Kết quả này gần với giỏ trị MIC là 312,5 àg/mL trong nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2017) [70].
Nghiên cứu tác dụng của isoeugenol trên P aeruginosas, Galvão và cộng sự (2012) đã báo cáo rằng isoeugenol có hoạt tính đáng kể trên trực khuẩn mủ xanh, với MIC là 64àg/mL và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 128àg/mL, và được coi là có tác dụng diệt khuẩn đối với loài này [20].
Hoạt tính kháng khuẩn của isoeugenol được đề xuất là do nhóm hydroxyl tự do của nó và vị trí của các liên kết đôi ở vị trí α, β của chuỗi bên và nhóm methyl ở vị trí γ Để tìm hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn của eugenol, Hyldgaard và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu hoạt động của isoeugenol trên E colivà L innocua.
Isoeugenol ức chế sự phát triển của hai chủng trên tại nồng độ lần lượt là 0,6 mg/mL và 1 mg/mL Sau khi đánh giá các đặc tính của màng tế bào vi khuẩn sau khi tiếp xúc với isoeugenol, nhóm nghiên cứu cho rằng isoeugenol làm mất ổn định và tăng tính thấm của màng và chất này hoạt động như như một chất tẩy rửa không gay rối loạn [29].
Hoạt tính kháng biofilm của isoeugenol cũng được quan tâm để ứng dụng trong lĩnh vực nguyên vật liệu để hạn chế lây truyền mầm bệnh Nghiên cứu của C.K. Nielsen và cộng sự (2018) đã cho kết quả lớp phủ isoeugenol được điều chế bằng phương pháp hấp phụ có tác dụng ngăn ngừa hình thành biofim của ba chủng S. aureus, L monocytogenes và P fluorescens trên bề mặt thép không gỉ và polyetylen [51].
Licarin A (C20H22O4), còn được gọi là dehydrodiisoeugenol, là một neolignan thuộc nhóm phenol Licarin A là một tinh thể không màu có nhiệt độ nóng chảy 132–
133 °C và có mùi thơm nồng Hợp chất này ít tan trong nước và tan tốt trong các dung môi hữu cơ như etyl acetat và diclometan Có hai cách để tổng hợp Licarin A:
Năm 1973, hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ vỏ cây Myristica fragrans, sau này nó thường được thu từ các họ thực vật khác nhau như Aristolochiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae và Piperaceae Mặc dù người ta biết rằng hợp chất này có thể được tìm thấy ở nhiều nồng độ khác nhau (dao động từ 0,08–0,53 mg/g thực vật) tùy thuộc vào loài Tuy nhiên, licarin A đã thu được bằng quá trình oxy hóa isoeugenol và cấu trúc của nó đã được xác định trước khi nó được phân lập từ nguồn tự nhiên [21].
Licarin A được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau với năng suất thấp.
Do đó, việc tổng hợp licarin A là một giải pháp thay thế để thu được số lượng đáng kể Theo nghĩa này, tổng hợp hóa học cổ điển từ isoeugenol tạo ra sản lượng tốt nhất.
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của licarin A
Licarin A được cho thấy là có một số hoạt tính sinh học như chống ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ký sinh trùng và kháng vi sinh vật
Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng licarin A có hiệu quả chống lại các chủng Mycobacteria Theo nghiên cứu của D J Alvarenga và cộng sự (2020) của Licarin A thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại Mycobacteria abscessusvới MIC
= 9,76 μg/mL và khángMycobacteria fortuitum, Mycobacteria massiliensevới MIC lần lượt là 39,06 μg/mL và 69,06 μg/mL Sự ức chế hình thành biofilm của các chủng này cũng đã được thử nghiệm, nhưng không quan sát thấy hoạt động đáng kể nào Hơn nữa, Licarin A đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại bốn chủngMycobacteriađa kháng thuốc và 12 chủng phân lập lâm sàng với MIC = 3,12–
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và nguyên vật liệu
Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của 3 mẫu thử và trên 8 chủng vi sinh vật. Đối tượng cụ thể được liệt kê tại bảng 2.1
Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Eugenol và hợp chất bán tổng hợp Nguồn cung cấp
1 Eugenol (Eu) Các chất bán tổng hợp được tổng hợp và khẳng định cấu trúc tại Phòng thí nghiệm Hóa học Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Các chủng VSV nghiên cứu
1 Candida albicansATCC 10231 Các chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tế bào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ và Viện
3 Staphylococcus aureusATCC 25923 kiểm nghiệm thuốc trung ương. Được lưu trữ ở - 80 0 C tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa sinh, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Trang thiết bị, máy móc Nguồn gốc
1 Cân kỹ thuật Sartorius – Đức
2 Cân phân tích Sartorius – Đức
3 Tủ lạnh Sanyo – Nhật Bản
6 Tủ cấy vô khuẩn BioAir - Italy
7 Nồi hấp tiệt khuẩn 50L ALP – Nhật Bản
8 Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc
STT Trang thiết bị, máy móc Nguồn gốc
10 Pipet 1000-200; 200-20; 20-1 àL Nichiryo – Nhật Bản
11 Pipet đa kênh AHN – Đức
12 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc
13 Đĩa 96 giếng SPL – Hàn Quốc
14 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang - UV Varioskan
15 Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U5100
17 Dụng cụ thủy tinh: bình nón, cốc có mỏ, ống đong, ống nghiệm có nút xoáy, pipet, đĩa petri… Trung Quốc
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Hãng – nước sản xuất
1 Môi trường lỏng Mueller Hinton (MHB) Merck – Đức
2 Môi trường lỏng Tryptic Soy (TSB) Merck – Đức
3 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Chemical
5 Tím tinh thể (Crystal violet) Sigma-Aldrich
2.1.2.2 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.4.
Bảng 2.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
MT1 Môi trường lỏng MHB: dạng bột pha sẵn: 2,1 g/100ml H2O
MT3 Thạch thường TSA (g/100ml)
MT4 SDA thạch = MT2 + thạch Agar (2,6 g/100ml môi trường)
MT5 Môi trường lỏng TGN (g/100ml)
MT6 Môi trường đệm PBS (g/L)
Nội dung nghiên cứu
Từ mục tiêu của đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol”, nội dung chi tiết của nghiên cứu như sau:
2.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
- Xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của VSV (MIC) và nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.
- Đánh giá khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của các hợp chất có hoạt tính tốt.
- Đánh giá khả năng diệt khuẩn theo thời gian của các hợp chất có hoạt tính tốt. chất bán tổng hợp từ eugenol.
- Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.
- Đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureuscủa các hợp chất có hoạt tính tốt ở các điều kiện: đa nồng độ, theo thời gian và kết hợp với kháng sinh.
- Đánh giá độc tính qua ly giải tế bào hồng cầu của eugenol và một số mẫu bán tổng hợp từ eugenol.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng
Các chủng sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các chủng E coli, S aureus, C. albicans, K pneumoniae, B subtilis, P aeruginosa, S enterica được lưu ở - 80 0 C tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa sinh, khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội, sau đó được cấy lên thạch TSA hoặc SDA trước khi sử dụng Tất cả các thao tác cấy được thực hiện trong tủ cấy vô khuẩn Tủ cấy được tiệt trùng bằng cách lau sạch bằng cồn 96 0 và bật đèn UV một giờ.
Cân, đong các thành phần theo công thức môi trường (mục2.1.2.2) Hòa tan các thành phần, đậy kín bằng nút bông không thấm nước hoặc nắp xoáy Hấp tiệt khuẩn ở
115 0 C, 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn xong, các bình đựng môi trường lỏng được bảo quản trong tủ lạnh Các bình đựng môi trường thạch được phân phối lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh.
Hoạt hóa giống thực hiện 1 lần/tuần, sử dụng môi trường thạch tương ứng với VSV, dùng que cấy vô trùng lấy một vòng VSV từ ống giống cấy sang bề mặt thạch tương ứng theo hình zigzag Các chủng sau đó được ủ 37 0 C.
2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do
2.3.2.1 Phương pháp xác định MIC với các đối tượng vi sinh vật
Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của VSV (MIC) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng sử dụng canh thang MHB cho vi khuẩn hoặc Sabouraud-dextrose cho C. albicans trên đĩa 96 giếng theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ (Clinical & Laboratory Standards Institute – CLSI) [66].
Một số hợp chất bán tổng hợp được hòa tan trong dung môi phù hợp chứaTween 80 - nồng độ 4% với eugenol (deugenol = 1,35), isoeugenol (disoeugenol = 1,1) và dung môi hữu cơ DMSO với LT4, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong MHB Các mẫu thử được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng (bao gồm 8 hàng từ A đến G, 12 cột từ 1 đến 12), từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân.
Hỗn dịch vi sinh vật có độ đục tương đương 0,5 McFarland được chuẩn bị trong PBS, với các khuẩn lạc trên đĩa thạch TSA hoặc SDA cho C albicans được ủ 37°C, qua đêm Hỗn dịch này được pha loãng 100 lần trong MHB hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans để thu được hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x10 6 vi khuẩn/ml và 1,5x10 4 vi nấm/ml Hỗn dịch làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37℃ trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật. Việc đánh giá bằng mắt được xác nhận lại bằng việc bổ sung natri resazurin (20 àl nồng độ 0,1 àg/mL) vào cỏc giếng, ủ 30 phỳt ở nhiệt độ phũng, trỏnh ỏnh sỏng Sự hiện diện của vi khuẩn sống được đánh giá thông qua sự khử hóa resazurin màu xanh lam, không huỳnh quang thành resorufin màu hồng, phát huỳnh quang MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không có sự tăng lên của cường độ huỳnh quang.
Tất cả các thử nghiệm được thực hiện 3 lần độc lập.
Thiết kế thí nghiệm được mô tả trong bảng 2.5.
Bảng 2 5 Mô tả sắp xếp thí nghiệm xác định MIC
2.3.2.2 Phương pháp xác định MBC với các đối tượng vi sinh vật
Xác định nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) dựa trên đĩa xác định MIC, tất cả các giếng không mọc được cấy lên đĩa thạch để xác định MBC Sau khi ủ ở 37 0 C trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc xuất hiện.
Nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất có khả năng diệt lớn hơn 99,9% lượng vi sinh vật so với thời điểm ban đầu.
2.3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật theo nồng độ
Nồng độ các mẫu thử được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC.
Cho hỗn dịch VSV tiếp xúc với một số hợp chất bán tổng hợp nồng độ khác nhau Dãy nồng độ từ cao đến giá trị bằng với MIC (16MIC, 8MIC, 4MIC, 2MIC, MIC) Mẫu được ủ 37ºC trong 20 giờ Sau 20 giờ, lượng VSV sống trong mẫu, trước và sau khi tiếp xúc với mẫu thử, sẽ được đánh giá bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch Mẫu sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp trong PBS, sau đó được cấy lên môi trường thạch phù hợp, TSA cho các vi khuẩn, SDA cho các vi nấm Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng phương pháp đếm sau khi ủ ở 37ºC trong 24 giờ.
Khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của mẫu được đánh giá dựa trên lượng VSV tại thời điểm trước khi tiếp xúc với mẫu thử và sau khi tiếp xúc với mẫu thử Kết quả được biểu diễn dưới dạng hiệu số log10 CFU/ml (delta log10 CFU/ml hoặc ∆log10
2.3.2.4 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật theo thời gian
Nồng độ các mẫu thử được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC.
Cho hỗn dịch VSV tiếp xúc với một số hợp chất bán tổng hợp nồng độ khác nhau (Hỗn dịch VSV có nồng độ tương đương 10 7 CFU/mL) Dãy nồng độ từ cao đến giá trị bằng với MIC (8MIC, 4MIC, 2MIC, 1MIC, 0.5 MIC) Mẫu được ủ 37ºC. Sau mỗi 1, 3, 5, 7, 24 giờ, lượng VSV sống trong mẫu, trước và sau khi tiếp xúc với mẫu thử, sẽ được đánh giá bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch Mẫu sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp trong PBS, sau đó được cấy lên môi trường thạch TSA (với vi khuẩn) Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng phương pháp đếm sau khi ủ ở 37ºC trong 24 giờ.
Khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của mẫu được đánh giá dựa trên lượng VSV tại thời điểm trước khi tiếp xúc với mẫu thử và sau khi tiếp xúc với mẫu thử Kết quả được biểu diễn dưới dạng hiệu số log10 CFU/ml (delta log10 CFU/ml hoặc ∆log10
CFU/ml) Thí nghiệm được tiến hành cùng mẫu chứng chứa vi sinhh vật nhưng không được tiếp xúc với hợp chất bán tổng hợp.
Thí nghiệm thực hiện tối thiểu 3 lần độc lập.
2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus
2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm S aureus trên đĩa 96 giếng
Biofilm S aureusđược tạo trên đĩa 96 giếng đáy bằng của SPL, sử dụng nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD620 nm (tương đương 10 7 CFU/mL), trong môi trường nuôi cấy TGN (TSB có bổ sung NaCl và glucose), thể tích 200 μl/giếng, ủ ở 37°C trong
2.3.3.2 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu của biofilm S aureus
Sau 24 giờ nuôi cấy tạo biofilm, môi trường nuôi cấy được thay mới (chứng dương) hoặc được thay thế bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung mẫu thử sử dụng đơn hoặc kết hợp với kháng sinh (Moxifloxacin, Vancomycin) Biofilm được ủ tiếp trong 24 giờ ở 37°C Nghiên cứu đánh giá 2 chỉ tiêu chính của biofilm S aureus là lượng vi sinh vật sống trong biofilm được đánh giá dựa trên khả năng chuyển hóa resazurin (cường độ huỳnh quang ở mẫu thử được so sánh với mẫu chứng dương - không bổ sung mẫu thử hoặc kháng sinh), đánh giá CFU bằng phương pháp cấy đếm và tổng sinh khối bằng nhuộm với tím tinh thể [3, 16]
Đánh giá lượng VSV sống trong biofilm
Lượng VSV được đánh giá trực tiếp bằng phương pháp đếm CFU trên đĩa thạch Mẫu cần đếm số lượng CFU sẽ được rửa nhẹ nhàng với PBS Vi sinh vật trong biofilm sẽ được phá ra khỏi biofilm bằng nước cất vô khuẩn, bằng cách hút nhả với pipet tối thiểu 20 lần, sau đó sẽ được vortex thật kỹ hoặc siêu âm trong vòng 1 phút nếu cần, để tách rời hoàn toàn các khuẩn lạc Mẫu sau đó sẽ được pha loãng trong PBS theo cơ số log, đến nồng độ phù hợp Khuẩn lạc sẽ được đếm trên đĩa thạch TSA sau khi cấy trải và ủ 24 giờ ở 37 o C Nồng độ được chọn là nồng độ có từ 30-300 khuẩn lạc trên đĩa Kết quả được biểu diễn dưới dạng log10 CFU/ml hoặc ∆log10
CFU/ml khi so sánh với chứng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
Thực hiện thử nghiệm MIC để xác định được nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển vi sinh vật của eugenol và hai hợp chất bán tổng hợp là isoeugenol và licarin A (LT4) Các giá trị MIC trên các chủng VSV thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Giá trị MIC (mg/L) của eugenol, một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol và kháng sinh tham chiếu trên các chủng vi sinh vật.
Chủng MIC (mg/L) vi sinh vật
Trong các mẫu thử, LT4 là hợp chất cho giá trị MIC thấp nhất Cụ thể như sau: Eugenol, isoeugenol thể hiện tác dụng ức chế 8/8 chủng VSV thử nghiệm với giá trị MIC cao với eugenol dao động từ 2540-10160 mg/L và isoeugenol dao động từ 537-8594 mg/L Eugenol có giá trị MIC thấp nhất (2540 mg/L) trên chủng
S.aureus ATCC 25923 và S.enterica Bên cạnh đó, isoeugenol có giá trị MIC thấp nhất (537 mg/L) trên chủng C albican.
LT4 thể hiện tác dụng ức chế 7/8 chủng VSV và không xác định được giá trịMIC với vi nấm C albican ATCC 20132 ngay cả ở nồng độ thử nghiệm cao nhất.Với các chủng Gram (+) nhưS aureus,B subtilischo giá trị MIC dao động từ 0,03 –
0,25 mg/L; Gram (-) như E coli, S enterica, P aeruginosa với MIC từ 0,03 – 2 mg/L Với chủng Gram (-)K pneumoniaecho giá trị MIC = 256 mg/L.
Khi so sánh với giá trị MIC của kháng sinh tham chiếu là meropenem và moxifloxacin trên các chủng thử nghiệm, nhìn chung, LT4 có giá trị MIC tương đương với giá trị MIC của kháng sinh trên một số chủng Cụ thể trên E.coli, B.subtilis và P.aeruginosa, LT4 và moxifloxacin gần như có cùng giá trị MIC.
Tương tự, trên E.coli và B.subtilis, LT4 cho giá trị MIC bằng hoặc nhỏ hơn meropenem Đặc biệt, LT4 có giá trị MIC là 0.125-0.25 mg/L trên S.aureus ATCC33591 nhỏ hơn rất nhiều so với meropenem (16 mg/L).Trên hai chủng
S.aureus vàS.enterica, LT4 có giá trị MIC gấp khoảng 4-10 lần moxifloxacin.
Sau khi thu được kết quả MIC, tiến hành thực hiện đánh giá MBC theo phương pháp đề cập Giá trị MBC của các mẫu trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Giá trị MBC (mg/L) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol trên các chủng vi sinh vật.
*MBC: - 3 log10CFU/ml so với lượng VSV tại thời điểm t0(tương đương với giảm
Tương tự kết quả MIC, giá trị MBC của LT4 có giá trị thấp nhất trong các hợp chất mang thử MBC của eugenol và isoeugenol trên các chủng vi sinh vật đều > 256 mg/L, trong khi LT4 thể hiện hoạt tính kháng 7/8 chủng VSV với các chủng Gram (+) như S aureus, B subtilischo giá trị MBC từ 0,03 - 1 mg/L; Gram (-) như E coli,S. enterica, P aeruginosa với MBC từ 0,03 – 8 mg/L Với chủng vi khuẩn gram (-) K. pneumoniae cho giá trị MBC = 256 mg/L và vi nấmC albicankhông xác định được MBC ở ngay nồng độ thử nghiệm cao nhất (>256mg/L).
3.1.3 Kết quả diệt vi sinh vật ở dạng tự do theo nồng độ của mẫu LT4.
Khả năng diệt VSV ở dạng tự do theo nồng độ của mẫu LT4 được thực hiện với một dãy nồng độ bao gồm 16MIC, 8MIC, 4MIC, 2MIC, MIC (mg/L), điều kiện thực hiện thí nghiệm tương tự với thực hiện MIC Kết quả biểu diễn trong hình 3.1.
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
Hình 3 1 Đáp ứng của mẫu LT4 với các chủng vi sinh vật ở dạng tự do tại các nồng độ khác nhau.
Mẫu mẫu LT4 thể hiện tác dụng diệt khuẩn tốt, ở nồng độ 2MIC có khả năng diệt > 3 log10 CFU/ml (tương đương với làm giảm 99,9% lượng VSV ở dạng tự do) với hầu hết các chủng VSV thử nghiệm (trừ S enterica).
Có thể thấy hoạt tính diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ LT4 được sử dụng. Nồng độ LT4 tăng cho tác dụng diệt khuẩn tăng điển hình trên các chủng E coli, S. aureus và P aeruginosa Ở thí nghiệm tiếp theo, tiếp tục đánh giá tác dụng diệt khuẩn của LT4 theo thời gian.
3.1.4 Kết quả diệt vi sinh vật ở dạng tự do theo thời gian của mẫu LT4
Khả năng diệt khuẩn theo thời gian được của LT4 được thực hiện trên chủng
S.aureus ATCC 33591 với nồng độ vi khuẩn 10 7 CFU/mL Khả năng kháng khuẩn được theo dõi tại các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ và 24 giờ Kết quả của thử nghiệm được thể hiện ở biểu đồ hình 3.2.
Hình 3.2 Khả năng diệt khuẩn theo thời gian của LT4 trên chủng S aureus
Từ biểu đồ trên, có thể thấy trong vòng 24h, khả năng diệt S aureus ở dạng tự do của mẫu LT4 phụ thuộc vào thời gian và nồng độ Nồng độ mẫu LT4 tăng, làm tăng khả năng diệt S aureus theo thời gian Cụ thể:
Tại nồng độ 0,5 MIC, LT4 chỉ ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở 5h đầu, sau đó, lượng vi sinh vật tăng lên và đạt gần bằng chứng tại thời điểm 24 giờ.
Tại nồng độ MIC, LT4 diệt khoảng 1 log10 CFU/ml sau 7h và sau 24h diệt 2-3 log10CFU/ml vi sinh vật.
Tại nồng độ 2 MIC, 4 MIC và 8 MIC, LT4 làm giảm đáng kể lượngS aureusở những giờ đầu, diệt khoảng 3 log10CFU/ml S aureussau 5h Tại thời điểm 7h, mẫu nồng độ 2 MIC chỉ diệt khoảng 3 log10 CFU/ml, trong khi mẫu nồng độ 4 MIC và8MIC diệt hơn 6 log10CFU/ml (tương đương với làm giảm hơn 99,9% lượng VSV ở dạng tự do)
Hoạt tính kháng biofilm S.aureus của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol 28 1 Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S.aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S.aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol.
Kết quả đánh giá số lượng S aureus còn sống trong biofilm bằng phương pháp gián tiếp thông qua chuyển hóa resazurin được trình bày trong hình 3.3.
Hình 3.3 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của eugenol và một số mẫu bán tổng hợp từ eugenol ở nồng độ 100 mg/L và 1000 mg/L
Tại nồng độ 100 mg/L, mẫu LT4 làm giảm chuyển hóa resazurin khoảng 25% giá trị RF, các mẫu còn lại làm giảm không đáng kể giá trị RF so với chứng.
Tại nồng độ 1000 mg/L, các mẫu làm giảm giá trị RF một cách rõ rệt, điển hình mẫu LT4 làm giảm 47,5% giá trị RF, các mẫu eugenol, isoeugenol, làm giảm khoảng 15-25% giá trị RF so với chứng (sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 2MIC LT4 tạo ra hiệu quả diệt > 99,9% hầu hết các chủng VSV thử nghiệm, tốt hơn gấp nhiều lần so với hoạt chất gốc eugenol Tại các nồng độ từ 4MIC, licarin A có khả năng diệt 99,9% vi sinh vật chỉ sau 7 giờ.
Eugenol là một monoterpene phenolic có hoạt tính kháng vi sinh vật ở nồng độ khá lớn Theo kết quả nghiên cứu này, con số này lên đến từ một nghìn đến vài nghìn mg/L trên một vài chủng vi sinh vật (S aureus, B subtilis, E coli,S.enterica,….) Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Thosar và cộng sự(2013) [77] Một vài nghiên cứu về dẫn chất bán tổng hợp từ eugenol đã cho thấy các dẫn chất tạo ra có khả năng kháng vi sinh vật tốt hơn eugenol Trong nghiên cứu của
Da Silva và cộng sự (2018), giá trị MIC của các dẫn chất được hình thành từ quá trỡnh este húa nhúm hydroxyl được tỡm thấy là 500 àg/mL [72], nghiờn cứu của Sandra Milena Leal Pinto và cộng sự (2019) cho kết quả MIC trên T mentagrophytes của các dẫn chất Eugenol dao động từ 62.5-250 μg/mL [76] Hay trong nghiên cứu gần đây của Simone Carradori và cộng sự (2023), một số dẫn chất của eugenol có giá trị MIC trờn H.pylori tương đổi tốt MIC từ 2-8 àg/mL giảm khỏ nhiều so với eugenol là từ 32-64 àg/mL[71] Trong nghiờn cứu này, dẫn xuất của eugenol (LT4) đó làm tăng khả năng kháng khuẩn rất rõ rệt trên một số chủng thực nghiệm so với eugenol (nguyên liệu ban đầu), thậm chí khả năng kháng khuẩn còn tương đương với một số kháng sinh tham chiếu.
LT4 - Licarin A là một neolignan thuộc nhóm phenol, ngoài bán tổng hợp, nó còn được tìm thấy trong hơn 17 loài thực vật, bao gồm các loại thảo mộc, trái cây và rễ Trong nghiên cứu của Chuan-Yun Xiao và cộng sự (2021), licarin A được phân lập từ Piper betle có hoạt tính khángS aureus MRSA với MIC = 256 mg/L lớn hơn nhiều lần so với mẫu bán tổng hợp LT4 được sử dụng trong nghiên cứu này [68]. Ngoài ra trong nghiên cứu của M A Jiménez Arellanes và cộng sự (2011) Licarin A được cho là không có hoạt tính trên E coli,P fluorescensvà L monocytogenes[31].
Có thể do phân lập từ tự nhiên và quá trình tách chiết năng suất thấp nên bán tổng hợp là một giải pháp thay thế tiềm năng để tạo nguồn licarin A.
Về hoạt tính kháng biofilm S.aureus
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn chủng Staphylococcus aureus
ATCC 33591 - kháng methicillin (MRSA) để đi sâu hơn vào đánh giá hoạt tính kháng VSV của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol, cụ thể là hoạt tính kháng biofilm.
Tụ cầu vàngS.aureus là nguyên nhân gây là nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng hiện nay và cũng là loại vi khuẩn đã xuất hiện nhiều chủng kháng kháng sinh. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự lây truyền các bệnh do tụ cầu vàng có thể kể đến là biofilm Tụ cầu vàng đã được chứng minh là có khả năng tạo biofilm mạnh trên cả bề mặt sinh học và phi sinh học như các thiết bị, dụng cụ y tế Do đó, nghiên cứu tìm ra các chất kháng khuẩn tiềm năng có hiệu quả trong điều trị biofilm
S.aureus nói riêng và biofilm của các VSV khác nói chung là chủ quan trọng, cần được quan tâm.
Nghiên cứu cho thấy LT4 có tác dụng kháng biofilm rất tốt, làm giảm 2,5 log10CFU/mlS aureus (tương đương với làm giảm hơn 99% số lượng S aureus) và giảm 1,5 log CFU/ml S aureus (tương đương với giảm > 90% S.aureus trong chất gốc là eugenol (giảm < 1 log10CFU/ml ở nồng độ 1000) Vậy nên, LT4 lả hợp chất tiềm năng để thực hiện nghiên cứu sâu hơn về tác động lên biofilm củaS.aureus.
Kết quả thử nghiệm đa nồng độ mẫu LT4 trên biofilm cho thấy hiệu quả diệt khuẩn trong biofilm của LT4 chưa thực sự nổi bật và chưa thể tiêu diệt được hết vi khuẩnS. aureus Bên cạnh đó, LT4 cũng thể hiện hoạt tính kháng biofilm theo phụ thuộc nồng độ, khi nồng độ LT4 tăng thì hiệu quả tác động lên vi sinh vật trong biofilm cũng tăng lên.
Nghiên cứu của Yvan Diaz Iglesias và cộng sự (2019) đánh giá hoạt tính của kháng biofilm của 2 chủng S aureusATCC 33591 (MRSA) và ATCC 25923 (MSSA) tạo biofilm được thực hiện trên 7 loại kháng sinh trong môi trường TGN Kết quả cho thấy rất ít kháng sinh cho hiệu quả diệt trên 99% VSV ở nồng độ thấp Một số kháng sinh như meropenem, azithromycin, rifampin, ciprofloxacin, tobramycin, vancomycin khi sử dụng nồng độ 100 mg/L cho hiệu quả giảm được 1 log10CFU/mL (tương đương với giảm 90% S aureus trong biofilm) [73] Trong một nghiên cứu trước đó của chúng tôi, khi đánh giá khả năng diệt khuẩn trong biofilm của Moxifloxacin theo nồng độ cho thấy Moxifloxacin cũng là kháng sinh diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ Nồng độ kháng sinh tăng thể hiện hoạt tính diệt S aureus trong biofilm tăng và tại nồng độ thử nghiệm cao nhất 1000 mg/L, Moxifloxacin làm giảm
