: BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ HUYỀN THƯƠNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT BÁN TỔNG HỢP TỪ EUGENOL LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ
TỔNG QUAN
Hợp chất bán tổng hợp có tác dụng kháng vi sinh vật
1.1.1 Đại cương về hợp chất bán tổng hợp
Bán tổng hợp là phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng sản phẩm tự nhiên làm nguyên liệu ban đầu để tạo ra các hợp chất mới, là sự kết hợp giữa các nguyên liệu tự nhiên và các phản ứng hóa học để tạo ra các phân tử có cấu trúc và đặc tính mong muốn [11] Bằng cách sử dụng khung cấu trúc sẵn có của các sản phẩm tự nhiên, phương pháp bán tổng hợp có thể tạo ra các hợp chất có cấu trúc phức tạp hơn so với các phương pháp tổng hợp truyền thống, giúp phát triển các loại thuốc mới có hiệu quả cao hơn Từ năm 1940 đến năm 2019, khoảng 33,5% thuốc được phê duyệt là sản phẩm tự nhiên hoặc có nguồn gốc trực tiếp từ chúng Việc phát triển các dạng thuốc mới dựa trên các sản phẩm tự nhiên làm nguồn cấu trúc vẫn là một lĩnh vực đang được nghiên cứu tích cực [12]
Các hợp chất thiên nhiên với ưu điểm về số lượng phong phú với nhiều cách sắp xếp cấu trúc các nhóm chức khác nhau, số lượng trung tâm lập thể nhiều, tỷ lệ dị nguyên tử khác nhau, khung cấu trúc vòng lõi đa dạng, có khả năng ứng dụng cao trong thiết kế và bán tổng hợp chất tương tự với đặc tính dược lý và hoạt tính sinh học đáng chú ý [13]
Hiện nay, hầu hết các nguyên liệu ban đầu được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ đều có nguồn gốc từ dầu mỏ, các nguyên liệu không thể tái tạo, độc hại, dễ cháy, tiềm ẩn rủi ro cho sức khỏe con người và môi trường Để đáp ứng mối quan tâm trên toàn thế giới về sự cạn kiệt các nguồn tài nguyên thiên nhiên không thể tái tạo, nhiều nhóm nghiên cứu về tổng hợp hữu cơ đã phải đối mặt với vấn đề tìm kiếm các giải pháp thay thế tự nhiên, dựa trên các nguồn sinh khối thay cho các nguồn thu được từ dầu mỏ Một trong những hướng nghiên cứu phổ biến hiện nay, tiềm năng ứng dụng tinh dầu và các dẫn xuất của chúng được chú ý như là nguyên liệu ban đầu cho các hóa chất có hoạt tính sinh học [14] như hoạt tính kháng khuẩn [15], chống oxy hóa, diệt côn trùng, kháng virus và kháng nấm [16] Các thành phần dễ bay hơi của tinh dầu (như linalool, eugenol, limonen…) về cơ bản là các dẫn xuất terpen và phenolic có trọng lượng phân tử thấp, đồng thời sự có mặt của các liên kết không bão hòa, các
4 nhóm chức (cacbonyl, hydroxyl, epoxid…) và cấu trúc đa dạng làm cho tinh dầu trở thành những nguyên liệu ban đầu tiềm năng để dẫn xuất hóa [14] từ đó thu được các hợp chất kháng vi sinh vật bán tổng hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, y học, chất bảo quản thực phẩm [14]
1.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất bán tổng hợp từ thành phần tinh dầu
Hoạt tính kháng vi sinh vật của các hợp chất là khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi sinh vật Một số hợp chất được bán tổng hợp từ limonen, citronellal, citral…đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trong các nghiên cứu sau:
Findik và cộng sự (2009) đã tổng hợp một số dẫn xuất 4,5-dihydrofurane từ limonen Hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp anti và syn-tetrahydrofuran được đánh giá bằng kỹ thuật khuếch tán đĩa thạch cho thấy tác dụng chống lại 12 chủng vi sinh vật gây bệnh khác nhau ở người (02 chủng nấm men, 05 chủng vi khuẩn Gram âm và
05 chủng vi khuẩn Gram dương) Tất cả các hợp chất bán tổng hợp được thử nghiệm đều có hoạt tính kháng khuẩn tốt, trong đó dẫn xuất từ cyclohexane-1,3-dione có hoạt tính mạnh nhất [17]
Victoria và cộng sự (2012) đã thực hiện một nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của α-phenylseleno citronellal và 2-phenylseleno citronellol, được điều chế từ terpenoid (R)-citronellal tự nhiên, thành phần chính của tinh dầu Cymbopogon nardus Kết quả quan sát cho thấy việc thêm một nhóm phenylselenium vào phân tử citronellal đã làm tăng hoạt tính kháng khuẩn, với kết quả tốt được quan sát thấy đối với se-citronellal chống lại 03 chủng vi khuẩn gây bệnh cho thực phẩm (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium) [18]
Goldbeck và cộng sự (2014) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 3-(p- chlorophenyl) thio citronellal được bán tổng hợp từ citral - hợp chất chính có trong tinh dầu Cymbopogon citratus Kết quả đã chỉ ra rằng hợp chất 3-(p-chlorophenyl) thio citronellal là một chất kháng vi sinh vật mạnh, có phổ tác dụng rộng chống lại cả vi khuẩn Gram (+) như L monocytogenes, S aureus và vi khuẩn Gram (-) như Shigella dysenteriae, Escherichia coli và Pseudomonas fluorescens Đồng thời
5 nghiên cứu chỉ ra vi khuẩn Gram (+) (MIC = 2,1mM) nhạy cảm hơn vi khuẩn Gram (-) (MIC = 4,2 mM) khi tiếp xúc với 3-(p-chlorophenyl) thio citronellal Về động học tác dụng của các hợp chất chống lại P fluorescens, tế bào chết xảy ra sau 33 phút tiếp xúc với 3-(p -chlorophenyl)thio citronellal, trong khi phải mất 75 phút tiếp xúc với citral để xảy ra hiện tượng chết tế bào [19]
1.1.3 Hoạt tính kháng biofilm của các hợp chất bán tổng hợp
Biofilm liên quan đến 65-80% trường hợp nhiễm khuẩn ở người, đặc biệt là những bệnh có biểu hiện dai dẳng hoặc tái phát Biofilm là một cộng đồng VSV nằm trong chất nền ngoại bào gồm các hợp chất cao phân tử ngoại bào: polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein Hàng rào vật lý này được cho là có khả năng bảo vệ chống lại các áp lực từ môi trường như nhiệt, ẩm, cũng như chống lại hệ thống miễn dịch của vật chủ Vi khuẩn trong biofilm có sức đề kháng với điều kiện ngoại cảnh cao hơn so với tế bào ở dạng tự do Các vi khuẩn trong biofilm rất kém đáp ứng với kháng sinh, liên quan chủ yếu đến giảm sinh khả dụng do hiệu ứng cản trở của chất nền ngoại bào biofilm, điều này giảm khả năng tiếp xúc của thuốc với các VSV trong biofilm [20]
Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus có thể bám dính và tạo biofilm trên cả bề mặt sinh học và bề mặt nhân tạo S aureus là tác nhân gây bệnh thường gặp nhất trong nhiễm trùng chi giả hoặc ống thông và là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng dai dẳng hoặc tái phát [21] Trong chất nền ngoại bào của biofilm S aureus bao gồm:
Thành phần polysaccharid do VSV sinh tổng hợp ra - có liên quan trực tiếp đến sự hình thành chất nền biofilm Thành phần chính của polysaccharid này là polysaccharid bám dính liên tế bào - polysaccharide intercellular adhesin (PIA), hay còn được gọi với tên khác là poly-N-acetylglucosamine (PNAG), khi xét trên khía cạnh hóa học, là trung gian kết dính giữa các tế bào vi khuẩn và liên quan đến khả năng bám dính của vi khuẩn với các bề mặt vật liệu sinh học [21]
PNAG được tổng hợp dưới sự biểu hiện của locus ica (intercellular adhesion), bao gồm các gen icaA, icaD, icaB và icaC [22] Protein IcaA là một N- acetylglucosamine transferase, cần cho việc sinh tổng hợp PNAG IcaA biểu hiện một
6 hoạt tính kém, hoạt tính này sẽ được tăng cường dưới sự hỗ trợ của protein IcaD để sản xuất ra PNAG [23] IcaC đóng vai trò vận chuyển PNAG ra ngoài trong khi đó icaB, sẽ đóng vai trò gắn PNAG trên màng [24] Biểu hiện của operon icaADBC được điều hòa trực tiếp bởi promoter ica cũng như thông qua biểu hiện của chất điều hòa IcaR; cả hai yếu tố này được kiểm soát bởi các protein điều hòa chung (SigB, SarA) [21, 25] Những sự điều hòa này chi phối operon ica trong việc sinh tổng hợp PNAG
Hình 1.1 Polysaccharid poly-N- acetylglucosamine và operon chịu trách nhiệm cho trong sinh tổng hợp nó a Protein IcaA, icaD, icaC và icaD và quá trình sinh tổng hợp
PNAG b Operon icaADBC và vai trò của nó trong sinh tổng hợp PNAG (theo [25, 26])
Eugenol và các hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
1.2.1 Đặc điểm và hoạt tính sinh học của eugenol
Eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol, C10H12O2) là một hợp chất phenolic được tìm thấy nhiều trong các loại tinh dầu tự nhiên của thực vật thuộc họ Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae và Myristicaceae, và là thành phần quan trọng của tinh dầu đinh hương (Syzygium aromaticum) (82,4%) [3], tinh dầu trầu không (Piper betle) (77,24%) [5], hương nhu trắng (Ocimum gratissimum) (54,42%) [4], tinh dầu quế (Cinnamomum zeylanicum) Eugenol là một hợp chất dễ bay hơi không màu hoặc màu vàng nhạt và có độ hòa tan trong nước thấp (khoảng 2460 mg/L ở 25 °C), hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ, mùi nồng và hương vị nồng [7] Eugenol có độ ổn định hóa học thấp và nhạy cảm với quá trình oxy hóa và các tương tác hóa học khác nhau Khi dùng bằng đường uống, eugenol được hấp thu nhanh chóng bởi các cơ quan khác nhau và chuyển hóa ở gan Do đó, đóng gói eugenol dường như là giải pháp tốt nhất để ngăn chặn sự hấp thu sớm, cải thiện khả năng hòa tan trong nước và tăng cường hoạt động [38]
9 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol)
Eugenol và các sản phẩm chuyển hóa của nó có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là ứng dụng trong hương liệu và y dược Eugenol là thành phần tinh dầu đã được chứng minh là có nhiều đặc tính sinh học như giảm đau, chống oxy hóa, kháng virus, kháng nấm, kháng khuẩn, chống viêm Eugenol cũng thể hiện tác dụng chống trầm cảm, giảm căng thẳng và được sử dụng để điều trị rối loạn động kinh, có đặc tính bảo vệ thần kinh và hoạt tính chống ung thư [6, 7] Mặc dù có nhiều đặc tính quan trọng nhưng eugenol có thể gây kích ứng và dị ứng [39]
1.2.2 Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng biofilm của eugenol
Eugenol đã được chứng minh về hoạt tính kháng vi sinh vật đối với nhiều loài như S aureus, E coli, Pseudomonas aeruginosa, [8-10] và tiềm năng này được quy cho nhóm OH tự do trong cấu trúc của nó Eugenol hoạt động kháng lại vi khuẩn bằng cách làm hỏng màng tế bào chất; là một phân tử kỵ nước, eugenol có thể dễ dàng xuyên qua màng tế bào lipopolysaccharid và đi vào tế bào chất Một khi hiện diện trong tế bào, nó có thể gây ra những thay đổi đối với cấu trúc tế bào, dẫn đến rò rỉ các thành phần nội bào như protein và lipid từ đó gây ra sự ly giải tế bào và gây chết VSV [9, 39, 40]
Eugenol cũng được phát hiện có hoạt tính kháng nấm chống lại nhiều chủng nấm in vitro, bao gồm Candida albicans, Aspergillus niger, Penicillium glabrum, Penicillium italicum, Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae, Trichophyton mentagrophytes, Lenzites betulina, Laetiporus sulphureus và Trichophyton rubrum
Các nghiên cứu chỉ ra rằng eugenol làm rối loạn chức năng màng tế bào, ức chế các yếu tố độc lực và ngăn ngừa sự hình thành màng sinh học của nấm [39] Tác dụng diệt nấm của eugenol ở C albicans chủ yếu là do sự phá vỡ tính toàn vẹn của màng
10 cũng như làm suy yếu đáng kể hệ thống phòng thủ thông qua lactoperoxidase qua trung gian gốc tự do, sau đó dẫn đến tổn thương màng [41]
Một số nghiên cứu đã cho thấy rõ tác dụng kháng vi sinh vật cũng như tác dụng kháng biofilm của eugenol Trong nghiên cứu của Mahmoud và cộng sự (2023) hoạt tính kháng khuẩn của eugenol được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch cho kết quả đường kính vùng ức chế với giá trị trung bình ± SD từ 10 ± 06 mm đến 22 ± 04 mm và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nằm trong khoảng từ 23,0 - 51,0 μg/mL đối với các chủng Helicobacter pylori phân lập lâm sàng và các chủng chuẩn Bên cạnh đó nghiên cứu đã tiến hành đánh giá tác dụng của eugenol đối với sự hình thành biofilm H pylori, kết quả cho thấy khi sử dụng eugenol nồng độ 25 và 50 àg/mL cho tỉ lệ ức chế hỡnh thành biofilm lần lượt là 49,32% và 73,21% [8]
Mukesh và cộng sự (2015) đánh giá tác dụng của eugenol trên đối tượng S aureus kháng methicillin và nhạy cảm với methicillin (MRSA và MSSA) Kết quả cho thấy giá trị MIC của eugenol đối với S aureus dao động từ 0,01% đến 0,04%, với MBC đo được xấp xỉ gấp đôi MIC Không quan sát thấy sự khác biệt về giá trị MIC giữa các chủng phân lập MRSA và MSSA Eugenol ở nồng độ MIC hoặc 2MIC đã loại bỏ một cách hiệu quả biofilm của các chủng lâm sàng MRSA và MSSA Eugenol tại MIC đã làm giảm đáng kể hơn 50% tổng sinh khối biofilm và tại nồng độ 2MIC số lượng VSV trong biofilm giảm 4 log10 CFU/ml [9]
1.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật của các dẫn xuất bán tổng hợp từ eugenol
Eugenol là một monoterpene phenolic tự nhiên thuộc nhóm phenylpropanoid Eugenol chứa ba vị trí hoạt động trong cấu trúc: nhóm hydroxyl, allylic và vòng thơm, làm cho eugenol trở thành nguyên liệu ban đầu quan trọng để tổng hợp tổng thể các sản phẩm tự nhiên có giá trị và các loại thuốc mới Nhóm phenol mang lại cho eugenol không chỉ hoạt tính kháng khuẩn mà còn có khả năng loại bỏ các loại oxy phản ứng Tuy nhiên, việc ứng dụng, xử lý và bảo quản eugenol có thể phức tạp do tính dễ bay hơi, không ổn định và độ hòa tan thấp trong nước Việc kết hợp eugenol trong các cấu trúc phân tử cao hoặc bán tổng hợp tạo dạng chất mới là một chiến lược hiệu quả để tận dụng phần hoạt tính, phát triển và sử dụng lâu dài hoạt chất dễ bay hơi này [42]
11 Trong nghiên cứu của Eyambe và cộng sự (2011), eugenol là thành phần chính của tinh dầu đinh hương (Eugenia caryophyllata) và chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động sinh học của tinh dầu, bao gồm cả hoạt động kháng khuẩn Nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất eugenol là epoxy-eugenol và 3-bromo- 2-hydroxy eugenol Hoạt tính kháng khuẩn của 2 dẫn xuất chống lại S aureus ATCC
25923 đã được đánh giá và so sánh với hoạt tính của eugenol và doxycline (đối chứng) Các tác giả đã quan sát thấy rằng epoxy-eugenol hoạt động mạnh hơn tiền chất eugenol, trong khi dẫn xuất bromo có hoạt tính tương tự như eugenol Giá trị MIC và MBC của hợp chất epoxy-eugenol là 57 và 115 μg/mL so với 1,2 và 2,4 μg/mL với đối chứng và 115 và 230 μg/mL đối với eugenol [43]
Sandra Milena Leal Pinto và cộng sự (2019) đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol cho kết quả isoeugenol và methyl isoeugenol có khả năng ức chế lớn nhất đối với nấm da T mentagrophytes, với MIC lần lượt là 62,5 và 500 μg/mL và MFC lần lượt là 125 và 500 μg/mL, O-ethyl eugenol và O-butyl eugenol có MIC là 125 – 250 μg/mL và MFC từ 250 –500 μg/mL được xác định với ba loài nấm da: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes và
Trichophy tontonsurans Trong số các dẫn xuất này, methyl isoeugenol ở nồng độ
300 và 100 μg/mL, được phát hiện là ức chế hoàn toàn (100 %) sự phát triển xuyên tâm sợi nấm của cả ba loài sau 20 ngày điều trị [44]
Trong nghiên cứu “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của 1,2,3- triazoles mới có nguồn gốc từ eugenol làm tác nhân kháng vi khuẩn” cho kết quả 16 hợp chất bán tổng hợp nguồn gốc từ eugenol có các đặc tính ức chế tăng trưởng VSV tốt Trong đó có 3 dẫn xuất cho thấy tiềm năng phát triển thành nguyên liệu trong quá trình tìm kiếm các phân tử có hoạt tính sinh học chống lại vi khuẩn Mycobacteria đang phát triển nhanh chúng, bao gồm ether benzylic (MIC = 48,89 àM) chống lại
Mycobacterium abscessus ATCC 19977, O - galactosid (MIC = 31,76 àM) chống Mycobacterium massiliense ATCC 48898 và sulfonate (MIC = 88,64 àM) chống lại Mycobacterium fortuitum ATCC 6841 [45].
Một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol được sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu này chuyển hóa eugenol, hợp chất được tách từ một số tinh dầu
12 Việt Nam, để tạo thành các sản phẩm isoeugenol, vanilin, licarin A, hỗn hợp đồng phân licarin, feruloylmethan, là những sản phẩm có hoạt tính sinh học phong phú, có tính ứng dụng cao trong hương liệu, phụ gia thực phẩm và đặc biệt là nguyên liệu cho hóa dược
Hình 1.4 Quy trình bán tổng hợp một số hợp chất từ eugenol
Trong số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol, vanilin và licarin A là hai sản phẩm của quá trình oxi hóa isoeugenol Ngoài ra vanillin còn được sử dụng như chất trung gian trong tổng hợp xeton α, β-không no feruloylmethan Các nghiên cứu bán tổng hợp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài
Isoeugenol (2-methoxy-4-(1-propenyl) phenol) là một hợp chất tự nhiên, được tìm thấy trong nhiều tinh dầu của hạt nhục đậu khấu, đinh hương và quế, và được sử dụng trong nước hoa, xà phòng, chất tẩy rửa, làm mát không khí và làm chất tạo hương vị trong mỹ phẩm và thực phẩm Isoeugenol đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn tương đương hoặc thậm chí vượt trội so với isoform eugenol có khả năng kháng khuẩn cao Hoạt tính kháng khuẩn của isoeugenol đã được đề xuất là do nhóm hydroxyl tự do của nó và vị trí của các liên kết đôi ở vị trí α, β của chuỗi bên và nhóm methyl ở vị trí γ Isoeugenol có hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng
13 VSV như E coli, Bacillus licheniformis, Micrococcus luteus, P aeruginosa, S aureus [46, 47]
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của isoeugenol (2-methoxy-4-(1-propenyl) phenol) Trong nghiên của Hyldgaard và cộng sự (2015), isoeugenol ức chế sự phát triển của tế bào E coli ở nồng độ 0,6 mg/mL và tế bào L innocua ở nồng độ 1 mg/mL Isoeugenol ở nồng độ 2MIC có khả năng làm giảm lượng tế bào L innocua đến mức không thể phát hiện [46]
Hay trong nghiên cứu của Galvão và cộng sự (2022), isoeugenol là một lựa chọn để đánh giá tác dụng kháng VSV trên chủng P aeruginosa Isoeugenol có hoạt tớnh khỏng khuẩn đỏng kể, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 64àg/mL và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 128àg/mL, và được coi là cú tỏc dụng diệt khuẩn đối với loài này [48]
Vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) là thành phần chính của đậu vani và được sản xuất tự nhiên thông qua quy trình xử lý nhiều bước, tuy nhiên 90% vanilin hiện đang sử dụng được sản xuất tổng hợp từ lignin, eugenol hoặc guaiacol Vanilin thường được công nhận là an toàn và được sử dụng làm hương liệu/mùi thơm trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước hoa Vanilin tổng hợp cũng được sử dụng làm chất trung gian trong công nghiệp hóa chất và dược phẩm để tổng hợp thuốc diệt cỏ và thuốc [49] Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo đặc tính kháng khuẩn của vanilin, thể hiện đặc tính sinh học tương tự với các hợp chất phenolic phổ biến trong tinh dầu thực vật như carvacrol, thymol và eugenol Các thí nghiệm in vitro đã chứng minh tác dụng kháng khuẩn của vanilin đối với các vi khuẩn, nấm men và nấm mốc khác nhau liên quan đến thực phẩm Hơn nữa, độc tính tế bào của vanilin thấp hơn so với các hợp chất phenolic khác đã được báo cáo, cho thấy tiềm năng như một chất kháng khuẩn an toàn [49]
14 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) Trong nghiên cứu của Peiyao Chen và cộng sự (2023), vanilin cho thấy hoạt tính kháng lại chủng E coli O157:H7 với MIC là 2 mg/mL Nghiên cứu cho thấy tổn thương màng tế bào và gián đoạn chuyển hóa năng lượng là những cơ chế quan trọng tạo nên tác dụng ức chế của vanilin đối với vi khuẩn E coli O157:H7 [49]
Trong một nghiên cứu khác của DJ Fitzgerald và cộng sự (2004), vanilin cho giá trị MIC với các chủng E coli, Lactobacillus plantarum và L innocua lần lượt là
1.3.1.3 Licarin A và hỗn hợp đồng phân licarin
Licarin A (C20H22O4), còn được gọi là dehydrodiisoeugenol, là một neolignan thuộc nhóm phenol Licarin A là một tinh thể không màu có nhiệt độ nóng chảy 132–
133 °C và có mùi thơm nồng Hợp chất này ít tan trong nước và tan tốt trong các dung môi hữu cơ như etyl acetat và dilometan Có hai cách để tổng hợp Licarin A: hóa học cổ điển và xúc tác sinh học [51]
Năm 1973, hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ vỏ cây Myristica fragrans, sau này nó thường được thu từ các họ thực vật khác nhau như
Aristolochiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae và Piperaceae, mặc dù người ta biết rằng hợp chất này có thể được tìm thấy ở nhiều nồng độ khác nhau (dao động từ 0,08– 0,53 mg/g thực vật) tùy thuộc vào loài Tuy nhiên, licarin A đã thu được bằng quá trình oxy hóa isoeugenol và cấu trúc của nó đã được xác định trước khi nó được phân lập từ nguồn tự nhiên [51]
Licarin A được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau với năng suất thấp
Do đó, việc tổng hợp licarin A là một giải pháp thay thế để thu được số lượng đáng kể hợp chất này Theo nghĩa này, tổng hợp hóa học cổ điển từ isoeugenol tạo ra sản lượng tốt nhất Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng Licarin A cho thấy một loạt
15 các hoạt động sinh học như kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa và kháng viêm [51]
Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của licarin A (dehydrodiisoeugenol)
Licarin A có hiệu quả chống lại các chủng Mycobacteria Hơn nữa, licarin A còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại áp xe Mycobacteria (MIC = 9,76 μg/mL), Mycobacteria fortuitum (39,06 μg/mL) và Mycobacteria massiliense (39,06 μg/mL) [51]
Sự phá hủy biofilm của các chủng này cũng đã được thử nghiệm, nhưng không quan sát thấy hoạt động đáng kể nào Ngoài ra, người ta còn phát hiện ra rằng licarin
A có hoạt tính chống lại các chủng Mycobacteria không gây bệnh lao (MIC = 3,12– 6,25 μg/mL) Hơn nữa, licarin A đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại bốn chủng Mycobacteria đa kháng thuốc và 12 chủng phân lập lâm sàng (MIC = 3,12–25 àg/mL) [51]
(-)-Licarin A đã được thử nghiệm trên mô hình động vật mắc bệnh lao, gây bệnh bằng M tuberculosis H37Rv hoặc MDR, trong đó liều 5 mg/kg làm giảm trực khuẩn phổi vào ngày điều trị thứ 30 và giảm đáng kể tình trạng viêm phổi ở những ngày điều trị 30 và 60 của điều trị Tuy nhiên, hợp chất này không có hoạt tính ở một số vi khuẩn, chẳng hạn như E coli, P fluorescens và L monocytogenes [51]
Feruloylmethan (C11H12O3) là một hợp chất α, β ceton không no có cấu trúc tương tự curcumin (thiếu nhóm methoxy trong vòng benzen) Tuy nhiên, so với curcumin, feruloylmethan ít được nghiên cứu hơn Một số nghiên cứu cho thấy feruloylmethan là sản phẩm thủy phân kiềm của curcumin, có tác dụng sinh học tuy nhiên tác dụng kém hơn đáng kể so với curcumin [52]
16 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của feruloylmethan
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và nguyên vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm eugenol và 05 hợp chất bán tổng hợp với 08 chủng VSV bao gồm các chủng vi khuẩn Gram (-), Gram (+), vi nấm và 04 kháng sinh
Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Eugenol và hợp chất bán tổng hợp từ eugenol Nguồn cung cấp
1 Eugenol (Eu) Các chất bán tổng hợp được tổng hợp và khẳng định cấu trúc tại Phòng thí nghiệm Hóa học Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
5 Hỗn hợp đồng phân Licarin (LT1)
Các chủng VSV nghiên cứu
1 Candida albicans ATCC 10231 Các chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tế bào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ và Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương Được lưu trữ ở - 80 0 C tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa sinh, khoa Công nghệ sinh
8 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Các dụng cụ thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
Bảng 2.2 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Trang thiết bị, máy móc Nguồn gốc
1 Cân kỹ thuật Sartorius – Đức
2 Cân phân tích Sartorius – Đức
3 Tủ lạnh Sanyo – Nhật Bản
6 Tủ cấy vô khuẩn BioAir - Italy
7 Nồi hấp tiệt khuẩn 50L ALP – Nhật Bản
8 Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc
10 Pipet 1000-200; 200-20; 20-1 àL Nichiryo – Nhật Bản
11 Pipet đa kênh AHN – Đức
12 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc
13 Đĩa 96 giếng SPL – Hàn Quốc
STT Trang thiết bị, máy móc Nguồn gốc
14 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang - UV
15 Máy quang phổ UV-VIS
Dụng cụ thủy tinh: bình nón, cốc có mỏ, ống đong, ống nghiệm có nút xoáy, pipet, đĩa petri… Trung Quốc Nghiên cứu sử dụng các hóa chất như sau:
Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Hãng – nước sản xuất
1 Môi trường lỏng Mueller Hinton (MHB) Merck – Đức
2 Môi trường lỏng Tryptic Soy (TSB) Merck – Đức
3 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Chemical
5 Tím tinh thể (Crystal violet) Sigma-Aldrich
2.1.2.2 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
MT1 Môi trường lỏng MHB: dạng bột pha sẵn: 2,1 g/100ml H2O
MT3 Thạch thường TSA (g/100ml)
MT4 SDA thạch = MT2 + thạch Agar
MT5 Môi trường lỏng TGN
MT6 Môi trường đệm PBS (g/L)
Nội dung nghiên cứu
Từ mục tiêu của đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol”, nội dung chi tiết của nghiên cứu như sau:
2.2.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
- Xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của VSV (MIC) và nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
- Đánh giá khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của các hợp chất có hoạt tính tốt
2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng biofilm Staphylococcus aureus ATCC 33591 của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
- Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
- Đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus của các hợp chất có hoạt tính tốt ở các điều kiện: đa nồng độ, theo thời gian và kết hợp với kháng sinh
- Một số đánh giá về độ an toàn và cơ chế của hợp chất sử dụng trong nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa chủng
Các chủng sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các chủng E coli, S aureus, C albicans, K pneumoniae, B subtilis, P aeruginosa, S enterica được lưu ở - 80 0 C tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa sinh, khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội, sau đó được cấy lên thạch TSA hoặc SDA trước khi sử dụng Tất cả các thao tác cấy được thực hiện trong tủ cấy vô khuẩn Tủ cấy được tiệt trùng bằng cách lau sạch bằng cồn 96 0 C và bật đèn UV một giờ
Cân, đong các thành phần theo công thức môi trường (mục 2.1.2.2) Hòa tan các thành phần, đậy kín bằng nút bông không thấm nước hoặc nắp xoáy Hấp tiệt khuẩn ở 115 0 C, 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn xong, các bình đựng môi trường lỏng được bảo quản trong tủ lạnh Các bình đựng môi trường thạch được phân phối lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh
Hoạt hóa giống thực hiện 1 lần/tuần, sử dụng môi trường thạch tương ứng với VSV, dùng que cấy vô trùng lấy một vòng VSV từ ống giống cấy sang bề mặt thạch tương ứng theo hình zigzag Các chủng sau đó được ủ 37 0 C
2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do
2.3.2.1 Phương pháp xác định MIC với các đối tượng vi sinh vật
➢ Quy trình đánh giá MIC:
Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của VSV (MIC) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng sử dụng canh thang MHB cho vi khuẩn hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans trên đĩa 96 giếng theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ (Clinical & Laboratory Standards Institute – CLSI) [57]
Một số hợp chất bán tổng hợp được hòa tan trong dung môi phù hợp chứa Tween
80 - nồng độ 4% với eugenol (deugenol = 1,35), isoeugenol (disoeugenol = 1,1) và dung môi hữu cơ DMSO với vanilin, FT5, LT1, LT4, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong MHB Các mẫu thử được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng
23 (bao gồm 8 hàng từ A đến G, 12 cột từ 1 đến 12), từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân
Hỗn dịch vi sinh vật có độ đục tương đương 0,5 McFarland được chuẩn bị trong PBS, với các khuẩn lạc trên đĩa thạch TSA hoặc SDA cho C albicans được ủ 37°C, qua đêm Hỗn dịch này được pha loãng 100 lần trong MHB hoặc Sabouraud-dextrose cho C albicans để thu được hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x10 6 vi khuẩn/ml và 1,5x10 4 vi nấm/ml Hỗn dịch làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37℃ trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật Việc đánh giá bằng mắt được xác nhận lại bằng việc bổ sung natri resazurin (20 àl nồng độ 0,1 àg/mL) vào cỏc giếng, ủ 30 phỳt ở nhiệt độ phũng, trỏnh ỏnh sỏng Sự hiện diện của vi khuẩn sống được đánh giá thông qua sự khử hóa resazurin màu xanh lam, không huỳnh quang thành resorufin màu hồng, phát huỳnh quang MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không có sự tăng lên của cường độ huỳnh quang Tất cả các thử nghiệm được thực hiện 3 lần độc lập
Bảng 2.4 Mô tả sắp xếp thí nghiệm xác định MIC
2.3.2.2 Phương pháp xác định MBC với các đối tượng vi sinh vật
Xác định nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) dựa trên đĩa xác định MIC, tất cả các giếng không mọc được cấy lên đĩa thạch để xác định MBC Sau khi ủ ở 37 0 C trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc xuất hiện
Nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất có khả năng diệt lớn hơn 99,9% lượng vi sinh vật so với thời điểm ban đầu
2.3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi sinh vật ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ các mẫu thử được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC
Cho hỗn dịch VSV tiếp xúc với một số hợp chất bán tổng hợp nồng độ khác nhau Dãy nồng độ từ cao đến giá trị bằng với MIC (16MIC, 8MIC, 4MIC, 2MIC, MIC) Mẫu được ủ 37ºC trong 20 giờ Sau 20 giờ, lượng VSV sống trong mẫu, trước và sau khi tiếp xúc với mẫu thử, sẽ được đánh giá bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch Mẫu sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp trong PBS, sau đó được cấy lên môi trường thạch phù hợp, TSA cho các vi khuẩn, SDA cho các vi nấm Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng phương pháp đếm sau khi ủ ở 37ºC trong 24 giờ Khả năng diệt khuẩn theo nồng độ của mẫu được đánh giá dựa trên lượng VSV tại thời điểm trước khi tiếp xúc với mẫu thử và sau khi tiếp xúc với mẫu thử Kết quả được biểu diễn dưới dạng hiệu số log10 CFU/ml (delta log10 CFU/ml hoặc ∆log10
2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus
2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm S aureus trên đĩa 96 giếng
Biofilm S aureus được tạo trên đĩa 96 giếng đáy bằng của SPL, sử dụng nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD620 nm (tương đương 10 7 CFU/mL), trong môi trường nuôi cấy TGN (TSB có bổ sung NaCl và glucose), thể tích 200 μl/giếng, ủ ở 37°C trong
2.3.3.2 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu của biofilm S aureus
Sau 24 giờ nuôi cấy tạo biofilm, môi trường nuôi cấy được thay mới (chứng dương) hoặc được thay thế bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung mẫu thử sử dụng đơn hoặc kết hợp với kháng sinh (Moxifloxacin, Vancomycin) Biofilm được ủ tiếp trong 24 giờ ở 37°C Nghiên cứu đánh giá 2 chỉ tiêu chính của biofilm S aureus là lượng vi sinh vật sống trong biofilm được đánh giá dựa trên khả năng chuyển hóa resazurin (cường độ huỳnh quang ở mẫu thử được so sánh với mẫu chứng dương - không bổ sung mẫu thử hoặc kháng sinh), đánh giá CFU bằng phương pháp cấy đếm và tổng sinh khối bằng nhuộm với tím tinh thể [20, 58]
25 Đánh giá lượng VSV sống trong biofilm
➢ Lượng VSV được đánh giá trực tiếp bằng phương pháp đếm CFU trên đĩa thạch Mẫu cần đếm số lượng CFU sẽ được rửa nhẹ nhàng với PBS Vi sinh vật trong biofilm sẽ được phá ra khỏi biofilm bằng nước cất vô khuẩn, bằng cách hút nhả với pipet tối thiểu 20 lần, sau đó sẽ được vortex thật kỹ hoặc siêu âm trong vòng 1 phút nếu cần, để tách rời hoàn toàn các khuẩn lạc Mẫu sau đó sẽ được pha loãng trong PBS theo cơ số log, đến nồng độ phù hợp Khuẩn lạc sẽ được đếm trên đĩa thạch TSA sau khi cấy trải và ủ 24 giờ ở 37 o C Nồng độ được chọn là nồng độ có từ 30-300 khuẩn lạc trên đĩa Kết quả được biểu diễn dưới dạng log10 CFU/ml hoặc ∆log10
CFU/ml khi so sánh với chứng
➢ Lượng VSV sống được đánh giá gián tiếp thông qua khả năng chuyển hóa resazurin (không huỳnh quang) thành resorufin (phát huỳnh quang) của vi sinh vật sống Mẫu được rửa với PBS rồi sau đó được ủ với 200 μl resazurin nồng độ 10mg/L, trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau 30 phút ủ, mẫu sẽ được đo cường độ huỳnh quang trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 560 và 590nm Cường độ huỳnh quang của các mẫu thử sẽ được so sánh với mẫu chứng dương theo giá trị phần trăm (% RF) Đánh giá tổng sinh khối biofilm
Tổng sinh khối biofilm sẽ được đánh giá thông qua việc nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (Crystal Violet- CV) Mẫu biofilm được rửa nhẹ với PBS, loại lượng PBS còn sót với giấy thấm Biofilm sau đó sẽ được sấy khô để cố định ở 60°C trong tối thiểu 2 giờ Mẫu sau đó sẽ được nhuộm với tím tinh thể (nồng độ 50mg/L) trong vòng 15 phút, ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Các mẫu biofilm sau đó được loại
CV dư và rửa nhẹ nhàng với nước RO CV gắn vào biofilm sau đó được hòa tan trong acid acetic 66% trong vòng 1 giờ, tránh ánh sáng Các đĩa mẫu được đo hấp thụ UV tại bước sóng 570nm trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux Kết quả thu được biểu diễn dưới dạng tỉ lệ % tổng sinh khối biofilm so với chứng dương (%CV), thực hiện trong cùng một điều kiện thử nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tối thiểu 3 lần độc lập
2.3.4 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch
Chuẩn bị môi trường tương tự ở mục 2.3.1 Cấy các VSV E coli, S aureus, K pneumoniae, B subtilis, P aeruginosa, S enterica lên đĩa thạch TSA hoặc SDA cho
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Hoạt tính kháng vi sinh vật ở dạng tự do của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
Thực hiện thử nghiệm MIC để xác định được nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển vi sinh vật của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol bao gồm isoeugenol, vanilin, feruloylmethan (FT5), hỗn hợp licarin (đồng phân) (LT1) và licarin A (LT4) Giá trị MIC trên các chủng VSV trình bày trong bảng 3.1
Trong 6 hợp chất sử dụng đánh giá khả năng kháng VSV ở dạng tự do, mẫu LT4 cho giá trị MIC thấp nhất Cụ thể như sau:
Eugenol, isoeugenol thể hiện tác dụng ức chế 8/8 chủng VSV thử nghiệm với giá trị MIC cao dao động từ 1270 - 10160 mg/L và 537 – 8594 mg/L
03 hợp chất bán tổng hợp gồm vanilin, FT5 và LT1 không xác định được MIC ở nồng độ thử nghiệm cao nhất - đều cho giá trị MIC > 256 mg/L với tất cả các chủng VSV thử nghiệm (trừ giá trị MIC của vanilin với C albican ATCC 20132 là 32 mg/L)
Hợp chất bán tổng hợp LT4 thể hiện hoạt tính ức chế 7/8 chủng VSV thử nghiệm Với các chủng Gram (+) như S aureus, B subtilis cho giá trị MIC dao động từ 0,03 – 0,25 mg/L; Gram (-) như E coli, S enterica, P aeruginosa với MIC từ 0,03 – 2 mg/L Với chủng vi khuẩn gram (-) K pneumoniae cho giá trị MIC = 256 mg/L và vi nấm C albican không xác định được MIC ngay ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (>256mg/L)
Khi so sánh giá trị MIC các mẫu thử với MIC kháng sinh tham chiếu, nhận thấy LT4 có giá trị MIC tương đương với MIC một số KS trên các chủng VSV như
E coli, P aeruginosa Đặc biệt, LT4 có giá trị MIC thấp hơn so với MIC Meropenem trên S aureus ATCC 33591 và B subtilis với giá trị MIC lần lượt là 0,125 - 0.25 mg/L và 0,03 mg/L Đối với chủng E coli, MIC của LT4 = 0,03 mg/L thấp hơn so với MIC của Moxifloxacin
28 Bảng 3.1 Giá trị MIC (mg/L) của eugenol, một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol và kháng sinh tham chiếu trên các chủng vi sinh vật
Eugenol Isoeugenol Vanilin FT5 LT1 LT4 Kháng sinh tham chiếu
Sau khi thu được kết quả MIC, tiến hành thực hiện đánh giá MBC theo phương pháp đề cập trong mục 2.3.2.2, giá trị MBC của các mẫu trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2 Giá trị MBC (mg/L) của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol trên các chủng vi sinh vật
MBC * (mg/L) Eugenol Isoeugenol Vanilin FT5 LT1 LT4
*MBC: - 3 log10 CFU/ml so với lượng VSV tại thời điểm t0 (tương đương với giảm 99,9% số lượng VSV so với thời điểm ban đầu) Bảng 3.2 cho thấy LT4 là mẫu bán tổng hợp có giá trị MBC nhỏ nhất trong tất cả các mẫu đánh giá MBC của eugenol, isoeugenol, vanilin, FT5 và LT1 trên các chủng VSV đều cho giá trị > 256 mg/L (trừ giá trị MBC của vanilin với C albican ATCC 20132 là 128 mg/L), trong khi LT4 thể hiện hoạt tính kháng 7/8 chủng VSV
30 với các chủng Gram (+) như S aureus, B subtilis cho giá trị MBC từ 0,03 - 1 mg/L; Gram (-) như E coli, S enterica, P aeruginosa với MBC từ 0,03 – 8 mg/L Với chủng vi khuẩn gram (-) K pneumoniae cho giá trị MBC = 256 mg/L và vi nấm C albican không xác định được MBC ở ngay nồng độ thử nghiệm cao nhất (>256mg/L)
3.1.3 Kết quả diệt vi sinh vật ở dạng tự do theo nồng độ của mẫu LT4
Khả năng diệt VSV ở dạng tự do theo nồng độ của mẫu LT4 được thực hiện với một dãy nồng độ bao gồm 16MIC, 8MIC, 4MIC, 2MIC, MIC (mg/L), điều kiện thực hiện thí nghiệm tương tự với thực hiện MIC Kết quả biểu diễn trong hình 3.1
Hình 3.1 Đáp ứng của mẫu LT4 với các chủng VSV ở dạng tự do tại các nồng độ
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
16MIC 8MIC 4MIC 2MIC MIC
31 Hình 3.1 cho thấy mẫu LT4 thể hiện tác dụng diệt khuẩn tốt, ở nồng độ 2MIC có khả năng diệt > 3 log10 CFU/ml (tương đương với làm giảm 99,9% lượng VSV ở dạng tự do) với hầu hết các chủng VSV thử nghiệm (trừ S enterica)
Với S enterica, mẫu bán tổng hợp LT4 từ nồng độ MIC đến 8MIC cho hiệu quả diệt VSV tương tự nhau, làm giảm 2 log10 CFU/ml (tương đương với giảm 99% lượng VSV ở dạng tự do) và ở nồng độ 16MIC, hiệu quả diệt khuẩn của mẫu LT4 tăng cường, làm giảm > 3 log10 CFU/ml S enterica
Nhận thấy hoạt tính diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ LT4 được sử dụng Nồng độ LT4 tăng cho tác dụng diệt khuẩn tăng điển hình trên các chủng E coli, S aureus và P aeruginosa.
Hoạt tính kháng biofilm S aureus ATCC 33591 của một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng biofilm S aureus của eugenol và một số hợp chất bán tổng hợp từ eugenol
Thực hiện khảo sát tác dụng kháng biofilm S aureus của eugenol và các hợp chất bán tổng hợp từ eugenol ở nồng độ 100 mg/L và 1000 mg/L
Kết quả đánh giá số lượng S aureus còn sống trong biofilm bằng phương pháp gián tiếp thông qua chuyển hóa resazurin được trình bày trong hình 3.2
Hình 3.2 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của eugenol và một số mẫu bán tổng hợp từ eugenol ở nồng độ 100 mg/L và 1000 mg/L Ở nồng độ 100 mg/L, mẫu LT4 làm giảm chuyển hóa resazurin khoảng ~25%
C on tr ol Eu Iso Va ni
C on tr ol Eu Iso Va ni
32 giá trị RF, các mẫu còn lại làm giảm không đáng kể giá trịRF so với chứng Ở nồng độ 1000 mg/L, các mẫu làm giảm giá trị RF một cách rõ rệt, điển hình mẫu LT4 làm giảm 47,5% giá trị RF, các mẫu eugenol, isoeugenol, LT1, FT5 làm giảm khoảng 15-25% giá trị RF so với chứng (sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 90% S aureus trong biofilm) khi sử dụng ở nồng độ là 100 mg/L 2 chất bán tổng hợp LT1 và FT5 chỉ làm giảm 1 log10 CFU/ml ở nồng độ 1000 mg/L Khi so sánh với tác dụng kháng biofilm giữa mẫu gốc eugenol và các chất bán tổng hợp thì nhận thấy tác dụng của mẫu bán tổng hợp LT4 vượt trội hơn cả Chất gốc eugenol và 2 chất bán tổng hợp isoeugenol và vanilin có tác động kém đến S aureus trong biofilm chỉ làm
50 giảm khoảng 0,4 log10 CFU/ml khi dùng ở nồng độ cao 1000 mg/L Đồng thời, nghiên cứu chỉ ra rằng tất cả các hợp chất sử dụng trong đánh giá biofilm đều không làm thay đổi đáng kể tổng sinh khối của biofilm so với chứng Các kết quả này cho thấy các hợp chất bán tổng hợp có tác động trực tiếp lên S aureus trong biofilm Đồng thời nghiên cứu chỉ ra mẫu bán tổng hợp có hiệu quả hơn trong việc diệt khuẩn S aureus trong biofilm so với chất gốc eugenol, xác nhận rằng việc sửa đổi cấu trúc của các hợp chất trong nghiên cứu này rất quan trọng trong việc phát hiện ra các phân tử hoạt tính sinh học mới
Ngoài ra, khi so sánh tác dụng kháng biofilm của LT4 với một số kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu về hoạt tính kháng biofilm S aureus của Yvan Diaz Iglesias và cộng sự (2019) có thể thấy, LT4 là đối tượng tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng biofilm S aureus và ứng dụng trong thực tế Trong nghiên cứu của Yvan Diaz Iglesias đánh giá hoạt tính của kháng biofilm của 2 chủng S aureus ATCC 33591 (MRSA) và ATCC 25923 (MSSA) tạo biofilm được thực hiện trên 7 loại kháng sinh trong môi trường TGN Kết quả cho thấy rất ít kháng sinh cho hiệu quả diệt trên 99% VSV ở nồng độ thấp Một số kháng sinh như meropenem, azithromycin, rifampin, ciprofloxacin, tobramycin, vancomycin khi sử dụng nồng độ
100 mg/L cho hiệu quả giảm được 1 log10 CFU/mL (tương đương với giảm 90% S aureus trong biofilm) [58] Từ thí nghiệm nhận thấy LT4 với hiệu quả diệt khuẩn lên tới 1,5 log10 CFU/ml khi sử dụng ở nồng độ 100 mg/L và 2,5 log10 CFU/ml ở nồng độ
1000 mg/L sẽ là hợp chất tiềm năng cần được nghiên cứu sâu hơn về tác động lên biofilm của S aureus
Thực hiện đánh giá sâu hơn hiệu quả kháng biofilm của LT4 thông qua thử nghiệm đa nồng độ để đánh giá về tác dụng của hợp chất trên biofilm Kết quả cho thấy ở nồng độ thấp, hiệu quả diệt khuẩn trong biofilm của LT4 chưa thực sự nổi bật và chưa thể tiêu diệt được hết vi khuẩn S aureus Quan sát thấy khi nồng độ của chất bán tổng hợp LT4 tăng thì hiệu quả tác động lên VSV trong biofilm tăng (LT4 thể hiện tác dụng diệt khuẩn trong biofilm phụ thuộc vào nồng độ) Trong một nghiên cứu trước đó của chúng tôi, khi đánh giá khả năng diệt khuẩn trong biofilm của Moxifloxacin theo nồng độ cho thấy Moxifloxacin cũng là kháng sinh diệt khuẩn phụ
51 thuộc vào nồng độ Nồng độ kháng sinh tăng thể hiện hoạt tính diệt S aureus trong biofilm tăng và tại nồng độ thử nghiệm cao nhất 1000 mg/L, Moxifloxacin làm giảm
Nghiên cứu còn đánh giá khả năng diệt S aureus theo thời gian của mẫu LT4, kết quả cho thấy LT4 thể hiện tác dụng diệt khuẩn trong biofilm mạnh nhất trong 24 giờ đầu, và tiếp tục diệt S aureus trong các giờ tiếp theo tuy nhiên có xu hướng chậm hơn 24 giờ đầu Tại thời điểm 72 giờ sau khi tiếp xúc với mẫu LT4, S aureus trong biofilm giảm khoảng 99,9% so với thời điểm ban đầu Kết quả này tương tự với tác dụng diệt khuẩn trong biofilm theo thời gian của kháng sinh tham chiếu Moxifloxacin
Từ các nghiên cứu trên chúng tôi cho rằng một chiến lược kết hợp mẫu bán tổng hợp từ eugenol với các kháng sinh điều trị sẽ tối ưu được hiệu quả diệt VSV trong biofilm nhằm hiệp đồng tác dụng của chất bán tổng hợp và kháng sinh đồng thời giúp giảm lượng kháng sinh phải sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn hình thành biofilm S aureus Nghiên cứu lựa chọn 2 kháng sinh - moxifloxacin là một kháng sinh hiệu quả trong diệt vi khuẩn trong biofilm và vancomycin là tiêu chuẩn vàng trong điều trị tụ cầu vàng MRSA để tiến hành đánh giá khả năng tăng cường hiệu quả tác động lên S aureus trong biofilm Tuy nhiên kết quả nghiên cứu cho thấy, không có sự thay đổi rõ rệt giữa sử dụng các mẫu bán tổng hợp ở dạng đơn và khi kết hợp với kháng sinh Giảm chuyển hóa resazurin của S aureus và lượng VSV trong biofilm giữa các mẫu sử dụng đơn hoặc kết hợp với kháng sinh ở cùng nồng độ sử dụng không có sự khác biệt lớn Đồng thời kết quả cho thấy không có sự thay đổi về tổng sinh khối màng biofilm giữa các mẫu Kết quả này một lần nữa nhấn mạnh hợp chất bán tổng hợp từ eugenol LT4 tạo ra hiệu quả kháng biofilm thông qua tác động trực tiếp lên S aureus trong biofilm mà không làm hỏng cấu trúc màng Tương tự với kết quả trong nghiên cứu của Diogo Teixeira Carvalho và cộng sự (2020) khi đánh giá hoạt tính kháng biofilm Mycobacteria (M massiliense, M fortuitum và M abcessus) chỉ ra rằng licarin A và các dẫn xuất của licarin A được xác định là không có chất nào có thể phá hủy màng biofilm của Mycobacteria đã hình thành trước đó tuy nhiên cả licarin A và dẫn xuất của nó có thể ức chế sự hình thành biofilm ở một mức độ nào
52 đó phụ thuộc vào nồng độ chất sử dụng Nghiên cứu này cho rằng một số yếu tố liên quan đến chu trình sinh học của biofilm có thể giải thích khả năng kháng cự cao của cấu trúc biofilm với các chất kháng khuẩn sau khi nó được hình thành Trong số các yếu tố này, có thể nêu bật khó khăn trong việc thâm nhập biofilm do sự gia tăng sức đề kháng vật lý gây ra bởi sự hiện diện của các chất đa bào ngoại bào, làm trì hoãn hoặc thậm chí ngăn chặn sự khuếch tán của thuốc hoạt động [66]
Một số đánh giá về độ an toàn và cơ chế tác dụng của mẫu bán tổng hợp từ eugenol
Sau đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật ở dạng tự do và kháng biofilm S aureus của eugenol và một số chất bán tổng hợp từ eugenol bao gồm isoeugenol, vanilin, feruloylmethan (FT5), licarin A (LT4), hỗn hợp licarin (đồng phân) (LT1), tiến hành xác định độc tính đánh giá qua ly giải tế bào hồng cầu giúp xác định mức độ an toàn của các chất này khi được sử dụng trong cơ thể Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất dùng trong nghiên cứu đều không có độc tính ly giải tế bào hồng cầu, các hợp chất đều không gây tan máu đáng kể, % tan máu thấp ≤ 10% Hợp chất bán tổng hợp đáng chú ý nhất trong nghiên cứu này là mẫu LT4 (licarin A) - trong một vài nghiên cứu khác cũng chỉ ra licarin A không tạo ra tác dụng độc hại và có độc tính thấp [51]
Ngoài ra, dựa trên tính chất kháng khuẩn in vitro tiềm năng qua nghiên cứu thực nghiệm, thực hiện nghiên cứu các quá trình tương tác liên phân tử giữa enzyme đích và LT4 (licarin A) bằng phương pháp nghiên cứu mô phỏng docking phân tử để đánh giá tổng quát tiềm năng của hợp chất trong việc ức chế các enzyme thông qua các trạng thái liên kết được hình thành cho thấy licarin A là chất ức chế DNA GyrB tiềm năng Cơ chế tác dụng này tương tự với cơ chế tác dụng lên VSV của nhóm kháng sinh quinolon là nhóm kháng sinh phổ rộng, được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Hoạt động của quinolon dựa trên cơ chế ức chế hai enzyme topoisomerase quan trọng: DNA gyrase (gồm hai tiểu đơn vị GyrA và GyrB) và topoisomerase IV DNA gyrase và topoisomerase IV là những enzyme thiết yếu cho quá trình sao chép DNA của vi khuẩn Chúng giúp tháo xoắn và tái xoắn DNA, tạo điều kiện cho quá trình sao chép diễn ra Quinolon liên kết với DNA gyrase và
53 topoisomerase IV, ngăn cản hoạt động của chúng dẫn đến DNA không thể được tháo xoắn và tái xoắn đúng cách từ đó gây ra gãy DNA và làm gián đoạn quá trình sao chép, dẫn đến chết tế bào vi khuẩn [69, 70]
Enzyme GyrB đóng vai trò thiết yếu trong việc kiểm soát cấu trúc liên kết DNA Enzyme này phổ biến trong tế bào vi khuẩn nhưng không xuất hiện trong cơ thể người Nhờ đặc điểm này cùng với việc cấu trúc sinh học của GyrB được nghiên cứu kỹ lưỡng, enzyme này, cùng với enzyme DNA gyrase nói chung, trở thành mục tiêu tiềm năng trong việc phát triển các loại kháng sinh mới [71] Ngoài ra, một số nhóm cấu trúc ức chế GyrB khác cũng đã được nghiên cứu và phát triển như 9H- pyrimido[4,5-b] indole cho thấy hoạt tính ức chế enzyme mạnh chống lại M tuberculosis GyrB, đồng thời cũng có hiệu quả đáng kể chống lại các chủng M tuberculosis kháng quinolone, isoniazid và rifampicin hay hợp chất furan-2- carboxamide và thiophene-2-carboxamide ức chế GyrB hiệu quả, thể hiện hoạt tính mạnh chống lại cả S aureus và MRSA [71]