Thông tin về tính chất lý hóa cơ bản của ba hợp chất alkenylbenzen được thực hiện trong nghiên cứu được nêu trong bảng 1.2[13]: Bảng 1.2: Tính chất hoá lý của 3 hợp chất alkenylbenzen C
TỔNG QUAN
Tổng quan chung về nhóm alkenylbenzen
1.1.1 Giới thiệu về nhóm alkenylbenzen
Alkenylbenzen là nhóm hợp chất thiên nhiên tìm thấy trong rất nhiều loài thực vật khác nhau như quế (Cinnamomum spp), húng quế (Occimum basilicum), thì là (Peucedanum graveolens), đại hồi (Illicium verum), tiểu hổi (Foeniculum vulgare), hương nhu (Occimum gratiscimum), tiêu đen (Piper nigrum), Hầu hết những loài thực vật này, đều có hương thơm đặc trưng và hấp dẫn nên được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau như làm gia vị, làm thức ăn, làm thuốc ở hầu khắp các nơi trên thế giới Dưới đây là một số thông tin cơ bản về các loài thực vật, đã và đang được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia, trong thành phần chứa một tỉ lệ tương đối cao các hợp chất alkenylbenzen
- Các loài quế nói chung (Cinnamomum spp): thường được sử dụng làm gia vị và làm thuốc vì vị cay ấm đặc trưng Thành phần chính trong vỏ, thân và lá quế là Cinamyldehyd và eugenol [6]
- Đại hồi hay hồi 5 cánh (Illicium verum): là một loại thực vật rất phổ biến ở miền bắc Việt Nam và Trung Quốc, thường xuyên được sử dụng làm gia vị cho nhiều món ăn truyền thống Quả đại hồi có thành phần tinh dầu lên đến 7-9% khối lượng, trong đó trans-anethol chiếm tới từ 72 – 92 % Ngoài ra, trong thành phần tinh dầu của đại hồi còn có thêm các hợp chất terpenoid như myrcen, terpineol , một số alkenylbenzen khác như estragol (2%), cis-anethol (0,5%), [7]
- Tiểu hồi (Foeniculum vulgare), là loài thực vật có nguồn gốc từ khu vực Địa Trung Hải, sau đó qua khu vực Trung Đông, trở thành thực vật được trồng tương đối phổ biến ở Châu Á Mọi bộ phận của cây tiểu hồi đều có thể được sử dụng cho các mục đích làm gia vị, làm thuốc trị cảm, thực phẩm hỗ trợ tiêu hóa; tuy nhiên, bộ phận được sử dụng nhiều nhất là hạt tiểu hồi Trong thành phần tinh dầu tiểu hồi, bên cạnh các hợp chất nhóm terpenoid như limonen, camphen, pinen; cũng có các hợp chất thuộc nhóm alkenylbenzen như eugenol, chavicol, methylchavicol (estragol), anethol, [8]
- Húng quế (Occimum basilicum): là cây nhiệt đới thuộc họ Bạc hà (Lamiacea), được dùng phổ biến như một gia vị và rau thơm trong nhiều nền ẩm thực khu vực Đông Á và Đông Nam Á Trong thành phần của tinh dầu húng quế, có nhiều hợp chất bay hơi
4 khác nhau tùy thuộc vào tính chất của đất và khí hậu nơi trồng, trong đó có 2 thành phần có tỉ lệ lớn nhất là linanool và estragol (một alkenylbenzen đã biết có nguy cơ gây ung thư) với tỉ lệ 3:1 Ngoài ra, trong tinh dầu húng quế cũng có những hợp chất alkenylbenzen khác như eugenol, methyl eugenol,
Loại và hàm lượng alkenylbenzen trong cây và tinh dầu của một số thực vật được tổng hợp trong bảng 1.1 [9], [10], [11], [12]
Bảng 1.1: Hàm lượng anlkenylbenzen trong một số thực vật
Chất Cây Hàm lượng trong cây Hàm lượng trong tinh dầu (%)
Húng quế 0,8 ppm Đinh hương 28,5 ppm
Bên cạnh cách sử dụng dược liệu như một gia vị/thực phẩm/thuốc cổ phương, các hợp chất thơm trong tinh dầu, trong đó có nhóm hợp chất alkenylbenzen cũng thường được tách/chiết từ các loài thực vật khác nhau để sử dụng riêng lẻ như một gia vị, phụ
5 gia tạo hương thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm, hay phụ gia trong nhiều ngành công nghiệp khác như hóa mỹ phẩm, nước hoa,
1.1.2 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của các alkenylbenzen
Alkenylbenzen là một nhóm các hợp chất hóa học có cấu trúc tương đối đơn giản, gồm 1 vòng benzen liên kết với một nhóm alkenyl, có nguồn gốc thực vật Nhóm hợp chất này tương đối phổ biến, được tìm thấy hầu hết trong các loại tinh dầu thực vật như cam, chuối, ; đặc biệt là những loài thực vật có mùi thơm đặc trưng - được sử dụng làm gia vị như: hồi, quế, đinh hương, thảo quả, thì là, [9], [13]
Các hợp chất alkenylbenzen hiện đang được phân loại thành 2 nhóm lớn [9]:
- Nhóm propenylbenzen: là các alkenylbenzen có liên kết đôi 2-3, với các chất đại diện như: estragol (methylchavicol), safrol, myristicin, elemicin, eugenol,
- Alkenylbenzen có liên kết đôi 1-2 (nhóm allylbenzen), với các đại diện như: trans-anethol, β-asaron,…
Công thức cấu tạo của một số alkenylbenzen thường gặp được thể hiện trong hình 1.1 [9]
Hình 1.1: Công thức cấu tạo một số alkenylbenzen thường gặp
Theo hệ thống cảnh báo sớm các vấn đề thực phẩm và thức ăn chăn nuôi của Châu Âu (RASFF), có 5 hợp chất nhóm alkenylbenzen: estragol, methyl eugenol, safrol, trans-anethol, myriscitin, được xếp vào nhóm các tác nhân hóa học gây hại cho con người [1] Trong đó, ba alkenylbenzen (estragol, methyl eugenol và safrol) được cấm bổ sung vào thực phẩm Quy định Châu Âu (EC) số 1334/2008 [1]
Thông tin về tính chất lý hóa cơ bản của ba hợp chất alkenylbenzen được thực hiện trong nghiên cứu được nêu trong bảng 1.2[13]:
Bảng 1.2: Tính chất hoá lý của 3 hợp chất alkenylbenzen
Tính chất Estragole Methyl eugenol Safrol
1.1.3 Độc tính của các hợp chất nhóm alkenylbenzen
Nhìn chung, các chất trong nhóm alkenylbenzen có con đường chuyển hóa trong cơ thể tương tự nhau và phụ thuộc vào lượng hấp thu các hợp chất alkenylbenzen vào cơ thể [14] Các nghiên cứu hiện nay cho rằng, có 3 con đường chuyển hóa chính các hợp chất alkenylbenzen
- Con đường O-demethyl hoá: đây là con đường chuyển hóa xảy ra chủ yếu, khi lượng alkenylbenzen hấp thu vào cơ thể ít ( 95%, các thông tin được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1 Thông tin về các chất chuẩn trong nghiên cứu
TT Tên chất Hãng cung cấp Độ tinh khiết (%)
1 Estragol Sigma-Aldrich 98,0 34098-1ml BCCG6987
3 Methyl eugenol Sigma-Aldrich 98,0 w247502- sample-K
2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc các chất nhóm alkenylbenzen, chất đồng hành dicyclohexylmethanol và chất chuẩn nội cafein nồng độ 1000 ppm
Cân chính xác khoảng 10 mg từng chất chuẩn nhóm alkenylbenzen, chất đồng hành và chất chuẩn nội vào lần lượt từng cốc có mỏ 25 mL trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01mg Hòa tan bằng AcOEt và chuyển vào bình định mức 10 mL, tráng cốc nhiều lần vào bình và định mức đến vạch bằng AcOEt, lắc đều, bảo quản các dung dịch ở -20 º C
Ghi chú: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc được tính thực tế theo lượng chuẩn cân và độ tinh khiết của chất chuẩn
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp các alkenylbenzen 100 ppm
Hút chính xác 1,00 mL các dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng AcOEt và lắc đều, bảo quản các dung dịch ở -20 º C
Dung dịch chất đồng hành trung gian dicyclohexylmethanol và chất chuẩn nội trung gian cafein 100 ppm
Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc dicyclohexylmethanol hoặc cafein cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng AcOEt và lắc đều, bảo quản các dung dịch ở -20 º C
- Máy sắc ký khí khối phổ, bao gồm máy sắc ký khí Trace GC 1300 series, bộ phận đưa mẫu tự động TriPlus RSH, cổng bơm mẫu, detector khối phổ kỹ thuật Orbitrap với nguồn ion hóa kết hợp EI/CI của Thermo Scientific Hệ thống máy GC-MS trong nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1
Hình 2.1 Hệ thống GC-HRMS sử dụng trong nghiên cứu
- Cột TG-35MS (30 m ì 0,25 mm ì 0,25 àm) của Thermo Scientific
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg, Mettler Toledo
- Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g, Mettler Toledo
- Máy đồng nhất mẫu, Phillips
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 rpm đối với ống ly tâm 50 mL, Mikro 200R, Hettich
- Máy lắc xoáy vortex, IKA
- Bình định mức các loại: 10 mL, 20 mL
- Ống ly tâm nhựa 15 mL và 50 mL có nắp kín
- Màng lọc mẫu, kớch thước lỗ 0,2 àm.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu, khảo sát một số điều kiện để xác định đồng thời 3 chất nhóm alkenylbenzen (estragol, methyl eugenol, safrol), sử dụng chất chuẩn nội cafein và chất đồng hành dicyclohexylmethanol:
+ Khảo sát điều kiện trên GC-MS: cột phân tích, chương trình nhiệt độ, điều kiện khối phổ
+ Nghiên cứu, khảo sát phương pháp xử lý mẫu: Khảo sát phương pháp chiết, khảo sát dung môi chiết, khảo sát thời gian chiết
- Thẩm định phương pháp phân tích
+ Độ đặc hiệu của phương pháp phân tích
+ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
+ Khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn
+ Độ lặp lại của phương pháp phân tích
+ Độ thu hồi của phương pháp phân tích
- Áp dụng phương pháp để phân tích sàng lọc và định lượng mẫu thực
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Khảo sát điều kiện GC-MS
2.4.1.1 Khảo sát điều kiện MS Để chọn cỏc ion đặc trưng cho cỏc chất phõn tớch, tiến hành tiờm 1 àL dung dịch chuẩn nồng độ 0,5 ppm với từng alkenylbenzen và các chất nội chuẩn, chất đồng hành vào hệ thống Q-Orbitrap-HRMS Phân tích ở chế độ Fullscan với m/z 50-700 (EI 70eV), so sánh khối phổ thực nghiệm thu được ở thời gian lưu của chất phân tích với khối phổ tương ứng trong thư viện phổ NIST MS search 2.2 (Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ quốc gia, Gaithersburg, Hoa Kỳ) và lựa chọn ít nhất 2 ion con với sai số khối không quá
5 ppm để thực hiện yêu cầu nhận dạng cho kỹ thuật HRMS-Q-Orbitrap
2.4.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký khí
- Khảo sát điều kiện sắc ký khí: Khảo sát nhiệt độ bắt đầu với 3 mức nhiệt độ là 50 o C,
Bảng 2.2 Chương trình nhiệt độ tiến hành phân tích dự kiến
Bước Tốc độ gia nhiệt
Thời gian cố định nhiệt độ (phút)
2.4.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
90 mẫu gia vị bao gồm hạt tiêu (Piper nigrum), vỏ quế cassia (Cinamomum cassia), quả đại hồi (Illicium verum), cành và lá rau mùi (Coriandrum sativum), cành và lá thì là (Anethum graveolens), cành và lá húng quế (Ocimum bacilicum), cành và lá húng bạc hà (Mentha aquatica), lá húng chanh (Coleus amboinicus), nụ hoa đinh hương (Syzigium aromaticum), thân rễ gừng (Zingiber officinale), thân rễ giềng (Alpinia officinarum), hạt dổi (Michelia tonkinensis), hạt mắc khén (Zanthoxylum rhetsa), hạt thảo quả (Amomum tsao-ko) và các mẫu bột tiêu, bột quế, bột hồi, được thu thập ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội Số lượng của từng loại mẫu được trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3 Số lượng của các loại mẫu phân tích
2.4.2.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
- Các mẫu gia vị khô được bảo quản ở nhiệt độ phòng, các mẫu gia vị tươi được bảo quản ở 2-8 o C và được đồng nhất trước khi phân tích
- Khảo sát điều kiện xử lý mẫu tối ưu trên mẫu gia vị tươi là húng bạc hà và mẫu gia vị khô là tiêu đen qua tham khảo với 2 phương pháp chiết là chiết bằng dung môi kết hợp rung siêu âm và QuEChER Sau khi chọn được phương pháp xử lý mẫu, tiến hành khảo sát dung môi chiết và thời gian chiết mẫu
- Với phương pháp QuEChERS, cân 3 g mẫu gia vị khô là tiêu đen hoặc mẫu gia vị tươi là hỳng bạc hà vào ống ly tõm 50 mL, thờm 10 àL chất đồng hành dicyclohexylmethanol 100 ppm pha trong AcOEt, riêng với mẫu gia vị khô sẽ bổ sung thêm 5 ml nước để làm ẩm Sau đó, mẫu được thêm 20 mL ACN, lắc bằng máy lắc vortex trong 5 phút Tiếp đó, thêm 4g magie sulfat khan, 1g NaCl, 1 g trinatri citrate dihydrat và 0,5 g dinatri hydrocitrate sesquihydrate vào mẫu lắc mạnh bằng tay và lắc vortex trong 5 phút Ly tâm ở 6000 vòng/5 phút và lấy 5 mL dịch trong cho vào ống ly tâm 15 ml chứa 1g NaCl và 4g MgSO4 khan, lắc mạnh và ly tâm ở 6000 vòng/5 phút Cuối cùng, lấy 2 mL dịch chiết, thổi khô bằng khí nitơ, hòa cặn bằng 2 mL AcOEt Lọc qua màng lọc 0,2àm và lấy 990 àL dịch lọc thờm 10 àL nội chuẩn cafein 100 ppm pha trong AcOEt vào vial để tiến hành phân tích trên hệ thống GC-MS
- Với phương pháp chiết bằng dung môi kết hợp với rung siêu âm ở nhiệt độ phòng, tiến hành khảo sát dung môi chiết và thời gian chiết Dựa vào các tài liệu tham khảo [12] và khả năng hòa tan của các chất thuộc nhóm alkenylbenzen, tiến hành khảo sát 3 loại dung môi là n-hexan, AcOEt và ACN Các mức khảo sát thời gian chiết là 15,
30, 45, 60 và 75 phút Để khảo sát dung môi chiết, cân 3 g đối với mẫu gia vị khô là tiờu đen hoặc mẫu gia vị tươi là hỳng bạc hà vào ống ly tõm 50 mL, thờm 10 àL chất đồng hành dicyclohexylmethanol 100 ppm pha trong AcOEt để kiểm soát các sai số trong quá trình chiết xuất và 25 mL AcOEt hoặc ACN hoặc n-hexan, tiến hành chiết siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 45 phút Sau đó, mẫu được ly tâm 6000 vòng/5 phút, lọc qua màng lọc 0,2àm và thờm 990 àL dịch lọc vào vial Thờm 10 àL chất chuẩn nội cafein 100 ppm pha trong AcOEt vào để kiểm soát các sai số trong quá trình phân tích trên thiết bị Quy trình xử lý mẫu dự kiến được thể hiện tại hình 2.2
Hình 2.2: Quy trình chiết rung siêu âm dự kiến
Phương pháp phân tích sau khi khảo sát được các thông số tối ưu về điều kiện phân tích sắc ký và xử lý mẫu, tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, đánh giá các thông số sau: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng
(LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi Đánh giá kết quả theo quy định của AOAC
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5% [25]
Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EU 2021/808 của Hội đồng Châu Âu [25] Đồng nhất mẫu, cân 3 g tiêu đen hoặc 3g húng bạc hà/ống ly tâm
+ 25 mL dung mụi chiết, 10àL dicyclohexylmethanol 100ppm Lắc, chiết rung siêu âm, ly tâm 6000 vòng/phút 5 phút
Lọc qua màng lọc 0,2àm
Thờm 990àL dịch chiết và 10 àL caffein 100ppm vào vial, và phõn tớch trờn
2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu/nhiễu đường nền (S/N) Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu nền (S/N = Signal to noise ratio)
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)
LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)
Ngoài ra, LOQ còn có thể được xác định là nồng độ mà tại đó phương pháp vẫn còn đảm bảo được tính tuyến tính
2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 0,02 đến 5 mg/L và khảo sát sự phụ thuộc của tỷ lệ tín hiệu chất phân tích và nội chuẩn vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Để xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền 1 mẫu gia vị khô là tiêu đen và 1 mẫu gia vị tươi là húng bạc hà Chiết mẫu theo quy trình đã khảo sát sau đó bơm mẫu vào hệ thống GC-HRMS ở các điều kiện đã chọn Thực hiện phân tích lặp 6 lần trong cùng điều kiện Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD (%)) Độ lệch chuẩn (SD) tính theo công thức (1) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) tính theo công thức (2) như sau:
+ 𝑺 𝒊 là diện tích của pic sắc kí thứ i
+ 𝑺 𝒕𝒃 là diện tích trung bình của n lần chạy
+ n là số lần lặp lại
27 Độ thu hồi: Thực hiện trên các nền mẫu tiêu đen và húng bạc hà Các dung dịch này được thêm ở 2 nồng độ chuẩn, thêm lần lượt 8mcg và 22 mcg chuẩn vào mẫu và tiến hành làm lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng độ Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất tìm lại so với chuẩn thêm vào
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Công thức tính hàm lượng chất phân tích trong mẫu:
Cm :hàm lượng chất phân tích trong mẫu (mg/kg)
C: nồng độ chất phân tích tính theo đường chuẩn (mg/L) k: hệ số pha loãng
V: thể tích định mức (mL) m: khối lượng cân mẫu (g)
2.4.4 Phân tích định lượng mẫu thực
Các điều kiện phân tích định lượng được thiết lập như sau:
- Cột TG-35MS (30 m ì 0,25 mm x 0,25 àm) của Thermo Scientific
- Nhiệt độ cột theo chương trình thu được sau khi khảo sát
- Pha động là khí N2 tinh khiết cao (99,999%) với tốc độ dòng cố định 1 ml/phút
- Chế độ tiêm mẫu không chia dòng với thời gian không chia dòng là 6 phút, nhiệt độ buồng tiờm mẫu là 250 o C và thể tớch tiờm mẫu 1 àL
- Chế độ ion hóa va chạm điện tử (EI) với năng lượng 70eV
- Chế độ khối phổ: Chế độ quét toàn dải (Fullscan), khoảng quét m/z 50-700 Da, thời gian quét 200ms
- Độ chính xác khối: Cài đặt ở 5 ppm
- Giá trị m/z (phân giải cao) của các alkenylbenzen được lấy từ kết quả phân tích sàng lọc và đưa vào phân mảnh để tạo thành các ion phân mảnh Bảng thời gian lưu tương đối và các ion phân mảnh được lựa chọn dựa vào kết quả khảo sát thực tế trên chuẩn tại phòng thí nghiệm
Mẫu được coi là đủ điều kiện để tính toán kết quả nếu độ thu hồi của chất đồng hành dicyclohexylmethanol đạt từ 80-110% Độ thu hồi của chất đồng hành được tính dựa theo phương pháp so sánh giữa tỷ lệ diện tích pic của chất đồng hành với chất chuẩn nội trong mẫu thử và trung bình cộng của tỷ lệ diện tích pic của chất đồng hành và chất chuẩn nội trong các mẫu chuẩn được sử dụng để lập đường chuẩn
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp
Dựa theo tài liệu tham khảo [1], tiến hành chọn dicyclohexylmethanol làm chất chuẩn đồng hành trong quy trình chiết mẫu để kiểm soát cả quá trình phân tích Hợp chất này được chọn do tính ổn định và rất khó xuất hiện trong các nền mẫu gia vị có trong nghiên cứu Theo tài liệu tham khảo [1], dung dịch chuẩn cafein đã được thêm vào dưới dạng nội chuẩn khi tiến hành phân tích trên hệ thống GC–HRMS để xác minh hiệu suất chính xác của hệ thống phân tích
3.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện thiết bị GC-MS
3.1.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện khối phổ
Các điều kiện phân tích trên khối phổ đã được tối ưu hóa tự động sử dụng phần mềm của thiết bị bằng cách tiêm các dung dịch chuẩn riêng lẻ alkenylbenzen 0,5 ppm vào hệ thống Q-Orbitrap-HRMS để chọn các ion đặc trưng cho từng chất phân tích (Bảng 3.1) Chế độ quét toàn dải (Full scan, m/z 50–700 Da) đã được sử dụng và cho sắc ký đồ ion tổng (TIC) (Hình 3.1) Lựa chọn mảnh ion có m/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng Việc xác định chất phân tích được thực hiện bằng cách so sánh kết quả thời gian lưu và tra cứu mảnh phổ của chất phân tích ở chế độ EI ở 70 eV với thư viện khối phổ được cung cấp và cập nhật kèm theo hệ thống GC-MS (NIST MS Search 2.2) Theo đó, ít nhất hai ion với cường độ thấp hơn, có độ chính xác khối lượng ≤5 ppm được chọn cho từng chất phân tích ở thời gian lưu tương ứng để thực hiện các yêu cầu nhận dạng cho kỹ thuật HRMS-Q-Orbitrap
Bảng 3.1: Các thông số khối phổ tối ưu phân tích 3 alkenylbenzen
Ion định lượng Ion định tính 1 Ion định tính 2 m/z Độ chính xác khối (ppm)
Công thức mảnh m/z Độ chính xác khối (ppm)
Công thức mảnh m/z Độ chính xác khối (ppm)
Sau khi tiến hành đo khối phổ thực nghiệm và so sánh với khối phổ lý thuyết, trong đó độ chính xác khối được tính bằng tỷ lệ chênh lệch giữa giá trị m/z thực nghiệm so với giá trị m/z lý thuyết, các mảnh ion định tính và định lượng đã được lựa chọn như trong bảng 3.1
Hình 3.1: Phổ phân mảnh của các chất phân tích (A) Estragol, (B) Safrol, (C) Methyl eugenol, (D) Dicyclohexylmethanol, (E) Cafein
3.1.1.2 Kết quả tối ưu điều kiện GC
Trong nhóm ankenylbenzen có nhiều chất là đồng phân của nhau hoặc có cùng khối lượng phân tử hoặc sự phân mảnh có nhiều mảnh giống nhau nên việc tối ưu điều kiện trên GC để tách các chất ra khỏi nhau là việc rất quan trọng Bên cạnh cột tách, chương trình nhiệt độ, trong đó có nhiệt độ bắt đầu cũng đóng vai trò quan trọng đối với việc phân tách các chất trong sắc ký khí Ba mức nhiệt độ bắt đầu là 50 o C, 60 o C và
80 o C đã được lựa chọn để khảo sát với hỗn hợp dung dịch chuẩn 3 chất alkenylbenzen ở nồng độ 0,5 ppm Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.2, 3.3, 3.4 như sau:
Hình 3.2: Sắc ký đồ với nhiệt độ bắt đầu 50 o C (A) Estragol, (B) Safrol, (C) Methyl eugenol, (D) Dicyclohexylmethanol, (E) Cafein
Hình 3.3: Sắc ký đồ với nhiệt độ bắt đầu 60 o C (A) Estragol, (B) Safrol, (C) Methyl eugenol, (D) Dicyclohexylmethanol, (E) Cafein
Hình 3.4: Sắc ký đồ với nhiệt độ bắt đầu 80 o C (A) Estragol, (B) Safrol, (C) Methyl eugenol, (D) Dicyclohexylmethanol, (E) Cafein
Kết quả thu được cho thấy, tại nhiệt độ là 50 o C cho pic các chất gọn, cân đối, đường nền ổn định, tín hiệu rõ ràng, còn khi tăng dần nhiệt độ, các pic thu được có xu hướng bị tù Do nhiệt độ sôi của AcOEt vào khoảng 77 o C nên việc giảm nhiệt độ bắt đầu xuống thấp hơn 50 o C sẽ làm kéo dài đáng kể thời gian lưu của dung môi, do đó, nhiệt độ bắt đầu là 50 o C được lựa chọn trong nghiên cứu này Chương trình nhiệt độ sau khi tối ưu được thể hiện ở bảng 3.2 và thời gian phân tích của các chất được thể hiện tại bảng 3.3
Bảng 3.2: Chương trình nhiệt độ tối ưu phân tích 3 ankenylbenzen
Bảng 3.3: Thời gian lưu của các chất phân tích
Bảng 3.3: Thời gian lưu của các chất phân tích
Chất phân tích Thời gian lưu (phút)
3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.1.2.1 Lựa chọn phương pháp chiết
Trên cơ sở tham khảo tài liệu [19], hai phương pháp xử lý mẫu được lựa chọn để khảo sát nhằm phân tích các hợp chất alkenylbenzen trong gia vị bằng phương pháp sắc ký khí là chiết siêu âm với AcOEt và QuEChERS Một số alkenylbenzen (như: methyl eugenol) không bền ở nhiệt độ cao đặc biệt trong môi trường chứa nước ở các mẫu gia vị tươi nên quá trình chiết siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng [27] Hai đối tượng mẫu gia vị khô (tiêu đen) và tươi (húng bạc hà) được lựa chọn để đánh giá hiệu suất thu hồi ở mức thêm 62,5 g với mỗi chất chuẩn alkenylbenzen Quy trình xử lý mẫu thực hiện theo mục 2.4.2.2 Kết quả khảo sát phương pháp chiết nhóm alkenylbenzen trong mẫu tiêu đen và húng bạc hà được thể hiện tại hình 3.5 và 3.6
Bước Tốc độ gia nhiệt
Thời gian cố định nhiệt độ (phút)
Hình 3.5: Độ thu hồi của 3 chất alkenylbenzen với phương pháp chiết rung siêu âm và phương pháp QuEChERS trên nền mẫu húng bạc hà
Hình 3.6: Độ thu hồi của 3 chất alkenylbenzen với phương pháp chiết siêu âm và phương pháp QuEChERS trên nền mẫu tiêu đen
Kết quả thu được cho thấy phương pháp chiết kết hợp rung siêu âm ở nhiệt độ thường cho hiệu suất thu hồi lớn hơn phương pháp chiết QuEChERS trên cả 2 nền mẫu với tất cả 3 chất nghiên cứu Vì vậy, phương pháp chiết kết hợp rung siêu âm ở nhiệt độ thường được lựa chọn để tiếp tục cho khảo sát tiếp theo
3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết
Trên cơ sở tham khảo tài liệu [19], tính chất của nhóm alkenylbenzen và dung môi chiết phù hợp với phân tích trên sắc ký khí, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát 3 dung môi chiết là ACN, AcOEt và n-hexan Các khảo sát được thực hiện với hai nền mẫu đại
36 diện là gia vị khô (tiêu đen) và gia vị tươi (húng bạc hà), thêm 62,5 g với mỗi chất chuẩn alkenylbenzen để đánh giá hiệu suất thu hồi Quy trình xử lý mẫu thực hiện theo mục 2.4.2.2 phần chiết rung siêu âm Kết quả phân tích được được thể hiện ở hình 3.7 và 3.8
Hình 3.7: Độ thu hồi trên các dung môi khác nhau của 3 chất nhóm alkenylbenzen trên nền húng bạc hà
Hình 3.8: Độ thu hồi trên các dung môi khác nhau của 3 chất alkenylbenzen trên nền mẫu tiêu đen
Kết quả phân tích cho thấy, trong ba dung môi khảo sát là ACN, AcOEt và n-hexan thì hai dung môi ACN, n-hexan cho kết quả thấp hơn so với AcOEt, hiệu suất thu hồi của 3 alkenylbenzen khi chiết bằng ACN là thấp nhất Hiệu suất thu hồi của 3
37 alkenylbenzen cao nhất khi sử dụng dung môi chiết là AcOEt Do đó, dung môi AcOEt được lựa chọn để chiết 3 alkenylbenzen trong nghiên cứu này
3.1.2.3 Lựa chọn thời gian chiết
Trong quá trình chiết siêu âm, thời gian chiết ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích Do đó, việc khảo sát thời gian chiết phù hợp là cần thiết nhằm thu được hiệu quả chiết cao nhất, đồng thời giảm ảnh hưởng tối đa với một số chất alkenylbenzen dễ bị phân hủy và bay hơi trong quá trình chiết Năm mức thời gian chiết được lựa chọn để khảo sát là 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút và 75 phút nhằm tìm ra được thời gian tối ưu để chiết được tối đa các chất nghiên cứu Tiến hành khảo sát trên hai nền mẫu gia vị khô (tiêu đen) và gia vị tươi (húng bạc hà) ở mức thêm 62,5 g với mỗi chất chuẩn alkenylbenzen để đánh giá hiệu suất thu hồi Quy trình xử lý mẫu thực hiện theo mục 2.4.2.2 phần chiết rung siêu âm Kết quả phân tích được thể hiện tại hình 3.9 và 3.10
Hình 3.9: Độ thu hồi trên các thời gian chiết khác nhau của 3 chất nhóm alkenylbenzen trên nền húng bạc hà
Hình 3.10: Độ thu hồi trên các thời gian chiết khác nhau của 3 chất nhóm alkenylbenzen trên nền mẫu tiêu đen
15 phút 30 phút 45 phút 60 phút 75 phút
H iệu su ất t hu hồ i ( %)
Thời gian siêu âm (phút) estragol safrol methyleugenol
15 phút 30 phút 45 phút 60 phút 75 phút
H iệu su ất t hu hồ i ( %)
Thời gian siêu âm (phút) estragole safrol methyleugenol
Kết quả thu được cho thấy với hầu hết các chất nghiên cứu, khi tăng thời gian chiết từ 15 phút lên 45 phút, hiệu suất thu hồi tăng lên Độ thu hồi khi chiết trong 30 và 45 phút có sự khác nhau ít nhất với hầu hết các chất Khi tăng thời gian chiết lên 60 và 75 phút, độ thu hồi có xu hướng giảm dần Khi thời gian rung siêu âm tăng lên, khả năng chiết càng lớn, tuy nhiên, khi thời gian chiết dài có thể dẫn đến phân hủy và/hoặc bay hơi một số chất phân tích Điều này có thể giải thích cho kết quả thu được Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn thời gian chiết là 45 phút để tiếp tục tiến hành nghiên cứu do đây là thời gian chiết duy nhất được khảo sát mà hiệu suất thu hồi đối với tất cả
3 chất nghiên cứu trên cả 2 nền mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép 80-115% (đối với nồng độ trong khoảng 1-10 ppm) theo yêu cầu của AOAC [25]
Tóm lại, quá trình xử lý mẫu sử dụng chiết siêu âm bằng AcOEt trong 45 phút ở nhiệt độ phòng Đây là phương pháp xử lý mẫu đơn giản và hiệu quả đối với 3 chất nhóm alkenylbenzen là estragol, safrol, methyl eugenol và có thể áp dụng với các alkenylbenzen khác như isoeugenol, acetyleugenol, myristicin apiol, chavicol, elemicin, dựa trên sự tương đồng về cấu trúc hóa học giữa chúng Kết quả này tương tự như công bố của Rivera-Pérez cùng cộng sự [1] và Zhao cùng cộng sự [29] trong nghiên cứu xác định các alkenylbenzen Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên phương pháp này được áp dụng thành công với các mẫu gia vị tươi
Quy trình chiết mẫu được lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát các điều kiện xử lý mẫu được thể hiện ở hình 3.11:
Hình 3.11: Quy trình xử lý mẫu tối ưu
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng
Trước hết, trong phương pháp sắc ký sử dụng detector khối phổ (MS), số điểm IP (identification point) là một giá trị quan trọng để đánh giá độ đặc hiệu Cách tính số điểm IP trong phương pháp GC-HRMS như sau: 1 điểm với kỹ thuật tách GC, 1,5 điểm với mỗi ion [25] Theo kết quả trong Bảng 1, mỗi chất phân tích đều có 3 ion Vì vậy, tất cả các chất đều có điểm IP ≥ 5,5 đáp ứng được yêu cầu về điểm IP (IP ≥ 5)
Ngoài ra, độ đặc hiệu của phương pháp còn được xác nhận qua việc phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn Từ kết quả thu được cho thấy mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu chất phân tích, chênh lệch thời gian lưu tỷ đối của alkenylbenzen trong mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn không quá 0,5%, đáp ứng tiêu chuẩn EU 2021/808 đối với sắc ký khí có sử dụng nội chuẩn [25] Kết quả được trình bày ở hình 3.12, 3.13, 3.14 và bảng 3.4
Với kỹ thuật HRMS, độ đặc hiệu được thể hiện ở độ chính xác khối là mức độ chênh lệch khối của mảnh khối xác định được so với mảnh khối lý thuyết Kết quả thu Đồng nhất mẫu, cân 1 g tiêu đen hoặc 3g húng bạc hà/ống ly tâm
+ 25 mL AcOEt, 10àL dicyclohexylmethanol 100ppm Lắc, chiết rung siêu âm, ly tâm 6000 vòng/phút 5 phút
Lọc qua màng lọc 0,2àm
Thờm 990àL dịch chiết và 10 àL caffein vào vial, và phõn tớch trờn GC-MS
40 được ở bảng 3.1 cho thấy độ lệch khối của các chất phân tích không quá 5 ppm, đáp ứng yêu cầu của AOAC
Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn
Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu húng bạc hà thêm chuẩn
Bảng 3.4: Chênh lệch thời gian lưu tỷ đối của mẫu chuẩn và thử thêm chuẩn
Estragol Safrol Methyl eugenol Cafein
Thời gian lưu tỷ đối 0,66 0,75 0,82 1
Thời gian lưu tỷ đối 0,66 0,75 0,82 1
Chênh lệch thời gian lưu tỷ đối (%) 0,12 0,13 0,20
Ngoài ra, khi so sánh phổ phân mảnh của chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn đều cho thấy có các mảnh ion với tỷ lệ tương đương nhau Ví dụ, so sánh phổ đồ mẫu chuẩn ở nồng độ 2 mg/L và mẫu thử thêm chuẩn của Estragol tại Hình 3.15
Hình 3.15: Phổ phân mảnh của Estragol của chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Bảng 3.5: Tỷ lệ diện tích của ion định tính/ ion định lượng của các chất
Methyl eugenol (m/z2,06735) Chất phân tích m/z1,06
Từ các kết quả thu được cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao khi phân tích các chất nhóm alkenylbenzen
Với các điều kiện đã chọn, tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn với nồng độ của các chất Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng thành dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm việc ở các nồng độ khác nhau Sau đó tiến hành tiêm vào hệ thống GC-MS Thiết lập phương trình tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và nội chuẩn với nồng độ của các chất theo phương trình hồi quy tuyến tính Tiến hành dựng đường chuẩn trong khoảng từ 0,02-5 mg/L, kết quả thu được được thể hiện trong bảng 3.6 và Hình 3.16 và phụ lục 1
Hình 3.16: Đường chuẩn của estragol
Bảng 3.6: Đường chuẩn của các alkenylbenzen
Stt Hoạt chất Đường chuẩn r
Từ phương trình hồi quy của 3 hợp chất cho thấy hệ số tương quan r ≥ 0,9998 Các hệ số r lớn cho thấy tỷ lệ diện tích pic chất phân tích và chất chuẩn nội có mối quan hệ tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,02 đến 5 mg/L Khoảng nồng độ này đã đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong thực tế Đối với các mẫu có nồng độ cao hơn giới hạn tuyến tính cần tiến hành pha loãng mẫu trước khi phân tích
3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp
Giới hạn phát hiện được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được với tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền [25] Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp Chất nào nhạy hơn sẽ cho giới hạn phát hiện nhỏ Cũng theo phương pháp này giới hạn định lượng là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà cho tín hiệu lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đường nền hay mẫu trắng (S/N = 10) [25]
Do hàm lượng của các chất trong nhóm alkenylbenzen không đồng đều, có chất hàm lượng cao có chất hàm lượng rất thấp nên cần xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng để đánh giá khả năng sử dụng phương pháp khi xác định mẫu thực tế Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã sử dụng phương pháp xác y = 2.0255x + 0.0266 R² = 1
44 định LOD, LOQ dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) Xác định LOQ bằng cách tiến hành thêm các nồng độ nhỏ dần của hỗn hợp các chất nhóm alkenylbenzen vào mẫu trắng (mẫu thử không phát hiện chất phân tích) cho đến khi thu được tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N
= 10) LOD được xác định theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích LOD = 3 x LOQ/10 Các kết quả LOD, LOQ của các chất phân tích được cho thấy tại nồng độ 0,02 mg/kg là nồng độ nhỏ nhất có thể phát hiện 3 alkenylbenzen với tỷ số S/N ≥ 10, tương ứng với LOQ= 0,15 mg/kg và LOD= 0,05 mg/kg cho 3 chất nhóm alkenylbenzen Giới hạn phát hiện này nhỏ, phù hợp để xác định hàm lượng chất trong mẫu thực tế do đó phương pháp có thể áp dụng rất tốt để xác định các chất nhóm alkenylbenzen
Hình 3.17: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ LOQ
3.2.4 Độ lặp lại Độ lặp lại là một thông số đánh giá độ chính xác của phương pháp cho phép đánh giá độ chụm của các kết quả phân tích Tiến hành phân tích 3 chất nhóm alkenylbenzen trong mẫu tiêu đen và húng bạc hà với quy trình chiết mẫu đã khảo sát sau đó bơm mẫu vào hệ thống GC-MS ở các điều kiện đã chọn Thực hiện phân tích lặp 6 lần trong cùng điều kiện Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD) và
45 độ lệch chuẩn tương đối (RSD (%)) Độ lặp lại của các chất phân tích được thể hiện trong các bảng 3.7
Bảng 3.7: Độ lặp lại của 3 alkenylbenzen trên nền mẫu húng bạc hà và tiêu đen
Các kết quả trên cho thấy, giá trị độ lệch chuẩn tương đối đối với cả 3 chất nhóm alkenylbenzen trên cả 2 nền mẫu húng bạc hà và tiêu đen từ 1,00 – 6,30 % Các kết quả này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng yêu cầu RSD% ≤ 11%, theo AOAC [25]
3.2.5 Độ thu hồi Độ thu hồi hay độ đúng của phương pháp là một trong những thông số để đánh giá độ chính xác Thực hiện đánh giá độ thu hồi trên nền các nền mẫu húng bạc hà và tiêu đen Hàm lượng các chất nhóm alkenylbenzen khác nhau rất nhiều Do đó, các mẫu này thêm hàm lượng ở 2 mức khác nhau và làm lặp lại 6 lần Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất tìm lại so với chuẩn thêm vào Kết quả độ thu hồi được thể hiện trong bảng 3.8 và phụ lục 5
Bảng 3.8: Tóm tắt kết quả xác định độ thu hồi các alkenylbenzen trên nền mẫu húng bạc hà và tiêu đen
Húng bạc hà Tiêu đen
Các kết quả trên cho thấy, độ thu hồi của các chất nhóm alkenylbenzen trên các nền mẫu húng bạc hà 91,3-106,9 %, mẫu tiêu đen 90,6-105,9 nằm trong khoảng từ 90-
107 % đối với nồng độ 100 mg/kg và 80-110 đối với nồng độ 10 mg/kg đáp ứng yêu cầu về độ thu hồi AOAC khi phân tích chất các chất nhóm alkenylbenzen [25].
Ứng dụng phương pháp định lượng 3 akylbenzen trong các mẫu thực tế
Kết quả phân tích 3 chất nhóm alkenylbenzen được trình bày tại bảng 3.9 đến bảng 3.13, hình 3.18 đến 3.22 và phụ lục 9
Bảng 3.9: Kết quả định lượng các alkenylbenzen trong các mẫu hạt tiêu
STT Tên mẫu Hàm lượng (mg/kg) Tổng
(mg/kg) Estragol Safrol Methyl eugenol
1 Tiêu trắng hạt 2,12