nguyễn thị ngọc lan nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất cao giàu verbascosid từ dược liệu chè vằng

Do đó để thu góp phần nghiên cứu được cao Chè vằng có hàm lượng Verbascosid cao, mở ra ứng dụng trong sử dụng và dược phẩm, nghiên cứu: “Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất cao giàu verbasc

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Chè vằng

1.1.1 Vị trí phân loại của Jasminum subtriplinerve Blume

Chè vằng hay còn gọi là chè cước man, dây cẩm văn, cây dâm trắng, lài ba gân là loài thực vật có hoa thuộc họ Nhài (Oleaceae) Có tên khoa học là Jasminum subtriplinerve Blume [4], [10] Chè vằng có vị trí phân loại như sau [31]:

Chi: Nhài (Jasminum L.) Loài: Jasminum subtriplinerve 1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, hình thái

Cây Chè vằng là một cây nhỏ, mọc thành bụi ở bờ rào hay bụi tre hoặc bám vào các cây lớn Thân cây cứng, chia thành từng đốt, đường kính 5 – 6 mm, chia thành nhiều cành, có thể vươn cao 1 – 1,5 m và vươn dài tới 15 – 20 m, thân và cảnh đều nhẵn Lá mọc đối, hình mũi mác, phía cuống tù hay hơi tròn, đầu lá nhọn, dài 4 – 7,5 cm, rộng 2 – 4,5 cm, những lá phía trên nhỏ hơn lá phía dưới, mép nguyên, trên có 3 gần rõ rệt Cuống lá nhẵn, dài 3 – 12 mm Hoa mọc thành xim nhiều hoa (chừng 7 – 9 hoa), cánh hoa màu trắng Quả hình cầu, đường kính 7 – 8 mm (bằng hạt ngô) Khi chín có màu vàng, trong quả có một hạt rắn chắc Mùa quả chín tháng 7 – 10 [4]

Chè vằng phân bố phổ biến và khá tập trung ở khu vực các nước Đông Nam Á và Nam Á Ngoài ra, cây cũng còn gặp ở các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam Ở Việt Nam, Chè vằng có rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng núi thấp, trung du và cả đồng bằng, không thấy cây mọc ở vùng núi cao trên 1500 m [1] Cây gặp nhiều từ Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, qua Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng tới Khánh Hòa [1], [12]

Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Chè vằng, có các nhóm chất chính như terpen glycosid, flavonoid glycosid, phenylethanoid glycosid, phenylpropanoid glycosid, steroid, triterpenoid, …

- Nhóm terpenglyosid: Anatolioside A, 6′′′-epi-anatolioside A, chevangin A, chevangin B, 6-epi-chevangin B, chevangin C, Chevangin D [21]

- Nhóm Phenylethanoid glycosid: Verbascosid, isoverbascosid,… [9], [11], [19]

- Flavonoid glycosid: Rutin, Isoquercitrin, Astragalin, Nicotiflorin [9]

- Nhóm Phenylpropanoid glycosid: Jasnervosid A, Jasnervosid B, Jasnervosid C, Jasnervosid D,… [18]

- Acid phenolic: Acid gallic, Acid protocatechuic [6]

Trong đó nhóm phenylethanoid glycosid gồm các verbascosid, isoverbascosid là thành phần chính mang lại tác dụng dược lý của Chè vằng Trong một số nghiên cứu, hàm lượng verbascosid chiếm khoảng 1,8 – 9,3 mg/g tùy từng mẫu ở các nơi khác nhau [7]

1.1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của J subtriplinerve được khảo sát bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH Theo nghiên cứu của Dai Hue Ngan và cộng sự khả năng chống oxy hoá của các chất chiết xuất từ J subtriplinerve được xác định ở 200 μg/mL và so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của 44μg/mL acid ascorbic Chiết xuất có SC (khả năng bẫy gốc tự do) trên 50% được coi là có hoạt tính chống oxy hóa Kết quả thu được cho thấy đa số các chiết xuất đều có hoạt tính kháng oxy hoá trừ petroleum ether, trong đó hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate là mạnh nhất với SC% là 68.7 ± 0.9% [27]

Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Mai và các cộng sự đã sử dụng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH và phương pháp ức chế gốc tự do NO để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ thân và lá của cây Vằng sẻ (J subtriplinerve) Các kết quả cho thấy cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa [6]

Năm 2008, Đái Huệ Ngân và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của năm dịch thử từ loài J subtriplinerve bằng cách sử dụng Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis làm vi sinh vật đích Kết quả cho thấy chiết xuất ether dầu hỏa có tác dụng ức chế B subtilis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 100 μg/mL, các dịch chiết ethyl acetat và ethanol ức chế S aureus với giá trị MIC = 200 μg/mL và chiết xuất methanol ức chế E coli với giá trị MIC

= 200 μg/mL Mặt khác, dịch chiết nước không có tác dụng ức chế bất kỳ chủng vi khuẩn nào ở nồng độ bằng hoặc thấp hơn 200 μg/mL Tất cả các dịch chiết không cho thấy bất kỳ tác dụng ức chế nào đối với các nấm hoặc nấm men [27]

1.1.4.3 Tác dụng chống ung thư

4 Chiết xuất Chè vằng có từ ether dầu hỏa tác dụng gây độc tế bào in vitro trên cả hai dòng tế bào ung thư ở người là Hep-G2 và RD với giá trị IC50 lần lượt là 19,2 và 20,0 μg/mL [27]

Các jasnervosid A  H phân lập từ thân cây J nervosum (J subtriplinerve) được đánh giá tác dụng gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư ở người (A-549, Bel-

7402 và HCT-8), nhưng khả năng ức chế không đáng kể [18]

1.1.5 Công dụng của Chè vằng trong y học cổ truyền

Theo Y học cổ truyền, Chè vằng có vị hơi đắng, chát, tính ấm, quy kinh tâm và tỳ; có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, khu phong, hoạt huyết điều kinh, tiêu viêm, trừ mủ Chè vằng dùng tươi hoặc khô dưới dạng thuốc sắc hoặc nấu nước tắm với lượng thích hợp, được sử dụng trị rối loạn kinh nguyệt, dùng cho phụ nữ sau sinh bị nhiễm khuẩn sốt cao Ngoài ra, còn dùng trị phong thấp do huyết kém, đau nhức xương khớp và các bệnh ngoài da [1], [2]

Trong dân gian, lá vằng phơi khô được nấu hay pha nước uống cho phụ nữ sau sinh để kích thích tuyến sữa, điều trị viêm nhiễm, hoặc dùng lá nấu nước tắm trị ghẻ lở [10].

Verbascosid

5 + Tan ít trong nước lạnh, tan tốt trong nước và ethanol, không tan trong ether và chloroform [39]

Verbascosid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Hợp chất này thuộc họ nhóm phenylethanoid glycosid và đã được phát hiện ở nhiều loại cây như: Lippia citriodora, Syringa vulgaris và Olea europaea L

Verbascosid tan trong dung môi nước và ethanol, khó tan trong dung môi ether và cloroform Các tạp chất có nhiều trong Chè vằng là chất màu, gôm, chất nhầy tan tốt trong dung môi hữu cơ ít phân cực Do vậy, nên lựa chọn dung môi chiết xuất là ethanol hoặc nước,… kèm theo đó là phương pháp chiết xuất phù hợp với điều kiện với loại dung môi như siêu âm, ngâm, chiết hồi lưu… [8], [27]

Verbascosid đã được phát hiện có nhiều tác dụng sinh học khác nhau như: chống oxy hóa, chống viêm, chống độc gan, chống oxy hóa,…

1.2.2.1 Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của verbascosid, được đánh giá qua nhiều nghiên cứu khác nhau, và được báo cáo qua bài đánh giá của Alipieva và cộng sự Qua đó thấy được khả năng nhận dọn gốc tự do superoxide anion (O2 -), nitric oxide (NO), peroxynitrite (NO3 -) và DPPH [14]

Trong nghiên cứu của Pierre Luhata, verbascosid thể hiện khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH tốt, với giá trị IC50 là 0,09 ± 0,03 μg/mL so với 0,05 ± 0,0 μg/mL đối với acid ascorbic làm đối chứng Nó cũng có khả năng loại bỏ gốc H2O2 [28]

Tác dụng chống viêm của verbascosid cũng đã được quan sát thấy ở chuột bị viêm xương khớp do giảm hoạt động của yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB), là các yếu tố phiên mã cảm ứng điều chỉnh các gen liên quan đến tình trạng viêm Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy sự giảm sản sinh các yếu tố hoại tử khối u (TNF)-α và interleukin của phản ứng viêm (IL-1β, IL-6) [24]

Các tế bào đuôi gai được điều trị bằng verbascosid, người ta đã quan sát thấy sản xuất các cytokine tiền viêm thấp hơn, bao gồm interleukin (IL)-12 và TNF-α, và sản xuất nhiều cytokine IL-10 chống viêm [16]

1.2.2.3 Tác dụng chống ung thư

Trong nghiên cứu của Wei-Qiang Jia đã chứng minh rằng verbascosid ức chế sự tăng sinh, di căn và xâm lấn của tế bào u nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) đồng

6 thời thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) thông qua kích hoạt SHP-1 và ức chế quá trình phosphoryl hóa STAT3 [33]

Trong nghiên cứu của Hugo A Garro và cộng sự, đã chứng minh rằng verbascosid cũng có khả năng ức chế quá trình sao chép ADN, hoạt động ức chế tế bào ung thư [17] Trên cơ sở số liệu thu được của Kostyuk và cộng sự cho rằng verbascosid có tác dụng ngăn ngừa hóa học do tia cực tím gây ra ung thư da không hắc tố [25]

1.2.2.4 Một số tác dụng khác

Theo nghiên cứu của Quanbo Xiong và các cộng sự hoạt tính bảo vệ gan ức chế chất tạo gốc CCl4 và gốc caffeoyl trong phân tử verbascosid quan trọng đối với hoạt động bảo vệ gan [34]

Tác dụng bảo vệ thần kinh của verbascosid đã được nghiên cứu trên nhiều mô hình thí nghiệm Trong nghiên cứu của Guo-Qing, verbascosid làm giảm đáng kể sự chết theo chu trình của tế bào (apoptosis) do MPP + (1-methyl-4-phenylpyridinium) gây ra, tăng mức độ hydro peroxide ngoại bào, kích hoạt caspase-3 Kết quả này chỉ ra verbascosid giúp điều trị bệnh Parkinson [29]

Trong nghiên cứu gần dây của Yi Zhao và cộng sự, cung cấp bằng chứng verbascosid phát huy tác dụng chống trầm cảm thông qua các cơ chế tác dụng khác nhau Verbascosid thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp dopamine (DA) bằng cách thúc đẩy hoạt động của tyrosine hydroxylase mARN và protein, thụ thể 5-hydroxytryptamine 1B (5- HT1B), hemeoxygenase-1 (HO-1), SQSTM1, protein liên quan đến quá trình tái tổ hợp

5 (ATG5) và Beclin-1, đồng thời làm giảm hoạt động của caspase-3 và α-synuclein, do đó có tác dụng chống trầm cảm [36].

Tổng quan về chiết xuất

Khái niệm về chiết xuất: Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất khỏi phần không tan trong dược liệu Sản phẩm của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết xuất [8] 1.3.1 Các phương pháp chiết xuất về verbascosid trong dược liệu

Hiện nay, verbascosid được chiết xuất từ dược liệu từ nhiều phương pháp chiết khác nhau

Phương pháp ngâm: Đây là quy trình đơn giản và vẫn được sử dụng rộng rãi, liên quan đến việc để nhà máy nghiền thành bột ngâm trong dung môi thích hợp trong hộp kín ở nhiệt độ phòng Để tăng tốc độ chiết, thỉnh thoảng hoặc khuấy liên tục được thêm vào Trong nghiên cứu của Đái Huệ Ngân, 500 g dược liệu được ngâm ở nhiệt độ phòng, bắt đầu bằng ether dầu mỏ tiếp theo là ethyl acetat, ethanol và methanol với 1 lít mỗi dung môi trong 48 giờ [27] Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế Nhược

7 điểm chính của nó là một quá trình tiêu tốn thời gian Ngoài ra, để khai thác triệt để, một lượng lớn dung môi được sử dụng

Phương pháp chiết hồi lưu: Dược liệu được ngâm trong dung môi trong bình đáy tròn, được nối với một tụ điện Dung môi được đun nóng cho đến khi đạt đến điểm sôi Như hơi nước ngưng tụ, dung môi được tuần hoàn vào bình Không phù hợp với các chất kém bền với nhiệt có thể bị phân hủy trong quá trình chiết xuất [27], [31]

Phương pháp chiết siêu âm: sóng siêu âm lan truyền trong môi trường lỏng gây nên những dao động mạnh của các phân tử, làm xuất hiện nhất thời các bóng khí trong lòng chất lỏng Quá trình bóng khí hình thành và xẹp đi gây ra một số tác dụng: tạo ra các sóng va đập và lực cắt xé mạnh, tăng nhiệt độ, tạo các tia dung môi nhỏ va đập vào bề mặt pha rắn Kết quả là siêu âm làm phá vỡ một phần màng tế bào, tăng khả năng thấm của thành tế bào, giảm kích thước tiểu phân, phát sinh các kênh khuếch tán trong dược liệu và tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp Trong một số nghiên cứu hợp chất verbascosid được chiết xuất từ dược liệu bằng phương pháp này [8],[22],[7] Các nghiên cứu về chiết xuất dược liệu đều khẳng định siêu âm rút ngắn đáng kể thời gian chiết, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

1.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Nhiệt độ chiết thường phụ thuộc vào phương pháp chiết xuất và loại dung môi sử dụng Tăng nhiệt độ có tác dụng làm giảm độ nhớt dung môi, thuận lợi cho quá trình hòa tan, khuếch tán, đối lưu, rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, tăng nhiệt độ có thể gây ra một số bất lợi như:

- Gây phá hủy các hợp chất kém bền với nhiệt

- Làm tăng độ tan của các tạp chất, dịch chiết lẫn nhiều tạp

- Nhiệt độ cao làm tinh bột dễ bị hồ hóa, gây cản trở quá trình chiết xuất và ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết

- Làm tăng tốc độ bay hơi dung môi, dễ gây hao hụt dung môi [3]

Các hoạt chất trong dược liệu thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất nên quá trình khuếch tán hoạt chất nhanh đạt đến cân bằng hơn Nếu thời gian chiết xuất ngắn sẽ không chiết kiệt được hoạt chất Nếu thời gian chiết quá lâu, tỷ lệ hoạt chất trong dịch chiết không tăng nhưng dịch chiết nhưng tạp sẽ tiếp tục tăng lên Vì vậy thời gian chiết xuất ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và chất lượng của dịch chiết Với dung môi nước, thời gian ngâm lạnh không nên quá 24 giờ do dễ nhiễm khuẩn [3]

 Tỷ lệ dược liệu và dung môi

8 Thông thường, hiệu suất chiết tăng lên nếu tăng tỷ lệ dung môi Nếu dùng ít dung môi có thể không chiết hết được hoạt chất, nhưng nếu dùng quá nhiều dung môi có thể làm tăng lượng tạp chất Tùy theo dược liệu, dung môi, mục đích và phương pháp chiết xuất, tỷ lệ dược liệu và dung môi được lựa chọn thích hợp.

Một số phương pháp định lượng verbascosid trong Chè vằng

Trong các nghiên cứu trước đó, verbascosid trong Chè vằng được định lượng bằng một số phương pháp như:

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [7]: Điều kiện sắc ký

- Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150 ì 4,6 mm; 5 àm)

- Detector PDA, bước sóng phát hiện: 330 nm

- Pha động: ACN/0,01% TFA (A) – H2O/0,01% TFA (B) Chương trình rửa giải gradient: 10 – 30% A (0 – 30 phút), 30 – 80% A (30 – 36 phút), 80 – 10% A (36 – 41 phút), 10% A (41 – 50 phút)

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

Xử lý mẫu cao: Cân chính xác khoảng 0,2 g cao chè vằng cho vào ống falcon, thêm

9 ml MeOH 70%, siêu âm trong 15 phút ở 40 o C, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Sau đó tiến hành tinh chế dịch chiết đem đi chấm sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [8]: Điều kiện sử dụng TLC- Scanning:

- Bản mỏng silica gel 60 F254 kích thước 10x10 cm, hoạt hóa 110 o C trong 1 giờ

- Sử dụng mao quản định mức

- Dung môi pha động: Ethyl acetat – H2O – Acid formic = 10:3:2

Xử lý mẫu: Cân chính xác 1 g dược liệu vào bình nón, thêm 10 ml MeOH 60% và tiến hành chiết siờu õm ở 40 o C trong 30 phỳt Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 àm sau đó cất thu hồi dung môi, thu được cắn Hòa tan trong 10ml MeOH thu được dịch chấm sắc ký.

Cao dược liệu

Theo Dược điển Việt Nam V, cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [2]

Có nhiều cách phân loại cao thuốc như theo thể chất (Dược điển Việt Nam V, Trung Quốc 2015,…), định lượng marker (BP, EP), thành phần của cao (BP, EP, USP),… Trong Dược điển Việt Nam V, cao dược liệu được phân loại theo thể chất, gồm cao khô, cao đặc (cao mềm), cao lỏng tùy theo hàm ẩm còn lại trong cao [2]

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân huỷ hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác

Cao đặc là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

1.5.2 Phương pháp bào chế cao đặc

Theo Dược điển Việt Nam V, phương pháp điều chế cao thường có 2 giai đoạn là chiết xuất dược liệu và loại dung môi khỏi cao Đối với cao đặc, có thể điều chế bằng cách cô loại dung môi từ dịch chiết dược liệu hoặc phân tán lại cao khô vào dung môi ban đầu [2]

Giai đoạn 1: Chiết xuất là quá trình dùng dung môi ở trạng thái thích hợp để hòa tan chất tan (hoạt chất) có trong dược liệu, sau đó tách chúng khỏi phần không tan của dược liệu (bã dược liệu) [3] Tùy theo bản chất của dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản xuất và điều kiện trang thiết bị, có thể sử dụng phương pháp chiết xuất: Ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác

Giai đoạn 2: Dịch chiết được cô đặc đến khi dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá 20% được cao đặc Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá

60 o C Nếu không có điều kiện cô đặc và sấy ở dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80 o C Trường hợp muốn thu được cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [2]

Bên cạnh phương pháp chiết xuất các thông số quy trình như tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ, số lần chiết…có ảnh hưởng lớn đến chất lượng cao tạo thành [3]

1.5.3 Yêu cầu chất lượng Đối với cao đặc theo Dược điển Việt Nam V, các chỉ tiêu sau phải được kiểm soát:

- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

- Mất khối lượng do làm khô: Cao đặc không quá 20%

- Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn

- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 12.17 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật

- Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn [2].

Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Phương pháp thay đổi một yếu tố (one factor at the time - OFAT) là phương pháp khảo sát các yếu tố các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất thường được sử dụng Nguyên tắc của phương pháp là chỉ thay đổi giá trị của một thông số cần khảo sát, trong khi giữ nguyên các thông số còn lại ở điều kiện tối ưu đã khảo sát trước đó [20]

Với những ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi xử lý thống kê phức tạp, phương pháp OFAT là một phương pháp rất hữu hiệu và thường được ứng dụng nhiều trong khảo sát các yếu tố đến một quá trình, đặc biệt trong trường hợp số lượng yếu tố cần khảo sát ít và các yếu tố này hoàn toàn độc lập với nhau

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp OFAT để xác định điều kiện tối ưu cho một quá trình gặp phải những nhược điểm như:

- Số lượng thí nghiệm cần phải tiến hành lớn, đặc biệt khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến quá trình

- Không đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các yếu tố khi coi các yếu tố cần khảo sát là độc lập với nhau

- Khả năng xác định chính xác điều kiện tối ưu bị hạn chế do số lượng quan sát ít và chỉ có thể lựa chọn điều kiện tối ưu trong một số các giá trị khảo sát Khi khảo sát trong một khoảng rộng các giá trị sẽ tốn chi phí và thời gian Để khắc phục các nhược điểm trên, nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên các nguyên tắc về thống kê (Design of Experiments) đã được phát triển Trong đó, phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) là một trong những công cụ được sử dụng phổ biến nhất để xác định điều kiện tối ưu [32]

1.6.2 Phương pháp đáp ứng bề mặt

 Giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt

Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology: RSM) được phát triển từ những năm 50 của thế kỷ trước bởi nhà khoa học Box và đồng sự [23] Phương

11 pháp là mô hình thống kê giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất bằng cách kết hợp tất cả các yếu tố có trong phân tích thử nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu [30]

Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1: Sơ đồ phương pháp RSM để thiết kế tối ưu [38] Ưu điểm của phương pháp bề mặt đáp ứng là phản ánh được sự tương tác lẫn nhau giữa các biến đầu vào mà phương pháp tối ưu hóa đơn yếu tố không làm được, hiển thị ảnh hưởng thực của các biến lên đáp ứng đầu ra, với hiệu quả cao và chi phí thấp.

 Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra

Biến đầu vào (biến độc lập): Là thông số khi thay đổi sẽ ảnh hưởng đến giá trị của biến đầu ra Biến đầu vào bao gồm 2 loại: Biến kiểm soát được (Ví dụ: Nhiệt độ, dung môi, thời gian ) và biến không kiểm soát được (Ví dụ: Độ ẩm môi trường ) Biến đầu vào được lựa chọn cần thỏa mãn các điều kiện:

- Là biến độc lập, khi điều chỉnh giá trị không làm thay đổi giá trị của yếu tố khác

- Là các biến có thể định lượng được

12 Biến đầu ra (biến phụ thuộc): Là kết quả của thí nghiệm, cần phải đo đạc và đánh giá Ví dụ: Hàm lượng hoạt chất

Từ đó việc lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra: Từ các yếu tố ảnh hưởng, chọn ra các biến đầu vào có ảnh hưởng lớn đến biến đầu ra Việc này giúp giảm đáng kể số thí nghiệm cần phải thực hiện

 Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt

Có nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm như mô hình phức hợp trung tâm (CCD), Doehlert (DD), mô hình đầy đủ Trong số đó, thiết kế Box-Behnken là một trong những mô hình phổ biến nhất để xác định các điều kiện tối ưu Box-Behnken là một mô hình rất hiệu quả vì yêu cầu số lần chạy nhỏ Nó là một giải pháp thay thế quan trọng để tránh các thí nghiệm tốn thời gian Do đó, Box-Behnken được áp dụng rộng rãi trong các quy trình ly trích một chất hoặc nhóm chất từ nguyên liệu thực vật cụ thể [35]

Trước khi thiết kế thí nghiệm, các biến đầu vào cần được mã hóa các giá trị khảo sát, chuyển thành khoảng giá trị [-1;1] để đảm bảo thiết kế thí nghiệm có tính trực giao và tính xoay cũng như giảm thiểu sai số trong quá trình tính toán, hạn chế sai sót do chênh lệch đơn vị của các biến độc lập [26]

Số lượng thí nghiệm phải thực hiện theo mô hình, với k biến được tính theo công thức:

- N: là số thí nghiệm cần tiến hành

- k: là số biến đầu vào

- C0: là số thí nghiệm trung tâm

Xây dựng và đánh giá mô hình

Mô hình là một phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của biến đầu ra vào biến đầu vào Mô hình bậc 2 thường được sử dụng để xác định giá trị tối ưu của biến đầu ra và có dạng:

- α: Các hệ số tương ứng

13 Sau khi có kết quả thực nghiệm, sử dụng các phương pháp toán học khác nhau để xác định giá trị của các hệ số trong mô hình Một trong số những phương pháp hay được sử dụng nhất hiện nay là hồi quy tuyến tính đa biến Đánh giá mô hình vừa xây dựng dựa trên độ tương thích và khả năng dự đoán, được đặc trưng bằng các hệ số R 2 , R 2 hiệu chỉnh, R 2 dự đoán, mức độ không tương thích (lack of fit) Mô hình chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu chuẩn thống kê

- Sự không phù hợp (Lack of fit) nhằm đánh giá mức độ phù hợp của mô hình Mô hình được coi là phù hợp nếu p > 0,05 Nếu p < 0,05, mô hình không được chấp nhận

- R 2 đặc trưng cho mối tương quan giữa biến đầu vào và biến đầu ra R 2 càng gần 1, mô hình có độ tuyến tính càng cao

- R 2 hiệu chỉnh đặc trưng cho mức độ bền vững của mô hình R 2 hiệu chỉnh càng gần R 2 mô hình càng bền vững

- R 2 dự đoán đặc trưng cho khả năng dự đoán của mô hình R 2 dự đoán càng gần

R 2 hiệu chỉnh mô hình dự đoán càng tốt

Từ mô hình, cần xác định hàm mục tiêu và tìm nghiệm tối ưu bằng phương pháp thích hợp Hàm mục tiêu là hàm thể hiện kết quả mà người thực hiện phải đạt được, ví dụ biến đầu ra R đạt giá trị lớn nhất

Sau khi tìm được giá trị tối ưu, tiến hành phân tích và đánh giá kết quả thu được Nếu kết quả phù hợp, kiểm chứng lại bằng thực nghiệm Nếu kết quả không phù hợp, xem lại từng bước để tìm ra vấn đề.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: bộ phận trên mặt đất của cây Chè vằng được thu hái ở xã Cam Nghĩa, huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị, được giám định tên khoa học là Jasminum subtriplinerve Blume Mẫu tiêu bản được lưu tại phòng tiêu bản cây thuốc, khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội mã số tiêu bản HNIP/18811/24

Xử lý sau khi thu hái: Phần trên mặt đất của cây Chè vằng được làm sạch tạp chất, cắt nhỏ rồi sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60 o C trong 10 giờ đến RHdl ≤ 11%

2.1.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.2.1 Dụng cu, thiết bị, nghiên cứu

- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg

- Bể siêu âm WUC -D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)

- Máy đo hàm ẩm AND – MF50

- Bản mỏng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-Silica gel 60 F254, Merck)

- Đèn tử ngoại soi hai bước sóng 254nm và 366nm

- Máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ HPTLC CAMMAG tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: bình định mức, cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, pipet, micropipet, ống đong, đũa thủy tinh, bình cầu, phễu lọc, giấy lọc,…

- Chuẩn verbascosid độ tinh khiết 98% lô số CFS202401 cung cấp bởi Chemfaces

Sử dụng phần mềm Design Expert 13

Nội dung 1: Xây dựng phương pháp định lượng verbascosid trong cao Chè vằng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ (HPTLC – Scanning)

Thu hái và sơ chế Chè vằng theo quy trình trong Dược điển Việt Nam V

Xây dựng quy trình định lượng verbascosid trong cao Chè vằng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ (HPTLC – Scanning) và thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp như: Tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính và độ lặp lại Định lượng hàm lượng verbascosid trong cao Chè vằng thu được bằng phương pháp đã xây dựng

Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất verbascosid từ dược liệu Chè vằng bằng phương pháp thay đổi một yếu tố OFAT

Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết siêu âm, khảo sát các yếu tố của quá trình chiết xuất như: nồng độ cồn (10%, 25%, 40%, 50%), thời gian (15 phút, 30 phút,

45 phút), nhiệt độ (50 o C, 65 o C, 80 o C) và tỷ lệ dược liệu dung môi (1:10; 1:20; 1:30) Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất và lựa chọn khoảng giá trị cho các điều kiện chiết xuất thông qua xác định hiệu suất chiết verbascosid từ dược liệu

Nội dung 3: Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất verbascosid từ Chè vằng

Tiến hành tối ưu hóa quá trình chiết xuất với mục tiêu hiệu suất chiết cao và hiệu suất chiết verbascosid là lớn nhất

2.3.1 Phương pháp định lượng verbascosid trong Chè vằng

Xây dựng phương pháp định lượng verbascosid trong Chè vằng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ (HPTLC – Scanning) bằng cách khảo sát một số hệ dung môi pha động sau:

+ Hệ 1: Ethyl acetat: methanol: nước = 7,7:1,5:0,8

+ Hệ 2: Ethyl acetat: acid formic: nước = 9:0,5:0,5

+ Hệ 3: Ethyl acetat: acid acetic: acid formic: nước = 8: 2: 2:1

+ Hệ 4: Ethyl acetat: acid formic: methanol: nước = 10:1:1:1 Điều kiện sắc ký:

- Pha tĩnh: bản mỏng TLC-Silica gel 60 F254 kích thước 20x10 cm

- Dung môi pha động: Ethyl acetat: Acid formic: methanol: nước 10:1:1:1

- Tốc độ tiờm: 0,2 àl/min

- Thể tớch tiờm mẫu: 1-10àl

- Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm

Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn verbascosid Hòa tan trong bình định mức 10,0 ml, định mức đến vạch bằng methanol thu được dung dịch chuẩn verbascosid Tiến hành lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi định lượng Nồng độ của dung dịch chuẩn verbascosid (w/v) là:

- mc: Khối lượng verbascosid chuẩn (mg)

- Kc: Độ tinh khiết của chất chuẩn (K%)

- Vc: Thể tích pha mẫu chuẩn (,0 ml)

Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu (đã qua rây số 250) vào bình định mức 20ml, thêm chính xác dung môi methanol đến vạch, đậy nút bình Chiết siêu âm trong

30 phút ở 40 o C, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều Tiến hành lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi định lượng

Hàm lượng verbascosid trong mẫu thử dược liệu được tính theo công thức:

- Cdl: Hàm lượng verbascosid trong dược liệu (g/g %)

- mdl: Khối lượng dược liệu sử dụng (g)

- Vdl: Thể tích dung môi dùng chiết mẫu thử dược liệu (= 20 ml)

- V chấm: Thể tớch chấm (= 10 àl)

- RHdl: Độ ẩm dược liệu sử dụng (%)

- Sdl: Diện tích pic sắc ký mẫu dược liệu thử (mAU)

- a: Hệ số góc của đường chuẩn

- b: Hệ số chặn của đường chuẩn

Cân chính xác khoảng 0,1 g cao Chè vằng vào bình định mức 20ml, định mức methanol đến vạch Siêu âm trong 10 phút và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều Tiến hành lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi định lượng

Hàm lượng verbascosid trong cao Chè vằng được tính theo công thức:

- Ccao: Hàm lượng verbascosid trong cao (g/g %)

- mcao: Khối lượng cao sử dụng (g)

- Vcao: Thể tích dung môi dùng cho mẫu thử cao (= 20ml)

- V chấm: Thể tớch chấm (= 5àl)

- RHcao: Độ ẩm cao sử dụng (%)

- Scao: Diện tích pic sắc ký mẫu dược liệu thử (mAU.s)

- a: Hệ số góc đường chuẩn

- b: Hằng số chắn của đường chuẩn

2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng verbascosid trong Chè vằng

Phương pháp định lượng verbascosid trong dược liệu Chè vằng theo mục 3.1 được thẩm định một số chỉ tiêu bao gồm: tính phù hợp hệ thống, độ lặp lại, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, đường chuẩn và độ đúng theo hướng dẫn của AOAC [15]

Tiến hành tiêm lần lượt các vết dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn verbascosid, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn lên bản mỏng sắc ký Khai triển sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ và ghi lại sắc ký đồ

Yêu cầu: Không có pic lạ với vết mẫu trắng có cùng hệ số lưu giữ với chất chuẩn 2.3.2.2 Tính phù hợp hệ thống

Tiến hành tiêm 6 vết dung dịch verbascosid chuẩn lên bản mỏng sắc ký Khai triển sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ và ghi lại sắc ký đồ, hệ số lưu giữ và diện tích pic

2.3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Đưa lên bản mỏng sắc ký dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau có nồng độ lần lượt là 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml và 5 mg/ml Khai triển sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ và ghi lại sắc ký đồ, hệ số lưu giữ và diện tích pic Xây dựng phương trình tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn

Yêu cầu: Đường chuẩn xây dựng có hệ số tương quan R 2 ≥ 0,99

Tiến hành định lượng 6 mẫu dung dịch thử của cao dược liệu, sau đó tính hàm lượng verbascosid trong 6 mẫu đó và đánh giá độ lặp lại

Phương pháp thêm chuẩn: Chuẩn verbascosid được thêm vào cao và tiến hành hòa tan Tạo các mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ tương ứng 80%, 100%, 120% lượng verbascosid có trong mẫu thử, kí hiệu lần lượt T1, T2, T3 Tạo 3 mẫu thử thêm chuẩn với mỗi nồng độ thêm chuẩn

Tính tỷ lệ thu hồi R% của mỗi lượng chất chuẩn thêm vào các mẫu thêm chuẩn theo công thức:

- mt+c: lượng verbascosid trong dung dịch thử thêm chuẩn (mg)

- mt: lượng verbascosid trong dung dịch thử (mg)

- mc: lượng verbascosid trong dung dịch chuẩn thêm vào (lý thuyết)

Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng 92% - 105%

2.3.3 Phương pháp chiết xuất Chè vằng

Tiến hành chiết xuất Chè vằng bằng phương pháp chiết siêu âm

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng verbascosid trong Chè vằng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ (HPTLC)

Tiến hành tiêm lần lượt các vết dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn verbascosid, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn lên bản mỏng sắc ký và khai triển sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao kết hợp quét phổ

Hình ảnh chồng phổ của các vết có cùng Rf trên sắc ký đồ của của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn cho thấy các pic có phổ hấp phụ tương đồng nhau Kết quả trong hình 3.1

Hình 3 1: Ảnh chồng phổ chuẩn, thử, thử thêm chuẩn Mặt khác, sắc ký đồ của 3 mẫu: mẫu trắng dung môi MeOH, mẫu chuẩn của dung dịch verbascosid trong MeOH, mẫu thử của cao Chè vằng quan sát được:

- Sắc ký đồ của mẫu thử có 1 vết chính có cùng hình dạng với vết verbascosid trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện vết tương ứng với vết verbascosid trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn có vết verbascosid với Rf=0,56 và sắc ký đồ của mẫu thử cùng có 1 vết với Rf=0,56

23 Hình 3 2: Sắc ký đồ của mẫu trắng

Hình 3 3: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn verbascosid

Hình 3 4: Sắc ký đồ của mẫu thử cao Chè vằng 3.1.1.2 Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành triển khai sắc ký 6 lần lặp lại với cùng dung dịch verbascosid chuẩn lên bản mỏng sắc ký ở nồng độ chuẩn 3mg/ml Giá trị RSD của diện tích pic < 2% đáp ứng yêu cầu về tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng Kết quả chi tiết ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng Vết Mẫu

RSD=1,76%0,99 Như vậy, phương pháp

24 định lượng verbascosid trong Chè vằng đạt yêu cầu về khoảng tuyến tính và đường chuẩn Kết quả chi tiết ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Nồng độ verbascosid (mg/ml)

Tiến hành định lượng lặp lại 6 mẫu dung dịch thử của cao Chè vằng, tính hàm lượng verbascosid trong cao, kết quả cho thấy hàm lượng verbascosid trung bình là 0,088g/g với giá trị RSD < 2% đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp định lượng Kết quả chi tiết ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng

Hàm lượng verbascosid trong cao (g/g)

TB=0,0880 RSD=1,48%