Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn .... Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng và thẩm định ph
TỔNG QUAN
Tổng quan về Đỏ ngọn
1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 2009 [16] , chi Cratoxylum Blume có vị trí phân loại như sau:
Họ: Hypericaceae Chi: Cratoxylum Blume Đỏ ngọn có tên khoa học là Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer gồm 2 dưới loài là Cratoxylum formosum subsp formosum và Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein, thuộc chi Cratoxylum Blume., họ Ban, bộ Ban, ngành Ngọc lan [2,
1.1.2 Đặc điểm thực vật Đỏ ngọn là loại cây nhỏ, thân gỗ, có gai ở gốc, (khi thành cây lâu năm có thể cao và to), cành non có lông tơ màu vàng nhạt, cành già nhẵn, màu xám Thân phía ngọn có màu đỏ do lông tơ màu đỏ (Đỏ ngọn) Lá cây có hình mũi mác, dài 12 – 13 cm, rộng 3,4 – 4 cm, mọc đối xứng nhau, cuống lá ngắn 3 – 5 mm Mặt gân trên của lá có màu đỏ đến 1/3, lá non có màu đỏ đến quá nửa Hoa mọc thành chùm trên cành ở vị trí kẽ lá, màu trắng hoặc hơi hồng, có lông màu tía Quả nang, dài 15 mm, rộng 7 – 8mm Bên trong chứa hạt nhỏ, hình trứng, dài 6 mm, rộng 3 mm [2, 10]
1.1.3 Đặc điểm phân bố Ở Việt Nam, Đỏ ngọn thường mọc hoang tại các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc, đặc biệt là ở các vùng đồi trọc Có thể tìm thấy Đỏ ngọn tại Xuân Mai – Ba Vì, Quảng Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn Ngoài ra Đỏ ngọn cũng rất phổ biến tại các nước Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma…), Ấn Độ và các tỉnh ở phía nam Trung Quốc [2, 10]
1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
Bộ phận dùng: Tại Việt Nam, bộ phận được nghiên cứu và sử dụng chính là lá [1] Ngoài ra, vỏ thân, rễ cũng được sử dụng làm thuốc [2, 10]
Thu hái: Đỏ ngọn được thu hái quanh năm
Chế biến: Có thể dùng tươi, ủ rồi phơi khô, sấy khô tùy theo mục đích sử dụng [1, 2, 10]
1.1.5 Thành phần hóa học chính
Theo Nguyễn Liêm và các cộng sự (1996), Đỏ ngọn có các nhóm hoạt chất chủ yếu là flavonoid, xanthon, tanin pyrocatechic, phytosterol, saponin triterpenoid, acid hữu cơ và các đường khử [8]
Từ lá và rễ của Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer, Heewon An và các cộng sự Việt Nam (2023) đã phân lập được 5 flavonoid: quercetin-3-O-𝜷-D-glucopyranosid
(isoquercitrin) (1), isorhamnetin-3-O-glucosid (2), quercetin-3-O-α-L-arabinosid (guaijaverin)
Trong quá trình nghiên cứu, Ninh Thế Sơn cùng các cộng sự (2019) đã phân lập ra 4 flavonol và flavonol glycosides từ lá của Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer: quercetin (6), quercitrin (7), hyperin (quercetin-3-O-β-galactopyranosid) (8), afzelin (9), isoquercitrin (quercitrin-3-O-β-D-glucopyranosid) (1) [36]
Khi so sánh hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid này, người ta thu được kết quả: catechin (IC50 42,98 àg/mL) > isoquercitrin (IC 50 45,63 àg/mL) > magniferin (IC50 64,03 àg/mL) > hyperin (IC50 64,22 àg/mL) > quercetin (IC50 64,54 àg/mL) catechin-3-O-(3,4- dihydroxylbenzoyl) > (IC50 75,37 àg/mL) > afzelin (IC50 > 100,00 àg/mL) [36]
4 Theo Kitanov G, Assenov L, Dam The Van (1988), trong lá Đỏ ngọn có quercetin hyperosid (8), 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon, mangiferin và isomangiferin Các tác giả đã phân tích lá Đỏ ngọn thu hái vào tháng 1 tại Việt Nam và thu được kết quả chứa 3,9 – 4,7% tanin và 0,51 – 0,56% flavonoid Lá chứa nhiều hyperosid, mangiferin, isomangiferin hơn trong cành [23]
Từ lá của Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein, Xue – Li - Cao, Yoichiro Ito (2000) đã dùng phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu năng độ cao phân lập được 2 flavonoid là Epigallocatechin gallate (10) và Epicatechin gallate (11) có tác dụng chống oxi hóa tốt [40]
Trong dịch chiết của Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein, Nguyễn Thị Mai (2017) đã phân lập ra được 4 flavonoid có tác dụng chống oxy hóa rất tốt là kaempferol- 3-O-α-L-arabinopyranosid (12), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid (13), Quercetin-3-O-β-
Từ vỏ và rễ cây Cratoxylum formosum subsp pruniflorum (Kurz) Gogelein trồng ở tỉnh Nông Khai miền Nam Thái Lan, Nawong Boonnak và các cộng sự đã chiết bằng diclometan, phân lập các chất bằng sắc ký đã tách được 10 xanthon với sự khác nhau chỉ là ở các mạch nhánh (R1 và R2) [42] Tác giả đã gọi tên chúng là các prunifloron được đánh số từ 1 đến 10 Công thức của chúng có cấu trúc:
5 R1≠ R2 và đều là gốc ankyl hoặc dẫn xuất của nó
Tên của chúng lần lượt là: 1 Prunifloron A; 2 Prunifloron B; 3 Prunifloron C; 4 Prunifloron D; 5 Prunifloron E; 6 Prunifloron F; 7 Prunifloron G; 8 Prunifloron H; 9 Prunifloron I; 10 Prunifloron J
1.1.6 Công dụng và tác dụng dược lý
❖ Tính vị, công năng, phối hợp theo y học cổ truyền và công dụng Đỏ ngọn có vị đắng chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiêu hóa [1]
Trong dân gian, Đỏ ngọn được dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, phục hồi sức khỏe sau ốm đau sinh đẻ Người bị đầy bụng khó tiêu dùng 100 g lá non nấu với 1 L nước, thay nước uống hàng ngày giúp hỗ trợ tiêu hóa Người bị cảm nắng, sốt dùng lá Đỏ ngọn kết hợp với Thanh cao hoa vàng sắc uống giúp hồi phục sức khỏe [2, 10]
Một vài bài thuốc có sử dụng Đỏ ngọn như sau:
- Chữa bí tiểu tiện: Lá Đỏ ngọn 20g, thân rễ Mía dò 10g, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm 2 lần trong ngày
- Chữa vết thương, làm khô, chóng lên da non, hút mủ: Ngọn non và lá Đỏ ngọn 60g, Nhọ nồi 50g, Vôi bột 40g, Hạt Cau già 30g, phơi khô, tán bột mịn Rắc lên vết thương đã được phủ 1 lớp gạc mỏng
- Phòng cảm nắng, chữa lỵ: Lá non Đỏ ngọn, sắc uống thay chè
- Chữa bỏng: Lá Thành ngạnh giã nát, trộn với nước vo gạo đặc, đắp lên miệng vết thương [2]
Tại Trung Quốc, lá của loài Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer được sử dụng để điều chế thành thuốc trị sốt, ho, đau dạ dày, chảy máu trong, loét dạ dày, đầy hơi, tiêu chảy, ngộ độc thực phẩm [19, 27] Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm tới tác dụng chữa bệnh của Đỏ ngọn Nhóm nghiên cứu của Học viện Quân Y - Hà Nội cho biết Đỏ ngọn ít độc, dịch chiết toàn phần của lá và thân cây có tác dụng chống oxy hoá tốt, hoạt huyết, tăng lưu thông máu, tăng cường chức năng thành mạch, giảm đông máu Ở Thái Nguyên, Bác sĩ Hoàng Sầm sử dụng dịch
6 chiết lá Đỏ ngọn để làm thực phẩm chức năng, hỗ trợ chữa các bệnh như: ghẻ lở, zona thần kinh, mất ngủ, hỗ trợ tiêu hóa, giảm trí nhớ [6, 8, 10]
Tác dụng chống oxy hóa
Các phương pháp chiết xuất flavonoid từ Đỏ ngọn
Hiện nay có rất nhiều phương pháp dùng để chiết xuất Đỏ ngọn, đa phần trong số đó đều ưu tiên sử dụng ethanol ở nhiều nồng độ để chiết xuất flavonoid Một vài quy trình có thể tham khảo như sau:
Tiến hành ngâm 1,0 kg cành (có lá) Đỏ ngọn với 6 L ethanol 50% trong 7 ngày Lọc lấy dịch chiết, cất cô quay thu hồi dung môi ở nhiệt độ dưới 40℃ tới cao đặc sau đó tiến hành đông khô Kết quả thu được 3,78% (khối lượng/khối lượng) chiết xuất thô của dịch chiết Đỏ ngọn Dịch chiết được bảo quản ở nhiệt độ 4℃, kín khí [32]
Phương pháp chiết siêu âm:
Tiến hành chiết siêu âm 1,0 g lá Đỏ ngọn với dung môi ethanol 60%, tỷ lệ 1 : 30 g/mL ở 60℃ trong 25 phút Dịch chiết thu được đem ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút [41]
Tiến hành cân 5,0 kg bột lá Đỏ ngọn đem chiết siêu âm với methanol 100% trong 4 giờ (làm lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 L, nhiệt độ phòng) Lọc lấy dịch chiết, cất cô quay thu hồi dung môi tới thể chất cao đặc thu được 450 g cao [26]
Phương pháp chiết hồi lưu:
Tiến hành chiết hồi lưu 5,0 kg cành (có lá) Đỏ ngọn khô cắt nhỏ với 40 L ethanol 60% trong 2 giờ, làm lặp lại 2 lần Lọc lấy dịch chiết, cất cô quay thu hồi dung môi tới thể chất cao đặc thu được 675,0 g cao [19]
Tiến hành cân 6,0 kg bột lá Đỏ ngọn tiến hành chiết hồi lưu với methanol 100% trong 10 giờ, làm lặp lại 3 lần Kết quả thu được 700 g cao đặc Tiến hành phân lập thu được 27 mg isoquercitrin [13]
Trong thực tế sản xuất, ưu tiên sử dụng các phương pháp có trang thiết bị rẻ tiền, tối ưu được dung môi, dễ thực hiện và có khả năng tự động hóa như chiết hồi lưu[3, 4, 26, 38].
Các phương pháp định lượng flavonoid trong Đỏ ngọn
Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến bằng phản ứng tạo màu với AlCl 3 :
Pha QE chuẩn và bột cao khô lá Đỏ ngọn trong ethanol 50% thu được dung dịch chuẩn và thử Cho 5 mL dung dịch chuẩn hoặc thử trộn đều với 5 mL dung dịch AlCl3 2% trong methanol Sau 30 phút, đo mật độ quang ở bước sóng 415 nm Mẫu trắng chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng không thêm thuốc thử Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g) trong mẫu thử tính theo QE chuẩn
9 Kết quả thu được cao khô lá Đỏ ngọn có hàm lượng flavonoid toàn phần là 60,73±1,96 mgQE/g [11]
Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp của Ramya và Dramothadan (2012) [34]
Dung dịch chuẩn: QE được sử dụng làm đường chuẩn 10 mg QE được hòa tan trong ethanol 80%, sau đú pha loóng thành cỏc nồng độ 25, 50 và 100 àg/mL Hỳt chớnh xỏc 0,5 mL dung dịch chuẩn, thêm 1,5 mL ethanol 95%, 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL, 1 mL kali acetat và 2,8 mL nước cất Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Tiến hành đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 415 nm với máy Shimadzu Máy quang phổ UV-160A (Kyoto, Nhật Bản) Mẫu trắng là mẫu dung dịch chuẩn không có AlCl3 10%
Dung dịch thử: Hút chính xác 0,5 mL dịch chiết ethanol của dược liệu (nồng độ 1 mg/mL), thêm 1,5 mL ethanol 95%, 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL kali acetat 1 M và 2,8 mL nước cất Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Tiến hành đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 415 nm để xác định hàm lượng flavonoid Mẫu trắng là mẫu dung dịch thử không có AlCl3
10%, thêm 5 mL ethanol 95%, 0,1 mL kali acetat và 2,8 mL nước cất
Kết quả thu được trình bày trong Bảng 1.1:
Bảng 1.1 Hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá, rễ và thân cây C formosum [15]
Bộ phận Lá Rễ Thân
Tổng hàm lượng Flavonoid (mg QE/g chiết xuất) 101,6 49,8 28,7
Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp của Patel và cộng sự (2010) [33] Dóy dung dịch chuẩn: Dựng methanol pha chuẩn QE thành cỏc nồng độ 50 – 800 àg/mL
Dung dịch thử: Hỳt chớnh xỏc 250 àL dịch chiết C formosum, thờm 75 àL NaNO2 5%, trộn đều và để yờn 5 phỳt Thờm tiếp 150 àL AlCl3 10% và để phản ứng 6 phỳt Tiếp tục thờm
500 àL NaOH 1 M và 2mL nước cất, trộn đều, để phản ứng trong búng tối ở nhiệt độ phũng 30 phút Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 415 nm
Mẫu trắng là dung dịch thử hoặc chuẩn không có AlCl3 10%
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, độ hấp thu được ghi nhận để tiến hành xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu cao chiết
Hàm lượng flavonoid toàn phần chứa trong mẫu cao chiết được đo lường bằng hàm lượng
QE đương lượng và được tính bằng công thức:
Trong đó: o F: hàm lượng flavonoid toàn phần (mg QE/g dược liệu khô) o c: nồng độ QE xỏc định từ đường chuẩn (àg/mL) o V: thể tích dịch chiết (mL) o m: khối lượng cao chiết có trong thể tích (g) o N: độ ẩm của cao chiết (%) o H: hiệu suất chiết cao (%)
Phương pháp tối ưu hóa chiết xuất flavonoid
Tối ưu hóa một công thức hay quy trình là việc tìm công thức, thông số (hoặc điều kiện tiến hành) của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm [9]
- Biến đầu vào (input variable) còn gọi là biến độc lập (independent variable) hay yếu tố (factor): Là những biến mà người làm thí nghiệm có thể thay đổi giá trị của nó khi tiến hành thí nghiệm (các thông số, điều kiện thí nghiệm) và sự thay đổi này sẽ kéo theo sự thay đổi giá trị của biến đầu ra [9] Căn cứ vào khả năng kiểm soát, người ta chia biến đầu vào làm 2 loại: biến kiểm soát được và biến không kiểm soát được
- Biến đầu ra (output variable) còn gọi là biến phụ thuộc (dependent variable) hay đáp ứng (response): Là các kết quả của thí nghiệm mà người làm thí nghiệm thấy cần phải đo đạc và đánh giá [9]
Theo lý thuyết hệ thống, một hệ thống có thể xem như một quá trình chuyển đổi từ biến đầu vào (input) thành biến đầu ra (output) Các biến đầu vào biết trước có thể thay đổi, điều khiển và sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình tối ưu hóa Chính vì vậy tối ưu hóa cần phải thể hiện được mối quan hệ giữa biến đầu ra và biến đầu vào Mối quan hệ này thường được biểu diễn đơn giản nhất bằng mô hình toán học [9]
Dưới đây là 2 phương pháp tối ưu hóa chiết xuất flavonoid:
1.4.1 Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time - OFAT) dựa trên nguyên tắc thay đổi giá trị của một thông số cần khảo sát trong khi giữ nguyên các thông số khác để đánh giá ảnh hưởng của từng thông số lên đáp ứng của một quá trình
Trong các thí nghiệm thiết kế theo OFAT, chỉ một yếu tố được phép thay đổi, các yếu tố khác phải được giữ cố định, kiểm soát chặt chẽ các ảnh hưởng bằng chuẩn hóa, loại trừ hoặc đảm bảo không gây ra nhiễu giữa các thí nghiệm [20] Khi so sánh kết quả giữa các thí nghiệm này có thể xác định trực tiếp liệu yếu tố khảo sát có ảnh hưởng và ảnh hưởng như thế nào tới quá trình [43]
11 Ưu điểm của phương pháp là đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thống kê và phân tích dữ liệu phức tạp Khi số lượng các yếu tố hay giá trị cần khảo sát không nhiều, biến hoàn toàn độc lập, ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu là rất nhỏ thì phương pháp này rất hữu hiệu [18]
Phương pháp này cũng có một vài nhược điểm như phải làm một lượng lớn thí nghiệm, đặc biệt khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến quá trình Phương pháp không đánh giá được ảnh hưởng của sự tương tác giữa các yếu tố Số lượng quan sát hữu hạn, khoảng khảo sát lớn nên việc lựa chọn điều kiện tối ưu kém chính xác và tốn kém Để khắc phục những nhược điểm trên, các phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên những nguyên lý thống kê đã được phát triển Trong đó, bề mặt đáp ứng là một trong số những phương pháp thường được sử dụng nhất [18]
1.4.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology – RSM) là phương pháp sử dụng các kỹ thuật thống kê và toán học để xây dựng, phát triển, cải thiện và tối ưu hóa một công thức cũng như một quy trình nhất định [31]
Từ đầu vào là các mức yếu tố đầu vào trong thiết kế thí nghiệm kết hợp với biến đầu ra, RSM đưa ra mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của chúng Trong RSM thường sử dụng 3 loại mô hình chính: mô hình tuyến tính (linear model), mô hình tương tác bậc 2 (interaction model) và mô hình bậc 2 (quadratic model) Trong đó, mô hình bậc 2 thường được sử dụng phổ biến hơn cả để xác định giá trị tối ưu của biến đầu ra Trường hợp tổng quát của mô hình này có dạng:
Trong đó: o Y là biến đầu ra o Xi là các biến đầu vào o βi là các hệ số tương ứng
Từ mô hình này, RSM sẽ đưa ra hàm mục tiêu (hàm kỳ vọng) thể hiện kết quả mà người thực hiện kỳ vọng có thể đạt được
Từ khi ra đời cho đến nay, RSM đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như vật liệu, hóa học, dược phẩm… Phương pháp tập trung chính vào 2 vấn đề: tối ưu hóa điều kiện quy trình hoặc một công thức; lựa chọn các thông số, điều kiện để thu được sản phẩm yêu cầu Từ đó, RSM giúp xây dựng và phát triển các quy trình sản xuất, giảm thiểu các yếu tố nhiễu, nâng cao chất lượng sản phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu tới thời điểm hiện tại đã có hơn 2000 nghiên cứu tối ưu hóa sử dụng RSM được công bố [44]
Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Tối ưu hóa công thức hay quy trình là việc tìm công thức, thông số hay điều kiện tiến hành của quy trình để sản phẩm làm ra đạt chất lượng tốt nhất trong giới hạn mong muốn của người làm thí nghiệm
Việc thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa gồm những bước cơ bản sau:
❖ Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn sàng lọc (screening experiment) Mục tiêu của bước sàng lọc này là để giảm thiểu số lượng biến đầu vào từ một danh sách các yếu tố ảnh hưởng, chỉ giữ lại những biến độc lập quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến biến phụ thuộc Nhờ đó, giúp làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần phải thực hiện Giai đoạn này sẽ thiết kế và tiến hành các thí nghiệm sơ bộ nhằm phân tích ảnh hưởng của các biến đầu vào lên các biến đầu ra để loại bỏ các biến đầu vào không hoặc ít ảnh hưởng
Các biến đầu vào được lựa chọn phải thỏa mãn điều kiện:
- Là biến độc lập, sự thay đổi giá trị của từng biến này dẫn đến sự thay đổi của biến đầu ra là hoàn toàn độc lập, không phụ thuộc và kéo theo sự thay đổi của các yếu tố khác
- Là biến định lượng, có trị số xác định cụ thể Các biến định tính như loại dung môi, loại tá dược, phương pháp chiết… không thể đưa vào làm yếu tố đầu vào Để lựa chọn các biến đầu vào, có thể căn cứ vào: cơ sở lý thuyết, ý kiến chuyên gia, các nghiên cứu tương tự hay trực tiếp tiến hành các thí nghiệm thăm dò và sàng lọc Việc sàng lọc này sẽ giúp giảm đáng kể số thí nghiệm cần thực hiện
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thu hái: Cành mang lá của cây Đỏ ngọn được thu hái tháng 04 năm 2024 ở xã Yên Bài, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là
Cratoxylum formosum (Jack) Benth & Hook.f ex Dyer Tiêu bản được lưu trữ tại khoa Dược học Cổ truyền, khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 1, mã số tiêu bản HNIP/18820/24)
Xử lý mẫu sau thu hái: Tuốt lấy lá từ cành mang lá, sấy lá Đỏ ngọn tươi trong tủ sấy tĩnh, nhiệt độ 55 – 60℃, tới khi đạt độ ẩm
Xử lý mẫu trước khi chiết: Dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay, rây qua rây 1400 thu được bột thô, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng
Xác định độ ẩm bột dược liệu: < 20% (thường là 10 - 12%)
Hình 2.1 Dược liệu và bột dược liệu Đỏ ngọn
Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất, chất chuẩn
STT Danh mục Tên hóa chất Nguồn gốc
Công ty TNHH Phát triển Công nghệ Thành Đô (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.)
2 Dung môi pha chế, chiết xuất, tráng rửa
Nước cất Phòng cung cấp nước cất của trường Đại học Dược Hà Nội
Ethanol 96% Công ty cổ phần Tập đoàn
3 Các hóa chất, thuốc thử AlCl3.6H2O Trung Quốc
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị
STT Dụng cụ và Thiết bị Nơi sản xuất
1 Tủ sấy Shellab, tủ sấy Memmert Đức
2 Bếp cô cách thủy Memmert Đức
3 Bếp bảo ôn model WHM12014 Hàn Quốc, Daihan
4 Tủ hốt hóa chất Fume hood Việt Nam, Ati
5 Máy li tâm HermLe Z207A Đức,
6 Bể siêu âm Elmasonic S 100H Đức, Elma
Hệ thống cô quay chân không (gồm bể điều nhiệt, bộ phận điều chỉnh tốc độ quay, sinh hàn, máy bơm chân không) Đức, IKA
8 Máy xay Dược liệu DQF - 200 Trung Quốc
9 Máy đo độ ẩm Ohaus Trung Quốc
10 Cột sắc kí lỏng Kromasil® Hãng Kromasil
11 Cân phân tích, cân kĩ thuật AND EK – 410i Nhật Bản
12 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Thụy sĩ
13 Máy đo quang Hitachi U-1800 Nhật Bản
Tủ lạnh bảo quản mẫu, bếp từ, các dụng cụ bằng thủy tinh (bình nón, đũa thủy tinh, phễu lọc, bình cầu, mao quản, …), các dụng cụ đo lường (cồn kế, nhiệt kế, pipet, ống đong, bình định mức, …), bông lọc, giấy lọc, giấy dán dầu, giấy bạc, các dụng cụ lưu mẫu và lấy mẫu khác
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid trong cao đặc Đỏ ngọn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis)
Dự kiến quy trình chiết xuất cao đặc Đỏ ngọn
Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Đỏ ngọn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV – Vis) (Phụ lục 4.1 – Dược điển Việt Nam V) [1] Phương pháp định lượng được thẩm định về độ phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chụm, độ đúng theo quy định của AOAC [12]
2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
Lựa chọn các yếu tố, các giá trị khảo sát và các thông số đánh giá theo Bảng 2.3:
Bảng 2.3 Các yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
Yếu tố khảo sát Giá trị khảo sát Các thông số đánh giá Dung môi chiết ethanol 50 – 70 – 90%
Hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần trong cao Phương pháp chiết – nhiệt độ chiết ngâm (nhiệt độ phòng, nóng), hồi lưu tại nhiệt độ sôi dung môi, siêu âm (nhiệt độ phòng, nóng) Thời gian chiết 30 phút, 60 phút, 90 phút
Tiến hành thiết kế thí nghiệm khảo sát theo phương pháp thay đổi một yếu tố, chiết xuất và định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao thu được bằng phương pháp định lượng đã xây dựng
Kết quả thu được xử lý tối ưu hóa bằng RSM, xác định ảnh hưởng của các biến số tới quá trình chiết xuất và đưa ra điều kiện chiết xuất phù hợp cho hàm lượng flavonoid toàn phần tối ưu
2.3.3 Nội dung 3: Xây dựng quy trình và nâng cấp quy mô chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
Trên cơ sở kết quả tối ưu hóa, xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ Đỏ ngọn ở quy mô 200 g dược liệu/mẻ
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Chiết xuất và điều chế cao đặc Đỏ ngọn dự kiến
Cân chính xác khoảng 15 g bột thô dược liệu Đỏ ngọn vào bình cầu 500 mL, thêm 15 mL ethanol 70% thấm ẩm dược liệu trong 15 phút Tiến hành chiết hồi lưu với 150 mL ethanol 70% ở 80℃ trong 60 phút Lọc dịch chiết qua bông, phần bã dược liệu và bông lọc đưa trở lại bình cầu Thêm tiếp 150 mL dung môi ethanol 70%, chiết hồi lưu ở 80℃ trong 1h Lọc dịch chiết qua bông, tráng bã dược liệu bằng ethanol 70% Gộp dịch chiết 2 lần và dịch tráng bã dược liệu, lọc lại bằng lọc hút chân không Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 55 – 60℃, 33 vòng/phút đến thể chất lỏng sánh Chuyển dịch đặc ra cốc có mỏ, tráng bình bằng dung môi, cô cách thủy ở 80℃ (kèm khuấy trộn) đến thể chất đặc sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60℃ đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)
2.4.2 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Đỏ ngọn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis)
Nguyên tắc: Flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến, sử dụng phản ứng tạo màu với AlCl3 được mô tả bởi J.Zhishen (1999) [21]
❖ Chuẩn bị các dung dịch gốc
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 12,5 mg chuẩn IQE vào bình định mức 50 mL, hòa tan và định mức tới vạch bằng ethanol thu được dung dịch A có nồng độ 250 μg/mL Hút chính xác 5,0 mL dung dịch A vào bình định mức 25 mL, định mức tới vạch bằng ethanol thu được dung dịch B Nồng độ dung dịch chuẩn gốc được xác định bằng công thức:
Trong đó: o m: khối lượng chuẩn đã cân (μg) o V: thể tích dung dịch chuẩn (mL) o P: độ tinh khiết của chất chuẩn o H: hàm ẩm của chất chuẩn
Chuẩn bị dung dịch thử gốc: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao dược liệu vào ống ly tâm 15 mL, siêu âm với 10 mL ethanol trong 15 phút Dịch hòa tan định mức vào bình định mức 100 mL thu được dung dịch thử gốc
❖ Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: Hút chính xác 3,0 mL dung dịch B vào bình định mức 10 mL, thêm 2 mL AlCl3 2%, định mức tới vạch bằng ethanol, phản ứng ở nhiệt độ phòng 15 phút
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút chính xác 3,0 mL dung dịch B vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng ethanol
Tiến hành quét phổ mẫu thử để xác định bước sóng cực đại
❖ Khảo sát nồng độ thuốc thử
Chuẩn bị các dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức
10 mL, thêm 2 mL AlCl3 có nồng độ lần lượt là 1%, 2%, 5%, 7%, 10% Định mức tới vạch bằng ethanol, để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng ethanol Đo độ hấp thụ các dung dịch thử ở bước sóng cực đại Xác định nồng độ AlCl3 cho độ hấp thụ lớn nhất
❖ Khảo sát thời gian phản ứng
Chuẩn bị dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức 10mL, thêm 2 mL AlCl3 định mức tới vạch bằng ethanol, để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút hoặc 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40 phút
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng ethanol Đo độ hấp thụ các dung dịch thử ở bước sóng cực đại Xác định thời gian phản ứng cho độ hấp thụ lớn nhất
❖ Tiến hành định lượng flavonoid toàn phần
Sau khảo sát, lựa chọn điều kiện đo quang phù hợp để tiến hành định lượng:
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu, tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ phù hợp và tiến hành phản ứng theo điều kiện đã khảo sát
Chuẩn bị mẫu trắng của dãy dung dịch chuẩn: Pha dãy mẫu trắng tương tự mẫu chuẩn, không thêm thuốc thử, định mức tới vạch bằng ethanol
Chuẩn bị dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức 10 mL và tiến hành phản ứng với AlCl3
Chuẩn bị mẫu trắng của dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng ethanol
Tiến hành đo quang: Đo độ hấp thụ tại bước sóng cực đại dãy dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn với nồng độ isoquercitrin: y = ax + b với hệ số tương quan R ≥ 0,995 [12]
20 Nồng độ flavonoid toàn phần trong mẫu cao được xác định theo isoqercitrin từ nồng độ tính toán được thông qua đường chuẩn Từ đó tính toán các thông số đánh giá sau:
Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao Đỏ ngọn được tính theo công thức:
Trong đó: o HL: hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao dược liệu (%) o C: nồng độ flavonoid toàn phần (μg/mL) o K: độ pha loãng o Vt: thể tích mẫu thử (mL) o m: khối lượng cao dược liệu mẫu thử (μg) o Hc: hàm ẩm cao dược liệu (%)
Hiệu suất chiết flavonoid toàn phần trong cao Đỏ ngọn được tính theo công thức:
Trong đó: o Hf: hiệu suất chiết flavonoid toàn phần trong cao dược liệu (%) o mc: khối lượng cao dược liệu thu được (g) o Hc: hàm ẩm cao dược liệu (%) o HLc: hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao dược liệu (%) o mdl: khối lượng dược liệu làm cao (g) o Hdl: hàm ẩm dược liệu (%) o HLdl: hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu (%)
2.4.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC về độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ đúng [12]
❖ Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp của hệ thống được khảo sát dựa vào việc phân tích 6 lần một mẫu chuẩn trên máy quang phổ UV - Vis với cùng điều kiện đã khảo sát, được đánh giá dựa vào sai số tương đối của 6 phép thử song song đối với độ hấp thụ
Tiến hành đo 6 lần một mẫu dung dịch chuẩn IQE nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính ở cùng điều kiện đo quang, ghi lại độ hấp thụ tại các lần đo
Yêu cầu: Hệ thống được coi là phù hợp nếu %RSD của độ hấp thụ các lần đo không vượt quá 2% [12]
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Flavonoid toàn phần trong cao đặc Đỏ ngọn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis)
3.1.1.1 Khảo sát bước sóng phát hiện
Tiến hành theo mục 2.4.2.1 thu được kết quả IQE có đỉnh hấp thụ cực đại ở 415nm nên bước sóng này được lựa chọn để tiến hành đo độ hấp thụ các dung dịch
Hình 3.1 Kết quả khảo sát cực đại hấp thụ chuẩn isoquercitrin 3.1.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc thử
Tiến hành theo mục 2.4.2.1 thu được kết quả như Hình 3.2:
Hình 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ AlCl 3
Nhận xét: Độ hấp thụ của dung dịch thử tăng dần theo sự tăng dần nồng độ AlCl3 Khi AlCl3 đạt 5%, độ hấp thụ của dung dịch thay đổi không đáng kể dù tăng nồng độ AlCl3 Vì vậy, để tối ưu phản ứng và tiết kiệm hóa chất, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ AlCl3 là 5%
3.1.1.3 Khảo sát thời gian phản ứng
Tiến hành theo mục 2.4.2.1 thu được kết quả như Hình 3.3:
Hình 3.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng màu
Nhận xét: Độ hấp thụ của dung dịch thử tăng dần theo sự tăng dần thời gian phản ứng Khi thời gian phản ứng đạt 30 phút, độ hấp thụ của dung dịch thay đổi không đáng kể dù tăng thời gian phản ứng Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian phản ứng là 30 phút
3.1.1.4 Xây dựng phương pháp định lượng
Từ kết quả khảo sát xây dựng phương pháp định lượng như sau:
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, thử gốc: Chuẩn bị như mục 2.4.2.1 được dung dịch B có nồng độ 48,90 μg/mL và dung dịch thử gốc
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Lần lượt hút chính xác 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 mL dung dịch B vào bình định mức 10 mL, thêm 2mL AlCl3 5%, định mức tới vạch bằng ethanol, để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Thu được dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là 9,78; 14,67; 19,56; 24,45; 29,34; 34,23 μg/mL
Chuẩn bị mẫu trắng của dãy dung dịch chuẩn: Lần lượt hút chính xác 2,0; 3,0; 4,0; 5,0;
6,0; 7,0 mL dung dịch B vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng ethanol
Chuẩn bị dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử gốc vào bình định mức 10 mL, thêm 2 mL AlCl3 2%, định mức tới vạch bằng ethanol 70%, để phản ứng 15 phút
Chuẩn bị mẫu trắng của dung dịch thử: Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thử vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng ethanol 70%
Tiến hành đo quang và tính toán kết quả như phương pháp đã xây dựng tại mục 2.4.2.1
Kết quả thẩm định các tiêu chuẩn về độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chụm của phương pháp được trình bày chi tiết ở Phụ lục 3 và được tóm tắt ở Bảng 3.1:
5 10 15 20 25 30 35 40 độ h ấp th ụ thời gian phản ứng (phút)
Bảng 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong Đỏ ngọn
STT Tiêu chuẩn Yêu cầu Kết quả
1 Độ phù hợp hệ thống RSD (%) < 2,0% RSD = 1,06%
Y là độ hấp thụ tại bước sóng 415nm x là nồng độ isoquercitrin trong dung dịch (àg/mL)
3 Độ chụm Độ lặp lại hàm lượng flavonoid toàn phần có:
2 ngày: RSDR (%) = 0,99% Độ chính xác trung gian
Nhận xét: Phương pháp đạt yêu cầu về thẩm định của AOAC, có thể sử dụng để định lượng flavonoid toàn phần trong cao Đỏ ngọn.
Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
từ dược liệu Đỏ ngọn
3.2.1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
Tiến hành theo mục 2.4.3.1 kết quả thu được như sau:
❖ Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết
Hình 3.4 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid
Nhận xét: Khi tăng nồng độ ethanol từ 50% lên 70%, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng mạnh và giảm khi tăng nồng độ ethanol lên 90% Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ ethanol là 70% cho các thí nghiệm
❖ Ảnh hưởng của phương pháp chiết và nhiệt độ chiết
Hình 3.5 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp và nhiệt độ chiết tới hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid
Nhận xét: Trong các phương pháp chiết, phương pháp hồi lưu ở nhiệt độ sôi của ethanol cho kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tốt nhất Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu ở nhiệt độ 80℃ cho các thí nghiệm
50 70 90 hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% ) hiệu su ất ch iết flav on oid to àn p hầ n (% ) nồng độ ethanol (%) hiệu suất chiết flavonoid toàn phần hàm lượng flavonoid toàn phần
Ngâm nóng Siêu âm nhiệt độ thường
Siêu âm nóng Hồi lưu hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% ) hiệu su ất ch iết flav on oid to àn p hầ n (% ) phương pháp chiết hiệu suất chiết flavonoid toàn phần hàm lượng flavonoid toàn phần
❖ Ảnh hưởng của thời gian chiết
Hình 3.6 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết tới hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid
Nhận xét: Khi tăng thời gian chiết từ 30 đến 60 phút, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng Tuy nhiên khi tăng lên 90 phút, hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần giảm Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết 60 phút cho các thí nghiệm
❖ Ảnh hưởng của số lần chiết
Hình 3.7 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết tới hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid
Nhận xét: Khi tăng số lần chiết, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng lên
Tuy nhiên tới 3 lần chiết, hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần không thay đổi Vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết xuất là 2 cho các thí nghiệm
30 60 90 hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% ) hiệu su ất ch iết flav on oid to àn p hầ n (% ) thời gian chiết (phút) hiệu suất chiết flavonoid toàn phần hàm lượng flavonoid toàn phần
1 2 3 hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% ) hiệu su ất ch iết flav on oid to àn p hầ n (% ) số lần chiết (lần) hiệu suất chiết flavonoid toàn phần hàm lượng flavonoid toàn phần
❖ Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi : dược liệu
Hình 3.8 Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của DM/DL chiết tới hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ DM/DL, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng lên Khi tăng tới tỷ lệ 12 : 1 mặc dù hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần giảm Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ DM/DL 10:1 cho các thí nghiệm
Dựa theo yêu cầu mục 1.4.2 và phương pháp mục 2.4.3.2 lựa chọn các biến đầu vào và khoảng khảo sát của chúng để xây dựng mô hình trong phương pháp bề mặt đáp ứng như sau: o Dung môi chiết xuất: ethanol nồng độ 50; 70; 90% o Thời gian chiết xuất: 30; 60; 90 phút o Tỷ lệ dung môi : dược liệu: 8:1, 10:1, 12:1 mL/g
3.2.2 Tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Các yếu tố đầu vào có ảnh hưởng lớn quá trình chiết flavonoid đưa vào mô hình là: nồng độ ethanol, thời gian chiết xuất và DM/DL Điều kiện thích hợp khảo sát được từ các thí nghiệm đơn yếu tố mục 3.3.1 được lấy làm điểm chính giữa (điểm 0) trong thiết kế BBD và cùng với các điều kiện còn lại mã hóa theo Bảng 3.2:
8:1 10:1 12:1 hà m lư ợn g flav on oid to àn p hầ n (% ) hiệu su ất ch iết flav on oid to àn p hầ n (% ) tỷ lệ dung môi : dược liệu (mL/g) hiệu suất chiết flavonoid toàn phần hàm lượng flavonoid toàn phần
Bảng 3.2 Các mức của yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng Đơn vị
Thời gian chiết xuất Phút 30 – 90 30 60 90
Sử dụng tính năng RSM trên phần mềm Design Expert 13.0.5 để thiết kế thí nghiệm theo mô hình BBD thu được 15 thí nghiệm, trong đó có 3 thí nghiệm tại tâm để đảm bảo độ lặp và độ ổn định của quá trình chiết xuất Tiến hành thực hiện thí nghiệm theo thứ tự ngẫu nhiên Kết quả thiết kế thí nghiệm và tiến hành thực nghiệm thu được như sau:
Bảng 3.3 Kết quả hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm
Biến được mã hóa Biến thực
Hàm lượng flavonoid toàn phần (%) (Y 1 )
Hiệu suất chiết flavonoid toàn phần (%) (Y 2 )
3.2.2.2 Tối ưu hóa quá trình chiết xuất a) Kết quả xây dựng mô hình
Từ dữ liệu thực nghiệm 15 thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.7, tiến hành xây dựng mô hình bằng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (multivariable linear regression – MLR) sử dụng phần mềm Design Expert 13 để xử lý kết quả cụ thể thu được như sau:
Mô hình xây dựng bằng MLR biểu thị mối quan hệ của nồng độ ethanol (X1), thời gian chiết (X2), DM/DL (X3) đến hàm lượng flavonoid toàn phần (Y1) và hiệu suất flavonoid toàn phần (Y2) như sau:
Tiến hành đánh giá hai mô hình này bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA thu được kết quả ở bảng 3.4:
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá mô hình hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần bằng
Yếu tố Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p
Mức độ không tương thích
R 2 adj : hệ số xác định hiệu chỉnh
R 2 pre : hệ số xác định dự đoán a: p < 0,05; NS: not significant – không có ý nghĩa; S: significant – có ý nghĩa
Từ bảng kết quả ta thấy:
Mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng flavonoid toàn phần với các điều kiện chiết xuất (Y1) có:
- Giá trị xác xuất của mô hình p – value là 0,0004 < 0,05 do đó mô hình được lựa chọn có ý nghĩa thống kê
BÀN LUẬN
Về phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Đỏ ngọn bằng phương pháp
Phương pháp quang phổ UV – Vis được lựa chọn để tiến hành định lượng flavonoid toàn phần trong Đỏ ngọn Phương pháp này đã được áp dụng trong một vài nghiên cứu trước đây thu được kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần là 101,6mgQE/g dịch chiết [15] Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Đỏ ngọn bằng các sử dụng AlCl3 để tạo phức màu sau đó tiến hành đo quang
Khác với các nghiên cứu trước đó sử dụng QE làm chuẩn, nhóm nghiên cứu lựa chọn IQE do nó là một flavonoid có mặt trong dịch chiết Đỏ ngọn với tác dụng chống oxy hóa tốt [26, 36] IQE có thể phát hiện được cực đại hấp thụ ở vùng bước sóng 413 – 440nm Về thuốc thử tạo màu, nhóm nghiên cứu lựa chọn chỉ sử dụng AlCl3 để tạo phức mà không kali acetat hay NaOH như các nghiên cứu trước đó [15, 33] Điều này có thể giải thích do việc thêm kali acetat không ảnh hưởng tới quá trình tạo phức màu của flavonoid với AlCl3 [28, 38], còn việc thêm NaOH tạo môi trường kiềm và có thể tạo tủa Al(OH)3 nếu cho dư thuốc thử và gây cản trở quá trình đo quang Để đảm bảo đủ lượng thuốc thử cũng như đủ thời gian để phản ứng màu hoàn toàn, giúp tiết kiệm thuốc thử và thời gian, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát và lựa chọn nồng độ AlCl3 5% và 30 phút phản ứng
Quá trình thẩm định phương pháp định lượng này đều đạt giới hạn yêu cầu về độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ đúng Điều này cho thấy đây là phương pháp phù hợp áp dụng cho Đỏ ngọn
Từ kết quả định lượng các mẫu khảo sát ta thấy hàm lượng flavonoid toàn phần của Đỏ ngọn nằm trong khoảng 9,26 – 9,54% tương ứng 92,6 – 95,4 mgIQE/g cao đặc Kết quả này cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần dạng cao đặc gần tương đương dạng dịch chiết Việc giảm hàm lượng này có thể giải thích do quá trình thu hồi dung môi và điều chế cao đặc gây ảnh hưởng tới độ bền hoạt chất
Xét về ưu điểm, đo quang là một phương pháp phổ biến sử dụng trong định lượng nhóm flavonoid với cách làm đơn giản, chi phí thấp, phù hợp cho định lượng nhiều hoạt chất có hàm lượng nhỏ Tuy nhiên phương pháp này có độ chọn lọc kém nên việc thiết kế mẫu trắng tương ứng với từng mẫu giúp quy trình có tính chọn lọc tốt hơn Các phức màu có cực đại hấp thụ khác nhau cũng là một cản trở khiến kết quả đo độ hấp thụ bị sai lệch nên cần phải tiến hành theo đúng quy trình đã xây dựng để hạn chế ảnh hưởng này
Về khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn
Để hoàn thành mục tiêu tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ Đỏ ngọn cần giải quyết ba vấn đề: khảo sát, lựa chọn yếu tố đầu vào; thiết kế thí nghiệm, xây dựng và đánh giá mô hình; xác định điều kiện tối ưu
4.2.1 Về kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn biến đầu vào
Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) để tiến hành khảo sát Phương pháp rất hữu hiệu khi khảo sát ảnh hưởng của những yếu tố chỉ nhận một số lượng hữu hạn các giá trị đầu vào nhưng lại không đánh giá được tương tác của các yếu tố với nhau và ảnh hưởng của nhiều yếu tố cũng như tương tác của chúng tới kết quả đầu ra Chính vì vậy nhóm nghiên cứu không sử dụng phương pháp này để tối ưu hóa quá trình chiết xuất mà chỉ dùng nó để khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng[18, 20, 43] Kết quả khảo sát có các bàn luận như sau:
❖ Lựa chọn nồng độ ethanol
Khi thay đổi nồng độ ethanol sẽ làm ảnh hưởng tới các đặc tính của dung môi như khả năng hòa tan hoạt chất, độ nhớt, sức căng bề mặt và khả năng thấm vào dược liệu Khi tăng nồng độ ethanol ta thấy hàm lượng flavonoid toàn phần tăng dần do bản chất flavonoid là hoạt chất tan tốt trong ethanol nồng độ cao Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ ethanol là 70% cho các thí nghiệm khảo sát
❖ Lựa chọn phương pháp – nhiệt độ chiết xuất
Trong các phương pháp chiết, phương pháp hồi lưu cho kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tốt nhất vì dược liệu luôn được tiếp xúc với dung môi và nhiệt độ cao trong suốt quá trình chiết xuất Đây là phương pháp chiết xuất được sử dụng khá phổ biến, thiết kế đơn giản với các ưu điểm: tiết kiệm dung môi, tiết kiệm thời gian chiết xuất, bảo vệ môi trường, chi phí đầu tư thấp Phương pháp này còn có khả năng ứng dụng ở quy mô phòng thí nghiệm và nâng cấp lên quy mô công nghiệp Vì vậy với điều kiện trang thiết bị có sẵn và kết quả khảo sát sơ bộ nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu cho các thí nghiệm
Về nhiệt độ chiết xuất, các phương pháp chiết sử dụng nhiệt độ cao (ngâm nóng, siêu âm nóng, hồi lưu) cho kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tốt hơn Nhiệt độ chiết tăng sẽ làm giảm độ nhớt và giảm sức căng bề mặt dung môi, tăng độ tan và tốc độ khuếch tán hoạt chất, tăng khuếch tán đối lưu giúp tăng tốc độ chiết và tăng hiệu suất chiết [3, 4, 28] Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể ảnh hưởng đến các chất kém bền với nhiệt, hoặc tăng độ tan của tạp chất Với điều kiện phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ chiết là 80 o C là nhiệt độ sôi của ethanol cho các thí nghiệm
❖ Lựa chọn thời gian chiết
Khi tăng thời gian chiết, hàm lượng flavonoid toàn phần tăng dần nhưng khi thời gian chiết kéo dài quá lâu thì lại có sự giảm nhẹ Điều này có thể giải thích do khi tăng thời gian chiết, dược liệu được tiếp xúc với dung môi và nhiệt độ dài hơn, cấu trúc và độ bền cơ học của tế bào dược liệu giảm, làm tăng khả năng chiết chất gồm cả hoạt chất và tạp chất Khi đạt cân bằng chiết, hàm lượng hoạt chất trong dược liệu cân bằng với môi trường thì quá trình khuếch tán sẽ dừng lại và hiệu suất chiết sẽ đạt cao nhất Tuy nhiên, hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ hơn tạp chất, khuếch tán và đạt cân bằng chiết sớm hơn tạp chất [3, 4] Do đó nếu chiết trong thời gian quá dài, tỉ lệ hoạt chất không tăng mà tỉ lệ tạp sẽ tăng, hiệu suất chiết tăng lên nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần lại giảm Việc tăng thời gian tiếp xúc với nhiệt độ còn có thể gây ảnh hưởng đến độ bền của hoạt chất, đặc biết là với các chất có hoạt tính chống oxy hóa thuộc nhóm flavonoid của Đỏ ngọn Do đó, thời gian chiết tối ưu nhất nhóm nghiên cứu lựa chọn là 60 phút cho các thí nghiệm
❖ Lựa chọn số lần chiết
Khi tăng số lần chiết, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng lên Tiến hành chiết 1 lần sẽ chưa thể chiết hết hoạt chất Khi tăng số lần chiết, dung môi chiết xuất được làm mới từ đó tăng chênh lệch nồng độ hoạt chất trong dược liệu và dịch chiết dẫn tới tăng khả năng khuếch tán, lượng hoạt chất chiết được sẽ tăng lên Tuy nhiên khi tiếp tục tăng số lần chiết lên 3 lần, ta thấy hiệu suất chiết có tăng nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần không thay đổi Điều này chứng tỏ hoạt chất đã được chiết kiệt ở lần 2 Bên cạnh đó việc tăng nhiều lần chiết làm tiêu tốn dung môi hóa chất, năng lượng, thời gian cho cả quá trình chiết xuất và quá trình xử lý dịch chiết sau đó Vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn số lần chiết xuất là 2 cho các thí nghiệm khảo sát và mô hình tối ưu
❖ Lựa chọn tỷ lệ dung môi : dược liệu
Khi tăng tỷ lệ DM/DL, hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần tăng lên Đây là do khi tăng tỷ lệ DM/DL, lượng chất được chiết ra nhiều hơn, dễ dàng được chiết kiệt hơn Tuy nhiên khi tăng tỷ lệ lên đến 12 : 1 thì hiệu suất chiết tăng nhưng hàm lượng flavonoid toàn phần lại giảm do không chỉ hoạt chất mà tạp chất cũng được chiết ra nhiều hơn Mặt khác, khi tỷ lệ dung môi tăng lên thì dịch chiết thu được sẽ loãng dần, quá trình xử lý dịch chiết tốn nhiều thời gian và năng lượng, đồng thời gây lãng phí dung môi và hao hụt hoạt chất Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ DM/DL là 10:1 để đưa vào thí nghiệm khảo sát và mô hình tối ưu
4.2.2 Về tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Sau khi có kết quả khảo sát và lựa chọn yếu tố đầu vào quan trọng là nồng độ ethanol, thời gian chiết, DM/DL, ta thấy chúng đều là các biến liên tục Nếu tiếp tục áp dụng phương pháp thay đổi một yếu tố thì sẽ phải làm rất nhiều thí nghiệm với các mức nhỏ hơn, gây tốn kém Chính
43 vì vậy nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trên phần mềm Design Expert 13.0.5 để thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box – Behnken Mô hình này đưa ra 15 thí nghiệm để tiến hành thực nghiệm Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam tiến hành tối ưu hóa quy trình chiết flavonoid từ dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp này
Trên bộ số liệu thực nghiệm đã thu được, nhóm nghiên cứu giải quyết vấn đề xây dựng mô hình bằng phương pháp phương pháp MLR và đánh giá mô hình BBD thu được bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA Mô hình được thể hiện dưới dạng phương trình hồi quy bậc hai Phương trình này thể hiện sự ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào lên hàm kỳ vọng thông qua hệ số của biến trong phương trình
❖ Xác định điều kiện chiết xuất tối ưu
Ngoài ưu điểm đánh giá chính xác vai trò của từng yếu tố đầu ra với số thí nghiệm giảm đi đáng kể, rút ngắn thời gian khảo sát và tiết kiệm chi phí đầu tư, RSM cũng rất linh hoạt cho phép tối ưu hóa đồng thời nhiều mục tiêu Điều này khẳng định sự phù hợp của phương pháp trong việc xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ Đỏ ngọn một cách tối ưu
Kết quả phân tích RSM đã đưa ra một số giải pháp thỏa mãn yêu cầu về hàm lượng và hiệu suất chiết flavonoid toàn phần với các yếu tố thí nghiệm nằm trong phạm vi khảo sát Sau khi cân nhắc với điều kiện thực tế kết hợp cùng kết quả khảo sát bằng OFAT, nhóm nghiên cứu đã đưa ra được quy trình tối ưu như sau: o Dung môi chiết: ethanol 82% o Phương pháp chiết: hồi lưu ở 80℃ o Thời gian chiết: 83 phút o Số lần chiết: 2 lần o Tỷ lệ dung môi: dược liệu: 11 : 1 mL/g Đây không chỉ là kết quả về tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ Đỏ ngọn, việc ứng dụng đồng thời các phương pháp toán học vào trong nghiên cứu đã khẳng định vai trò ngày một to lớn của toán học hiện đại trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu