Đỗ trang ngân nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất dihydromyricetin từ chè dây khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ TRANG NGÂN NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CHIẾT XUẤT DIHYDROMYRICETIN TỪ CHÈ DÂY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ TRANG NGÂN Mã sinh viên: 1801483 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CHIẾT XUẤT DIHYDROMYRICETIN TỪ CHÈ DÂY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Phạm Thái Hà Văn - Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt từ ngày đầu nghiên cứu, giúp hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu phòng ban, thầy cô giáo, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy bảo với nhiều kiến thức quý báu suốt năm học Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn anh chị cao học làm thực nghiệm môn Dược học cổ truyền nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình làm nghiên cứu thực nghiệm, bạn làm khóa luận khóa 73 em nhóm nghiên cứu mơn Dược học cổ truyền, tất giúp đỡ, động viên, hỗ trợ nhiều Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè ln khích lệ, giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Do kiến thức thân giới hạn nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa quý thầy cô, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Đỗ Trang Ngân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Chè dây 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm thực vật 1.2 Tổng quan Chè dây 1.2.1 Thành phần hóa học 1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2.3 Công dụng y học cổ truyền dân gian 1.3 Tổng quan Dihydromyricetin 1.3.1 Cấu trúc hoá học tính chất vật lý dihydromyricetin 1.3.2 Tác dụng sinh học dihydromyricetin 1.4 Các nghiên cứu phương pháp chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây 1.5 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 1.5.1 Phương pháp thay đổi yếu tố 1.5.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị phần mềm 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Quy trình phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây 14 2.3.2 Quy trình chiết xuất định lượng dihydromyricetin chiết Chè dây 15 2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin Chè dây 16 2.3.4 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây 17 2.3.5 Phương pháp tối ưu hóa q trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây 18 2.3.6 Phương pháp xử lí số liệu 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Kết phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây 20 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin Chè dây 21 3.2.1 Độ đặc hiệu 21 3.2.2 Sự phù hợp hệ thống 22 3.2.3 Độ tuyến tính 22 3.2.4 Độ lặp lại 23 3.2.5 Độ 24 3.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 25 3.3.1 Nồng độ EtOH (tt/tt) 25 3.3.2 Thời gian chiết xuất 26 3.3.3 Nhiệt độ chiết xuất 26 3.4 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu 27 3.4.1 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 27 3.4.2 Kết tối ưu hóa q trình chiết xuất 29 3.5 Bàn luận 33 3.5.1 Về kết phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây 33 3.5.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây 34 3.5.3 Về kết tối ưu hóa q trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DĐVN Dược điển Việt Nam DHM Dihydromyricetin EtOH Ethanol HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao MeOH Methanol OFAT Phương pháp thay đổi yếu tố (One factor at a time) RSD Độ lệch chuẩn tương đối RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) SD Độ lệch chuẩn STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo tR Thời gian lưu TT Thuốc thử tt/tt Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG STT Kí hiệu Tên bảng Trang 1.1 Một số hợp chất flavonoid phân lập từ Chè dây 3.1 Kết tính phù hợp hệ thống phương pháp định lượng 23 3.2 Kết khảo sát độ tuyến tính 24 3.3 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng 25 3.4 Kết thẩm định độ phương pháp định lượng 25 3.5 Kết mã hoá biến đầu vào 30 3.6 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 30 3.7 Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình xây dựng 32 3.8 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm (n=3) 35 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Kí hiệu Tên hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo số acid hữu Chè dây 1.2 Công thức cấu tạo số thành phần khác 1.3 Quy trình tối ưu hóa phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 10 3.1 Sơ đồ phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây 21 3.2 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng 22 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ Spic DHM 24 3.4 Kết khảo sát nồng độ ethanol (tt/tt) 27 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 28 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 29 10 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng Dihydromyricetin dịch chiết với biến đầu vào 33 11 3.8 Kết tối ưu điều kiện chiết xuất 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây chè dây loại xanh quanh năm, có tên khoa học Ampelosis cantoniensis (H & A.) PL họ Nho (Vitacae) Chè dây gọi Thau rả (theo dân tộc Tày) hay Khau rả (theo dân tộc Nùng), phân bố nhiều nơi Việt Nam: Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải Phịng, Quảng Ninh, ng Bí, Hà Tây, Ninh Bình, vùng núi miền Trung [12] số nước Lào, Trung Quốc, Indonesia Chè dây loại dây leo có vị ngọt, đắng, tính mát, đồng bào dân tộc miền núi sử dụng vị thuốc dân gian chữa bệnh liên quan tới dày ợ hơi, ợ chua, đau rát thượng vị Các kết nghiên cứu chè dây Việt Nam cho thấy dịch chiết chè dây có nhiều hoạt tính sinh học q, cao khơ chè dây chứa đựng flavonoid có hoạt tính chống oxy hố ức chế phát triển số chủng vi khuẩn, điều trị có hiệu bỏng, điều trị tốt với bệnh nhân loét dày - tá tràng, ức chế đột biến gen gây nên số tác nhân độc hại [12] Dihydromyricetin hay gọi ampelopsin, chất chuyển hóa thứ cấp chè dây thuộc loại flavonoid với khả chống oxy hóa mạnh, kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, chống ung thư, bảo vệ gan chống nhiễm độc rượu [25] Do giá trị dihydromyricetin (DHM), hợp chất lên thành phần hoạt tính sinh học đầy hứa hẹn dành cho số ứng dụng dược phẩm thực phẩm chức Những năm gần đây, nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học có lợi từ thực vật quan tâm với nhu cầu ngày tăng sản phẩm mang đặc tính dược lý Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng hàm lượng DHM chiết từ chè dây cần thiết, tạo điều kiện thuận lợi cho việc áp dụng, sử dụng flavonoid aglycone tự nhiên với số chức tăng cường sức khỏe ghi nhận Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây” thực với hai mục tiêu: Phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây đạt tiêu chuẩn làm chất chuẩn Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa điều kiện chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Chè dây 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại Tên khoa học: Ampelopsis cantoniensis (Hook et Arn.) Planch Tên đồng nghĩa: Cissus cantoniensis Hook et Arn Theo hệ thống phân loại Takhtajan “Flowering Plants” (2009), Chè dây thuộc chi Ampelopsis, họ Nho (Vitaceae), Nho (Vitales), lớp Ngọc lan (Magnoliopisida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae) 1.1.2 Phân bố Chè dây phân bố Lạng Sơn, Cao Bằng, Lào Cai Sau phát thêm nhiều điểm Đồng Văn, Mèo Vạc, Yên Minh, Quản Bạ (Hà Giang); Hương Khê (Hà Tĩnh); Trà My (Quảng Nam); Đăk Tô, Konplong (Kon Tum); K'Bang (Gia Lai) số điểm khác Nghệ An, Lâm Đồng Đồng Nai [11] Chè dây loại ưa ẩm ưa sáng, thường leo mọc trùm lên loại bụi gỗ nhỏ vùng đồi, ven rừng bờ nương rẫy Độ cao phân bố từ 600 đến 1600m Cây tỏ thích nghi với vùng nhiệt đới núi cao, Hà Giang, Lào Cai Mùa chồi sinh trưởng mạnh trùng với mùa mưa ẩm Những mọc trùm lên loại khác có nhiều hoa bị che bóng Chè dây có khả tái sinh chồi mạnh sau bị cắt cành [11] 1.1.3 Đặc điểm thực vật Cây leo Thân cành cứng, hình trụ, có lơng nhỏ Tua chẻ đôi, mọc đối diện với Lá kép lông chim, mọc so le, có - 13 chét có cuống, hình trái xoan, dài 2,5 - 7,5 cm, rộng 1,5 - cm, gốc trịn, đầu nhọn, mép có cưa, nhẵn, mặt khơ có vết trắng loang lổ bị nấm mốc, mặt nhạt; kèm khô xác [11] Cụm hoa mọc đối diện với thành ngù phân nhiều nhánh, rộng - cm; hoa nhiều màu trắng; dài hình chén, có lơng mịn; tràng có cánh, mép nhăn, nhị 5, nhị mảnh; Bầu hình nón, nhăn, có ơ, nỗn Quả mọng chín màu đen; hạt - 4, thót lại gốc [11] Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng Dihydromyricetin dịch chiết với biến đầu vào trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng Dihydromyricetin dịch chiết với biến đầu vào Trong đó: Đồ thị (1), (2), (3) biểu thị mối tương quan hàm lượng Dihydromyricetin dịch chiết với: nồng độ EtOH - thời gian chiết xuất, nồng độ EtOH - nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất - nhiệt độ chiết xuất 31 3.4.2.2 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào Mục đích tối ưu hóa chiết xuất lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào để đạt mục tiêu thu hàm lượng Dihydromyricetin tối đa Sử dụng phần mềm Design expert 11 thu kết hình 3.8 Hình 3.8 Kết tối ưu điều kiện chiết xuất Các thông số chiết xuất tối ưu đạt từ mơ hình: • Nồng độ EtOH (tt/tt): 66,0888 % • Thời gian chiết xuất: 136,01 phút • Nhiệt độ chiết xuất: 78,5318 oC Tại điều kiện này, mô hình dự đốn hàm lượng Dihydromyricetin chiết từ dược liệu 287,8 (mg/g) Dựa vào điều kiện tối ưu trên, mơ hình kiểm nghiệm lại lần với điều kiện sau: • Nồng độ EtOH (tt/tt): 66 % • Thời gian chiết xuất: 136 phút • Nhiệt độ chiết xuất: 79oC Kết kiểm định mô hình thực nghiệm trình bày bảng 3.8 32 Bảng 3.8 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm (n=3) Hàm lượng Dihydromyricetin (mg/g) Giá trị dự đốn Giá trị thực nghiệm Độ xác 287,8 279,3 ± 4,1 97,05% Nhận xét: Mơ hình có khả dự đốn tương đối xác hàm lượng Dihydromyricetin dịch chiết với độ xác giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm 97,05% 3.5 Bàn luận 3.5.1 Về kết phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây Trong tài liệu mà nghiên cứu, để chiết flavonoid toàn phần Chè dây, dung môi mà tác giả dùng nước, methanol hay ethanol Quy trình chiết xuất trực tiếp với dung mơi nước có ưu điểm đơn giản, khơng tồn dư dung mơi Tuy nhiên phương pháp có hiệu suất chiết không cao Cả methanol ethanol chiết flavonoid toàn phần với hiệu suất cao ethanol có ưu điểm sẵn có, rẻ tiền, độc, dung môi thông dụng nên đề tài lựa chọn ethanol 75% làm dung môi chiết xuất Hai flavonoid xác định Chè dây myricetin dihydromyricetin [12] Hiện tại, phương pháp tách tinh chế hiệu cao liên quan đến dihydromyricetin myricetin chủ yếu kỹ thuật sắc ký khác sắc ký cột silica gel, sắc ký cột polyamide, sắc ký hấp phụ nhựa macroporous, sắc ký ngược dịng tốc độ cao [21] Phương pháp có hiệu suất tách cao độ tinh khiết cao, cần chi phí lớn, quy mơ điều chế nhỏ yêu cầu kỹ thuật cao không phù hợp cho sản xuất cơng nghiệp Ban đầu, nhóm nghiên cứu dự kiến phân lập tinh chế đồng thời myricetin dihydromyricetin Đây nghiên cứu phân lập myricetin dihydromyricetin từ Chè dây dựa vào độ tan khác chúng aceton Tuy nhiên lượng myricetin thô thu sau phân lập nhỏ nên tiến hành tinh chế dihydromyricetin Do đó, nghiên cứu đề xuất tiếp tục quy trình với quy mơ lớn để thu myricetin tinh khiết đạt tiêu chuẩn làm chất chuẩn Quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin mà đưa đơn giản, sử dụng dung mơi độc hại khơng độc hại, sử dụng trang thiết bị dễ thiết kế lắp đặt, thu hồi lại dung môi để tái sản xuất cho lần sau, vừa tiết kiệm không gây hại cho môi trường 33 Nghiên cứu phân lập tinh chế 5,54 g dihydromyricetin từ khoảng 100 g dược liệu Chè dây với hiệu suất 5,53% độ tinh khiết 98,98%, đủ điều kiện làm chất chuẩn Kết khơng có ứng dụng lĩnh vực kiểm nghiệm mà cịn ứng dụng sản xuất nguyên liệu để làm thuốc, mà nghiên cứu lâm sàng tác dụng dihydromyricetin có đầy đủ sức thuyết phục để đưa dạng thuốc với hoạt chất dihydromyricetin tinh khiết 3.5.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây Về kết nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất: Nồng độ Ethanol dung môi Do độ phân cực nước ethanol khác nên trộn lẫn ethanol nước cho hỗn hợp ethanol nước có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung môi có độ phân cực tương đương với hợp chất cần chiết xuất hịa tan chất tốt Kết cho thấy, dung mơi ethanol 60% dung mơi có độ phân cực gần tương đương với hợp chất cần chiết xuất nên chiết hàm lượng dihydromyricetin cao Thời gian chiết xuất Thông thường, hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu môi trường Khi đạt cân chiết (hàm lượng hoạt chất dược liệu cân với mơi trường), q trình khuếch tán dừng lại Lúc này, hiệu suất chiết cao Ngoài ra, hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ tạp chất nên khuếch tán nhanh đạt cân chiết sớm Nên thời gian chiết lâu, hàm lượng hoạt chất chiết khơng tăng mà cịn tăng tỉ lệ tạp chất, đồng thời tăng nguy phân hủy hoạt chất bền, gây ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết hiệu suất chiết [4] Do đó, cần khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu để thu dịch chiết có hàm lượng chất lượng cao Kết cho thấy, thời gian chiết xuất 120 phút cho hàm lượng dihydromyricetin cao Nhiệt độ chiết xuất Tăng nhiệt độ chiết xuất có tác dụng làm giảm độ nhớt sức căng bề mặt, tăng tính thấm dung mơi vào tế bào dược liệu, đồng thời tăng độ tan, tốc độ khuếch tán hoạt chất từ dược liệu môi trường tăng khuyếch tán đối lưu, giúp rút ngắn thời gian 34 chiết tăng hiệu suất chiết Kết hàm lượng dihydromyricetin tăng dần tăng nhiệt độ, kết phù hợp với lý thuyết nghiên cứu trước Zhang cộng ảnh hưởng nhiệt độ đến độ tan dihydromyricetin [42] Tuy nhiên, chiết nhiệt độ cao 80oC làm bay dung mơi ethanol, tăng chi phí sản xuất giảm chất lượng sản phẩm hình thành hợp chất không mong muốn, làm chuyển dạng cấu trúc polyphenol phá hủy số dạng polyphenol [4],[40] Đồng thời nhiệt độ cao gây nguy hiểm chiết xuất ethanol thiết bị không đảm bảo độ an tồn Vì vậy, đề tài giới hạn cận yếu tố nhiệt độ 80oC 3.5.3 Về kết tối ưu hóa q trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây Các yếu tố nồng độ Ethanol, thời gian chiết xuất nhiệt độ chiết xuất biến liên tục Do đó, khảo sát lựa chọn điều kiện chiết tối ưu sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố cần làm nhiều thí nghiệm, gây tốn Vì vậy, phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken cho phép đánh giá đầy đủ xác vai trị yếu tố tới biến đầu với số lượng thí nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp khác, giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức chi phí Có thể thấy, với biến đầu vào, biến có mức yếu tố, thiết kế theo mơ hình đầy đủ, số thí nghiệm cần thực tối thiểu 33 = 27 Trong đó, theo mơ hình Box-Behnken, cần N = 2.3.(3-1) + = 17 thí nghiệm (5 thí nghiệm tâm nhằm đánh giá khả lặp lại mơ hình) Với phương pháp bề mặt đáp ứng, mơ hình xây dựng có ý nghĩa thống kê, việc tìm điều kiện chiết xuất tối ưu trở nên dễ dàng, có độ xác cao Về kết quả, mơ hình xây dựng mục 3.4.2 có giá trị thực nghiệm hàm lượng Dihydromyricetin 279,3 ± 4,1 (mg/g) Hệ số R2 0,9524 cho thấy khoảng 95% lượng dihydromyricetin phụ thuộc vào mơ hình, khoảng 5% khơng giải thích mơ hình Điều q trình tiến hành thí nghiệm, số thao tác, thiết bị gây sai số nhiệt độ q trình chiết xuất mẫu chênh lệch nhiều yếu tố từ môi trường thiết bị đun, nhóm nghiên cứu cố gắng cố định điều kiện 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành mục tiêu đề với kết cụ thể sau: Đã phân lập tinh chế 5,54 g dihydromyricetin từ khoảng 100 g dược liệu Chè dây với hiệu suất 5,53% độ tinh khiết 98,98%, đủ điều kiện làm chất chuẩn Đã tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dihydromyricetin từ Chè dây phương pháp thay đổi số yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Từ lựa chọn kiều kiện chiết xuất tối ưu sau: - o Nhiệt độ chiết xuất: 79 C Thời gian chiết xuất: 136 phút - Nồng độ EtOH (tt/tt): 66% Khi chiết xuất điều kiện tối ưu, hàm lượng Dihydromyricetin thu dịch chiết 279,3 ± 4,1 mg/g 4.2 Đề xuất - - Nghiên cứu hoàn thiện nâng cấp quy trình quy mơ pilot quy mơ cơng nghiệp - Tiếp tục quy trình phân lập, tinh chế myricetin từ Chè dây đạt tiêu chuẩn làm chất chuẩn tối ưu hóa điều kiện chiết xuất myricetin từ Chè dây 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Ngọc Ánh, Đào Thị Thu Thủy, Hồng Văn Hà (2019), "Hoạt tính chống oxi hóa đẳng sâm (Codonopsis pilosula franch.) so sánh với số dược thảo khác axit ascobic", Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học Tập 24, Số 1: 16-20 Bộ môn Dược liệu (2010), Dược liệu học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp 489-490 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất y học, Hà Nội Nguyễn Thượng Dong (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Khoa học Kỹ thuật Phạm Thuỳ Dương (2004), Góp phần nghiên cứu tanin chè dây, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Hương Giang (2005), Nghiên cứu định tính định lượng đồng thời myricetin dihydromyricetin Chè dây chế phẩm AMPELOP phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Viết Toan, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2022), “Xác định hàm lượng Dihydromyricetin cao chiết Bạch liễm thu phương pháp chiết xuất vi sóng ứng dụng bào chế trà hòa tan hỗ trợ điều trị chứng đau dày”, Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Số 11: 66-71 Phạm Thị Kim Thảo, Nguyễn Thị Xuân Thu, Đặng Đức Long (2017), "Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn cao chiết cồn chè dây (Ampelopsis cantoniensis) khu vực miền trung Việt Nam", Tạp chí khoa học cơng nghệ đại học Đà Nẵng, số 1(110): 136-140 Vũ Hương Thủy (2008), Nghiên cứu phân lập, tinh chế Myricetin dihydromyricetin từ chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.) làm chất chuẩn, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội 10 Ngơ Thái Bích Vân, Đào Thị Thu Thảo, Hồng Thanh Trung, Triệu Tuấn Anh, Võ Dương Nguyên Sa, Kim Văn Hùng, Phạm Trần Vĩnh Phú (2022), "Hoạt tính kháng khuẩn in vitro cao chiết từ chè dây (Ampelopsis cantoniensis) thu hái Đà Nẵng vi khuẩn staphyloccus aureus phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng da", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 227(10), 235-242 11 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 12 Phùng Thị Vinh, Nghiên cứu thực vật, thành phần hoá học tác dụng sinh học chè dây, Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, (1995) Tiếng Anh 13 A.N Panche, A.D Diwan, S.R Chandra (2016), "Flavonoids: an overview", J Nutr Sci., 5, e47 14 B Wu, J Lin, J Luo, et al (2017), “Dihydromyricetin protects against diabetic cardiomyopathy in streptozotocin-induced diabetic mice”, BioMed Res Int 2017, 3764370 15 Chen Zuanguang, Wang Meixing, Cai Peixiang, and Chen Xiaojun (1997), “Determination of Ampelopsin and Myricetin in Ampelopsis cantoniensis”, Journal of Chinese Medicinal Materials, Vol 20, No 1, pp 23-25 16 Do Thi Ha, Phuong Thien Thuong, and Nguyen Duy Thuan (2017), “Protective action of Ampelopsis cantoniensis and its major constituent - Myricetin against LDL oxidation”, Journal of Chemistry, Vol 45, No 6, pp 768–771 17 Do Thi Thanh Trung, Pham Thi Vui, Nguyen Huyen Trang, Pham Vinh Hoa, Nguyen Thi Thanh Thi, Pham Thi Luong Hang, and Pham Bao Yen (2017), “Evaluation of inhibitory effects of Vietnamese medicinal plant extracts on Helicobacter pylori”, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, Vol 60, No 7, pp 23-27 18 F.J Ji, X.F Tian, X.W Liu, et al (2015), “Dihydromyricetin induces cell apoptosis via a p53-related pathway in AGS human gastric cancer cells”, Genet Mol Res 14, 15564e15571 19 H Zhu, P.H Luo, Y.Y Fu, et al (2015), “Dihydromyricetin prevents cardiotoxicity and enhances anticancer activity induced by adriamycin”, Oncotarget 6, 3254e3267 20 Int AOAC International Methods Committee J AOAC (2011), "Standard method performance requirements-AOAC International methods committee guidelines for validation of biological threat agent methods and/or procedures", 94, pp 1359-1381 21 Jingjing FAN, Hui He, Haoxiang Yu, Jianping Yu, Jiansheng YU (2021), Method for simultaneously separating dihydromyricetin and myricetin from Snake grapes, Australian patent No AU 2021100536 A4 22 Khan Muhammad Kamran, Abert-Vian Maryline, et al (2010), "Ultrasoundassisted extraction of polyphenols (flavanone glycosides) from orange (Citrus sinensis L.) peel", Food chemistry, 119(2), pp 851-858 23 L Le, B.P Jiang, W.T Wan, et al (2016), “Metabolomics reveals the protective of dihydromyricetin on glucose homeostasis by enhancing insulin sensitivity”, Sci Rep 6, 36184 24 Li Qiuping (2016), Ampelopsis cantoniensis-containing drug for preventing and treating hepatitis, China patent 25 Liu D, Mao Y, Ding L, Zeng XA (2019), “Dihydromyricetin: A review on identification and quantification methods, biological activities, chemical stability, metabolism and approaches to enhance its bioavailability”, Trends Food Sci Technol.,91:586-597 26 Myers Raymond H, Montgomery Douglas C, et al (2016), Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments, John Wiley & Sons, pp 27 Nam Vu, Hop Van Tran (2008), "Histopathology of gastric mucous membrane in patients with duodenal ulcer before and after treatment with Che day (Ampelopsis Cantoniensis Planch)", Journal of Medical Research, 62-66 28 Nam Vu, Trach Khanh Nguyen (2008), "Evaluation on the therapeutic effects of Che day in the treatment for gastro-duodenal ulcer in clinical, endoscopy and pathological anatomy", Journal of Medical Research, 54-59 29 Nguyen MD, Tran QC, Do MT, Pham DT, Le HH, Nguyen DB, et al (2022), “Anti-Ulcer Activity of Spray-dried Powders Prepared from Aerial Parts Extracts of Ampelopsis cantoniensis”, Pharmacogn J., 14(2): 276-281 30 Q Li, J Wang, X Zhu, et al (2017), “Dihydromyricetin prevents monocrotalineinduced pulmonary arterial hypertension in rats”, Biomed Pharmacother 96, 825e833 31 Richard F Gunst (1996), “Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments”, Technometrics, 38:3, 284-286 32 S Liu, Q Ai, K Feng, et al (2016), “The cardioprotective effect of dihydromyricetin prevents ischemia-reperfusion-induced apoptosis in vivo and in vitro via the PI3K/Akt and HIF-1a signaling pathways”, Apoptosis 21, 1366e1385 33 S.J Kao, W.J Lee, J.H Chang, et al (2017), “Suppression of reactive oxygen species- mediated ERK and JNK activation sensitizes dihydromyricetin-induced mitochondrial apoptosis in human non-small cell lung cancer”, Environ Toxicol 32, 1426e1438 34 Sun, Y -X., Liu, J C.,& Kennedy, J F (2010), “Extraction optimization of antioxidant polysaccharides from the fruiting bodies of Chroogomphis rutilus(Schaeff.: Fr.) O.K Miller by Box-Behnken statistical design”, Carbohydrate Polymers, 82(1), 209-214 35 T W Tan, H Y Tsai, Y F Chen, and J G Chung (2004), “Induction of apoptosis in human promyelocytic leukemia HL-60 cells by Ampelopsis cantoniensis crude extract,” In vivo, vol 18, no 4, pp 457-462 36 Wei Jianguo, Yang Dasong, Chen Weiyun, Wang Ximin, Wang Yunyue, Yang Yongping, Liu Kechun and Li Xiaoli (2014), "Chemical constituents from Ampelopsis cantoniensis and their anti-angiogenic activities", Chinese Traditional and Herbal Drugs 45 (7): 900-905 37 X Hou, J.F Zhang, H Ahmad, et al (2014), “Evaluation of antioxidant activities of ampelopsin and its protective effect in lipopolysaccharide-induced oxidative stress piglets”, PloS One 9, e108314 38 Y.Q Xu, S.P Wang, H.F Chan, et al (2017), “Dihydromyricetin induces apoptosis and reverses drug resistance in ovarian cancer cells by p53-mediated down- regulation of surviving”, Sci Rep 7, 46060 39 Yap Ling Sze, Lee Wai Leng, et al (2021), "Optimization of L-asparaginase production from endophytic Fusarium proliferatum using OFAT and RSM and its cytotoxic evaluation", 191, pp 106358 40 Yen Hoang Thi, Linh Trinh Thi Thuy, et al (2015), "Optimization of extraction of phenolic compounds that have high antioxidant activity from Rhodomyrtus tomentosa (ait.) Hassk.(sim) in chi linh, Hai Duong", Academia Journal of Biology, 37(4), pp 509-519 41 Z.Q Zhao, J.Q Yin, M.S Wu, et al (2014), “Dihydromyricetin activates AMPactivated protein kinase and P38(MAPK) exerting antitumor potential in osteosar- coma”, Canc Prev Res 7, 927e938 42 Zhang, P., Cai, S., Song, L., Zhang, L., Fan, H., Zhou, L., Lin, R., Yang, G., Bian, X., Wang, W., Zhang, J (2015), “Solubility of dihydromyricetin in ethanol and water mixtures from 288.15 to 323.15 K”, J Mol Liq., 211, 197–202 PHỤ LỤC - Phụ lục 1: Phiếu giám định tên dược liệu Phụ lục 2: Hình ảnh mẫu Chè dây Phụ lục 3: Dihydromyricetin thu sau tinh chế Phụ lục 4: Phổ UV-VIS sắc ký đồ DHM sau tinh chế Phụ lục 1: Phiếu giám định tên dược liệu Phụ lục 2: Hình ảnh mẫu Chè dây Phụ lục 3: Dihydromyricetin thu sau tinh chế Phụ lục 4: Phổ UV-VIS sắc ký đồ DHM sau tinh chế