Nghiên cứu tối ưu chiết xuất irisflorentin từ dược liệu xạ can khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỦY TIÊN NGHIÊN CỨU TỐI ƯU CHIẾT XUẤT IRISFLORENTIN TỪ DƯỢC LIỆU XẠ CAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỦY TIÊN 1801691 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU CHIẾT XUẤT IRISFLORENTIN TỪ DƯỢC LIỆU XẠ CAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hồn thành Bộ mơn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội Để hoàn thành khóa luận này, lời em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Tuấn Anh, người ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, niềm đam mê nghiên cứu tạo điều kiện tốt giúp em hồn thành khóa luận Những kiến thức thầy truyền đạt có ý nghĩa lớn em suốt trình học tập, nghiên cứu làm việc trường công việc sau Em xin bày tỏ lịng kính trọng sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Chi, thầy Lê Trọng Hoàng trực tiếp tận tình giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn gặp phải suốt trình nghiên cứu để em hoàn thành đề tài giao cách tốt Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập nghiên cứu Xin ghi nhận công sức đóng góp q báu, nhiệt tình bạn sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học môn Dược liệu, đặc biệt bạn Phạm Thị Thu Trà, em Phùng Thị Lý, bạn Bùi Thị Hồng Hạnh – người đồng hành, hỗ trợ em nhiều q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn to lớn đến gia đình, người thân bạn bè yêu thương, bên chỗ dựa tinh thần vững để em hồn thành khóa luận Mặc dù em cố gắng để khóa luận hồn thiện khơng tránh khỏi có sai sót q trình thực Kính mong thầy bảo, góp ý để khóa luận em hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thủy Tiên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Xạ can .2 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố .2 1.1.4 Thành phần hóa học .3 1.1.5 Tác dụng sinh học loài Belamcanda chinensis 10 1.2 Chiết xuất Xạ can 12 1.2.1 Phương pháp chiết xuất .13 1.2.2 Dung môi chiết xuất 14 1.3 Phương pháp định lượng 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nghiên cứu .16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp định lượng .16 2.2.2 Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 20 2.2.3 Thí nghiệm chiết xuất tối ưu .22 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can .28 3.1.1 Khoảng tuyến tính .28 3.1.2 Tính đặc hiệu 28 3.1.3 Tính thích hợp hệ thống 29 3.1.4 Độ lặp lại .30 3.1.5 Độ .31 3.1.6 Giới hạn phát giới hạn định lượng 32 3.2 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến quy trình chiết xuất irisflorentin từ thân rễ Xạ can 32 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol 32 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất 33 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi: dược liệu 34 3.3 Tối ưu hóa q trình chiết xuất irisflorentin từ Xạ can 35 3.4 Bàn luận 41 3.4.1 Về xây dựng thẩm định phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can 41 3.4.2 Xu hướng ảnh hưởng yếu tố thời gian chiết, tỉ lệ dung môi: dược liệu nồng độ ethanol đến hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao 41 3.4.3 Chọn phương án chiết xuất tối ưu 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 KẾT LUẬN 45 ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Nội dung đầy đủ Tên viết tắt AP - Protein hoạt hóa (Activator protein -1) BBD Thiết kế Box – Behnken (Box – Behnken design) COX - DPPH Enzyme cyclooxygenase 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ERR Tổng bình phương sai số thí nghiệm tâm (The pure error sum of squares) EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) LOF Tổng bình phương khơng tương thích (Lack of fit) LPS lipopolysaccharides PGE2 Prostaglandin E2 REGR Tổng bình phương hồi quy (The regression sum of squares) RESID Tổng bình phương phần dư (The residual sum of squares) RSD Độ lệch chuẩn tương tối (Relative standard deviation) RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology) SOD Enzyme superoxide dismutase TPA 12 -O- tetradecanoylphanol 13- acetate DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Các isoflavon phân lập Xạ can………………………………….5 Bảng 1.2 Các flavon phân lập Xạ can………………………………….8 Bảng 1.3 Các flavonol phân lập Xạ can…………………………………9 Bảng 1.4 Bảng tổng hợp phương pháp chiết xuất Xạ Can…………………………13 Bảng 1.5 Bảng tổng hợp dung môi chiết xuất Xạ can …………………………….14 Bảng 2.1 Các mức khoảng biến thiên biến đầu vào……………………………23 Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình BBD…………………………………….24 Bảng 2.3 Bảng phân tích phương sai…………………………………………………26 Bảng 3.1 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống……………………………………30 Bảng 3.2 Độ lặp lại phương pháp chiết………………………………………… 30 Bảng 3.3 Độ lặp lại phương pháp định lượng……………………………………31 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ phương pháp………………………………32 Bảng 3.5 Giới hạn phát giới hạn định lượng…………………………………32 Bảng 3.6 Các mức thí nghiệm sử dụng mơ hình RSM………………………… 35 Bảng 3.7 Kết hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm…………………………… 36 Bảng 3.8 Kết phân tích phương sai yếu tố mơ hình hàm lượng irisflorentin …………………….…………………………………………………………………37 Bảng 3.9 Kết phân tích tối ưu yếu tố mơ hình hàm lượng irisflorentin……37 Bảng 3.10 Kết phân tích phương sai yếu tố mơ hình hàm lượng cao…….38 Bảng 3.11 Kết phân tích tối ưu yếu tố mơ hình hàm lượng cao………….39 Bảng 3.12 Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm………………39 Bảng 3.13 Kết chiết xuất cao Xạ can theo thực nghiệm…………………………44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức chung isoflavon Xạ can……………………………5 Hình 1.2 Cấu trúc 2,3-dihydroirigenin…………………………………………….8 Hình 1.3 Công thức chung flavon Xạ can………………………………8 Hình 1.4 Cơng thức chung flavonol Xạ can…………………………….9 Hình 2.1 Mơ hình q trình lựa chọn sàng lọc biến……………………………….22 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic nồng độ irisflorentin… 28 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung mơi (a), mẫu chuẩn (b) mẫu thử (c) bước sóng 266nm…………………………………………………………………………………28 Hình 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng irisflorentin cao hàm lượng cao thu được……………………………………………………… 33 Hình 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng irisflorentin cao hàm lượng cao thu được…………………………………………………34 Hình 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi: dược liệu đến hàm lượng irisflorentin cao hàm lượng cao thu được……………………………………34 Hình 3.6 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hưởng hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao…………………………………………………………………………41 ĐẶT VẤN ĐỀ Xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) người dân sử dụng vị thuốc quý từ lâu trước với nhiều công dụng khác Xạ can chữa bệnh viêm họng, viêm amidan có mủ, ho nhiều đờm, khản tiếng, dùng chữa sốt, đại tiểu tiện không thông, sưng tắc tia sữa, đau kinh làm thuốc lọc máu [1] Các tác dụng dược lý bật Xạ can chống viêm [25], [50], chống ung thư [33], [43], kháng khuẩn, kháng nấm [36], bảo vệ gan chống oxy hóa [46] tác dụng bệnh tiểu đường [22] chứng minh qua nhiều nghiên cứu Tác dụng chống viêm, chống oxy hóa ức chế tế bào ung thư mức độ phân tử chủ yếu có mặt thành phần isoflavon, irisflorentin cho thành phần với nhiều hoạt tính sinh học bao gồm chống viêm chống ung thư [51] Do đó, việc nghiên cứu để chiết xuất hàm lượng cao irisflorentin nói riêng hợp chất isoflavon cần thiết để khai thác tối đa tiềm trị liệu dược liệu Xạ can Đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu bào chế viên nang đánh giá tác dụng theo hướng điều trị hen phế quản từ Xấu hổ (Mimosa pudica L.) Xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)”, dược liệu Xấu hổ Xạ can có đóng góp quan trọng liên quan đến ức chế giai đoạn viêm hiệu điều trị hen phế quản chế phẩm Với mục đích tạo sản phẩm có hiệu cao ổn định chất lượng, việc tiêu chuẩn dạng cao đơn Xấu hổ, Xạ can giai đoạn quan trọng nghiên cứu phát triển sản phẩm Nguyên liệu dược liệu đạt tiêu chuẩn nghiên cứu chiết xuất tạo dạng cao tối ưu hoạt chất sau tiêu chuẩn cao nâng cấp chuẩn hóa Với lý trên, đề tài “Nghiên cứu tối ưu chiết xuất irisflorentin từ dược liệu Xạ can” thực ban đầu quy mơ phịng thí nghiệm sau nâng cấp triển khai quy mô lớn sở để tiêu chuẩn hóa cao Xạ can công thức chế phẩm Để thực cụ thể hóa, đề tài hướng đến mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can Chiết xuất tối ưu dược liệu Xạ can theo hàm lượng irisflorentin CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Xạ can 1.1.1 Vị trí phân loại Xạ can cịn có tên khác Rẻ quạt, Lưỡi đồng Về mặt danh pháp, tên khoa học thức sử dụng Xạ can Iris domestica (L.) Goldblatt & Mabb., Belamcanda chinensis (L.) DC xem tên đồng nghĩa Tuy nhiên thống với tài liệu chuyên mơn dược điển, khóa luận sử dụng tên khoa học Xạ can Belamcanda chinensis (L.) DC Theo Hệ thống phân loại Takhtajan [42], Belamcanda chinensis (L.) DC có vị trí phân loại sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Hành (Liliopsida) Phân lớp: Hành (Liliidae) Bộ: La Dơn (Iridales) Họ: La Dơn (Iridaceae) Chi: Belamcanda 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,50-1m Thân rễ mọc bò, phân nhánh nhiều Thân ngắn bao bọc bẹ Lá hình dải, dài 30cm, rộng 2cm, gốc ốp lên nhau, đầu nhọn, gân song song, hai mặt nhẵn, gần màu; toàn xếp thành mặt phẳng xòe quạt Cụm hoa phân nhánh, dài 30-40 cm; bắc dạng vảy; hoa có cuống dài, xếp nhánh tán đơn, màu vàng cam điểm đốm tía; đài có nhỏ hình mũi mắc; tràng có cánh rộng dài gơn đài; nhị 3, đính gốc cánh hoa; bầu Quả nang, hình trứng; hạt nhiều, màu đen bóng Mùa hoa quả: tháng – 10 [1] 1.1.3 Phân bố Được trồng Ấn Độ, Triều Tiên, phía nam Nhật Bản, Đơng Nam Trung Quốc, Indonesia, Philippin, Thái Lan Ấn Độ Trung Quốc nước trồng nhiều Xạ can giới [1] Bảng 3.11 Kết phân tích tối ưu yếu tố mơ hình hàm lượng cao Yếu tố Hệ số Giá trị Prob > F Mô hình 19,6804 6,343.10-12 (*) X1 0,2287 0,0019 (*) X2 0,2201 0,0023 (*) X3 1,3662 3,359.10-7 (*) X1X2 0,0864 0,1738 X3X1 0,0295 0,6118 X2X3 -0,0471 0,4266 X12 -0,9479 1,402.10-5 (*) X22 -0,0402 0,5103 X32 -0,4207 0,0007 (*) (*) p 0,05) Đồng thời mức ý nghĩa cho mức độ khơng tương thích p = 0,089 > 0,05, chứng tỏ mơ hình hồn tồn tương thích với thực nghiệm Bảng 3.12 Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm Giá trị Hệ số Y1 Y2 Hệ số xác định R2 0,9832 0,997 Hệ số hồi quy hiệu chỉnh R2hiệu chỉnh 0,9529 0,9915 F - statistic 32,5 182,9 Độ lệch chuẩn 0,0006539 9,323.10-6 39 Từ bảng 3.12 thấy, hệ số hồi quy R2 mơ hình biểu diễn phụ thuộc hàm lượng irisflorentin với điều kiện chiết xuất 0,9832 Điều thể có 98,32% kết hàm lượng irisflorentin giải thích biến đổi yếu tố thời gian chiết, tỉ lệ dung môi: dược liệu, nồng độ ethanol; lại 1,68% biến đổi nguyên nhân khác gây Tương tự, với mơ hình hàm lượng cao (Y2) R2 0,997 Giá trị R2 gần 1,0000, phương trình hồi quy mơ tả kết thực nghiệm Trong mơ hình hồi quy, R2 lớn 0,9000 thể mơ hình tương thích với thực nghiệm, có nghĩa có tương quan chặt chẽ yếu tố nghiên cứu kết đầu ra, hay kết thu từ mô hình có độ tin cậy cao [17] Hệ số hồi quy hiệu chỉnh R2hiệu chỉnh mơ hình hàm lượng irisflorentin tính 0,9529, R2hiệu chỉnh mơ hình hàm lượng cao 0,9915 R2hiệu chỉnh mơ hình lớn 0,8000 cho thấy R2hiệu chỉnh giá trị cao chứng tỏ mơ hình hồi quy có liên quan chặt chẽ với liệu đầu vào F – statistic hay gọi tỉ lệ F, dùng để kiểm định phù hợp mơ hình với giả thuyết H0 “trung bình mẫu khác khơng đáng kể” bị phủ nhận Mức ý nghĩa tỉ lệ F < 0,05, giả thuyết H0 bị bác bỏ ngược lại Ở đây, mức ý nghĩa F – statistic mơ hình 0,00065 9,323.10-6, hai giá trị nhỏ 0,05 cho thấy biến thiên trung bình mẫu nhỏ, chứng tỏ mơ hình hồi quy phù hợp với liệu thu thập Đưa hệ số có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) vào phương trình hồi quy mơ tả mối quan hệ biến mã hóa lên hàm kỳ vọng Y ta phương trình sau: Y1 = 0,567 + 0,025.X1 + 0,005.X2 – 0,013.X3 Y2 = 19,68 + 0,229.X1 + 0,22.X2 + 1,366.X3 – 0,948.X12 – 0,421.X32 Đưa biến mã hóa X1, X2, X3 biến thực nghiệm nồng độ ethanol (%) thời gian chiết (giờ), tỉ lệ dung mơi: dược liệu (ml/g), thu phương trình mơ tả mối quan hệ hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao với biến thực nghiệm sau: Y1 = 0,5085 + 0,0013 Nồng độ ethanol + 0,0002 Thời gian – 0,0065 Tỉ lệ Y2 = - 1,0615 + 0,3433 Nồng độ ethanol + 0,0073 Thời gian + 1,946 Tỉ lệ 0,0024 Nồng độ ethanol2 – 0,1053 Tỉ lệ2 40 3.4 Bàn luận 3.4.1 Về xây dựng thẩm định phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can Nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can mà trước chưa có tác giả tiến hành Chương trình sắc ký tham khảo từ Dược điển Châu Âu [11] có điều chỉnh chương trình dung mơi để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Phương pháp định lượng mà nhóm nghiên cứu xây dựng thẩm định theo tiêu chí AOAC đáp ứng tiêu chí tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính đường chuẩn, độ thu hồi độ lặp lại Bên cạnh đó, phương pháp xây dựng có giới hạn phát tương đối thấp so với nghiên cứu trước (LOD = 0,05 µg/ml, LOQ = 0,165 µg/ml), đảm bảo phù hợp để định lượng irisflorentin cho mẫu cao chiết xuất điều kiện khác Với kết này, phương pháp định lượng xây dựng có tính ổn định để áp dụng rộng rãi vào việc định lượng irisflorentin mẫu cao Xạ can 3.4.2 Xu hướng ảnh hưởng yếu tố thời gian chiết, tỉ lệ dung môi: dược liệu nồng độ ethanol đến hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao Tác động biến tương tác lẫn biến ảnh hưởng đến hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao mô tả điểm đáp ứng bề mặt 3D điểm viền 2D Hai trục X Y biểu thị yếu tố ảnh hưởng, trục Z biểu thị hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao Các đường cong bề mặt phản ứng chiều cặp yếu tố lên hàm mục tiêu minh họa cách giữ yếu tố cịn lại mức Dựa vào mơ hình đáp ứng xác định giá trị tối ưu yếu tố ảnh hưởng làm cho hàm đáp ứng đạt giá trị cực đại 41 Hình 3.6 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hưởng hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao M1, M2, M3 đồ thị biểu diễn tương quan hàm lượng irisflorentin với nồng độ- thời gian chiết, nồng độ- tỷ lệ dung môi, thời gian chiết- tỷ lệ dung mơi Hình M1 cho thấy xu hướng ảnh hưởng nồng độ thời gian chiết tỷ lệ dung môi: dược liệu 6:1 Có thể thấy nồng độ ethanol thời gian chiết ảnh hưởng đến hàm lượng irisflorentin nồng độ ethanol có ảnh hưởng lớn Hàm lượng irisflorentin tăng cao đạt đỉnh nồng độ ethanol 90% Điều phù hợp với giải thích mối liên quan khả chiết flavonoid độ phân cực thay đổi tỷ lệ cồn-nước giải thích Hình M2 cho thấy xu hướng ảnh hưởng nồng độ ethanol tỷ lệ dung môi: dược liệu thời gian chiết 60 phút Quan sát đồ thị thấy hàm lượng irisflorentin tỷ lệ nghịch với tỷ lệ dung môi: dược liệu Hàm lượng irisflorentin cao tỷ lệ 42 dung môi: dược liệu thấp (4:1) thể việc tăng tỷ lệ dung môi: dược liệu làm tăng tạp chất dịch chiết dẫn đến làm giảm hàm lượng irisflorentin Hình M3 cho thấy xu hướng ảnh hưởng thời gian chiết tỷ lệ dung môi: dược liệu nồng độ ethanol 70% Hình biểu diễn mặt cong cho thấy thời gian chiết tối ưu đạt khoảng 60-70 phút, sau tiếp tục tăng thời gian chiết hàm lượng irisflorentin giảm xuống Điều chứng tỏ tiếp tục tăng thời gian chiết lượng irisflorentin tăng lên khơng đáng kể thay vào tạp chất tăng lên N1, N2, N3 đồ thị biểu diễn tương quan hàm lượng cao với nồng độ- thời gian chiết, nồng độ- tỷ lệ dung mơi, thời gian chiết- tỷ lệ dung mơi Hình N1 cho thấy xu hướng ảnh hưởng nồng độ thời gian chiết tỷ lệ dung môi: dược liệu 6:1 Nhìn vào mặt cong đồ thị dễ dàng nhận thấy nồng độ ethanol yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm lượng cao Hàm lượng cao tăng cao rõ rệt đạt đỉnh nồng độ ethanol 70% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Jun Li cộng [27] thử nghiệm dung môi chiết methanol ethanol dung mơi tốt tìm thấy ethanol 70% Hình N2 cho thấy xu hướng ảnh hưởng nồng độ ethanol tỷ lệ dung môi: dược liệu thời gian chiết 60 phút Quan sát đồ thị thấy hàm lượng cao tỷ lệ thuận với tỷ lệ dung môi: dược liệu Điều dễ dàng giải thích tăng lượng dung mơi hiệu suất chiết tăng làm tăng lượng chất hịa tan Hình N3 cho thấy xu hướng ảnh hưởng thời gian chiết tỷ lệ dung môi: dược liệu nồng độ ethanol 70% Đồ thị biểu diễn thể biến thiên chiều hàm lượng cao theo thời gian chiết Thời gian chiết lâu lượng chất chiết nhiều 3.4.3 Chọn phương án chiết xuất tối ưu Kết phân tích RSM phần mềm Modde 5.0 đưa số giải pháp thỏa mãn yêu cầu đồng thời tối ưu hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao với yếu tố thí nghiệm nằm phạm vi khảo sát Xét khía cạnh kinh tế, áp dụng quy mô lớn, mục tiêu quan trọng tiết kiệm dung môi nhằm nâng cao hiệu khai thác giảm tiêu hao lượng dùng để thu hồi Đối chiếu với giải pháp trên, giải pháp tối ưu đưa phần mềm Modde 5.0 với kết sau: - Nồng độ ethanol: 84,15 % - Thời gian chiết: 78,75 phút - Tỉ lệ dung môi: dược liệu: 6,79 :1 43  Kiểm tra kết mơ hình thực nghiệm Lặp lại thí nghiệm lần điểm tối ưu, kết thu được: Bảng 3.13 Kết chiết xuất cao Xạ can theo thực nghiệm Thực nghiệm Thơng số Trung RSD bình (%) Dự đốn Lần Lần Lần 0,5738 0,5711 0,5804 0,5751 0,83 0,5762 20,3362 20,3960 20,0164 20,2495 1,01 20,0003 Hàm lượng irisflorentin (%) Hàm lượng cao (%) Hàm lượng irisflorentin trung bình chiết điểm tối ưu đạt 0,575%, giá trị RSD lần chiết 0,83%, đó, hàm lượng cao trung bình chiết điểm tối ưu đạt 20,250% giá trị RSD lần chiết 1,01% cho thấy độ tập trung kết thu Đây nghiên cứu chiết xuất tối ưu irisflorentin từ cao đặc Xạ can, ưu điểm nghiên cứu tối ưu hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao Xạ can toàn phần thu So với nghiên cứu sử dụng dung môi nước hay dung môi hữu ethyl acetat, ether dầu hỏa, dung mơi ethanol mà nhóm nghiên cứu sử dụng đem lại hiệu chiết xuất tốt đồng thời dung môi xanh, an tồn hồn tồn ứng dụng quy mô công nghiệp Với điều kiện chiết xuất tối ưu nồng độ ethanol 84,15%, thời gian chiết 78,75 phút, tỷ lệ dung môi : dược liệu 6,79 : 1, thông số mức tương đối cao Chúng ta cần cần nhắc đến yếu tố kinh tế chiết xuất tối ưu Chi phí cho lượng dung mơi sử dụng, thời gian xử lý dịch chiết, nhân cơng vận hành máy móc cần tính đến ứng dụng quy mơ cơng nghiệp Vì vậy, để cân chi phí lợi ích, lựa chọn điều kiện chiết với nồng độ, thời gian chiết tỷ lệ dung môi : dược liệu không cao mà hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao giảm không đáng kể so với điều kiện chiết tối ưu để đưa vào sản xuất 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu chiết xuất tối ưu irisflorentin từ dược liệu Xạ can”, nhóm nghiên cứu thu kết sau: Về phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can a Xây dựng phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can phương pháp HPLC với điều kiện sau: - Pha tĩnh: Cột InertSustain C18 (5 µm, 4,6 x 250 mm) Tốc độ dòng: ml/phút - Nhiệt độ lị cột: 30ºC Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Bước sóng phát hiện: 266 nm - Pha động: acetonitril - acid phosphoric 0,05% b Đã thẩm định phương pháp theo tiêu chí AOAC về: - Tính đặc hiệu Tính thích hợp hệ thống (RSD nhỏ 2%) Độ lặp lại (các giá trị RSD nhỏ 2%) Độ (tỷ lệ thu hồi nằm khoảng 95 - 105%) - Đường chuẩn khoảng tuyến tính (R2 lớn 0,99) Giới hạn phát 0,05 µg/ml giới hạn định lượng 0,165 µg/ml Về nghiên cứu chiết xuất tối ưu Đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao: phương pháp chiết, dung mơi chiết, kích thước tiểu phân, số lần chiết, nhiệt độ chiết, nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi: dược liệu, thời gian chiết Lựa chọn yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng irisflorentin hàm lượng cao nồng độ ethanol, thời gian chiết, tỉ lệ dung mơi: dược liệu để đưa vào thí nghiệm tối ưu Phương trình biểu diễn phụ thuộc biến chọn hàm lượng irisflorentin, hàm lượng cao: Y1 = 0,5085 + 0,0013 Nồng độ ethanol + 0,0002 Thời gian – 0,0065 Tỉ lệ Y2 = - 1,0615 + 0,3433 Nồng độ ethanol + 0,0073 Thời gian + 1,946 Tỉ lệ - 0,0024 Nồng độ ethanol2 – 0,1053 Tỉ lệ2 Với phương pháp chiết hồi lưu nhiệt độ 80°C, dược liệu dạng bột thô, chiết xuất lần điều kiện: nồng độ ethanol: 84,15 %; thời gian chiết: 78,75 phút; tỉ lệ dung môi: 45 dược liệu: 6,79 :1 thu kết tối ưu hàm lượng irisflorentin 0,575 ± 0,005% hàm lượng cao 20,250 ± 0,2% ĐỀ XUẤT Đối với phương pháp định lượng irisflorentin cao Xạ can Áp dụng cho sản phẩm cao nghiên cứu nghiên cứu Có thể phát triển thành phương pháp áp dụng cho phịng thí nghiệm khác Đối với kết chiết xuất tối ưu Đây giai đoạn đầu, thông số nghiên cứu thực qui mơ phịng thí nghiệm Nhóm nghiên cứu điều chỉnh lên quy mơ pilot áp dụng sản xuất tiêu chuẩn hóa dạng cao nghiên cứu phát triển sản phẩm giai đoạn 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2017), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1095-1098 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 982 Nguyễn Văn Hân Đỗ Hữu Nghị (2017), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Y học, Hà Nội Hội Đồng Dược điển Việt Nam (2018), Dược điển Việt Nam V, Bộ Y tế, Hà Nội Đỗ Thị Thanh Huyền cộng (2013), "Các hợp chất flavonoid glycosid từ thân rễ Xạ Can", Tạp chí dược liệu, tr 243-248 Tiếng Anh Abe Fumiko, Chen Rong-Fu, et al (1991), "Iridals from Belamcanda chinensis and Iris japonica", Phytochemistry, 30(10), pp 3379-3382 AOAC (2019), Appendix F: guidelines for standard method performance requirements, AOAC Official Method of Analysis Bae E A., Han M J., et al (2001), "In vitro anti-Helicobacter pylori activity of irisolidone isolated from the flowers and rhizomes of Pueraria thunbergiana", Planta Med, 67(2), pp 161-3 10 11 12 13 14 15 Chen Y., Wu C M., et al (2011), "Combination of HPLC chromatogram and hypoglycemic effect identifies isoflavones as the principal active fraction of Belamcanda chinensis leaf extract in diabetes treatment", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 879(5-6), pp 371-8 Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Chinese pharmacopoeia, China Medical Science Press, Beijing Council of Europe (2019), European Pharmacopoeia, European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare of the Council of Europe (EDQM), Strasbourg Fang R., Houghton P J., et al (2008), "Cytotoxic effects of compounds from Iris tectorum on human cancer cell lines", J Ethnopharmacol, 118(2), pp 257-63 Gao Y., Fang L., et al (2014), "Suppressive effects of irisflorentin on LPSinduced inflammatory responses in RAW 264.7 macrophages", Exp Biol Med (Maywood), 239(8), pp 1018-1024 Ha le M., Que T N., et al (2013), "Toxicity, analgesic and anti-inflammatory activities of tectorigenin", Immunopharmacol Immunotoxicol, 35(3), pp 336-40 Ito H., Onoue S., et al (1999), "Iridal-type triterpenoids with ichthyotoxic activity from Belamcanda chinensis", J Nat Prod, 62(1), pp 89-93 16 Ito H., Onoue S., et al (2001), "Isoflavonoids from Belamcanda chinensis", Chem Pharm Bull (Tokyo), 49(9), pp 1229-31 17 Jay Eleanor, Aslani Parisa, et al (2011), "User testing of consumer medicine information in Australia", Health Education Journal, 70(4), pp 420-427 18 Jeong Gil-Saeng, An Ren-Bo, et al (2007), "Cytoprotective activity of Belamcanda chinensis rhizome against glutamate-induced oxidative injury in HT22 cells", Natural Product Sciences, 13(2), pp 101-104 19 Jin L, Jin YS, et al (2007), "Phenolic constituents of Belamcanda chinensis", Chemistry of Natural Compounds, 43, pp 700-701 20 Jin L., Chen H S., et al (2008), "Chemical constituents from Belamcanda chinensis", J Asian Nat Prod Res, 10(1-2), pp 89-94 21 22 Jin Li, Chen Hai Sheng, et al (2007), "New flavone and isoflavone glycoside from Belamcanda chinensis", Chinese Chemical Letters, 18(2), pp 158-160 Jung S H., Lee Y S., et al (2002), "Isoflavonoids from the rhizomes of Belamcanda chinensis and their effects on aldose reductase and sorbitol accumulation in streptozotocin induced diabetic rat tissues", Arch Pharm Res, 25(3), pp 306-12 23 24 25 26 27 28 Jung S H., Lee Y S., et al (2004), "Antioxidant activities of isoflavones from the rhizomes of Belamcanda chinensis on carbon tetrachloride-induced hepatic injury in rats", Arch Pharm Res, 27(2), pp 184-8 Lee Hee Ju, Lee Eun Ha, et al (2011), "Solvent composition effects on efficiency of pressurized liquid extraction of bioactive isoflavonoids from Belamcanda chinensis rhizomes", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 34(2), pp 143-154 Lee J W., Lee C., et al (2015), "Chemical constituents from Belamcanda chinensis and their inhibitory effects on nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells", Arch Pharm Res, 38(6), pp 991-7 Lewis Gareth A, Mathieu Didier, et al (1998), Pharmaceutical experimental design, CRC press Li J., Li W Z., et al (2009), "Quality evaluation of Rhizoma Belamcandae (Belamcanda chinensis (L.) DC.) by using high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector and mass spectrometry", J Chromatogr A, 1216(11), pp 2071-8 Li S., Li S., et al (2016), "Ultrafiltration-LC-MS combined with semipreparative HPLC for the simultaneous screening and isolation of lactate dehydrogenase inhibitors from Belamcanda chinensis", J Sep Sci, 39(23), pp 4533-4543 29 Liu B., Ma Y., et al (2008), "Tectorigenin monohydrate: an isoflavone from Belamcanda chinensis", Acta Crystallogr Sect E Struct Rep Online, 64(Pt 11), 30 pp o2056 Liu M., Yang S., et al (2012), "Chemical constituents of the ethyl acetate extract 31 of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities", Molecules, 17(5), pp 6156-69 Liu Zhengbo, Wang Jianhua, et al (2011), "Separation and purification of three high-purity isoflavonoids from Belamcanda chinensis (L.) DC by supercritical fluid extraction and high-speed counter-current chromatography", Separation Science and Technology, 46(16), pp 2501-2509 32 Ma L., Song Z W., et al (1996), "Determination of five isoflavones in 33 Belamcanda Chinensis by RP-HPLC", Yao Xue Xue Bao, 31(12), pp 945-9 Monthakantirat O., De-Eknamkul W., et al (2005), "Phenolic constituents of the rhizomes of the Thai medicinal plant Belamcanda chinensis with proliferative 34 activity for two breast cancer cell lines", J Nat Prod, 68(3), pp 361-4 Moriyasu Masataka, Igi Yukari, et al (2007), "New isoflavones from Belamcandae Rhizoma", Journal of Natural Medicines, 61, pp 329-333 35 Morrissey C., Bektic J., et al (2004), "Phytoestrogens derived from Belamcanda 36 37 38 39 40 41 42 chinensis have an antiproliferative effect on prostate cancer cells in vitro", J Urol, 172(6 Pt 1), pp 2426-33 Oh K B., Kang H., et al (2001), "Detection of antifungal activity in Belamcanda chinensis by a single-cell bioassay method and isolation of its active compound, tectorigenin", Biosci Biotechnol Biochem, 65(4), pp 939-42 Region Government of the Hong Kong Special Administrative (2010), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Department of Health, Hong Kong, pp Shin K H., Kim Y P., et al (1999), "Inhibition of prostaglandin E2 production by the isoflavones tectorigenin and tectoridin isolated from the rhizomes of Belamcanda chinensis", Planta Med, 65(8), pp 776-7 Song Zhi-Jun, Xu Xue-Min, et al (2011), "A new dimeric iridal triterpenoid from Belamcanda chinensis with significant molluscicide activity", Organic Letters, 13(3), pp 462-465 Song Zhi Jun, Luo Fan, et al (2007), "Two new isoflavonoids from the rhizomes of Belamcanda chinensis", Chinese Chemical Letters, 18(6), pp 694-696 Takahashfi Kunihiko, Hoshino Yoji, et al (2000), "Iridals from Iris tectorum and Belamcanda chinensis", Phytochemistry, 53(8), pp 925-929 Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, Springer Science & Business Media 43 Thelen P., Scharf J G., et al (2005), "Tectorigenin and other phytochemicals extracted from leopard lily Belamcanda chinensis affect new and established 44 targets for therapies in prostate cancer", Carcinogenesis, 26(8), pp 1360-7 Wen Yinghui, He Li, et al (2018), "A novel strategy to evaluate the quality of herbal products based on the chemical profiling, efficacy evaluation and pharmacokinetics", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 161, pp 326-335 45 Won Sick Woo, Eun Hee Woo (1993), "An isoflavone noririsflorentin from Belamcanda chinensis", Phytochemistry, 33(4), pp 939-940 46 Woźniak D., Oszmiański J., et al (2006), "Antimutagenic and antioxidant activity of the extract from Belamcanda chinensis (L.) DC", Acta Pol Pharm, 47 63(3), pp 213-8 Wu C., Li Y., et al (2011), "Hypoglycemic effect of Belamcanda chinensis leaf extract in normal and STZ-induced diabetic rats and its potential active faction", 48 Phytomedicine, 18(4), pp 292-7 Wu J H., Wang Y R., et al (2010), "Anti-proliferative and pro-apoptotic effects of tectorigenin on hepatic stellate cells", World J Gastroenterol, 16(31), pp 3911-8 49 50 51 52 53 54 Wu Y X., Xu L X (1992), "Analysis of isoflavones in Belamcanda chinensis (L.)DC and Iris tectorum Maxim by square wave voltammetry", Yao Xue Xue Bao, 27(1), pp 64-8 Xin Rui-hua, Zheng Ji-fang, et al (2015), "Belamcanda chinensis (l.) Dc: Ethnopharmacology, phytochemistryand pharmacology of an important traditional Chinese medicine", Afr J Tradit Complement Altern Med, 12(6), pp 39-70 Zhang X., Qiao G X., et al (2021), "Characterization of the metabolites of irisflorentin by using ultra-high performance liquid chromatography combined with quadrupole/orbitrap tandem mass spectrometry", J Pharm Biomed Anal, 203, pp 114222 Zhang Y Y., Wang Q., et al (2011), "Characterization and determination of the major constituents in Belamcandae Rhizoma by HPLC-DAD-ESI-MS(n)", J Pharm Biomed Anal, 56(2), pp 304-14 Zhou L X., Lin M (2000), "A new stilbene dimer shegansu B from Belamcanda chinensis", J Asian Nat Prod Res, 2(3), pp 169-75 Zhou Lixin, Lin Mao, et al (1996), "Studies on Chemical Constituents of the Roots of Blackberrylily (Belamcanda chinensis)", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 27, pp 8-10 PHỤ LỤC MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 1.1 SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ TUYẾN TÍNH 1.2 MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ LẶP LẠI 1.3 MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ THU HỒI