Tổng quan về cây Rau ngót (Breynia androgyna (L.) Chakrab & NPBalakr)
Vị trí phân loại
Cây Rau ngót còn có tên gọi khác là bồ ngót, bù ngót, hắc diện thần (Trung Quốc) [4] Theo Hệ thống phân loại của A Takhtajan [9], Breynia androgyna (L.) Chakrab & NPBalakr có vị trí phân loại như sau:
Phân lớp: Dilleniidae Bộ: Euphorbiales Họ: Phyllanthaceae Chi: Breynia Loài: Breynia androgyna (L.) Chakrab & NPBalakr Tên đồng danh: Sauropus androgynus (L.) Merr
Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Cây nhỏ, nhẵn, có thể cao tới 1,5 – 2m Có nhiều cành mọc thẳng Cây trồng thường chỉ cao 0,9 – 1m Vỏ thân cây màu xanh lục, sau màu nâu nhạt Lá mọc so le, dài 4 - 6cm, rộng 15 - 30mm, cuống rất ngắn 1- 2mm có 2 lá kèm nhỏ, phiến lá nguyên hình trứng dài hoặc bầu dục, mép nguyên Hoa đực ở mọi kẽ lá thành xim đơn ở phía dưới, hoa cái ở trên Quả nang hình cầu, hạt có vân nhỏ [4]
Loài rau ngót hiện chưa biết chính xác về nguồn gốc, song, cây mọc hoang dại ở Srilanca; vùng Sikkim, Kabasi và Abor của Ấn Độ Rau ngót được trồng rộng rãi ở một số nước Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á khác [6] Ở Việt Nam, rau ngót là loại cây trồng từ lâu đời, ở tất cả các vùng đồng bằng, trung du và vùng núi thấp để lấy lá làm rau ăn Cây sinh trưởng tốt trên nhiều loại đất, thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, với nhiệt độ trung bình 20 – 24 độ C Rau ngót thuộc loại cây ưa ẩm, ưa sáng và cũng có thể chịu hơi bóng, ra hoa quả hàng năm Tuy nhiên, chỉ có những cây không bị bẻ cành, hái lá thường xuyên mới có
3 khả năng ra hoa quả Đối với những cây mọc hoang dại ở Ấn Độ, hình thức tái sinh tự nhiên chủ yếu là từ hạt [6]
Cây còn có khả năng sinh chồi khỏe từ những thân cành bị cắt [6].
Thành phần hóa học
Theo nghiên cứu, trong dịch chiết Rau ngót có chứa các hợp chất alkaloid, triterpenoid, saponin, tannin, polyphenol, glycoside, flavonoid và nhiều các hợp chất khác [4], [15], [21], [35], [37]…
Bảng 1 1 Một số hợp chất flavonoid được phân lập từ Rau ngót
STT Tên hợp chất Cấu trúc hóa học TLTK
STT Tên hợp chất Cấu trúc hóa học TLTK
Hình 1 1 Công thức hóa học của Glc và Rha
Từ cây Rau ngót người ta đã phân lập được các hợp chất sau [10], [31]:
- 1 lignan diglycosid là (-)-isolariciresinol 3α-O-β-apiofuranosyl-(12)-O-β- glucopyranosid
- 3 lignan glycosid là (+)-isolariciresinol 3α-O-β-glucopyranosi, (-) isolariciresinol 3α-O-β-glucopyranosi và (+)-syringaresinol di-O-β-glucopyranosi
- 2 megastigman glycosid là Sauroposid và Corchoionosid C
- 4 nucleosid là Guanosin, Adenosin, 5′-deoxy-5′-methylsulphinyl-adenosin và Uridin.
Có 2 hợp chất steroid đã được phân lập từ cây Rau ngót là 5-en-3β, 20β-diol- stigmast, 5,24 (28)-dien-3β,20β-diol-stigmasta [10]
Trong 100g phần ăn được của Rau ngót chứa nước 86,4g, protein toàn phần 5,3g, carbohydrat 3,4g, natri 28mg, kali 503mg, canxi 169mg, phốt pho 64.5mg, sắt 2,7mg, vitamin A 1037mcg, β-caroten 6220mcg, vitamin B1 0,07mg, vitamin B2 0,39mg, vitamin PP 2,2mg, vitamin C 185mg, lysin 160mg, methionin 130mg, tryptophan 50mg, phenylalanin 260mg, threonin 340mg, valin 170mg, leucin 240mg, isoleucin 170mg [5]
Lá rau ngót chứa hầu hết các khoáng chất thiết yếu, bao gồm natri, kali, canxi, phốt pho, sắt, magie, đồng, kẽm, mangan và coban [15].
Một số hoạt tính sinh học của các chất có trong rau ngót
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các chất trong rau ngót có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa [17], [20], [21], [27], [38], kháng khuẩn [17], [32], tăng tiết sữa mẹ trong thời kỳ cho con bú [28], [29], chống đái tháo đường (chiết xuất từ lá Rau ngót ở liều uống làm giảm đáng kể mức đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxan gây ra) [24], giảm đau, hạ sốt, chống viêm [13], [25]
6 Ngoài ra, trong một nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết ethanol 96% của cây rau ngót có hoạt tính chống sốt rét mạnh Kết quả cũng xác nhận rằng cây có tác dụng ức chế và phòng ngừa sự phát triển của ký sinh trùng Chiết xuất ethanol cũng được phát hiện là có tác dụng ức chế quá trình giải độc heme [33]
1.1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa được đo lường dựa trên khả năng của chất chiết xuất làm giảm các gốc tự do DPPH Phương pháp DPPH nhanh, đơn giản và tương đối rẻ tiền Theo một nghiên cứu, dịch chiết rau ngót có giá trị IC50 chống lại gốc DPPH trong khoảng 85,71-93,91 ppm [20]
Kết quả của nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ thân cây rau ngót có hoạt tính kháng khuẩn cao Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ 7,81 đến 62,5 mg/l trong đó có tác dụng ức chế sự phát triển của Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Flavobacter sp.,
Pseudomonas aeruginosa và Vibrio cholerae ở mức 7,81 mg/l, Klebsiella sp., Aeromonas hydrophila và Vibrio alginolyticus ở mức 15,6 mg/l và có khả năng kiểm soát sự phát triển của Salmonella sp và Vibrio parahaemolyticus ở mức 62,5 mg/l [17]
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá rau ngót trong methanol, ethanol và nước được thực hiện riêng biệt Dịch chiết methanol cho thấy tác dụng ức chế đối với cả vi khuẩn gram dương (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) và âm
(Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium) nhiều hơn so với etanol và nước Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá rau ngót là do sự hiện diện của nhiều loại vitamin, peptid, glycosid, alkaloid, saponin, terpenoid và flavonoid [32].
Công dụng của Rau ngót trong y học cổ truyền
Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm lưu truyền trong dân gian, lá Rau ngót có mặt trong những bài thuốc:
Chữa sót rau: Lá Rau ngót tươi 40g, rửa sạch, giã nát, thêm nước đun sôi để nguội, gạn lấy 100ml nước chia làm 2 lần, uống cách nhau 10p Sau khoảng 15-30p phần rau còn lại sẽ bị tống ra Cũng có thể dùng lá tươi giã nát đắp vào 2 gan bàn chân [6]
Chữa tưa lưỡi: Lá Rau ngót tươi 5-10g, giã nát vắt lấy nước, thấm vào bông hay vải gạc đánh lên lưỡi, lợi và vòm miệng Chỉ sau 2 lần trẻ bú lại được [6]
Chữa đái dầm: Lá Rau ngót tươi 50g, rửa sạch, vò vào nước đã đun sôi để nguội, mỗi lần uống 1 bát Uống vài lần sẽ có kết quả [6]
Chữa hóc: Giã cây tươi, vắt lấy nước ngậm [4]
7 Ngoài ra, Rau ngót 30g, phối hợp với nõn cây dứa ăn quả 20g, rệp 7 -9 con, giã nát, thêm nước gạn uống, bã đắp chữa rắn độc cắn [6] Ở Ấn Độ, nước sắc rễ rau ngót chữa sốt, tiểu tiện khó, chẹt bàng quang, lá và rễ tương giã nát đắp ngoài chứa chứng viêm loét mũi [6].
Các phương pháp định lượng Flavonoid trong Rau ngót
Trong các nghiên cứu trước đó, flavonoid trong Rau ngót được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis Cách tiến hành như sau:
Việc chiết xuất bột lá Rau ngót khô (150,0 g) được thực hiện bằng phương pháp ngâm lạnh Dung môi được sử dụng là ethanol với các nồng độ khác nhau là 50%, 70% và 96% Mỗi quá trình chiết được thực hiện trong 24 giờ Dịch lọc được tách ra khỏi cặn bằng giấy lọc Phần cặn còn lại được xử lý lại 3 lần Dịch lọc từ mỗi dung môi được thu thập, làm bay hơi bằng máy cô quay ở 50°C và sử dụng nồi cách thủy ở 50°C cho đến khi thu được dịch chiết đặc
Việc xác định Tổng hàm lượng flavonoid toàn phần (TFC) tuân theo quy trình của Chang và cộng sự (2002) với những sửa đổi Chất chuẩn được sử dụng là quercetin Dung dịch Quercetin có khoảng nồng độ 33-129 ppm được sử dụng để tạo đường chuẩn Mối quan hệ giữa nồng độ quercetin (x) và độ hấp thụ của nó (y) tuân theo phương trình đường tuyến tính (y = bx ± a)
Mỗi cao chiết ethanol của lá Rau ngót được pha với nồng độ 7500 ppm trong methanol được hút bằng pipet 0,5 mL Sau đó thêm 1,5 mL methanol và 0,1 mL AlCl3 10% 0,1 mL natri axetat 1M được bổ sung và pha vừa đủ với lượng nước tối đa là 5 mL Dung dịch được ủ trong 60 phút ở nhiệt độ phòng Độ hấp thụ của dung dịch chiết được đo bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 434 nm Độ hấp thụ thu được được vẽ thành phương trình đường tuyến tính và sau đó TFC được tính theo công thức: Hàm lượng flavonoid trong dung dịch (àg/mL) nhõn với hệ số pha loóng và thể tớch dung dịch (mL) rồi chia cho khối lượng dịch chiết (g) TFC được biểu thị bằng mg tương đương với quercetin trên mỗi gam chiết xuất Mỗi chiết xuất được thử nghiệm với 5 lần lặp lại và được báo cáo là trung bình ± SD
Hàm lượng Flavonoid toàn phần thu được ở dịch chiết lá Rau ngót với dung môi ethanol 50% cao nhất là 11,18 ± 0,38 mgQE/g
Bột lá Rau ngót (100,0 g) được chiết lạnh bằng dung môi ethanol 70% (v/v) Quá trình ngâm nguyên liệu kéo dài 24 giờ, thỉnh thoảng khuấy đều Dịch lọc được lọc bằng
8 giấy lọc Phần cặn được ngâm lại với cùng dung môi mới Quá trình thu hồi kết thúc cho đến khi lần lọc cuối cùng cho kết quả âm tính về sự hiện diện của flavonoid bằng cách xác định bằng xét nghiệm Shinoda Dịch lọc thu được sau đó được làm bay hơi bằng thiết bị bay hơi quay chân không và tiếp tục sử dụng nồi cách thủy ở nhiệt độ 60°C cho đến khi thu được dịch chiết đặc
Dung dịch gốc Quercetin được pha ở nồng độ 1000 ppm trong ethanol 95% Dung dịch Quercetin (6 ppm) dùng để xác định bước sóng cực đại (trong khoảng 400-800 nm và thời gian hoạt động (0-60 phút), dung dịch Quercetin với các nồng độ khác nhau, cụ thể là 4-8 ppm được dùng để xác định đường chuẩn quercetin
Chiết xuất của lá Rau ngót (500 ppm) trong ethanol 95% được sử dụng làm dung dịch thử nghiệm để xác định hàm lượng flavonoid Thử nghiệm này được thực hiện bằng cách trộn dung dịch thử với 3 mL ethanol 96%, 0,2 mL AlCl3 10%, 0,2 mL natri axetat
1 M và nước cất đến thể tích 10 mL, sau đó lắc và ủ trong 40 phút Độ hấp thụ của dung dịch được đọc ở bước sóng 434,50nm bằng máy quang phổ UV-Vis Hàm lượng flavonoid tổng số được biểu thị bằng đơn vị mgQE/g dịch chiết và được tính bằng cách nhân nồng độ flavonoid trong dung dịch thử (ppm) với hệ số pha loãng và thể tích dung dịch thử (mL) rồi chia cho trọng lượng của dung dịch thử chiết xuất (g)
Hàm lượng Flavonoid toàn phần thu được trong dịch chiết lá Rau ngót ở vùng đồng bằng (Bogor), đồng bằng trung bình (Sleman) và vùng cao (Bandung) lần lượt là 8,56 ± 0,63 mgQE/g, 4,67 ± 0 ,30 mgQE/g và 9,72 ± 0,24 mgQE/g.
Tổng quan về tối ưu hóa chiết xuất
Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) là thay đổi giá trị của một thông số và giữ cố định tất cả các yếu tố khác để đánh giá ảnh hưởng của từng thông số lên đáp ứng của một quá trình Trong các thí nghiệm thiết kế theo phương pháp OFAT, yếu tố cần khảo sát cần được cô lập, tất cả các yếu tố còn lại phải được giữ cố định và kiểm soát chặt chẽ để không gây ra nhiễu giữa các thí nghiệm [16]
Với những ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi xử lý thống kê phức tạp, phương pháp OFAT là một phương pháp rất hữu hiệu và thường được ứng dụng nhiều trong khảo sát các yếu tố đến một quá trình, đặc biệt trong trường hợp số lượng yếu tố cần khảo sát ít và các yếu tố này hoàn toàn độc lập với nhau [12]
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology – RSM) là mô hình thống kê giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất bằng cách kết hợp tất cả các yếu tố có trong phân tích thử nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu [30]
Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng thể hiện trong hình 1.2
Hình 1 2 Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Biến đầu vào (biến độc lập): Là thông số khi thay đổi sẽ ảnh hưởng đến giá trị của biến đầu ra Biến đầu vào bao gồm 2 loại: Biến kiểm soát được (Ví dụ: Nhiệt độ, dung môi, thời gian ) và biến không kiểm soát được (Ví dụ: Độ ẩm môi trường )
Biến đầu ra (biến phụ thuộc): Là kết quả của thí nghiệm, cần phải đo đạc và đánh giá (Ví dụ: Hàm lượng hoạt chất )
Có nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm như mô hình phức hợp trung tâm (CCD), Doehlert, mô hình đầy đủ…Trong số đó, thiết kế Box-Behnken (BBD) là một trong những mô hình phổ biến nhất để xác định các điều kiện tối ưu [34]
Ba yếu tố thí nghiệm (X1, X2, X3:) được thiết kế theo 3 mức: -1: 0; 1 tương ứng với phạm vi nghiên cứu để đảm bảo thiết kế thí nghiệm có tính trực giao và tính xoay
10 cũng như giảm thiểu sai số trong quá trình tính toán, hạn chế sai sót do chênh lệch đơn vị của các biến độc lập [18]
Các giá trị thực của biến xi khi đưa vào thiết kế thí nghiệm sẽ được chuyển sang giá trị mã hóa Xi
Bảng 1 2 Các mức và khoảng biến thiên của biến đầu vào
Xi (mã hóa) xi (thực)
Công thức chuyển đổi giá trị thực xi sang giá trị mã hóa Xi như sau:
Xây dựng và đánh giá mô hình
Mô hình bậc 2 thường được sử dụng để xác định giá trị tối ưu của biến đầu ra Do đó, phương trình hồi quy đặc trưng cho sự phụ thuộc giữa hàm đáp ứng Y vào các biến
Trong đó B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22, B33 là các hệ số bậc 2; B12, B13,
B23 là hệ số tương tác của từng cặp yếu tố Đánh giá mô hình vừa xây dựng dựa trên độ tương thích và khả năng dự đoán, được đặc trưng bằng các hệ số R 2 , R 2 hiệu chỉnh, R 2 dự đoán, mức độ không tương thích (lack of fit) Mô hình chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu chuẩn thống kê Trong đó:
- Sự không phù hợp (Lack of fit) nhằm đánh giá mức độ phù hợp của mô hình Mô hình được coi là phù hợp nếu p > 0,05 Nếu p < 0,05, mô hình không được chấp nhận
- R 2 đặc trưng cho mối tương quan giữa biến đầu vào và biến đầu ra R 2 càng gần
1, mô hình có độ tuyến tính càng cao
- R 2 hiệu chỉnh đặc trưng cho mức độ bền vững của mô hình R 2 hiệu chỉnh càng gần R 2 mô hình càng bền vững.
- R 2 dự đoán đặc trưng cho khả năng dự đoán của mô hình R 2 dự đoán càng gần
R 2 hiệu chỉnh mô hình dự đoán càng tốt
Căn cứ theo mục tiêu mà người thực hiện nghiên cứu muốn đạt được, hàm mục tiêu của các biến đầu ra sẽ được xác định Hàm mục tiêu sẽ được cụ thể hóa bằng các tùy chọn mục tiêu tối ưu trên các phần mềm; thông qua các thuật toán và mô hình toán học đã xây dựng ở trên, nghiệm tối ưu thỏa mãn sẽ được tìm ra và từ đó xác định điều kiện tối ưu cho quá trình và kiểm chứng lại bằng thực nghiệm [18].
Tổng quan về cao đặc
Định nghĩa
Theo Dược điển Việt Nam V, cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp
Theo thể chất, cao dược liệu được phân thành 3 loại: Cao lỏng, cao đặc và cao khô Trong đó, cao đặc có thể chất đặc quánh, hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% [3].
Phương pháp bào chế cao đặc
Quy trình bào chế cao đặc được mô tả trong hình 1.3
Hình 1 3 Quy trình bào chế cao đặc
Chuẩn bị dược liệu, dung môi
Dược liệu dùng điều chế cao đặc phải đạt tiêu chuẩn quy định Sau đó, dược liệu được sấy khô và chia nhỏ tới độ mịn thích hợp
Dung môi chiết xuất phải đạt tiêu chuẩn Dược điển quy định và thường là nước và ethanol Có thể dùng hỗn hợp ethanol - nước hoặc ethanol - diethyl ether Nước là dung môi thông dụng và rẻ tiền nhưng có nhược điểm hòa tan nhiều tạp chất, cao khó bảo quản Ethanol hòa tan được nhiều loại hoạt chất, hoà tan ít tạp chất, cao dễ bảo quản hơn nên được dùng rộng rãi
Phương pháp chiết xuất hoạt chất được lựa chọn căn cứ vào: Bản chất của dược liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm, điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất Một số phương pháp chiết xuất thường được sử dụng trong điều chế cao: ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất có hỗ trợ siêu âm, …
Tinh chế dịch chiết nhằm đảm bảo hàm lượng hoạt chất và chất lượng cao, giúp tăng độ ổn định, giảm vi sinh vật đồng thời loại bỏ dung môi và các thành phần độc hại Nguyên tắc khi tinh chế dịch chiết là loại bỏ tối đa tạp chất mà không làm ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất và độ ổn định của hoạt chất Một số phương pháp tinh chế dịch chiết như loại bớt tạp chất, làm trong dịch chiết (lắng gạn, lọc, ly tâm…), tinh chế giảm vi sinh vật
Cô đặc là quá trình tăng tỉ lệ hoạt chất trong dịch chiết bằng cách bốc hơi dung môi nhưng chưa làm khô sản phẩm Để hạn chế sự phân hủy hoạt chất, quá trình cô đặc cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (50-60°C) và trong thời gian ngắn, tránh cô kéo dài ở nhiệt độ cao Do vậy, tốt nhất là cô dưới áp suất giảm Cần chú ý một số trường hợp dịch chiết sẽ tạo bọt nhiều khi áp suất nồi cô giảm Để hạn chế hiện tượng tạo bọt, có thể thêm vào dịch chiết một ít bơ cacao hay parafin Đối với điều chế cao đặc, cô dịch chiết đến độ ẩm không quá 20%
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
Nguyên liệu nghiên cứu
Bộ phận trên mặt đất của cây Rau ngót Mẫu Rau ngót được thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng
Mẫu Rau ngót được giám định tên khoa học là Breynia androgyna (L.) Chakrab
& NPBalakr (Tên đồng danh: Sauropus androgynus (L.) Merr) (Phụ lục 1) bởi Ths Nghiêm Đức Trọng, bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà nội
Xử lý sau khi thu hái: Phần trên mặt đất của cây Rau ngót được làm sạch tạp chất, cắt nhỏ, hông rồi sấy khô ở nhiệt độ 60 độ C đến hàm ẩm dưới 10%
Xử lý dược liệu trước khi chiết: Dược liệu được làm nhỏ bằng máy xay, rây qua rây phù hợp, đồng nhất mẫu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng
Hình 2 1 Cây Rau ngót ( Breynia androgyna (L.) Chakrab & NPBalakr)
Hóa chất, thiết bị
2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất:
- Chất chuẩn: Quercetin độ tinh khiết ≥ 98%, số lô CFN99272, nhà sản xuất Wuhan Chemfaces Biochemical (Phụ lục 2)
- Hóa chất định lượng: AlCl3.6H2O, NaOAc.3H2O đạt tiêu chuẩn chất lượng
2.1.2.2 Phương tiện và máy móc
- Cân phân tích ES225SM-DR Presica/Thụy Sỹ
- Cân phân tích GR200/Nhật Bản
- Cân kỹ thuật Sartorius Đức
- Bể siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)
- Bộ dụng cụ cô quay chân không Buchi Thụy Sĩ
- Máy đo hàm ẩm MF – 50 AND Nhật Bản
- Máy đo quang HITACHI Nhật Bản
- Bộ dụng cụ thủy tinh: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, pipet, đũa thủy tinh…và các dụng cụ khác cần thiết cho đề tài.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao
Rau ngót bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis
Xây dựng quy trình định lượng flavonoid toàn phần trong cao Rau ngót bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis và thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp như: Tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng
Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình chiết xuất flavonoid từ dược liệu Rau ngót
Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết siêu âm, khảo sát các yếu tố nồng độ dung môi chiết xuất (25%, 50%, 75%, 90%), thời gian siêu âm (15 phút, 30 phút, 45 phút) và nhiệt độ chiết xuất (40°C, 50°C, 65°C, 80°C) Đánh giá và lựa chọn các khoảng tối ưu của các yếu tố thông qua hàm lượng flavonoid toàn phần chiết được
Chiết xuất ở các điều kiện được thiết kế theo mô hình BBD thông qua phần mềm Design expert 13, đánh giá mô hình và lựa chọn kết quả tối ưu Kiểm tra lại bằng thực nghiệm 3 lần ở điều kiện tối ưu
Nội dung 3: Bước đầu bào chế cao đặc Rau ngót giàu flavonoid dựa trên các điều kiện đã khảo sát.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao Rau ngót bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis
2.3.1.1 Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Chuẩn bị dung dịch gốc: Cân chính xác 10mg Quercetin cho vào bình định mức 50ml, thêm Methanol (MeOH) đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ
15 0.2mg/ml Hút 10ml dung dịch trên vào bình định mức 50ml, thêm MeOH đến vạch thu được dung dịch chuẩn 0.04mg/ml = 40ppm
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Hút 1.5ml dung dịch trên vào bình định mức 10ml, thêm 2ml AlCl3 2%, 0.2ml NaOAc 1M, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều Để yên trong 30 phút
Chuẩn bị mẫu trắng: Hút 1.5ml dung dịch trên vào bình định mức 10ml, thêm 0.2ml NaOAc 1M, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều
Quét phổ để xác định bước sóng cực đại
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích
● Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Hút lần lượt 1ml, 2ml, 2.5ml, 3ml, 4ml dung dịch chuẩn 40ppm vào bình định mức 10ml, thêm 2ml AlCl3 2%, 0.2ml NaOAc 1M, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, để yên trong 30 phút, thu được dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là 4ppm, 8ppm, 10ppm, 12 ppm, 16ppm
Chuẩn bị mẫu trắng: Dung dịch tương ứng với từng mẫu đo nhưng không có thuốc thử AlCl3 2% Độ độ hấp thụ ở bước sóng 431nm, 0.99 ≤ R 2 ≤ 1
● Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành đo 6 lần một mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 14ppm, trong cùng điều kiện đo quang, ghi lại độ hấp thụ ở các lần đo
Yêu cầu: RSD của độ hấp thụ các lần đo không vượt quá 2%
● Độ lặp lại phương pháp định lượng
Chuẩn bị 6 mẫu dịch thử của cùng một mẫu cao dược liệu theo quy trình đã xây dựng Đo độ hấp thụ trong cùng điều kiện và tính hàm lượng flavonoid toàn phần Yêu cầu: RSD hàm lượng flavonoid toàn phần giữa các mẫu không vượt quá 3% [8]
Phương pháp thêm chuẩn: Chuẩn Quercetin được thêm vào cao và tiến hành hòa tan
16 Tạo các mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ tương ứng 80%, 100%, 120% lượng flavonoid toàn phần có trong mẫu thử, kí hiệu lần lượt T1, T2, T3 Tạo 3 mẫu thử thêm chuẩn với mỗi nồng độ thêm chuẩn
Tinh tỷ lệ thu hồi R% của mỗi lượng chất chuẩn thêm vào các mẫu thêm chuẩn theo công thức:
Trong đó: mt+c: Lượng Quercetin trong dung dịch thử thêm chuẩn (ug) mt: lượng Quercetin trong dung dịch thử (ug) mc: lượng Quercetin trong dung dịch chuẩn thêm vào (lý thuyết)
Yêu cầu: Độ thu hồi nằm trong khoảng 90 – 108%, RSD ≤ 2% [8]
2.3.1.3 Xây dựng quy trình định lượng
Cân 10g bột dược liệu vào bình nón nút mài dung tích 500ml, thêm 200ml ethanol 50%, chiết siêu âm trong 30 phút ở 65 o C Lọc dịch chiết bằng giấy lọc Dịch chiết được đem đi cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở
60 o C đến thể chất lỏng sánh Chuyển dịch chiết đậm đặc vào cốc có mỏ, tráng bình bằng ethanol, sau đó chuyển vào tủ sấy ở 50 o C đến thể chất cao đặc (Độ ẩm không quá 20%)
Cân chính xác 0.1g cao vào bình định mức 20ml, định mức đến vạch bằng methanol, siêu âm 10 phút cho cao phân tán vào dung môi, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm dung dịch thử để tiến hành định lượng
Mẫu thử: Hút 2 ml dung dịch thử cho vào bình định mức 10ml, thêm 2ml AlCl3
2%, 0.2ml NaOAc 1M, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều
Mẫu trắng: Dung dịch tương ứng với từng mẫu đo nhưng không có AlCl3 2% Để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi đem đo quang ở bước sóng hấp thụ cực đại
Hàm lượng flavonoid trong cao dược liệu tính theo Quercetin được tính toán như sau:
X: Hàm lượng flavonoid trong cao dược liệu (mg/g cao)
C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (ug/ml)
V: Thể tích dung môi đem pha cao (l)
𝑚 𝑐â𝑛 : Khối lượng cao cân đem pha (g) a: độ ẩm của cao (%)
Hàm lượng flavonoid toàn phần trong toàn bộ dược liệu khô được tính như sau:
𝑚 𝑑𝑙 𝑥 (100%−ℎ) (mg/g dược liệu) Trong đó:
Y1: Hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu thử (mg/g dược liệu)
𝑚 𝑐𝑎𝑜 : Tổng khối lượng cao thu được (g)
𝑚 𝑑𝑙 : Khối lượng dược liệu khô (g) h: độ ẩm của dược liệu (%)
2.3.2 Tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ dược liệu Rau ngót
2.3.2.1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất flavonoid từ cây
Hàm lượng flavonoid toàn phần chiết được từ dược liệu khô kiệt (mg/g) (Y1):
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑑ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢 𝑘ℎô Hiệu suất chiết cao thu được (%kl/kl) (Y2):
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
Nhóm nghiên cứu lựa chọn 3 yếu tố để tiến hành khảo sát bao gồm:
- Nồng độ dung môi ethanol: 25%, 50%, 75%, 90%
- Thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 45 phút
Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Các yếu tố: thời gian chiết xuất, nồng độ dung môi chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất sẽ lần lượt được khảo sát bằng cách tiến hành các thí nghiệm có thay đổi các mức khảo sát một yếu tố trong khi điều kiện của tất cả các yếu tố còn lại được giữ nguyên Từ kết quả khảo sát, các điều kiện tối ưu được lựa chọn và cố định để thực hiện các bước khảo sát tiếp theo
2.3.2.2 Phương pháp tối ưu hóa quy trình chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót
Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)
Dựa vào kết quả trên xác định được 3 biến sau khi có kết quả khảo sát là nồng độ ethanol, thời gian chiết, nhiệt độ chiết để đưa vào mô hình tối ưu
Y1: Hàm lượng flavonoid toàn phần chiết được (mg/g dược liệu)
Phương án thực nghiệm bao gồm 16 thí nghiệm, trong đó có 12 thí nghiệm tại điểm thí nghiệm toàn phần, 4 thí nghiệm tại tâm
Ma trận yếu tố mã hóa cho thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 3 yếu tố được trình bày trên bảng 2.1
Bảng 2 1 Ma trận yếu tố mã hóa thí nghiệm Box-Behnken 3 yếu tố Đơn vị thí nghiệm X 1 X 2 X 3
Tiến hành chiết xuất ở các điều kiện khác nhau, sau đó xác định hàm lượng cao và tổng hàm lượng flavonoid toàn phần chiết được bằng phương pháp đo quang
Tối ưu hóa chiết xuất
Dựa trên các mô hình đã xây dựng, tiến hành đánh giá độ chính xác, độ tuyến tính, khả năng dự đoán và sự phù hợp của mô hình với số liệu thực nghiệm thông qua giá trị p-value, hệ số xác định R 2 , hệ số xác định R2hiệu chỉnh và R2dự đoán
Cài đặt các yêu cầu riêng cho từng biến (tối thiểu, tối đa, trong khoảng giới hạn) sau đó phân tích các phương án tương ứng với các điều kiện chiết xuất thỏa mãn yêu cầu vừa cài đặt và mức kì vọng của phương án Từ đó, lựa chọn phương án tối ưu là phương án thỏa mãn đồng thời 2 điều kiện: tổng hàm lượng flavonoid toàn phần và hàm lượng cao cao nhất và mức kỳ vọng cao Sau khi đã lựa chọn được phương án tối ưu,
20 lặp lại điều kiện tối ưu 3 lần nhằm kiểm tra sự tương thích giữa lý thuyết với thực nghiệm
2.3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel Các thí nghiệm tối ưu được thiết kế và đọc kết quả bằng phần mềm Design Expert 13
2.3.3 Bào chế cao Rau ngót giàu flavonoid
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong cao Rau ngót
Khảo sát độ hấp thụ cực đại
Tiến hành như mục 2.3.1.1., khảo sát cực đại hấp thụ quang mẫu chuẩn Quercetin cho thấy độ hấp thụ quang đạt giá trị cực đại tại bước sóng 431nm và 268nm Bước sóng 431nm được chọn để tiến hành định lượng do đây là bước sóng nằm trong vùng khả kiến, đặc trưng cho các phức màu tạo thành từ phản ứng của các flavonoid và nhôm clorid
Hình 3 1 Kết quả khảo sát cực đại hấp thụ quang của chất chuẩn Quercetin
Thẩm định phương pháp phân tích
3.1.2.1 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành như mục 2.3.1.2., ghi lại độ hấp thụ và xây dựng đường chuẩn, đánh giá mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Quercetin thông qua R 2
Bảng 3 1 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy chuẩn Quercetin
Nồng độ (ppm) 4 8 10 12 16 Độ hấp thụ 0,191 0,411 0,51 0,604 0,814
Hình 3 2 Kết quả xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính dãy chuẩn
Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và độ hấp thụ quang trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số xác định R2 0,9993, thỏa mãn điều kiện 0,99 ≤ R2 ≤ 1
3.1.2.2 Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành đo lặp lại 6 lần mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 14ppm Ghi lại độ hấp thụ mỗi lần, tính toán RSD thu được kết quả ở bảng 3.2
Bảng 3 2 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng STT Độ hấp thụ Độ hấp thụ trung bình RSD (%)
Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối là 0,69% ≤ 2% nằm trong giới hạn yêu cầu Vì vậy, hệ thống sử dụng định lượng phù hợp với phép định lượng
3.1.2.3 Độ lặp lại của phương pháp định lượng Đo 6 mẫu dịch thử của cùng một mẫu cao dược liệu theo quy trình đã xây dựng Kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3 3 Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng
Khối lượng cao (g) Độ hấp thụ
Hàm lượng flavonoid trung bình (% g/g cao)
Giá trị RSD (%) của hàm lượng flavonoid là 1,9% ≤ 3%, nằm trong giới hạn yêu cầu Như vậy, phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại
Các mẫu thêm chuẩn có nồng độ tương ứng với 80%, 100%, 120% lượng Quercetin đương lượng trong mẫu thử Kết quả tỷ lệ thu hồi được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3 4 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng
Lượng có trong mẫu thử (àg)
Lượng chuẩn thêm vào (àg)
Tổng lượng tìm thấy (àg)
Lượng chuẩn tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)
Kết quả cho thấy độ thu hồi trung bình ở cả 3 mức thêm chuẩn đều nằm trong khoảng yêu cầu 90 - 108% và RSD nằm trong khoảng yêu cầu Do đó phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ đúng.
Tối ưu hóa chiết xuất flavonoid từ dược liệu Rau ngót
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ cây Rau ngót
3.2.1.1 Ảnh hưởng của thời gian chiết
Tiến hành khảo sát yếu tố thời gian với các giá trị lần lượt là 15 phút, 30 phút, 45 phút Các thông số khác được cố định bao gồm: nồng độ dung môi chiết xuất: 50%; nhiệt độ chiết xuất: 65°C
26 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian chiết được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3 5 Ảnh hưởng của thời gian đến tổng hàm lượng flavonoid toàn phần và hiệu suất chiết cao
STT Thời gian (phút) Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Khi tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 30 phút hàm lượng flavonoid toàn phần tăng dần từ 1,79mg/g đến 2,12mg/g Khi tiếp tục kéo dài thời gian chiết lên 45 phút, hàm lượng flavonoid toàn phần có xu hướn giảm dần Trong khoảng thời gian từ 15 phút đến 45 phút hiệu suất chiết cao luôn có xu hướng tăng dần
Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian 30p cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo và khoảng thời gian chiết là 15 phút – 45 phút cho các thí nghiệm tối ưu
3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết
Tiến hành khảo sát nồng độ ethanol với các giá trị lần lượt là 25%, 50%, 75%, 90%, (tt/tt) Các thông số khác được cố định bao gồm: thời gian chiết xuất: 30 phút; nhiệt độ chiết xuất: 65°C
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nồng độ dung môi chiết xuất được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3 6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến tổng hàm lượng flavonoid toàn phần và hiệu suất chiết cao
Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Khi nồng độ ethanol tăng từ 25% đến 75%, hàm lượng flavonoid trong dịch chiết tăng dần từ 1,81 mg/g đến 2,53 mg/g và đạt giá trị lớn nhất tại nồng độ ethanol 75% Khi tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên đến 90%, hàm lượng flavonoid giảm dần còn 2,04 mg/g Đồng thời hiệu suất chiết cao giảm dần khi tăng nồng độ dung môi do nồng độ ethanol càng thấp càng nhiều tạp chất được chiết ra
Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng độ 75% cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo và khoảng nồng độ ethanol từ 50% – 90% để đưa vào các thí nghiệm tối ưu
3.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Tiến hành khảo sát yếu tố nhiệt độ với các giá trị lần lượt là 40°C, 50°C, 65°C, 80°C Các thông số khác được cố định bao gồm: thời gian chiết xuất: 30 phút; nồng độ dung môi chiết xuất: 75%
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ chiết được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hàm lượng flavonoid toàn phần và hiệu suất chiết cao
STT Nhiệt độ (°C) Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Trong khoảng nhiệt độ khảo sát từ 40 o C đến 80 o C, nghiên cứu ghi nhận khi càng tăng nhiệt độ chiết xuất thì hàm lượng flavonoid toàn phần tăng dần từ 2,14mg/g đến 2,76mg/g và hiệu suất chiết cao cũng luôn có xu hướng tăng lên
Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng nhiệt độ từ 50 o C đến 80 o C là khoảng khảo sát trong các thí nghiệm tối ưu
Như vậy, từ kết quả của quá trình khảo sát, lựa chọn điều kiện cho quá trình tối ưu hoá như sau:
• Thời gian chiết xuất: 15 phút – 45 phút
3.2.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót
3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa quá trình chiết xuất với các thí nghiệm được thiết kế theo mô hình Box-Behnken nhằm xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu của 3 yếu tố: Nồng độ EtOH (X1), Thời gian chiết xuất (X2) và Nhiệt độ chiết xuất (X3) Biến phụ thuộc là Hàm lượng flavonoid toàn phần (Y1), Hiệu suất chiết cao (Y2)
Bảng 3 8 Kết quả mã hoá các biến đầu vào
Mã hóa Thông số Đơn vị Mức
X1 Nồng độ ethanol % (tt/tt) 50 70 90
Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3 9 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Biến đầu vào mang giá trị mã hóa
Biến đầu vào mang giá trị thực
Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Sau khi có kết quả định lượng, số liệu được đưa vào phần mềm Design expert 13 để xử lý thu được kết quả
3.2.2.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất
Hàm lượng flavonoid toàn phần (Y 1 )
Mô hình được xây dựng ở dạng phương trình toán học biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng flavonoid toàn phần từ dược liệu vào các biến đầu vào
- Phương trình với biến đầu vào đã được mã hóa:
- Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực:
Bảng 3 10 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình xây dựng được –
Hàm lượng flavonoid toàn phần
Biến số Tổng bình phương Bậc tự do Phương sai F - value p - value
Mô hình có giá trị p-value < 0,001 và giá trị p-value trong phép kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) > 0,05, chứng tỏ rằng sự không phù hợp không có ý nghĩa thống kê Mô hình có độ tuyến tính và tính bền vững khá cao (R 2 = 0,9676; R 2 hiệu chỉnh = 0,9190) Trong mô hình trên, hiệu số giữa R 2 hiệu chỉnh và R 2 dự đoán là 0,1923 < 0,2 là giới hạn khác biệt chấp nhận được theo Design Expert 13 Như vậy, có thể dùng mô hình trên để dự đoán điều kiện chiết xuất Flavonoid tối ưu từ Rau ngót Bên cạnh đó, có thể sử dụng mô hình này để xem xét sự ảnh hưởng của từng yếu tố đầu vào đến hàm lượng hoạt chất từ dịch chiết Nồng độ ethanol (X1), thời gian chiết xuất (X2), nhiệt độ chiết xuất (X3) đều có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng flavonoid toàn phần (Y1) Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng flavonoid toàn phần với các biến đầu vào được trình bày hình 3.3
Hình 3 3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết với các biến đầu vào
Trong đó: Đồ thị (1), (2), (3) lần lượt biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng flavonoid toàn phần với: nồng độ ethanol – nhiệt độ chiết xuất, nồng độ EtOH – thời gian chiết xuất, thời gian chiết xuất - nhiệt độ chiết xuất
Mô hình được xây dựng ở dạng phương trình toán học biểu thị sự phụ thuộc của tổng hiệu suất chiết cao vào các biến đầu vào
- Phương trình với biến đầu vào đã được mã hóa:
- Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực:
Bảng 3 11 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình xây dựng được –
Biến số Tổng bình phương
R 2 = 0,9940 R 2 hiệu chỉnh = 0,9850 R 2 dự đoán = 0,9597 Nhận xét:
Mô hình có giá trị p-value < 0,001 và giá trị p-value trong phép kiểm định sự không phù hợp (Lack of fit) > 0,05, chứng tỏ rằng sự không phù hợp không có ý nghĩa thống kê Mô hình có độ tuyến tính và tính bền vững cao (R 2 = 0,9940; R 2 hiệu chỉnh = 0,9850) Trong mô hình trên, hiệu số giữa R 2 hiệu chỉnh và R 2 dự đoán là 0,0253 < 0,2 là giới hạn khác biệt chấp nhận được theo Design Expert 13 Như vậy, có thể dùng mô hình trên để dự đoán điều kiện chiết xuất thu được khối lượng cao tối ưu từ Rau ngót Bên cạnh đó, có thể sử dụng mô hình này để xem xét sự ảnh hưởng của từng yếu tố đầu vào đến hiệu suất chiết cao Nồng độ ethanol (X1), thời gian chiết xuất (X2), nhiệt độ chiết xuất (X3) đều có ảnh hưởng đáng kể đến Hiệu suất chiết cao (Y2)
33 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hiệu suất chiết cao với các biến đầu vào được trình bày hình 3.7
Hình 3 4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hiệu suất chiết cao với các biến đầu vào
Trong đó: Đồ thị (1), (2), (3) lần lượt biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng cao với: nồng độ ethanol – nhiệt độ chiết xuất, nồng độ EtOH – thời gian chiết xuất, thời gian chiết xuất - nhiệt độ chiết xuất
3.2.2.3 Kết quả lựa chọn điều kiện tối ưu của các biến đầu vào
Với mục tiêu tối ưu là thu được Hàm lượng flavonoid toàn phần lớn nhất và Hiệu suất chiết cao lớn nhất, hàm mục tiêu được xác định là Y1 → max và Y2 → max Sử dụng phương pháp Bề mặt đáp ứng trên phần mềm Design Expert 13 để xác định giá trị tối ưu của các biến đầu vào thỏa mãn hàm mục tiêu đề ra Kết quả thu được ở bảng dưới đây:
Bảng 3 12 Kết quả tối ưu điều kiện chiết xuất
Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Hiệu suất chiết cao (% g/g) Kỳ vọng
Hàm kỳ vọng D (Desirability) thể hiện mức độ phù hợp của điều kiện tối ưu xác định so với hàm mục tiêu đề ra, với 0 ≤ D ≤ 1 Khi đó, bài toán tối ưu là việc lựa chọn giá trị của các biến đầu vào sao cho hàm kỳ vọng D đạt giá trị lớn nhất Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho thấy, mô hình xây dựng có khả năng xác định điều kiện tối ưu thỏa mãn hàm mục tiêu với các giá trị kỳ vọng D đạt 1,000
Tiến hành thực nghiệm tại điều kiện tối ưu để kiểm định khả năng dự đoán của mô hình, kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3 13 Kết quả kiểm định mô hình bằng thực nghiệm (n=3)
Thông số Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình RSD
Tổng hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
Bào chế cao đặc Rau ngót giàu flavonoid
Từ kết quả lựa chọn các yếu tố đầu vào, bước đầu tiến hành chiết xuất Rau ngót với điều kiện tối ưu, dịch chiết được cô để tạo cao đặc Rau ngót ở quy mô 10g dược liệu/mẻ theo quy trình trong hình 2.3
Rau ngót được xay nhỏ, rây qua rây có kích thước mắt rây 1400μm và 355μm Lấy phần bột lọt 95% qua rây 1400μm và lọt không quá 40% qua rây 355μm để được bột dược liệu thô
Cân 10g bột dược liệu vào bình nón nút mài, bổ sung 200ml dung môi ethanol 72% Chiết siêu âm ở nhiệt độ 80ºC, trong thời gian 28 phút Lọc dịch chiết bằng giấy lọc Dịch chiết được đem đi cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 60°C đến thể chất lỏng sánh Chuyển dịch chiết đậm đặc vào cốc có mỏ, tráng bình bằng ethanol, sau đó chuyển vào tủ sấy ở 50°C đến thể chất cao đặc
Tiến hành điều chế 03 mẻ Mỗi mẻ được đánh giá về cảm quan, độ ẩm, hàm lượng flavonoid trong cao, hàm lượng flavonoid toàn phần và hiệu suất chiết flavonoid
Sau khi điều chế, nhận thấy cao đặc Rau ngót là một khối đặc quánh, màu nâu, có mùi đặc trưng Kết quả được trình bày trong bảng 3.14
Bảng 3 14 Kết quả bào chế cao đặc Rau ngót
Khối lượng cao chiết được (g)
Hàm lượng flavonoid trong cao (mg/g)
Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg/g)
- Cao đặc thu được đạt chỉ tiêu về cảm quan
- Hàm ẩm: 7,65% - 7,75% < 20%, cao đạt chỉ tiêu của cao đặc
- Hàm lượng flavonoid trong cao: 9,70 mg/g
- Hàm lượng flavonoid toàn phần: 2,81mg/g
Bàn luận
3.4.1 Về xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong Rau ngót
Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc Rau ngót dựa trên phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3, trong đó mẫu trắng là tất cả các thành phần có trong mẫu thử nhưng không có thuốc thử AlCl3, điều này đã được tham khảo trong một số chuyên luận như Betulae folium , Calendulae floscủa Dược điển Châu Âu [11]
Phương pháp có tính chọn lọc nhờ khả năng lựa chọn bước sóng thích hợp để đo độ hấp thụ, thao tác nhanh chóng, thiết bị đơn giản, thích hợp phân tích hàng loạt mẫu phù hợp với mục đích chính của nghiên cứu là khảo sát sự thay đổi của hàm lượng flavonoid toàn phần trong nhiều mẫu cao Rau ngót theo các điều kiện chiết xuất
Kết quả thẩm định độ lặp lại của quá trình định lượng cho RSD < 1,9%, độ thu hồi đạt khoảng yêu cầu từ 95% - 105% chứng tỏ phương pháp thích hợp và có sự lặp lại giữa các thí nghiệm
3.4.2 Về tối ưu hóa chiết xuất flvonoid từ dược liệu Rau ngót
3.4.2.1 Về nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót
Khảo sát thời gian chiết
Hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra môi trường Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo…) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu; nhưng nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, đồng thời tăng nguy cơ phân hủy hoạt chất kém bền, gây ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết và cả hiệu suất chiết [1], [2] Do đó, cần khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu để thu được dịch chiết có hàm lượng và chất lượng hoạt chất cao
Kết quả cho thấy, thời gian chiết xuất 30 phút cho hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất, khi thời gian chiết lên đến 45 phút, hàm lượng flavonoid toàn phần giảm dần có thể do lượng tạp chất được chiết ra ngày càng nhiều, do đó làm giảm hàm lượng flavonoid Đồng thời, tạp chất chiết ra nhiều hơn cũng nên khối lượng cắn thu được càng nhiều làm hiệu suất chiết cao luôn có xu hướng tăng
Khảo sát nồng độ dung môi
Ethanol là dung môi được sử dụng rất nhiều để chiết xuất flavonoid và thường là ethanol hỗn hợp với nước theo các tỷ lệ khác nhau, nhiều nghiên cứu cũng sử dụng ethanol để chiết xuất flavonoid trong cây Rau ngót [19], [20], [35], [37]
37 Đồng thời, ethanol còn là dung môi phổ biến, thân thiện hơn so với các dung mỗi khác, có thể sử dụng trong phòng thí nghiệm cũng như trong quy mô công nghiệp, được ứng dụng rộng rãi, để thu hồi và phù hợp với xu hướng sử dụng dung môi xanh hiện nay [2] Do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn dung môi là ethanol
Do độ phân cực của nước và ethanol khác nhau nên khi trộn lẫn ethanol và nước sẽ cho các hỗn hợp ethanol và nước có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung môi có độ phân cực tương đương với hợp chất cần chiết xuất nhất sẽ hòa tan chất đó tốt hơn Kết quả cho thấy, dung môi ethanol 75% có thể là dung môi có độ phân cực gần tương đương với hợp chất cần chiết xuất nhất nên chiết được hàm lượng flavonoid cao nhất
Lựa chọn nhiệt độ chiết
Nhiệt độ tăng giúp làm giảm độ nhớt và sức căng bề mặt dung môi, tăng độ tan và tốc độ khuếch tán hoạt chất, từ đó giúp quá trình chiết xuất diễn ra nhanh hơn, đồng thời giúp tăng hiệu suất quá trình chiết [1], [2] Kết quả thu được là càng tăng nhiệt độ thì hàm lượng flavonoid chiết được càng tăng Tuy nhiên, khi chiết ở nhiệt độ rất cao trên 80°C lớn hơn nhiệt độ sôi của ethanol sẽ làm bay hơi dung môi, tăng chi phí sản xuất và giảm chất lượng sản phẩm do sự hình thành những hợp chất không mong muốn hoặc làm chuyển dạng cấu trúc các hợp chất [1] Đồng thời nhiệt độ cao có thể gây nguy hiểm khi chiết xuất bằng ethanol nếu thiết bị không đảm bảo độ an toàn Vì vậy, đề tài giới hạn cận trên của yếu tố nhiệt độ là 80°C
3.4.2.2 Về kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót
Quá trình chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong tối ưu hóa các quy trình chiết xuất dược liệu
Thiết kế BoxBehnken cho phép đánh giá nhanh chóng và chính xác vai trò của các yếu tố tới biến đầu ra dựa trên số thí nghiệm tối thiểu giúp rút ngắn đáng kể thời gian khảo sát và tiết kiệm chi phí đầu tư Đồng thời, phương pháp cũng rất linh hoạt cho phép tối ưu hóa đồng thời nhiều mục tiêu nghiên cứu với 16 thí nghiệm đã được sử dụng và xây dựng được một mô hình phù hợp trong dự đoán điều kiện chiết xuất tối ưu dược liệu Rau ngót với giá trị R 2 lớn Điều đó cho thấy phương pháp RSM rất có giá trị thực tiễn trong việc tối ưu hóa quá trình chiết xuất dược liệu nói chung và mô hình tối ưu chiết xuất flavonoid từ cây Rau ngót được thực hiện nói riêng
Từ mô hình, kết quả tối ưu hóa quy trình chiết xuất được thực hiện ở các điều kiện thời gian 27,671 phút, nồng độ ethanol 71.895%, nhiệt độ 79,838°C với giá trị thực nghiệm đạt được Hàm lượng flavonoid toàn phần là 2,81mg/g và Hiệu suất chiết cao là 28,95% g/g
3.4.3 Về bào chế cao Rau ngót giàu flavonoid
Từ kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chiết xuất flavonoid toàn phần từ Rau ngót, tiến hành bào chế cao đặc thu được hiệu suất chiết flavonoid trung bình khá cao là 87,46% với RSD 1,34% cho thấy độ lặp lại giữa các lần chiết và bào chế cao đúng quy trình, đạt hiệu quả, hoạt chất không bị thất thoát quá nhiều trong quá trình điều chế Nhóm nghiên cứu đang thực hiện bào chế cao đặc với 10g/mẻ, quy mô nhỏ nên có thể gây ra sai số lớn, cần thực hiện trên quy mô lớn hơn
Trong một khảo sát bên lề (Phụ lục 4), hàm lượng flavonoid đo được từ dịch chiết lá và dịch chiết thân cành Rau ngót (đối với mẫu thu hái tại Sóc Sơn, Hà Nội) lần lượt là 3,89mg/g và 17,1mg/g cho thấy hàm lượng flavonoid trong dịch chiết lá cao gấp 4,4 lần so với dịch chiết cành
Trong nghiên cứu này, mẫu Rau ngót được sử dụng là cả thân và cành mang lá nên hàm lượng flavonoid toàn phần thu được khá thấp là 2,81mg/g ở điều kiện tối ưu Có thể sử dụng mẫu là riêng lá Rau ngót để thu được hàm lượng cao hơn
