TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Piper L
1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Piper L
1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Piper L
Theo hệ thống phân loại thực vật của 3 tác giả gồm: Hutchinson (1974) [14], của Cronquist A (1988) [7] và Takhtajan (2009) [11], Chi Piper L có vị trí phân loại như sau:
1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái
Cây bụi, cây thảo hoặc cây leo Lá đơn, mép nguyên; mọc đối hoặc mọc cách; có thể có hoặc không có lá kèm (rụng sớm để lại sẹo ở mẫu khá rõ) Lá hình mác, hình trứng, hình tim, hình elip Phiến lá có thể mỏng hoặc dày; nhẵn bóng, nhăn nheo hoặc thô ráp; có thể có lông Cụm hoa dạng bông, mọc đối diện với lá hoặc ở nách lá Hoa trần, thường đơn tính (đa số khác gốc, ít khi cùng gốc) hoặc lưỡng tính, không có cuống Lá bắc nhỏ; mọc đối diện với hoa Bộ nhị 2-6, chỉ nhị ngắn; bao phần 2, 2-4 thùy Bộ nhụy có bầu nhụy rời hoặc đôi khi ôm lấy trục, 1 ô, 1 noãn; núm nhụy 2-5 Loại quả hạch, hình trứng, hình cầu hoặc có mặt cắt hình tam giác Mỗi quả có 1 hạt Hạt gần hình cầu, vỏ hạt mỏng; phôi nhỏ, ngoại nhũ dạng bột và cứng [1]
1.1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái chi Piper L
Chi Piper L là một thành viên của gia đình họ Hồ tiêu (Piperaceae) Với số lượng trên 2.000 loài, Chi này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới như Brazil (330 loài), Ecuador (100 loài), … và cận nhiệt đới như Ấn Độ (45 loài), Trung Quốc (60 loài), Thái Lan (38 loài), Việt Nam (44 loài), … gặp nhiều tại các vùng núi hoặc ở tầng cây thấp của các khu rừng ẩm nhưng cũng có thể mọc ở những khoảng đất trống, mọc ven sông suối, ven đường hoặc gần khu dân cư [6], [16]
1.1.2 Đặc điểm phân bố chi Piper L tại Lào
Theo tác giả Lee You Mi đã báo cáo có 14 loài thuộc chi Piper L., được gặp ở Lào
[4] và danh lục của các loài này được giới thiệu ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Phân bố của các loài thuộc chi Piper L tại Lào [4], [20]
STT Tên khoa học Tên Lào Phân bố (tỉnh) Bộ Phận dùng
1 P betle ໃບພູ Phân bố từ bắc đến nam của
2 P.boehmeriifolium ເຄືອສະຄ້ານ Phân bố từ bắc đến nam của
5 P laosanum ໄພລາວ Khammouan Trên mặt đất
6 P longum ອ ີ່ໂລ້ Phân bố từ bắc đến nam của
7 P massiei ອ ີ່ເລ ດ Phân bố từ bắc đến nam của
Ghi chú: (-) Không có thông tin.
Tổng quan về thành phần hóa học của chi Piper L
Trên tổng số hơn 2.000 loài thuộc chi Piper L được nghiên cứu về thành phần hóa học và có hơn 600 chất được công bố phân lập từ chi này Tùy mục đích của từng nghiên cứu, những bộ phận của chi Piper L được chọn làm đối tượng nghiên cứu về thành phần hóa học có thể là thân, lá, rễ, quả hoặc hạt Những hợp chất phân lập được có cấu trúc hóa học rất đa dạng và nằm trong những nhóm chính sau: alcaloid, tinh dầu, flavonoid, propenylbenzen, lignan, neolignan, … [17]
❖ Một số khung cấu trúc hợp chất alcaloid
Qua tham khảo tài liệu, đã thống kê được 280 alcaloid phân lập từ 61 loài thuộc chi
Piper L Dựa vào công thức cấu tạo, alcaloid đã được công bố có thể được chia thành 6 nhóm [28] Các cấu trúc alcaloid được trình bày như hình 1.1
(A) Khung piperidin; (B) Khung Δ3-piperidin-2-on; (C) Khung pyrrolidin (D) Khung không có dị vòng nitơ; (E) Khung aporphin; (F) Khung piperolactam Hình 1.1 Công thức cấu tạo của các nhóm alcaloid phân lập từ chi Piper L
❖ Một số khung cấu trúc hợp chất tinh dầu
Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của chi Piper L và được thể hiện ở mùi thơm đặc trưng của các cây trong chi Hai bộ phận của các loài thuộc chi Piper L được nghiên
5 cứu nhiều về thành phần tinh dầu là lá và quả Đây cũng là hai bộ phận chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất trong cây Qua thu thập tài liệu cho thấy thành phần tinh dầu chiết xuất từ 30 loài thuộc chi Piper L gồm có 112 cấu tử Hầu hết các cấu tử này đều có cấu tạo monoterpen (53 chất) hoặc sesquiterpen (57 chất), chỉ 2 cấu tử tinh dầu có cấu tạo diterpen [12], [18] Những hợp chất monoterpen và sesquiterpen này rất phong phú về cấu tạo hóa học và trong công thức cấu tạo của chúng có thể có hoặc không có nguyên tử oxy Với những hợp chất có oxy trong công thức cấu tạo, nguyên tử này thường nằm trong nhóm chức hydroxy, ether hoặc ceton Ngược lại, mới chỉ có một hợp chất trong công thức cấu tạo có nhóm chức este được báo cáo, đó là chất α-terpineol acetat được chiết xuất từ lá của loài P betle L và chưa thấy có hợp chất nào có nhóm chức aldehyd [20] Trong chi này (A) khung 1-isopropyl-4-methylcyclohexane như γ-terpinen, α-pinen,…; (B) khung Decahydro-1, 4, 6-trimethyl-naphthalen như cubenol, … và (C) khung decahydro-1,4,7 - trimethylazulen như β-guaien, guaiol, … Các khung cấu tạo điển hình của các cấu tử tinh dầu phân lập được từ chi Piper L được thể hiện ở hình 1.2
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của các nhóm tinh dầu phân lập từ chi Piper L
❖ Một số khung cấu trúc hợp hợp chất flavonoid
Từ một số loài thuộc chi Piper L., đã có 61 hợp chất flavonoid được phân lập và công bố Hầu hết những hợp chất này đều thuộc nhóm euflavonoid và nằm trong 4 phân nhóm gồm: (A) khung chalcon hoặc (B) khung dihydrochalcon có 16 hợp chất như adunctin A-
E, flavokawain A-C,…; (C) khung flavanon có 7 hợp chất như 5,7-Dihydroxyffavanone, 6-Hydroxy-5,7-dimethoxytlavanon,… và (D) flavon có 7 hợp chất như kaempferol, quercetin, vitexin, velutin,… Công thức cấu trúc các nhóm hợp chất flavnoid được trình bày dưới đây
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các nhóm flavonoid phân lập từ chi Piper L
❖ Một số khung cấu trúc hợp hợp chất lignan
Lignan là nhóm hợp chất phân lập được từ thực vật và được tạo nên bởi 2 đơn vị phenylpropan có cấu tạo C6-C3 và liên kết với nhau ở vị trí cacbon β - β’ của chuỗi bên Cấu tạo của nhóm hợp chất lignan phân lập được từ chi Piper L khá đa dạng, giữa các chất có sự khác nhau về loại, số lượng và vị trí nhóm thế ở hai nhân thơm Nhóm thế ở nhân thơm thường gặp gồm: -OH, -OCH3, -OCH2O- Bên cạnh đó, sự kết hợp giữa hai chuỗi bên của hai đơn vị cấu tạo nên hợp chất lignan cũng khá phong phú và tạo thành các dạng có (A) khung tetrahydrofuran như clusin, subebin, cubebinin, …(B) khung furofuran như aschantin, diaeudesmin, … (C) Khung aryltetralin như dihydrotrichostin, hemiariensin, …; (D) Khung neolignan như heterotropan, magnosalin, … Tính đến năm 2022, đã có 275 hợp chất thuộc nhóm này được công bố phân lập [10], [12]
Ghi chú: Ar = vòng thơm (aromatic ring) Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các nhóm lignan phân lập từ chi Piper L
Các nghiên cứu định tính các hợp chất trong chi Piper L
Trong hơn 2,000 loài thuộc chi Piper L, đã có một số loài được nghiên cứu định tính bằng phương pháp khác nhau như TLC, HPLC, HPTLC, phản ứng hóa học,
Trong Dược điển Lào (2019), đã định tính loài Piper samentosum Roxb bằng hương pháp TLC sử dụng hệ dung môi triển khai n-hexan : chloroform : ethyl acetat (4 : 3 : 3 v/v), chấm so với dược liệu đối chiếu sau khi triển khai xong soi các vết trên đèn UV 254nm, 365nm và phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vị trí, số vết, màu sắc vết tương tự với dung dịch đối chiếu Đối với loài Piper boehmeriifolium (Miq.) C.DC cũng đã tiến hành định tính bằng phương pháp TLC so với dược liệu đối chiếu, sử dụng hệ dung môi n-hexan : chloroform : ethyl acetat : amoniac (16 : 6 : 5 : 0,1 v/v), soi trên bước sóng 254nm, 365nm và phun thuốc thử molybdophosphoric acid 10% [23]
Piper lolot C DC (Lá lốt) là loài duy nhất của chi Piper L được tiêu chuẩn hóa trong
Dược Điển Việt Nam V, dược liệu được định tính bằng phản ứng hóa học với thuốc thử Bouchardat và phản ứng với thuốc thử picric 1% và dược liệu này cũng được định tính bằng phương pháp TLC sử dụng dược liệu Lá lốt chuẩn để đối chiếu, triển khai với hệ dung môi ethyl acetat : methanol : nước (100:17:13 v/v) Quan sát bản mỏng dưới sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị
Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu [3]
Trong Dược Điển Ấn Độ (2015),đã quy định tiêu chuẩn hóa 3 loài thuộc chi Piper
L gồm có Piper nigrum L., Piper betle L và Piper cubeba L.f Đối với loài Piper nigrum đã tiến hành định tính bằng TLC dùng piperin làm chất đối chiếu để so sánh triển khai trên hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (6 : 4 v/v), và phát hiện vết các hợp chất bằng thuốc thử kali iodobismuthat, piperin sẽ cho vết màu cam đen Loài Piper betle được định tính bằng phương pháp TLC sử dụng hệ pha động toluen : ethyl acetat (8 : 2 v/v) quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm, 265nm và so sánh với chất euganol và loài Piper cubeba L.f được định tính bằng phương pháp TLC sử dụng hệ dung môi khai triển chloroform : n- hexan (7 : 3 v/v) và sử dụng cubebin làm chất đối chiếu, sau khi triển khai xong quan sát dưới đèn tử ngoại 254nm, 365nm và phát hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH [22], [24]
8 Một số nghiên cứu khác đã so sánh định tính, bán định lượng 4 loài của Piper nigrum L., Piper retrofractum Vahl., Piper cubeba Hunter và Piper betle L đã tiến hành Nghiên cứu định tính bằng phương pháp HPTLC so với chất đối chiếu là piperin sử dụng hệ dung môi toluen - ethyl acetat – diethyl ester (6:3:1 v/v), phương pháp này cho thấy tất cả 4 loài nói trên đều hiện hợp chất piperin trong sắc ký đồ của chúng Qua phân tích bán định lượng bằng phương pháp HPTLC nhận thấy hàm lượng piperin trong các mẫu được sắp xếp theo thứ tự như Piper nigrum > Piper retrofractum > Piper cubeba > Piper betle [30]
Piper Longrum L được phân tích đồng thời piperin và piperlongumin trong dịch chiết rễ bằng phương pháp HPTLC với pha động toluen : ethyl acetat (6 : 4 v/v) , quan sát ở bước sóng 342nm, vết piperin được tách ra với giá trị Rf là 0,51 và vết piperlongumin có giá trị Rf là 0,74 [25] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Manisha và cộng sự (2011) đã tiến hành định tính bằng phản ứng hóa học dịch chiết MeOH của Piper longrum cho thấy xuất hiện các nhóm hợp chất như alcaloid, tanin, phenol, coumarin và tinh dầu [36]
Saiful và cộng sự (2018), đã nghiên cứu định tính hợp chất piperin trong dịch chiết MeOH Piper chaba Hunt bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, IR) và phương pháp TLC với dung môi triển khai là ester dầu hỏa : ethyl acetat (3 : 2 v/v) quan sát trên bước sóng 342nm, piperin cho Rf là 0,51 [15] Ngoài so sánh với chất piperin chuẩn, trong nghiên cứu của Haribabu và cộng sự đã được đánh giá định tính, định lượng
Piper chaba bằng phương pháp TLC, HPTLC, HPLC đối chiếu chất chuẩn asaranin và sesamin, sử dụng hệ dung môi ethyl acetat : n-hexan (3 : 7 v/v), cho vết tách tốt, pic hiện rõ [28] và đặc biệt trong nghiên cứu đã chỉ ra trong loại Piper chaba đã có các hợp chất nhóm alcaloid, coumarin, saponin, steroid, flavonoid [15]
Về loài Piper methysticum (G.Forst.) Hook & Arn trong nghiên cứu của Lebot và công sự (2014), đã nghiên cứu định tính và định lượng dịch chiết aceton của rễ Piper methysticum bằng phương pháp UHPLC/MS, IR, NIR sử dụng dung môi triển khai là n- hexan – dioxan (8 : 2 v/v) đối chiếu với các chất methysticin, kavain, yangonin, dihydrokavain, desmethoxygangonin, flavokavin A-C [33]
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã tiến hành định tính bằng phản ứng hóa học trong một số loài thuộc chi Piper L và các nghiên cứu cũng đã chỉ ra trong Piper nigrum xuất hiện các hợp chất alcaloid, saponin, tannin, steroid, flavonoid, terpenoid, phenol và
9 glycosid tim; loài Piper retrofractum có các nhóm hợp chất alcaloid, saponin, tannin, steroid, flavonoid, terpenoid và phenol; loài Piper longrum có alcaloid, saponin, tannin, steroid, flavonoid, terpenoid và phenol.Trong nghiên cứu Uzoekwe N.M và Ezenwajiugo C.E (2023) đã báo cáo trong loài Piper quineense xuất hiện nhóm hợp chất alcaloid, saponin, tanin, anthraquinon, glycosid tim, flavonoid, carotenoid, phenol, terpenoid [37]
Từ các nghiên cứu trên có thể tóm tắt các phương pháp định tính bảng TLC, HPLC, HPTLC và phản ứng hóa học một số loài thuộc chỉ Piper L qua bảng 1.2
Bảng 1.2 Các phương pháp định tính của một số loài thuộc chi Piper L
Tên khoa học Phương pháp định tính
Hệ dung môi Chất đối chiếu TLTK
Piper betle TLC Toluen : ethyl acetat (8 : 2v/v) Euganol [24]
HPTLC Toluen : ethyl acetat : diethyl ester (6 : 3 :1v/v ) Piperin [30]
Piper boehmeriifolium TLC N-hexan : chloroform : ethyl acetat : amoniac
Ester dầu hỏa : ethyl acetat (3 : 2 v/v) Piperin [15]
Ethyl acetat : n-hexan (3 : 7 v/v) Asaranin, sesamin [28]
Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Mayer), saponin (tạo bọt), steroid (định tính Liebermann-Burchard), flavonoid (NaOH, thuốc thử FeCl3 5%, H2SO4)
Piper cubeba TLC Chloroform : n-hexan (7 : 3v/v ) Cubebin [22]
HPTLC Toluen : ethyl acetat : diethyl ester (6 : 3 : 1 v/v) Piperin [30]
Piper Longrum HPTLC Toluen : ethyl acetat (6 : 4 v/v) Piperin, piperlongumin
Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Bouchardad, Mayer), tanin (thuốc thử FeCl3 5%, gelatin, đồng acetat), phenol (thuốc thử FeCl3 5%, đồng acetat), coumarin (thuốc thử diazo hóa, phản ứng mở, đóng vòng lacton), tinh dầu (có mùi thơm)
TLC Ethyl acetat – MeOH – nước (100 : 17 : 13 v/v) Dược liệu chuẩn [3]
Hóa học Thuốc thử Bouchardad - [1], [3]
Hóa học Thuốc thử picric 1% - [3]
Methysticin, kavain, yangonin, dihydrokavain, desmethoxygangoni n, flavokavin A-C
TLC N-hexan – ethyl acetat (6 : 4v/v ) Piperin [24]
TLC Toluen - ethyl acetat – diethyl ester (6 : 3 : 1v/v ) Piperin [30]
Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Bouchardad, Mayer), saponin (tạo bọt), tannin (thuốc thử đồng acetat), steroid (định tính Liebermann-Burchard), flavonoid (NaOH, thuốc thử FeCl3 5%, H2SO4), phenol (thuốc thử FeCl3 5%, đồng acetat) và glycosid
12 tim (thuốc thử Baljet, Legal, Keller-Kiliani, Xanhhydrol)
HPTLC Toluen - ethyl acetat – diethyl ester (6 : 3 :1 v/v) Piperin [30]
Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Bouchardad, Mayer), saponin (tạo bọt), tannin (thuốc thử đồng acetat), steroid (định tính Liebermann-Burchard), triterpenoid (thuốc thử Salkowsiki) flavonoid (NaOH, thuốc thử FeCl3 5%, H2SO4), terpenoid, phenol (thuốc thử FeCl3 5%, đồng acetat)
Piper samentosum TLC n-hexan : chloroform : ethyl acetat (4 : 3 : 3v/v) Dược liệu chuẩn [24]
1.4 Tổng quan về cây Sakhan ( Piper wallichii (Miq.) Hand.-Hazz.)
1.4.1 Tổng quan về thực vật học
1.4.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái
Piper wallichii (Miq.) Hand.-Mazz là cây thân thảo lâu năm, phần gốc mọc bò Thân cành mang hoa, thẳng đứng và nhẵn, có thể cao từ 2 - 4 m Lá mọc so le, có cuống ngắn Phiến lá hình trứng, thuôn, dài, dài khoảng 6 - 7,5 cm, rộng 3 - 5 cm Gốc hình tim hơi lệch, đầu lá nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông nhỏ, nhất là ở gân Lá có 5 - 7 gân Hoa đơn tính, mọc thành từng cụm Hoa đực dài khoảng 3,5 cm, có trục nhẵn, lá bắc tròn, có 2 nhị Hoa cái ngắn hơn, khoảng 1,5 cm, có cuống ngắn Cụm quả hình trụ, hơi cong, do nhiều quả mọng nhỏ tập hợp tạo thành, dài 1,5 - 3,5 cm, đường kính 0,3 - 0,5 cm, mặt ngoài màu xanh Gốc cụm quả có cuống còn sót lại hay vết của cuống đã rụng Quả mọng nhỏ, hình cầu, có mùi thơm, vị hăng, cay Hạt tròn cỡ 2 -2,5 mm Mùa hoa quả từ tháng 3 -5 [6]
1.4.1.2 Đặc điểm phân bố và sinh thái
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là bộ phận trên mặt đất cây Sakhan (bao gồm quả) được thu hái vào ngày 12 tháng 12 năm 2023 tại tỉnh Luangprabang – Lào, sử dụng để nghiên cứu đặc điểm thực vật và đặc điểm vi học
Mẫu thân cây Sakhan được cắt nhỏ, phơi sấy ở 55 o C đến độ ẩm dưới 10% Xay thành bột, bảo quản trong túi sạch kín, sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học
Mẫu tiêu bản được Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz., họ Hồ tiêu (Piperaceae) Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng tiêu bản thực vật – Viện Dược liệu (Số hiệu DV-070524)
- Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật : nước cất, nước javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phen, glycerin
- Dùng trong định tĩnh sơ bộ các thành phần hóa học : HCl đặc, thuốc thử Diazo, thuốc thử Fehling A & B, Na2CO3, NaOH 10%, FeCl3 5%, gelatin 1%, thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendroff, thuốc thử Bouchardat, …
- Dùng trong sắc ký lớp mỏng : Piperin chuẩn tinh khiết 98% (Sigma Aldrich, Mỹ), dung môi (ethanol, ethyl acetat, acid formic, …); bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), thuốc thử Dragendroff, thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol
- Dụng cụ thuỷ tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu 100 mL, 250 mL, 500 mL, ống đong, phễu thuỷ tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, …
- Dao lam, phiến kính, lam kinh
- Dụng cụ khác bắt sự, chày, thuyền tán, khay, …
- Tủ sấy Memmert (Đức) bếp điện
- Cân kỹ thuật SATORIUS TE412
- Kính hiển vi LEICA DM 1000
- Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
- Mô tả và phân tích đặc điểm hình thái các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của mẫu cây Sakhan
- Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu và đặc điểm vi phẫu các cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Sakhan
- Giám định tên khoa học của mẫu cây Sakhan
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học
- Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân của mẫu cây Sakhan bằng phản ứng hóa học
- Định tính sơ bộ dịch chiết toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng
- Định tính piperin bằng sắc ký lớp mỏng của thân mẫu cây Sakhan
- Định tính và xác định thành phần tinh dầu trong thân của mẫu cây Sakhan.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
Phân tích hình thái: Quan sát mô tả và phân tích các đặc điểm thực vật, bao gồm:
- Dạng sống, thân, lá (cách mọc, hình dạng, kích thước phiến lá, ngọn lá, gân lá, gốc lá, cuống lá)
- Hoa (kiểu cụm hoa, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình dạng, kích thước, liền/rời), bộ nhụy (số lượng, hình dạng, kích thước, lá noãn), quả, hạt (số lượng, hình dạng, màu sắc),
- Làm mẫu tiêu bản: Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô và lưu giữ tiêu bản tại Phòng tiêu bản – Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu
Giám định tên khoa học: Tên khoa học được xác định bằng phương pháp so sánh hình thái đối chiếu với khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong và ngoài nước
Vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 2 hoặc 3 tinh từ đoạn ngọn, Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí 1/2 - 1/3 dưới gần gốc của lá trưởng thành Các lát cắt
17 mỏng được tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép và lên tiêu bản vi phẫu Sau đó quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi
2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học
2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính bằng phản ứng hoá học Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ : anthranoid, glycosid tim, alcaloid, flavonoid, saponin, coumarin, taninm acid amin, steroid, triterpenoid, polysaccharid, chất béo, đường khử, acid amin, Carotenoid có trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [2]
2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên liệu: mẫu thân cây Sakhan được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 55°C, xay nhỏ, bảo quản trong túi zip nơi khô ráo
Dung dịch thử: Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, làm ẩm bằng MeOH, sau đó ngâm trong 10mL MeOH, bề mặt dung môi cách bề mặt dược liệu khoảng 1cm Sau 24h, siêu âm 30 phút rút lấy dịch chiết (dung dịch A)
❖ Định tính sơ bộ thành phần hoá học
Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 o C trong 30 phút Kích thước bản mỏng 2,5 x 7 cm
- Khảo sát hệ sắc ký với một số hệ dung môi sau:
+ Hệ 1: Cloroform: ethyl acetat: acid formic (7 : 3 : 0,5 v/v)
+ Hệ 2: Ethyl acetat: acid formic : nước (8 : 1 : 1 v/v)
+ Hệ 4: Toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v)
Triển khai sắc ký: Đưa bản mỏng đã chấm mẫu và làm khô vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển lấy bản mỏng ra và sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Phát hiện vết: Hiện vết bằng cách phun thuốc thử hiện màu Dragendroff rồi sấy ở 110°C trong 15 phút đến khi hiện màu, soi đèn từ ngoại ở các bước sóng 254nm và 366 nm trước và sau khi phun thuốc thử
❖ Định tính piperin bằng sắc ký lớp mỏng
Dung dịch đối chiếu: Hòa tan piperin chuẩn trong MeOH để được dung dịch có chứa 1mg/mL
Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 o C trong 30 phút Kích thước bản móng 3,5 x 6,5 cm
- Hệ dung môi pha động: Hệ 4: Toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) [24] Triển khai sắc ký: Đưa bản móng đã chẩm mẫu và làm khô vào bình sắc ký đã bảo hòa dung môi, đậy kín để yên, quan sát quá trình tách vết đến khi vết dung môi cách mép trên của bàn mỏng 1cm thì kết thúc quá trình Đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt Quan sát dưới ánh sáng từ ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm
Phát hiện vết: Hiện vết bằng thuốc thử Dragendroff Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu cam có cùng giá trị Rf, với vết piperin
2.3.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu bằng phương pháp sắc ký kết hợp khối phổ
Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí sẽ được detector khối phổ nhận biết Hiện nay , phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính ( dựa vào thời gian lưu ) hay định lượng (dựa vào chiều cao hay diện tích peak) tinh dầu
Phân tích thành phần tinh dầu được thực hiện bằng hệ thống GC In tuvo 9000 kết nối với khối phổ MSD 5977B (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), sử dụng cột mao quản tráng sẵn silica nung núng HP-5MS khụng phõn cực (30m x 0,25 mm x 0,25 àm) Chương trỡnh nhiệt độ được đặt từ 50°C giữ trong 3 phút, sau đó tăng lên đến 280°C (với tốc độ 5°C/ phút) Nhiệt độ inlet là 150°C Khí mang Heli, tốc độ khí mang 1ml/phút Tinh dầu được pha loóng với dung mụi cloroform, thể tớch tiờm mẫu1àL, chế độ chia dũng 50 : 1 Năng lượng ion hóa là 70 eV với phạm vi quét từ 45-450 amu Phổ được so sánh với thư viện Wiley, Flavor và Nist để phân tích kết quả
- Pha loãng tinh dầu cất được (tinh dầu được cất theo phương pháp lôi cuốn hơi nước) bằng dung môi cloroform đến nồng độ 1x10 -3 (v/v) Cho vào lọ vial
- Khởi động hệ thống sắc ký khí
Xác định các thành phần trong tinh dầu dựa trên nguyên lý so sánh độ trùng lặp về phổ khối của các chất sẵn có trong thư viện Thêm vào đó, giá trị RI được so sánh với các dữ liệu trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố Giá trị RI được tính theo thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các alkan trong dãy đồng đẳng alkan từ C8 đến C20 tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký Công thức tính RI :
RI : Chỉ số lưu giữ
RT(x) : Thời gian lưu của chất phân tích
RT(n) : Thời gian lưu của alkan liên trước pic phân tích
RT(n+1) : Thời gian lưu của alkan liên trước pic phân tích n : Số nguyên tử carbon của alkan liên trước pic phân tích
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
Cây thảo, leo lâu năm, thân gỗ, phần gốc mọc bò, cây có thể dài tới 2 đến 10 m Tiết diện thân hình tròn, có đường kính từ 1 - 4cm, bề mặt thân không nhẵn, vỏ thân ngoài khi non có màu xanh và khi già có màu nâu xám, thịt vỏ có màu hơi vàng hoặc nâu xám, có mùi thơm (A-C)
Ghi chú: (A) Cây Sakhan, (B) Thân cây khi già, (C) Bề mặt của thân già
Hình 3.1 Hình thái và dạng sống cây Sa khan
Lámọc cách, phiến lá nguyên đơn hình bầu dục hoặc hình trứng, rộng 4-10 cm, dài
2 - 24 cm, đầu phiến lá thuôn nhọn, gốc cong, hình nêm hoặc lõm vào thành hình tim, mặt trên nhẵn, có màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu lục nhạt, có lông thưa trắng và có mùi thơm Gân lá hình cung nổi rõ 2 mặt, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên, có 3 cặp gân phụ cong hình cung: cặp thứ nhất xuất phát từ đáy, cách bìa phiến 0,2-0,5 cm, không rõ, chạy dọc theo rìa phiến lá khoảng 2/3 chiều dài phiến; cặp thứ 2 rõ hơn xuất phát cùng vị trí cặp gân phụ thứ nhất cỏch bỡa phiến 1-1,5 cm, chạy đến tận gốc lỏ; cặp thứ 3 xuất phỏt từ ẳ cỏch đỏy gốc lá, tụ lại ở ngọn lá; nhiều gân phụ nằm ngang, nối liền các gân hình cung dạng mạng Có 2 lá kèm dạng vảy màu đen khô xác dài 0,5-0,8 cm, nằm 2 bên đáy gốc lá, rụng sớm Cuống lá màu xanh,có lông, dài 1-2 cm (D-J)
Ghi chú: (D) Cành và cách mọc lá, (E,F) Lá (mặt trên và mặt dưới), (G) Gân lá, (H).Cuống lá, (I) Cách phân nhánh ở thân, (J) Thân cây (K) Lá kèm
Hình 3.2 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng Cụm quả hình trụ, uốn cong, rủ xuống, rộng 1,0-1,2 cm, dài 10,5-17 cm, cuống dài
1-4 cm Quả mọng, hình cầu, đường kính cỡ 0,4 cm, quả sống có màu xanh và khi quả chín có màu cam hoặc đỏ, mỗi quả có 1 hạt Hạt gần hình cầu, màu vàng nâu, đường kính cỡ 2-
3 mm, Quả khô màu nâu đen, vỏ quả nhăn nhúm (K-Q) Mùa quả: tháng 6-8
Ghi chú: (L) Cụm quả non, (M, ) Cụm quả
Hình 3.3 Đặc điểm cơ quan sinh sản (quả)
Sau khi đối chiếu với các tài liệu tham khảo, so sánh với các mẫu tiêu bản thế giới tại phòng tiêu bản Royal Botanic Gardens, Kew (số hiệu DV-070524) và tham vấn chuyên
22 gia thực vật đã giám định mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Piper wallichii (Miq.) Hand.- Mazz, họ Hồ tiêu (Piperaceae)
Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz Mẫu nghiên cứu cây Sakhan
Hình 3.4 Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz và Mẫu nghiên cứu cây Sakhan
Tiến hành làm vi phẫu thân và lá theo mục lục 2.3.1 kết quả thu được như sau:
3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân
Thân hình gần tròn, mặt cắt vi phẫu đối xứng Từ ngoài vào trong, gồm Bần (1) gồm các tế bào hình chữ nhật vách dày hoá cutin, xếp sát nhau thành 1 hàng, bắt màu xanh của thuốc nhuộm Dưới lớp bần là Mô dày (2) gồm 8 – 10 lớp tế bào, thành tế bào có vách dày đều xung quanh, các tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng đều đặn, bắt màu hồng đậm, có sợi Mô cứng (3) vách dày hay rất dày rải rác trong lớp mô dày Mô mềm vỏ (4) gồm các tế bào thành mỏng, gần tròn, kích thước không đều, tế bào phía trong to hơn phía ngoài và sắp xếp lộn xộn Ngăn cách mô mềm vỏ (4) và mô mềm tủy (10) là vòng tế bào mô cứng (8) gồm 4 – 6 lớp tế bào có vách dày, hình đa giác, hóa gỗ, đầu tiên xuất hiện những tế bào riêng lẻ, rồi dần dần phát triển thành một vòng tế bào mô cứng rõ rệt bắt màu xanh Hệ thống mạch dẫn xếp trên 2 vòng Bó mạch vòng ngoài (7) nằm ở chỗ lõm của vòng mô cứng có khoảng 3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, hóa mô cứng thành cụm
23 trên các bó libe - gỗ, bó mạch vòng trong (11) gồm các bó libe - gỗ nằm ở phần mô mềm tủy, xếp thành vòng trong có từ 6 - 10 bó libe - gỗ Bó dẫn của thân dạng chồng chất, mô libe (5) nằm ngoài, mô gỗ (6) nằm trong, ở giữa là tượng tầng hay còn gọi là tầng phát sinh
Mô mềm tủy (10) gồm 12-14 lớp tế bào vách mỏng, gần tròn, kích thước không đều và to hơn tế bào mô mềm vỏ Có tế bào tiết (9) và hạt tinh bột (12) rải rác trong vùng mô mềm vỏ và mô mềm tủy Mô khuyết (13) nằm chính giữa của thân
Ghi chú: (1) Bần, (2) Mô dày, (3) Mô cứng, (4) Mô mềm vỏ, (5) Libe, (6) Gỗ, (7, 11)
Bó mạch, (8) Vòng tế bào mô cứng, (9) Tế bào tiết, (10) Mô mềm tủy, (12) Hạt tinh bột,
Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân của mẫu nghiên cứu
3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá
Gân lá: Đi từ trên xuống dưới, gân lá lồi tròn ở cả 2 mặt, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên Trong vi phẫu gân lá gồm các bộ phận: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (8) có 1 lớp tế bào hình bầu dục hay hình chữ nhật xếp thành một hàng đều đặn, sát nhau, lớp cutin dày và trên biểu bì dưới có nhiều lông dạng đơn bào (9) Mô dày trên (2) gồm 6 – 8 lớp tế bào
24 vách dày, hình đa giác, sắp xếp sát nhau, bắt màu hồng đậm Mô mềm (6) chiếm phần lớn diện tích thiết diện gân chính, gồm các tế bào hình đa giác kích thước không đều nhau có thành tế bào mỏng, sắp xếp lộn xộn và sát nhau Có một vòng tế bào cứng (5) xếp liên tục bao quanh bó libe – gỗ, bắt màu xanh đậm Bó libe – gỗ tạo thành vòng cung lớn ở giữa gân lá, hướng về phía biểu bì trên Gỗ (3) gồm các mạch gỗ hình đa giác, không đều, xếp lộn xộn, bắt màu xanh Libe (4) ở dưới bao lấy bó gỗ ở trên, bắt màu hồng nhạt Mô dày dưới (7) gồm 4 – 5 lớp tế bào có hình dạng và có màu giống mô dày trên
Phiến lá: Dưới lớp biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (8) là 2 lớp tế bào hạ bì Hạ bì trên
(10) gồm 2 dãy tế bào to hơn, hạ bì dưới (12) gồm 2 dãy tế bào nhỏ hơn Dưới hạ bì có một hàng tế bào mô giậu (11) hình chữ nhật thuôn dài, xếp khít nhau và thẳng góc với biểu bì trên Các đặc điểm lá được mô tả trong Hình 3.5
Ghi chú: (1) Biểu bì trên, (2) Mô dày trên, (3) Gỗ, (4) Libe, (5) Mô cứng, (6) Mô mềm, (7) Mô dày dưới, (8) Biểu bì dưới, (9) Lông che chở, (10) Hạ bì trên, (11) Mô giậu, (12) Hạ bì dưới
Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu lá của mẫu nghiên cứu
3.1.3 Đặc điểm bột của mẫu nghiên cứu
3.1.3.1 Đặc điểm của bột thân
Bột thân có màu xanh nâu, mùi hắc, vị cay Soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau: mảnh bần (1) các tế bào vách dày, sắp xếp lần lượt thành hàng xen kẽ nhau Mảnh mạch xoắn (2) Nhiều sợi dài, hẹp, vách dày tạo thành bó sợi (3) Có tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (4) Mảnh biểu bì thân (5) có màu nâu Tế bào mô cứng (6) hình đa giác Có mảnh mô mềm (7) tế bào hình gần tròn hay đa giác, vách mỏng lộn xộn Mảnh mạch vạch (8), mảnh mạch vòng (9)
Ghi chú: (1) Mảnh bần; (2) Mảnh mạch xoắn; (3) Bó sợi; (4) Tinh thể canxi oxalat; (5) Mảnh biểu bì thân; (6) Tế bào mô cứng; (7) Mảnh mô mềm; (8) Mảnh mạch vạch;
Hình 3.7 Đặc điểm bột thân của mẫu nghiên cứu
3.1.3.2 Đặc điểm của bột lá
Bột lá màu lục xám, mùi hắc, vị cay Soi kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì trên (1) của lá tế bào có vách mỏng, hình đa giác, mảnh biểu bì dưới (2) của lá tế bào có vách hơi uốn lượn, có nhiều lỗ khí (3) kiểu song bào, có mảnh mạch xoắn (4), hạt phấn (5) có dạng hình tròn Lông che chở nhiều, đầu tù, đơn bào (7) hay đa bào với 2 tế bào (6) Bó sợi (8), tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (9), hạt tinh bột (10) của lá nằm riêng lẻ hay tập trung từng thành đám Mảnh mô mềm (11) tế bào hình chữ nhật hay đa giác, vách mỏng Có mảnh mạch vạch (12), mảnh mạch vòng (13)
Ghi chú: (1) Mảnh biểu bì trên; (2) Mảnh biểu mang lỗ khí; (3) Lỗ khí; (4) Mảnh mạch xoắn; (5) Hạt phấn; (6,7) Lông che chở; (8) Bó sợi;(9) Tinh thể canxi oxalat; (10) Hạt tinh bột; (11) Mảnh mô mềm; (12) Mảnh mạch vạch; (13) Mảnh mạch vòng
Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học
3.2.1 Kết quả định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học
Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy bộ phận thân của cây Sakhan có các phản ứng dương tính với các nhóm alcaloid, flavonoid, saponin, tannin, acid amin, acid hữu cơ, carotenoid, tinh dầu steroid và terpenoid Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ thân cây Sakhan bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ Nhóm chất Phản ứng định tính Hình ảnh Kết quả Kết luận
Phản ứng Borntrager Ống thử không không xuất hiện tủa màu đỏ (-)
Không thấy tinh thể hình kim màu vàng (-)
Phản ứng Baljet Ống thử không có tủa màu đỏ cam
Không có Phản ứng Liberman Ống thử không có lớp màu hồng (-)
Phản ứng Legal Ống thử không xuất hiện màu đỏ cam (-)
Phản ứng Keller- Kiliani Ống thử không xuất hiện vòng màu tím đỏ (-)
Phản ứng với thuốc thử Mayer Ống thử xuất hiện tủa màu trắng (+)
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff Ống thử xuất hiện tủa màu cam (+)
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat Ống thử xuất hiện tủa màu đỏ (+)
Dung dịch ống thử có màu đỏ (+)
Có Phản ứng với kiềm
Dung dịch ống thử có màu vàng tăng lên (+)
5% ống thử xuất hiện tủa màu xanh đen
Phản ứng mở, đóng vòng lacton Ống số 1 không đục như ống số 2
Không có Phản ứng Diazo hóa Ống thử không xuất hiện tủa màu đỏ gạch (-)
Saponin Phản ứng tạo bọt Ống thử tạo bọt bền hơn 15 phút
Tanin Phản ứng với thuốc thử FeCl3 5% Ống thử xuất hiện tủa màu đen (+)
1% Ống thử xuất hiện tủa bông
Phản ứng với thuốc thử đồng acetat 10% Ống thử xuất hiện tủa bông trắng (+)
Acid hữu cơ Phản ứng với
Na2CO3 Ống thử có bọt khí bay lên (+)
Acid amin Phản ứng với ninhydrin Ống thử xuất hiện màu tím
Carotenoid Phản ứng với acid sulfuric đặc Ống thử xuất hiện tủa màu đen (+)
Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol Ông số một có màu tương tự như ông
Chất béo Tạo vết mờ trên giấy lọc
Không có vết mờ trên giấy lọc (-)
Tinh dầu Có mùi thơm đặc trưng
Có mùi thơm đặc trưng của tinh dầu
Phản ứng với thuốc thử Fehling Ống thử không xuất hiện tủa màu đỏ (-)
Lieberman-Burchard Ống thử xuất hiện màu xanh lục (+)
Ghi chú (-): Phản ứng âm tính, (+):Phản ứng dương tính
3.2.2 Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng
3.2.2.1 Định tính sơ bộ dịch chiết toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng
Sau khi triển khai với các hệ dung môi đã trình bày ở mục 2.3.2 kết quả cho thấy hệ dung môi hệ 4: Toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) cho sắc ký đồ của dịch chiết MeOH của thân cây Sakhan tách được nhiều vết, các vết gọn và rõ nét Hình ảnh sắc ký đồ được trình bày trong hình
Sắc ký đồ dịch chiết MeOH từ thân của cây Sakhan sau khi triển khai với điều kiện sắc ký trên ở 254 nm, 365 nm, ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu là Dragendroff thu được ít nhất 14 vết với các Rf tương tự là 0,03; 0,05; 0,14; 0,15; 0,18; 0,25; 0,28; 0,35; 0,45; 0,46; 0,58, 0,59; 0,63 và 0,78 với màu sắc tương ứng được trình bày trong bảng 3.2
31 (A) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở bước song 254nm
(B) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở bước song 365nm
(C) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở ánh sáng trắng Sau khi hiện màu bằng thuốc thử
Hình ảnh 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần tử thân cây Sakhan
Bảng 3.2 Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần thân cây Sakhan
UV 254nm UV 365nm Ánh sáng trắng Sau khi hiện màu bằng thuốc thử
Ghi chú (-): Không vết, (+): Vết mờ, (++): Vết đậm
3.2.2.2 Định tính piperin trong cây Sakhan bằng sắc ký lớp mỏng
Qua tham khảo một số nghiên cứu về điều kiện sắc lý lớp mỏng đối với chất đối chiếu và khảo sát một số pha động tham khảo được nhận thấy hệ dung môi toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) cho kết quả tách trên sắc ký đồ tốt Soi vết từ ánh sáng tử ngoại
254 nm, 365nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử Dragendroff
Trên sắc ký đồ, ở ánh sáng từ ngoại 254 nm, dung dịch đối chiếu piperin cho 1 vết đen, ở bước sóng 365 nm cho 1 vết màu xanh đen và có màu cam sau khi hiện vết bằng thuốc thử Dragendroff với giá trị Rơ là 0,64 Dung dịch thử cũng cho 1 vết tách có màu sắc và Rf trùng với vết đối chiếu piperin Như vậy có thể sơ bộ kết luận trong thành phần dịch chiết MeOH của Sa khan có piperin
(1) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở bước song 254nm
(2) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở bước song 365nm
(3) Sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu ở ánh sáng trắng Sau khi hiện màu bằng thuốc thử (C) Dung dịch chất đối chiếu piperin
Hình ảnh 3.9 Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần tử thân cây Sa khan với chất piperin đối
Bảng 3.3 Sắc ký đồ của chất đối chiếu và dịch chiết toàn phần thân cây Sakhan
254 nm 365 nm Ánh sáng trắng
Sau khi hiện màu bằng tt
Ghi chú (-): Không vết, (+): Vết mờ, (++): Vết đậm, (C): Chất đối chiếu, (T): Thử
3.2.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu thân loài Piper wallichii (Miq.) Hand.-Mazz bằng GC-MS
Tinh dầu được triển khai sắc ký khí kết hợp khối phổ Sắc ký đồ tinh dầu của thân mẫu nghiên cứu ở phụ lục 3 Thành phần hóa học với thời gian lưu (phút) và hàm lượng
34 (%) của tinh dầu trong bộ phần thân của cây Piper wallichii (Miq.) Hand.-Mazz được trình bày như trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả phân tích thành phần trong tinh dầu thân cây Sakhan
STT RT RI cal RI lib Thành phần Phân loại Area %
Nhận xét : Theo kết quả bảng phân tích, tinh dầu cất từ thân cây Sakhan đã xác định được ít nhất 25 cấu tử, chiếm khoảng 90,51% hàm lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu Các cấu tử được phân vào 4 nhóm chính: monoterpen (5,6%), monoterpenoid (0,5%), sesquiterpen (68,80%), sesquiterpenoid (6,23%), phenylpropanoid (6,21%) và các nhóm không xác định được (3,17%) Trong đó, nhóm chất sesquiterpen chiếm chủ yếu với 68,80% toàn lượng tính đầu phân tích
Thành phần chiếm hàm lượng cao nhất là : (E)-β-caryophyllen 40,35% tiếp theo là các hàm lượng nhỏ hơn như iso-caryophyllen (7,90%), sarisan (6,21%), limonen (5,36%), β-bisabolen (5%), α-humulen (3,44%), β-selinen (2,80%), (E)-γ-bisabolen (5,54%), caryophyllen oxid (2,11%) Ngoài ra, còn một số hợp chất với hàm lượng nhỏ hơn nữa bao
36 gồm Ar-curcumen (1,57%), α-selinen (1,55%), δ-cadinen (1,44%), β-farnesen (E) (1,40%), nerolidol (1,32%), 1-epi-cubenol (1,81%), α-muurolol (0,75%), δ-cadinol (0,65%), linalool (0,5%), (E,E)-α-farnesen (0,44%), α-calacoren (0,37%), spathulenol (0,25%), camphen (0,24%), caryophyllenyl alcohol (0,17%) và 6-epi-cubenol (0,17%)
Thời gian lưu của các hợp chất với hàm lượng lớn trong tinh đấu tập trung ở giữa quá trình phân tích, khoảng từ phút 25-33.
Bàn luận
3.3.1 Về đặc điểm thực vật
3.3.1.1 Về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học Đối với mẫu nghiên cứu cây Sakhan: nhóm nghiên cứu chỉ thu hái được cơ quan sinh dưỡng (thân và lá)và thu được bộ phận quả, không thu được bộ phận hoa Vì vậy, vấn đề quan trọng đầu tiên của đề tài là giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu Các đặc điểm hình thái của cây được phân tích, so sánh với các đặc điểm được mô tả trong khóa phân loại chi Piper L của Yung Chien Tseng (1999)và so sánh với tài liệu “A synopsis of Thai Piper (Piperaceae) của Suwanphakdee C” Qua phân tích, nhóm nghiên cứu đã giám định mẫu cây nghiên cứu có tên khoa học là Piper wallichii (Miq.) Hand.-Mazz.thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) Dựa vào đặc điểm thực vật ta có thể phân biệt được loài này so với các loài khác trong chi với một số đặc điểm nổi bật như: Đặc điểm Mẫu cây Sakhan
(Miq.) Hand.-Mazz trong khóa phân loại của Yung Chien Tseng [42]
(Miq.) Hand.-Mazz trong khóa phân loại của Suwanphakdee [41]
Dạng sống Cây leo Cây leo, cây đơn tính Cây leo, cây đơn tính Thân Thân gỗ, bề mặt thân không nhẵn, vỏ thân ngoài khi non có màu xanh và khi già có màu nâu xám
Thân già có màu nâu đen, không nhẵn, có lông
Cây thân gỗ Thân non có màu xanh và khi già có màu nâu xám, không nhẵn
Lá Đặc điểm Lá đơn, mọc cách, phiến lá nguyên đơn hình bầu dục hoặc hình trứng, rộng 4-10
Lá đơn; mọc cách; phiến lá hình trứng, hình mũi mác hoặc hình elip hẹp; mỏng;
Lá đơn, mọc cách, Phiến lá nhẵn, mép lá nguyên, đầu, nhọn,
37 cm, dài 2 - 24 cm, mép lá nguyên, đầu phiến lá thuôn nhọn, gốc cong, hình nêm hoặc lõm vào thành hình tim, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông thưa trắng gốc lá hình tim, đầu, nhọn; phiến lá mặt dưới có lông mịn gốc hình tim, mặt dưới có lông mịn
Kích thước 13-25 x 5-12 cm 5-14 x 4-10 cm 12-25 x 4-12 cm Màu sắc Mặt trên có màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu lục nhạt
Mặt trên có màu xanh lục đậm, mặt dưới màu lục nhạt
Mặt trên có màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu lục nhạt
Gân lá 3 cặp gân 5-7 gân 2-3 cặp gân
Cuống lá 1-2 cm, có lông 1-2 cm, có lông 0,8-1,9 cm, có lông
Cụm quả hình trụ, uốn cong, rủ xuống, rộng 1,0-1,2 cm, dài 10,5-17 cm, cuống dài 1-4 cm Quả mọng, hình cầu, quả sống có màu xanh và khi quả chín có màu cam hoặc đỏ, mỗi quả có 1 hạt Hạt gần hình cầu, màu vàng nâu
Cụm quả thuôn dài, cuống dài 2-4,2 cm, có lông, Quả hình cầu, kích thước 3 mm, có 1 hạt
Cụm quả thuôn dài, 0,9-1,7 cm x 6-25 cm,trục quả có lông mịn, Quả hình cầu, kích thước 2-5 mm, không có cuống, khi chín có màu cam hoặc đỏ; khi khô màu nâu đen, vỏ quả nhăn nhúm
3.3.1.2 Về đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột thân, lá
Việc nghiên cứu để mô tả đặc điểm vi phẫu, mô tả đặc điểm bột của thân và lá của cây Sakhan đã giúp hoàn thiện cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật của cây, đồng thời góp phần nhận thức, phân biệt và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này.
3.3.2 Về thành phần hoá học
Khoá luận đã tập trung nghiên cứu thành phần hoá học của thân cây vì đây là bộ phần được người dân Lào sử dụng chủ yếu với nhiều công dụng như kích thích tiêu hóa, giảm đau, lỵ, lở loét dạ dày, giun, ký sinh trùng và tăng trí nhớ, … [37]
3.3.2.1 Về định tính các nhóm chất trong thân cây Sa khan bằng phản ứng hóa học
38 Dựa trên các tài liệu tham khảo và bài giảng dược liệu, khoá luận đã tiến hành định tính bằng các phản ứng hoá học các nhóm glycosid tim, coumarin, alcaloid, flavonoid, coumarin, saponin, tanin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, tinh dầu Các nhóm chất: alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, acid amin, acid hữu cơ, carotenoid, tinh dầu và sterol cho phản ứng dương tính thấy rõ, do đó có thể kết luận những nhóm chất này có trong cây với độ tin cậy khá cao.Tuy nhiên với nhóm chất coumarin, có những nghiên cứu cho rằng trong thân cây Piper wallichii có nhóm chất coumarin nhưng khi thực hiện các phản ứng định tính của nhóm chất này thì cho kết quả âm tính Sự sai khác có thể do lượng coumarin trong cây quá ít nên không đủ lượng chất làm phản ứng dương tính
3.3.2.2 Định tính thành phần hoá học bằng SKLM
Thử nghiệm định tính sơ bộ thành phần hoá học trong dịch chiết toàn phần MeOH thân cây Sakhan bằng SKLM cho thấy mặc dù đã khảo sát nhiều hệ dung môi và chọn ra hệ dung môi tốt nhất là toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) nhưng các vết vẫn chưa được tách rõ Qua tổng quan tài liệu cho thấy thành phần hoá học củacây Sakhan khá phức tạp gồm nhiều nhóm chất, đặc biệt là nhóm alcaloid có nhiều khung cấu trúc tương tự nhau nên phương pháp sắc ký lớp mỏng khó tách rõ các vết (có thể quan sát trên sắc ký đồ của dịch chiết toàn phần của thân cây Sakhan cho thấy có 2 vết màu cam có vị trí rất gần nhau Rf = 0,64 và 0,65) Do đó để có thể sơ bộ xác định các hợp chất trong Sakhan, đề xuất sử dụng phương pháp xây dựng vân tay sắc ký bằng kỹ thuật HPLC
Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thành phần hoá học của các loài trong chi Piper
L cho thấy poperin được xem là một trong các marker để phân biệt giữa các loài khác, piperin có nhiều tác dụng sinh học quan trọng đã được chứng minh và được sử dụng làm chất chuẩn để đánh giá chất lượng một số loài trong chi Piper Lnhư Piper nigrum, Piper cubeba, … Do đó, nghiên cứu đã tiến hành định tính chất piperin này trong thân của cây
Sakhan bằng kỹ thuật SKLM Kết quả sau khi triển khai sắc ký mẫu thử trong cùng điều kiện với mẫu đối chiếu piperin và phân tích sắc ký đồ thu được tại các bước sóng khác nhau, so sánh Rf chất đối chiếu, có thể sơ bộ xác định trong sắc ký đồ dịch chiết thân của cây Sakhan có các vết rõ ràng, có cùng Rf, màu sắc với piperin Tuy nhiên để có thể khẳng định chắc chắn, có thể sử dụng thêm kỹ thuật HPLC và đối chiếu phổ UV của mẫu thử và chất đối chiếu piperin Đây là những gợi ý quan trọng về thành phần có hoạt tính từ đó gợi
39 những hướng nghiên cứu sâu về tác dụng sinh học cần nghiên cứu cũng như kiểm soát chất lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu
3.3.2.3 Về thành phần hóa học tinh dầu
Về thành phần hóa học tinh dầu qua tổng hợp tài liệu, mới chỉ có trên 100 loài trong số hơn 2.000 loài thuộc chi Piper L được nghiên cứu về thành phần hóa học Theo các tài liệu đã công bố, tinhdầu là thành phần điển hình của họ Hồ tiêu (Piperaceae) nói chung và chi Piper L nói riêng Số lượng chất được công bố cho nhóm tinh dầu là 112 Trong số trên
100 loài đã được nghiên cứu, Piper nigrum L là loài được nghiên cứu nhiều nhất Kết quả đã phân lập được 51 tỉnh dầu, 40 alcaloid, 8 flavonoid, 4 alkanpolyenylbenzen từ loài này [25]
Trongđề tài này đã tiến hành nghiên cứu tinh dầutrong thân của loài Piper wallichii, kết quả cho thấy Trong tinh dầu thân của loài Piper wallichii được đặc trưng bởi các sesquitecpen (75,03%); trong đó các sesquitecpen hydrocacbon chiếm 68,80% các sesquitecpen chứa oxy chiếm 6,23%, các thành phần khác chiếm tỷ lệ không đáng kể Đã xác định được 24 hợp chất chiếm 90,51% tổng lượng tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là (E)-β-caryophyllen 40,35%, iso-caryophyllen (7,90%), sarisan (6,21%), limonen (5,36%), β-bisabolen (5%), α-humulen (3,44%), β-selinen (2,80%), (E)-γ- bisabolen (5,54%), caryophyllen oxid (2,11%), … Nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh các hợp chất tinh dầu đã nêu trên đều có tác dụng sinh học đáng chú ý như có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, giảm đau, chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh và tăng trí nhớ [5], trong đó hợp chất (E)-β-caryophyllen chiếm tỷ lệ cao nhất trong tình đầu của thân Sakhan Có nghiên cứu đã cho thấy (E)-β-caryophyllen là tiền chất để tổng hợp thuốc hóa trị paclitaxel có tác dụng gây độc tế bào ung thư của con người theo quá trình apoptosis [32] Ngoài ra, có một số nghiên cứu tiến hành thử nghiệm trên loài giun
Caenorhabditis elegans về nghiên cứu sự lão hóa và tuổi thọ, kết quả đã chứng minh hợp chất (E)-β-caryophyllen có tác động lên các gen liên quan đến giảm căng thẳng và kéo dài tuổi thọ của sinh vật [19] Trong đề tài này đã góp phần trong nghiên cứu thành phần tinh dầu của loài Piper wallichii