aoyma phimkeo nghiên cứu đặc điểm thực vật và định tính thành phần hóa học của cây sakhan thu hái tại lào

HÓA HỌC CỦA CÂY SAKHAN

THU HÁI TẠI LÀO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Aoyma PHIMKEO MÃ SINH VIÊN: 1901536

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA CÂY SAKHAN

THU HÁI TẠI LÀO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này, em đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè

Đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, thầy

là người định hướng đề tài khóa luận này cho em, là người thấy tiềm năngcủa em để thực hiện đề tài này

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Hồng Cường

Người thầy đã dành cho em sự giúp đỡ quý báu Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo, các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Dược học cổ truyền cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ trong trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Hà Nội, Ngày 03 tháng 06 năm 2024 Sinh viên

Aoyma PHIMKEO

i

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Piper L 2

1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Piper L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Piper L 3

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học của chi Piper L 4

1.3 Các nghiên cứu định tính các hợp chất trong chi Piper L 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 16

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 16

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 20

3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 20

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 22

3.1.3 Đặc điểm bột của mẫu nghiên cứu 25

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học 26

3.2.1 Kết quả định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học 26

3.2.2 Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng 30

PHỤ LỤC

MeOH : Methanol NIR : Quang phổ cận hồng ngoại

STT : Số thứ tự TLC : Sắc ký lớp mỏng UHPLC/MS : Sắc ký lỏng siêu cao ápkhối phổ v/v : Thể tích/thể tích

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố của các loài thuộc chi Piper L tại Lào Trang 4 Bảng 1.2 Các phương pháp định tính của một số loài thuộc chi Piper L Trang 10 Bảng 1.3 Các hợp chất được gặp trong loài Piper wallichii Trang 13 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ Trang 26 Bảng 3.2 Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần thân cây Sakhan Trang 31 Bảng 3.3 Sắc ký đồ của chất đối chiếu và dịch chiết toàn phần thân cây Sakhan Trang 33 Bảng 3.4 Kết quả phân tích thành phần trong tinh dầu thân cây Sakhan Trang 34

v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của các nhóm alcaloid phân lập từ chi Piper Trang 4 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của các nhóm tinh dầu phân lập từ chi Piper Trang 5 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các nhóm flavonoid phân lập từ chi Piper Trang 6 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các nhóm lignan phân lập từ chi Piper Trang 6 Hình 3.1 Hình thái và dạng sống cây Sakhan Trang 20

Hình 3.3 Đặc điểm cơ quan sinh sản (quả) Trang 21 Hình 3.4 Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz và Mẫu nghiên cứu cây Sakhan Trang 22 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân của mẫu nghiên cứu Trang 23 Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu lá của mẫu nghiên cứu Trang 24 Hình 3.7 Đặc điểm bột thân của mẫu nghiên cứu Trang 25 Hình 3.8 Đặc điểm bột lá của mẫu nghiên cứu Trang 26 Hình 3.9 Sắc ký đồ dịch chiết toàn phần tử thân cây Sakhan Trang 32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sakhan (Piper wallichii (Miq.) Hand - Mazz.) từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ

truyền Trung Hoa có tác dụng ôn trung tán hàn, hạ khí, chỉ thống [40] Những nghiên cứu trước đây cho thấy thành phần hóa học có hoạt tính đặc trưng của dược liệu này là alcaloid với tác dụng đáng chú ý [21], [27], [24] Cùng với alcaloid, thành phần tinh dầu cũng đã

được nghiên cứu từ lâu trong chi Piper L với hàng chục hợp chất tinh dầu được xác định

với nhiều tác dụng quý báu giống như nhóm hợp chất alcaloid Những thành phần tinh dầu này vẫn chưa trở thành chỉ tiêu trong đánh giá chất lượng dược liệu Sakhan Gần đây, nhiều tác giả khoa học trên thế giới đã đề nghị nên đưa nhóm hợp chất tinh dầu trở thành một

trong những chỉ tiêu chất lượng của các dược liệu trong chi Piper L [8], [26]

Tại Lào, Sakhan được trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc của Lào như Luangphabang, Xiengkhouang và Xayaboury Sakhan trong dân gian Lào đã được sử dụng như một dược liệu trong điều trị một số triệu chứng như kích thích tiêu hóa, giảm đau, lỵ, lở loét dạ dày, giun, ký sinh trùng và tăng trí nhớ [37] Tuy nhiên việc nghiên cứu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học về cây Sakhan ở Lào còn khá hạn chế và ngoài ra, trong Dược điển Lào [23] vẫn chưa có chuyên luận về dược liệu Sakhan gây khó khăn cho việc kiểm tra, đánh giá chất lượng nguồn dược liệu Sakhan trong nước cũng như việc xuất nhập khẩu Do vậy, để nâng cao giá trị sử dụng và nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu Sakhan, đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và định tính thành phần hóa học của cây Sakhan thu hái tại Lào” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm vi phẫu và đặc điểm vi học bột của cây Sakhan thu hái tại Lào

2 Định tính thành phần hóa học của thân cây Sakhan thu hái tại Lào bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

3 Phân tích thành phần hóa học tinh dầu của thân cây Sakhan thu hái tại Lào

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Piper L 1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Piper L

1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Piper L

Theo hệ thống phân loại thực vật của 3 tác giả gồm: Hutchinson (1974) [14], của

Cronquist A (1988) [7] và Takhtajan (2009) [11], Chi Piper L có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ Hồ tiêu (Piperales) Họ Hồ tiêu (Piperaceae)

Chi Piper L

1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái

Cây bụi, cây thảo hoặc cây leo Lá đơn, mép nguyên; mọc đối hoặc mọc cách; có thể có hoặc không có lá kèm (rụng sớm để lại sẹo ở mẫu khá rõ) Lá hình mác, hình trứng, hình tim, hình elip Phiến lá có thể mỏng hoặc dày; nhẵn bóng, nhăn nheo hoặc thô ráp; có thể có lông Cụm hoa dạng bông, mọc đối diện với lá hoặc ở nách lá Hoa trần, thường đơn tính (đa số khác gốc, ít khi cùng gốc) hoặc lưỡng tính, không có cuống Lá bắc nhỏ; mọc đối diện với hoa Bộ nhị 2-6, chỉ nhị ngắn; bao phần 2, 2-4 thùy Bộ nhụy có bầu nhụy rời hoặc đôi khi ôm lấy trục, 1 ô, 1 noãn; núm nhụy 2-5 Loại quả hạch, hình trứng, hình cầu hoặc có mặt cắt hình tam giác Mỗi quả có 1 hạt Hạt gần hình cầu, vỏ hạt mỏng; phôi nhỏ, ngoại nhũ dạng bột và cứng [1]

1.1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái chi Piper L

trên 2.000 loài, Chi này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới như Brazil (330 loài), Ecuador (100 loài), … và cận nhiệt đới như Ấn Độ (45 loài), Trung Quốc (60 loài), Thái Lan (38 loài), Việt Nam (44 loài), … gặp nhiều tại các vùng núi hoặc ở tầng cây thấp của các khu rừng ẩm nhưng cũng có thể mọc ở những khoảng đất trống, mọc ven sông suối, ven đường hoặc gần khu dân cư [6], [16]

3

1.1.2 Đặc điểm phân bố chi Piper L tại Lào

Theo tác giả Lee You Mi đã báo cáo có 14 loài thuộc chi Piper L., được gặp ở Lào

[4] và danh lục của các loài này được giới thiệu ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân bố của các loài thuộc chi Piper L tại Lào [4], [20]

STT Tên khoa học Tên Lào Phân bố (tỉnh) Bộ Phận

12 P sylvaticum - Xaisomboun, Xayabouly, -

13 P thomsonii - Bokeo, Phongsaly,

Oudomxay, xayabouly

-

4 14 P wallichii ສະຄ້ານ Luangphabang,

Xiengkhouang

Thân

Ghi chú: (-) Không có thông tin

1.2 Tổng quan về thành phần hóa học của chi Piper L

Trên tổng số hơn 2.000 loài thuộc chi Piper L được nghiên cứu về thành phần hóa

học và có hơn 600 chất được công bố phân lập từ chi này Tùy mục đích của từng nghiên

cứu, những bộ phận của chi Piper L được chọn làm đối tượng nghiên cứu về thành phần

hóa học có thể là thân, lá, rễ, quả hoặc hạt Những hợp chất phân lập được có cấu trúc hóa học rất đa dạng và nằm trong những nhóm chính sau: alcaloid, tinh dầu, flavonoid, propenylbenzen, lignan, neolignan, … [17]

❖ Một số khung cấu trúc hợp chất alcaloid

Qua tham khảo tài liệu, đã thống kê được 280 alcaloid phân lập từ 61 loài thuộc chi

Piper L Dựa vào công thức cấu tạo, alcaloid đã được công bố có thể được chia thành 6

nhóm [28] Các cấu trúc alcaloid được trình bày như hình 1.1

(A) Khung piperidin; (B) Khung Δ3-piperidin-2-on; (C) Khung pyrrolidin (D) Khung không có dị vòng nitơ; (E) Khung aporphin; (F) Khung piperolactam

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của các nhóm alcaloid phân lập từ chi Piper L

❖ Một số khung cấu trúc hợp chất tinh dầu

Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của chi Piper L và được thể hiện ở mùi thơm đặc trưng của các cây trong chi Hai bộ phận của các loài thuộc chi Piper L được nghiên

5 cứu nhiều về thành phần tinh dầu là lá và quả Đây cũng là hai bộ phận chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất trong cây Qua thu thập tài liệu cho thấy thành phần tinh dầu chiết xuất

từ 30 loài thuộc chi Piper L gồm có 112 cấu tử Hầu hết các cấu tử này đều có cấu tạo

monoterpen (53 chất) hoặc sesquiterpen (57 chất), chỉ 2 cấu tử tinh dầu có cấu tạo diterpen [12], [18] Những hợp chất monoterpen và sesquiterpen này rất phong phú về cấu tạo hóa học và trong công thức cấu tạo của chúng có thể có hoặc không có nguyên tử oxy Với những hợp chất có oxy trong công thức cấu tạo, nguyên tử này thường nằm trong nhóm chức hydroxy, ether hoặc ceton Ngược lại, mới chỉ có một hợp chất trong công thức cấu tạo có nhóm chức este được báo cáo, đó là chất α-terpineol acetat được chiết xuất từ lá của

loài P betle L và chưa thấy có hợp chất nào có nhóm chức aldehyd [20] Trong chi này

(A) khung 1-isopropyl-4-methylcyclohexane như γ-terpinen, α-pinen,…; (B) khung Decahydro-1, 4, 6-trimethyl-naphthalen như cubenol, … và (C) khung decahydro-1,4,7 - trimethylazulen như β-guaien, guaiol, … Các khung cấu tạo điển hình của các cấu tử tinh

dầu phân lập được từ chi Piper L được thể hiện ở hình 1.2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của các nhóm tinh dầu phân lập từ chi Piper L

❖ Một số khung cấu trúc hợp hợp chất flavonoid

Từ một số loài thuộc chi Piper L., đã có 61 hợp chất flavonoid được phân lập và công

bố Hầu hết những hợp chất này đều thuộc nhóm euflavonoid và nằm trong 4 phân nhóm gồm: (A) khung chalcon hoặc (B) khung dihydrochalcon có 16 hợp chất như adunctin A-E, flavokawain A-C,…; (C) khung flavanon có 7 hợp chất như 5,7-Dihydroxyffavanone, 6-Hydroxy-5,7-dimethoxytlavanon,… và (D) flavon có 7 hợp chất như kaempferol, quercetin, vitexin, velutin,… Công thức cấu trúc các nhóm hợp chất flavnoid được trình bày dưới đây

6

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các nhóm flavonoid phân lập từ chi Piper L

❖ Một số khung cấu trúc hợp hợp chất lignan

Lignan là nhóm hợp chất phân lập được từ thực vật và được tạo nên bởi 2 đơn vị phenylpropan có cấu tạo C6-C3 và liên kết với nhau ở vị trí cacbon β - β’ của chuỗi bên

Cấu tạo của nhóm hợp chất lignan phân lập được từ chi Piper L khá đa dạng, giữa các chất

có sự khác nhau về loại, số lượng và vị trí nhóm thế ở hai nhân thơm Nhóm thế ở nhân thơm thường gặp gồm: -OH, -OCH3, -OCH2O- Bên cạnh đó, sự kết hợp giữa hai chuỗi bên của hai đơn vị cấu tạo nên hợp chất lignan cũng khá phong phú và tạo thành các dạng có (A) khung tetrahydrofuran như clusin, subebin, cubebinin, …(B) khung furofuran như aschantin, diaeudesmin, … (C) Khung aryltetralin như dihydrotrichostin, hemiariensin, …; (D) Khung neolignan như heterotropan, magnosalin, … Tính đến năm 2022, đã có 275 hợp chất thuộc nhóm này được công bố phân lập [10], [12]

Ghi chú: Ar = vòng thơm (aromatic ring)

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các nhóm lignan phân lập từ chi Piper L

7

1.3 Các nghiên cứu định tính các hợp chất trong chi Piper L

Trong hơn 2,000 loài thuộc chi Piper L, đã có một số loài được nghiên cứu định tính

bằng phương pháp khác nhau như TLC, HPLC, HPTLC, phản ứng hóa học,

Trong Dược điển Lào (2019), đã định tính loài Piper samentosum Roxb bằng hương pháp TLC sử dụng hệ dung môi triển khai n-hexan : chloroform : ethyl acetat (4 : 3 : 3 v/v),

chấm so với dược liệu đối chiếu sau khi triển khai xong soi các vết trên đèn UV 254nm, 365nm và phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vị trí,

số vết, màu sắc vết tương tự với dung dịch đối chiếu Đối với loài Piper boehmeriifolium

(Miq.) C.DC cũng đã tiến hành định tính bằng phương pháp TLC so với dược liệu đối chiếu,

sử dụng hệ dung môi n-hexan : chloroform : ethyl acetat : amoniac (16 : 6 : 5 : 0,1 v/v), soi

trên bước sóng 254nm, 365nm và phun thuốc thử molybdophosphoric acid 10% [23]

Piper lolot C DC (Lá lốt) là loài duy nhất của chi Piper L được tiêu chuẩn hóa trong

Dược Điển Việt Nam V, dược liệu được định tính bằng phản ứng hóa học với thuốc thử Bouchardat và phản ứng với thuốc thử picric 1% và dược liệu này cũng được định tính bằng phương pháp TLC sử dụng dược liệu Lá lốt chuẩn để đối chiếu, triển khai với hệ dung môi ethyl acetat : methanol : nước (100:17:13 v/v) Quan sát bản mỏng dưới sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu [3]

Trong Dược Điển Ấn Độ (2015),đã quy định tiêu chuẩn hóa 3 loài thuộc chi Piper L gồm có Piper nigrum L., Piper betle L và Piper cubeba L.f Đối với loài Piper nigrum

đã tiến hành định tính bằng TLC dùng piperin làm chất đối chiếu để so sánh triển khai trên

hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (6 : 4 v/v), và phát hiện vết các hợp chất bằng thuốc thử kali iodobismuthat, piperin sẽ cho vết màu cam đen Loài Piper betle được định tính bằng

phương pháp TLC sử dụng hệ pha động toluen : ethyl acetat (8 : 2 v/v) quan sát bản mỏng

dưới đèn tử ngoại 254nm, 265nm và so sánh với chất euganol và loài Piper cubeba L.f được định tính bằng phương pháp TLC sử dụng hệ dung môi khai triển chloroform : n-

hexan (7 : 3 v/v) và sử dụng cubebin làm chất đối chiếu, sau khi triển khai xong quan sát dưới đèn tử ngoại 254nm, 365nm và phát hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH [22], [24]

thứ tự như Piper nigrum > Piper retrofractum > Piper cubeba > Piper betle [30] Piper Longrum L được phân tích đồng thời piperin và piperlongumin trong dịch

chiết rễ bằng phương pháp HPTLC với pha động toluen : ethyl acetat (6 : 4 v/v) , quan sát ở bước sóng 342nm, vết piperin được tách ra với giá trị Rf là 0,51 và vết piperlongumin có giá trị Rf là 0,74 [25] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Manisha và cộng sự (2011) đã tiến

hành định tính bằng phản ứng hóa học dịch chiết MeOH của Piper longrum cho thấy xuất

hiện các nhóm hợp chất như alcaloid, tanin, phenol, coumarin và tinh dầu [36] Saiful và cộng sự (2018), đã nghiên cứu định tính hợp chất piperin trong dịch chiết

MeOH Piper chaba Hunt bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, IR) và phương pháp TLC với dung môi triển khai là ester dầu hỏa : ethyl acetat (3 : 2 v/v) quan sát trên bước sóng 342nm, piperin cho Rf là 0,51 [15] Ngoài so sánh với chất piperin

chuẩn, trong nghiên cứu của Haribabu và cộng sự đã được đánh giá định tính, định lượng

Piper chaba bằng phương pháp TLC, HPTLC, HPLC đối chiếu chất chuẩn asaranin và

sesamin, sử dụng hệ dung môi ethyl acetat : n-hexan (3 : 7 v/v), cho vết tách tốt, pic hiện rõ [28] và đặc biệt trong nghiên cứu đã chỉ ra trong loại Piper chaba đã có các hợp chất

nhóm alcaloid, coumarin, saponin, steroid, flavonoid [15]

Về loài Piper methysticum (G.Forst.) Hook & Arn trong nghiên cứu của Lebot và công sự (2014), đã nghiên cứu định tính và định lượng dịch chiết aceton của rễ Piper

methysticum bằng phương pháp UHPLC/MS, IR, NIR sử dụng dung môi triển khai là

n-hexan – dioxan (8 : 2 v/v) đối chiếu với các chất methysticin, kavain, yangonin, dihydrokavain, desmethoxygangonin, flavokavin A-C [33]

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã tiến hành định tính bằng phản ứng hóa học

trong một số loài thuộc chi Piper L và các nghiên cứu cũng đã chỉ ra trong Piper nigrum

xuất hiện các hợp chất alcaloid, saponin, tannin, steroid, flavonoid, terpenoid, phenol và

9

glycosid tim; loài Piper retrofractum có các nhóm hợp chất alcaloid, saponin, tannin, steroid, flavonoid, terpenoid và phenol; loài Piper longrum có alcaloid, saponin, tannin,

steroid, flavonoid, terpenoid và phenol.Trong nghiên cứu Uzoekwe N.M và Ezenwajiugo

C.E (2023) đã báo cáo trong loài Piper quineense xuất hiện nhóm hợp chất alcaloid,

saponin, tanin, anthraquinon, glycosid tim, flavonoid, carotenoid, phenol, terpenoid [37] Từ các nghiên cứu trên có thể tóm tắt các phương pháp định tính bảng TLC, HPLC,

HPTLC và phản ứng hóa học một số loài thuộc chỉ Piper L qua bảng 1.2

10

Bảng 1.2 Các phương pháp định tính của một số loài thuộc chi Piper L

Tên khoa học Phương

pháp định tính

Hệ dung môi Chất đối chiếu TLTK

Piper betle TLC Toluen : ethyl acetat (8 : 2v/v) Euganol [24]

HPTLC Toluen : ethyl acetat : diethyl ester (6 : 3 :1v/v ) Piperin [30]

Piper boehmeriifolium TLC N-hexan : chloroform : ethyl acetat : amoniac

(16 : 6 : 5 : 0,1 v/v)

Dược liệu chuẩn [14]

Piper chaba

NMR, IR và TLC

Ester dầu hỏa : ethyl acetat (3 : 2 v/v) Piperin [15]

TLC, HPLC và HPTLC

Ethyl acetat : n-hexan (3 : 7 v/v) Asaranin, sesamin [28]

Hóa học

Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Mayer), saponin (tạo bọt), steroid (định tính Liebermann-Burchard), flavonoid (NaOH, thuốc thử FeCl3 5%, H2SO4)

-

[13]

Piper cubeba TLC Chloroform : n-hexan (7 : 3v/v ) Cubebin [22]

HPTLC Toluen : ethyl acetat : diethyl ester (6 : 3 : 1 v/v) Piperin [30]

Piper Longrum HPTLC Toluen : ethyl acetat (6 : 4 v/v) Piperin,

piperlongumin

[29]

11 Hóa học

Alcaloid (thuốc thử Dragendroff, Bouchardad, Mayer), tanin (thuốc thử FeCl3 5%, gelatin, đồng acetat), phenol (thuốc thử FeCl3 5%, đồng acetat), coumarin (thuốc thử diazo hóa, phản ứng mở, đóng vòng lacton), tinh dầu (có mùi thơm)

Piper lolot

TLC Ethyl acetat – MeOH – nước (100 : 17 : 13 v/v) Dược liệu chuẩn [3]

Piper methysticum UHPLC-MS,

NIR, MIR

N-hexan – dioxan (8 : 2v/v )

Methysticin, kavain, yangonin,

dihydrokavain, desmethoxygangonin, flavokavin A-C

-

[37]

12 tim (thuốc thử Baljet, Legal, Keller-Kiliani, Xanhhydrol)

-

[37]

Piper samentosum TLC n-hexan : chloroform : ethyl acetat (4 : 3 : 3v/v) Dược liệu chuẩn [24]

13

1.4 Tổng quan về cây Sakhan ( Piper wallichii (Miq.) Hand.-Hazz.)

1.4.1 Tổng quan về thực vật học

1.4.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Piper wallichii (Miq.) Hand.-Mazz là cây thân thảo lâu năm, phần gốc mọc bò Thân

cành mang hoa, thẳng đứng và nhẵn, có thể cao từ 2 - 4 m Lá mọc so le, có cuống ngắn Phiến lá hình trứng, thuôn, dài, dài khoảng 6 - 7,5 cm, rộng 3 - 5 cm Gốc hình tim hơi lệch, đầu lá nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông nhỏ, nhất là ở gân Lá có 5 - 7 gân Hoa đơn tính, mọc thành từng cụm Hoa đực dài khoảng 3,5 cm, có trục nhẵn, lá bắc tròn, có 2 nhị Hoa cái ngắn hơn, khoảng 1,5 cm, có cuống ngắn Cụm quả hình trụ, hơi cong, do nhiều quả mọng nhỏ tập hợp tạo thành, dài 1,5 - 3,5 cm, đường kính 0,3 - 0,5 cm, mặt ngoài màu xanh Gốc cụm quả có cuống còn sót lại hay vết của cuống đã rụng Quả mọng nhỏ, hình cầu, có mùi thơm, vị hăng, cay Hạt tròn cỡ 2 -2,5 mm Mùa hoa quả từ tháng 3 -5 [6]

1.4.1.2 Đặc điểm phân bố và sinh thái

Sakhan chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Á gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan và Lào Ở Lào, cây thường mọc phổ biến ở một số tỉnh miền núi phía Bắc như Luangphabang, Xiengkhouang và Xayaboury [24] Sakhan là loại cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc rải rác, đôi khi tạo thành từng đám dưới tán rừng núi ở hai bên bờ khe suối và ven rừng núi đá vôi ẩm [24], [27]

1.4.1.3 Thành phần hóa học

Theo một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Sakhan, các nhà khoa học chủ yếu phân lập được các nhóm hợp chất alcaloid, lignan, tinh dầu và một số các nhóm hợp chất khác như flavonoid, phenolic, triterpenoid, phenylpropanoid, … tóm tắt thành phần hóa học của Sakhan được thể hiện ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Các hợp chất được gặp trong loài Piper wallichii

14 A, piperolactam B - D, aristololactam A IIIa, BII, stigmalactam, goniothalactam, piwallidion, cepharadion và neoechinulin A…

2 Lignan

galbelgin, prestegan B, (–)-olivil, neoolivil, syringaresinol, medioresinol, epipinoresinol, 3',5'-dimethoxybiphenyl-3,4'-diol, lirioresinol A, pinoresinol, prinsepiol, epilyoniresinol, isolariciresinol, (+)-lyonisid, isolariciresinol, (–)-

nudiposid, kadsurenon, denudatin B, hancinon D

,(+)-licarin A, wallichinin, hancinon C, hancinon B, (+)-burchellin, piperwalliol A, rosalaevin B, 9-

hydroxyeriobofuran,

[9], [31], [35]

3 Flavonoid (-)-epicatechin, (-)-taxifolin [38] 4 Phenolic piperwalliosid A, piperwalliosid B, piperwalliosid

Mẫu thân cây Sakhan được cắt nhỏ, phơi sấy ở 55oC đến độ ẩm dưới 10% Xay thành bột, bảo quản trong túi sạch kín, sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học

Mẫu tiêu bản được Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu giám định tên

khoa học là Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz., họ Hồ tiêu (Piperaceae) Mẫu tiêu bản

được lưu giữ tại phòng tiêu bản thực vật – Viện Dược liệu (Số hiệu DV-070524)

- Dùng trong sắc ký lớp mỏng : Piperin chuẩn tinh khiết 98% (Sigma Aldrich, Mỹ), dung môi (ethanol, ethyl acetat, acid formic, …); bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), thuốc thử Dragendroff, thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ thuỷ tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu 100 mL, 250 mL, 500 mL, ống đong, phễu thuỷ tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, …

- Dao lam, phiến kính, lam kinh - Dụng cụ khác bắt sự, chày, thuyền tán, khay, … - Tủ sấy Memmert (Đức) bếp điện

- Cân kỹ thuật SATORIUS TE412 - Kính hiển vi LEICA DM 1000 - Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)

- Giám định tên khoa học của mẫu cây Sakhan

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân của mẫu cây Sakhan bằng phản ứng hóa học

- Định tính sơ bộ dịch chiết toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng - Định tính piperin bằng sắc ký lớp mỏng của thân mẫu cây Sakhan - Định tính và xác định thành phần tinh dầu trong thân của mẫu cây Sakhan

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái

Phân tích hình thái: Quan sát mô tả và phân tích các đặc điểm thực vật, bao gồm: - Dạng sống, thân, lá (cách mọc, hình dạng, kích thước phiến lá, ngọn lá, gân lá, gốc lá, cuống lá)

- Hoa (kiểu cụm hoa, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình dạng, kích thước, liền/rời), bộ nhụy (số lượng, hình dạng, kích thước, lá noãn), quả, hạt (số lượng, hình dạng, màu sắc),

- Làm mẫu tiêu bản: Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô và lưu giữ tiêu bản tại Phòng tiêu bản – Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu

Giám định tên khoa học: Tên khoa học được xác định bằng phương pháp so sánh hình thái đối chiếu với khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong và ngoài nước

2.3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

Vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 2 hoặc 3 tinh từ đoạn ngọn, Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí 1/2 - 1/3 dưới gần gốc của lá trưởng thành Các lát cắt

17 mỏng được tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép và lên tiêu bản vi phẫu Sau đó

quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính bằng phản ứng hoá học

Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ : anthranoid, glycosid tim, alcaloid, flavonoid, saponin, coumarin, taninm acid amin, steroid, triterpenoid, polysaccharid, chất béo, đường khử, acid amin, Carotenoid có trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [2]

2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Nguyên liệu: mẫu thân cây Sakhan được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 55°C, xay nhỏ,

bảo quản trong túi zip nơi khô ráo

Dung dịch thử: Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: cân

chính xác khoảng 1g bột dược liệu, làm ẩm bằng MeOH, sau đó ngâm trong 10mL MeOH, bề mặt dung môi cách bề mặt dược liệu khoảng 1cm Sau 24h, siêu âm 30 phút rút lấy dịch

chiết (dung dịch A)

❖ Định tính sơ bộ thành phần hoá học

Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký

- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 oC trong 30 phút

Kích thước bản mỏng 2,5 x 7 cm - Khảo sát hệ sắc ký với một số hệ dung môi sau:

+ Hệ 1: Cloroform: ethyl acetat: acid formic (7 : 3 : 0,5 v/v) + Hệ 2: Ethyl acetat: acid formic : nước (8 : 1 : 1 v/v)

+ Hệ 3: N-hexan: ethyl acetat (4 : 1 v/v) + Hệ 4: Toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) Triển khai sắc ký: Đưa bản mỏng đã chấm mẫu và làm khô vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển lấy bản mỏng ra và sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Phát hiện vết: Hiện vết bằng cách phun thuốc thử hiện màu Dragendroff rồi sấy ở 110°C trong 15 phút đến khi hiện màu, soi đèn từ ngoại ở các bước sóng 254nm và 366 nm trước và sau khi phun thuốc thử

18

❖ Định tính piperin bằng sắc ký lớp mỏng

Dung dịchthử : dung dịch A Dung dịch đối chiếu: Hòa tan piperin chuẩn trong MeOH để được dung dịch có chứa 1mg/mL

Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký - Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110oC trong 30 phút Kích thước bản móng 3,5 x 6,5 cm

- Hệ dung môi pha động: Hệ 4: Toluen: ethyl acetat: acid acetic (10 : 6 : 0,5 v/v) [24] Triển khai sắc ký: Đưa bản móng đã chẩm mẫu và làm khô vào bình sắc ký đã bảo hòa dung môi, đậy kín để yên, quan sát quá trình tách vết đến khi vết dung môi cách mép trên của bàn mỏng 1cm thì kết thúc quá trình Đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt Quan sát dưới ánh sáng từ ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm

Phát hiện vết: Hiện vết bằng thuốc thử Dragendroff Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu cam có cùng giá trị Rf, với vết piperin

2.3.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu bằng phương pháp sắc ký kết hợp khối phổ

Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí sẽ được detector khối phổ nhận biết Hiện nay , phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính ( dựa vào thời gian lưu ) hay định lượng (dựa vào chiều cao hay diện tích peak) tinh dầu

Phân tích thành phần tinh dầu được thực hiện bằng hệ thống GC In tuvo 9000 kết nối với khối phổ MSD 5977B (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), sử dụng cột mao quản tráng sẵn silica nung nóng HP-5MS không phân cực (30m x 0,25 mm x 0,25 µm) Chương trình nhiệt độ được đặt từ 50°C giữ trong 3 phút, sau đó tăng lên đến 280°C (với tốc độ 5°C/ phút) Nhiệt độ inlet là 150°C Khí mang Heli, tốc độ khí mang 1ml/phút Tinh dầu được pha loãng với dung môi cloroform, thể tích tiêm mẫu1µL, chế độ chia dòng 50 : 1 Năng lượng ion hóa là 70 eV với phạm vi quét từ 45-450 amu Phổ được so sánh với thư viện Wiley, Flavor và Nist để phân tích kết quả

Tiến hành:

19 - Pha loãng tinh dầu cất được (tinh dầu được cất theo phương pháp lôi cuốn hơi nước) bằng dung môi cloroform đến nồng độ 1x10-3 (v/v) Cho vào lọ vial

- Khởi động hệ thống sắc ký khí - Tiến hành phân tích

Xác định các thành phần trong tinh dầu dựa trên nguyên lý so sánh độ trùng lặp về phổ khối của các chất sẵn có trong thư viện Thêm vào đó, giá trị RI được so sánh với các dữ liệu trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố Giá trị RI được tính theo thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các alkan trong dãy đồng đẳng alkan từ C8 đến C20 tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký Công thức tính RI :

RI = 100 𝑛 + 100. 𝑅𝑇(𝑥)−𝑅𝑇(𝑛)

𝑅𝑇(𝑛+1)−𝑅𝑇(𝑛)

Trong đó : RI : Chỉ số lưu giữ RT(x) : Thời gian lưu của chất phân tích RT(n) : Thời gian lưu của alkan liên trước pic phân tích RT(n+1) : Thời gian lưu của alkan liên trước pic phân tích n : Số nguyên tử carbon của alkan liên trước pic phân tích

20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Cây thảo, leo lâu năm, thân gỗ, phần gốc mọc bò, cây có thể dài tới 2 đến 10 m Tiết diện thân hình tròn, có đường kính từ 1 - 4cm, bề mặt thân không nhẵn, vỏ thân ngoài khi non có màu xanh và khi già có màu nâu xám, thịt vỏ có màu hơi vàng hoặc nâu xám, có mùi thơm (A-C)

Ghi chú: (A) Cây Sakhan, (B) Thân cây khi già, (C) Bề mặt của thân già

Hình 3.1 Hình thái và dạng sống cây Sa khan Lámọc cách, phiến lá nguyên đơn hình bầu dục hoặc hình trứng, rộng 4-10 cm, dài 2 - 24 cm, đầu phiến lá thuôn nhọn, gốc cong, hình nêm hoặc lõm vào thành hình tim, mặt trên nhẵn, có màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu lục nhạt, có lông thưa trắng và có mùi thơm Gân lá hình cung nổi rõ 2 mặt, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên, có 3 cặp gân phụ cong hình cung: cặp thứ nhất xuất phát từ đáy, cách bìa phiến 0,2-0,5 cm, không rõ, chạy dọc theo rìa phiến lá khoảng 2/3 chiều dài phiến; cặp thứ 2 rõ hơn xuất phát cùng vị trí cặp gân phụ thứ nhất cách bìa phiến 1-1,5 cm, chạy đến tận gốc lá; cặp thứ 3 xuất phát từ ¼ cách đáy gốc lá, tụ lại ở ngọn lá; nhiều gân phụ nằm ngang, nối liền các gân hình cung dạng mạng Có 2 lá kèm dạng vảy màu đen khô xác dài 0,5-0,8 cm, nằm 2 bên đáy gốc lá, rụng sớm Cuống lá màu xanh,có lông, dài 1-2 cm (D-J)

Ghi chú: (L) Cụm quả non, (M, ) Cụm quả

Hình 3.3 Đặc điểm cơ quan sinh sản (quả)

Sau khi đối chiếu với các tài liệu tham khảo, so sánh với các mẫu tiêu bản thế giới tại phòng tiêu bản Royal Botanic Gardens, Kew (số hiệu DV-070524) và tham vấn chuyên

22

gia thực vật đã giám định mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Piper wallichii (Miq.)

Hand.-Mazz, họ Hồ tiêu (Piperaceae)

Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz Mẫu nghiên cứu cây Sakhan

Hình 3.4 Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz và Mẫu nghiên cứu cây Sakhan

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

Tiến hành làm vi phẫu thân và lá theo mục lục 2.3.1 kết quả thu được như sau:

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân

Thân hình gần tròn, mặt cắt vi phẫu đối xứng Từ ngoài vào trong, gồm Bần (1) gồm các tế bào hình chữ nhật vách dày hoá cutin, xếp sát nhau thành 1 hàng, bắt màu xanh của thuốc nhuộm Dưới lớp bần là Mô dày (2) gồm 8 – 10 lớp tế bào, thành tế bào có vách dày đều xung quanh, các tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng đều đặn, bắt màu hồng đậm, có sợi Mô cứng (3) vách dày hay rất dày rải rác trong lớp mô dày Mô mềm vỏ (4) gồm các tế bào thành mỏng, gần tròn, kích thước không đều, tế bào phía trong to hơn phía ngoài và sắp xếp lộn xộn Ngăn cách mô mềm vỏ (4) và mô mềm tủy (10) là vòng tế bào mô cứng (8) gồm 4 – 6 lớp tế bào có vách dày, hình đa giác, hóa gỗ, đầu tiên xuất hiện những tế bào riêng lẻ, rồi dần dần phát triển thành một vòng tế bào mô cứng rõ rệt bắt màu xanh Hệ thống mạch dẫn xếp trên 2 vòng Bó mạch vòng ngoài (7) nằm ở chỗ lõm của vòng mô cứng có khoảng 3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều, hóa mô cứng thành cụm

23 trên các bó libe - gỗ, bó mạch vòng trong (11) gồm các bó libe - gỗ nằm ở phần mô mềm tủy, xếp thành vòng trong có từ 6 - 10 bó libe - gỗ Bó dẫn của thân dạng chồng chất, mô libe (5) nằm ngoài, mô gỗ (6) nằm trong, ở giữa là tượng tầng hay còn gọi là tầng phát sinh Mô mềm tủy (10) gồm 12-14 lớp tế bào vách mỏng, gần tròn, kích thước không đều và to hơn tế bào mô mềm vỏ Có tế bào tiết (9) và hạt tinh bột (12) rải rác trong vùng mô mềm vỏ và mô mềm tủy Mô khuyết (13) nằm chính giữa của thân

Ghi chú: (1) Bần, (2) Mô dày, (3) Mô cứng, (4) Mô mềm vỏ, (5) Libe, (6) Gỗ, (7, 11) Bó mạch, (8) Vòng tế bào mô cứng, (9) Tế bào tiết, (10) Mô mềm tủy, (12) Hạt tinh bột,

(13) Mô khuyết

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân của mẫu nghiên cứu

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá

Gân lá: Đi từ trên xuống dưới, gân lá lồi tròn ở cả 2 mặt, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt

trên Trong vi phẫu gân lá gồm các bộ phận: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (8) có 1 lớp tế bào hình bầu dục hay hình chữ nhật xếp thành một hàng đều đặn, sát nhau, lớp cutin dày và trên biểu bì dưới có nhiều lông dạng đơn bào (9) Mô dày trên (2) gồm 6 – 8 lớp tế bào