đề tài vi sinh vật chỉ thị môi trường

Trong số những vi sinh vật này có những vi sinh vật mà sự có mặt của chúng trong môi trường với một số lượng, nồng độ nhất định gây cho môi trường bị ô nhiễm về mặt vi sinh vật.. Khái qu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA MÔI TRƯỜNG & BẢO HỘ LAO ĐỘNG

NHÓM 6

Trần Nguyễn Bảo

Trương Như Huỳnh 9200036 4 Phạm Thuỵ Ngọc Trân 9200037 7

ĐỀ TÀI: VI SINH VẬT CHỈ THỊ MÔI

TRƯỜNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật là những sinh vật có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không thể nhìn thấy được, nó chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi và nó có thể phân bố khắp nơi trong môi trường đất, nước, không khí và cả môi trường sinh vật, hàng hóa, lương thực, thực phẩm Trong số những vi sinh vật này có những vi sinh vật mà sự có mặt của chúng trong môi trường với một số lượng, nồng độ nhất định gây cho môi trường bị ô nhiễm về mặt vi sinh vật

Tuy nhiên chúng ta không thể khảo sát từng nhóm vi sinh vật xem môi trường có bị ô nhiễm về mặt vi sinh vật hay không vì việc này gặp rất nhiều khó khăn về mặt kinh tế cũng như để đảm bảo an toàn cho người làm việc vì nhiều vi sinh vật rất nguy hiểm đối với sức khỏe con người

Vậy làm thế nào để kiểm tra môi trường có bị ô nhiễm về mặt vi sinh vật hay không?

Đó là nhờ vào các vi sinh vật chỉ thị Vậy vi sinh vật chỉ thị là gì? Nó có những đặc điểm nào? Bao gồm những nhóm nào điển hình và cách xác định nó ra sao? Đó là những vấn

đề rất đáng quan tâm Vì vậy, việc tìm hiều về “Vi sinh vật chỉ thị” sẽ giúp cho mọi người

có cái nhìn sâu sắc hơn về vi sinh vật

MỤC LỤC

1 Khái quát về vi sinh vật chỉ thị 4

1.1 Khái niệm 4

1.2 Ý nghĩa 4

1.3 Phân loại vi sinh vật chỉ thị 4

1.4 Một số vi sinh vật chỉ thị thông dụng 6

1.4.1 Tổng số coliform 6

1.4.2 Coliform phân 6

1.4.3 Streptococcus phân 7

1.4.4 Vi khuẩn kị khí 7

1.4.5 Bacteriophage (xạ khuẩn) 8

1.4.6 Nấm men và VSV kháng axit 8

1.4.7 Đếm sinh vật dị dưỡng (HPC) 8

1.4.8 Chỉ thị hóa học của chất lượng nước 9

2 Phát hiện những VSV chỉ thị 9

2.1 Phương pháp MPN (Most probable number) 9

2.2 Phương pháp ELISA ( Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 9

2.3 Phương pháp đếm đĩa 10

2.4 Phương pháp màng lọc (Membrane-filter) 10

2.5 Phương pháp PCR 10

2.6 Phương pháp lai phân tử 11

3 Ứng dụng 11

4 Tổng kết 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

NỘI DUNG

1 Khái quát về vi sinh vật chỉ thị

1.1 Khái niệm

Chỉ thị sinh học là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng ôxi cũng như khả năng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường sống và do đó sự hiện diện của chúng biểu hiện 1 tình trạng về điều kiện sinh thái của môi trường sống nằm trong giới hạn yêu cầu và khả năng chống chịu của sinh vật đó

Một số loài địa y được xem như là loài chỉ thị cho sự mẫn cảm với ô nhiễm sunfua điôxit (SO2)

Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật chỉ thị lý tưởng:

 Là thành viên của vi khuẩn đường ruột trong động vật máu nóng

 Hiện diện khi có VSV gây bệnh tồn tại

 Số lượng lớn hơn VSV gây bệnh

 Ít nhất phải đề kháng như vi khuẩn gây bệnh với sự tác động của môi trường

với sự khử trùng trong nhà máy xử lý nước và nước thải như VSV gây bệnh

 Không nhân lên trong môi trường

 Phải được phát hiện bằng những phương pháp đơn giản nhanh và rẻ tiền

 Nên là vi khuẩn không gây bệnh

1.2 Ý nghĩa

Các chỉ thị sinh học có thể sử dụng trong đánh giá sinh thái, đặc biệt là trường hợp của

nhóm quần thể chỉ thị điều kiện khu vực cần thiết phải được bảo tồn Chỉ thị loài cũng được dùng trong điều kiện đánh giá môi trường đặc biệt là đánh giá chất lượng nước và trong việc sử dụng để lập bản đồ về sự mẫn cảm đối với môi trường Việc đánh giá chất lượng nước có mục đích là kiểm tra vệ sinh trong nước, xác định mức độ an toàn của nước đối với sức khỏe của con người

1.3 Phân loại vi sinh vật chỉ thị

 Tính mẫn cảm (Sensitivity): nhạy cảm với nhiệt độ, pH, oxy hòa tann và chất dinh dưỡng sẵn có Sự hiện diện của một số đồng vật nguyên sinh nhất định là chỉ số đánh giá hoạt động của hệ thống xử lý

 Như một công cụ để thăm dò (Detector): đo đạc sự phản ứng và thích nghi đối với

sự thay đổi của môi trường (tuổi, nhóm loài, giảm kích thước quần thể, tập quán sống )

 Như một công cụ khai thác (Exploiter): chỉ thị cho sự ô nhiễm của môi trường

 Như một công cụ tích lũy sinh học (Accumulator): các loài tích lũy sinh học bao gồm hóa chất trong mô của chúng ví dụ các loài địa y

Có 3 nhóm VSV chỉ thị ô nhiễm do phân gồm:

- Nhóm coliform đặc trưng là Escherichia coli (e.coli): là một loài vi khuẩn gram

âm, phân bố rộng trên môi trường sống của Trái Đất, kí sinh trong ruột già của người và hầu hết các loài thú đẳng nhiệt

- Nhóm streptococci đặc trưng là Streptococcus faecalis.: là một vi khuẩn gram dương, hình cầu, phát triển trong chuỗi hoặc cặp, dễ dang uốn cong hoặc xoắn giống như một chuỗi xoắn

- Nhóm Clostridia khử sunfit đặc trưng là Clostridium perfringents Là vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, thường có trong tự nhiên vầ có thể được tìm thấy trong sự phân rã của thực vật, cặn biển, đường ruột của con người và động vật có xương sống, côn trùng và đất

Sự có mặt của các VSV này chỉ thị tình trạng nước bị ô nhiễm do phân, như vậy có nghĩa là có thể có vi trùng gây bệnh và ngược lại nếu không có các VSV chỉ thị do phân

có nghĩa là có thể không có vi trùng gây bệnh do phân

Trong 3 nhóm VSV chỉ thị trên nhóm coliform thường được lựa chọn để phân tích bởi vì:

- Chúng là nhóm VSV quan trọng nhất trong việc đánh giá vệ sinh nguồn nước

và có đầy đủ các tiêu chuẩn của các loài vi sinh chỉ thị lí tưởng

- Chúng có thể được xác định trong điều kiện thực địa

- Việc xác định coliform dể dàng hơn để xác định các VSV khác

1.4 Một số vi sinh vật chỉ thị thông dụng

1.4.1 Tổng số coliform

Bao gồm những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, gram âm không sinh bào tử, hình que lên men lactose và sinh khí trong vòng 48h ở 35oC Loại này bao gồm E.coli, Enterobacter, Klebsiella và Citrobacter Những loại này được thải ra với số lượng lớn trong phân người và súc vật Một số thành viên của nhóm (thí dụ như là Klebsiella) đôi khi có thể phát triển trong nước thải công nghiệp và nông nghiệp Tổng số coliform là chỉ thị tốt nhất cho hiệu quả

xử lí của một nhà máy xử lí nước thải

1.4.2 Coliform phân

Coliform phân bào gồm tất cả những coliform có thể lên men lactose ở 44.50C và bao gồm vi khuẩn như Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae Sự hiện diện của coliform phân chỉ thị sự hiện diện của phân động vật máu nóng Coliform phân có kiểu tồn tại tương tự như những sinh vật gây bệnh nhưng ít sử dụng để chỉ thị sự nhiễm bẫn protozoa

và virus Chúng ít đề kháng với chất khử trùng hơn virus hay nang protozoa Chúng cũng có thể được phân lập từ nước thải và nước với những điều kiện thích hợp một số những cải tiến về phương pháp đã được đề xuất để cải tiến sự phát hiện những

vi sinh chỉ thị này đặc biệt là coliform phân

1.4.3 Streptococcus phân

Chúng thường trú ẩn trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng Một nhóm nhỏ của nhóm Streptococcus phân, Enterococci(S.faecalis và S.faecium) đã được cho rằng hữu dụng trong việc chỉ thị sự hiện diện của virus, đặc biệt trong bùn và nước biển

Hình 1: Escherichia Coli Hình 2: Klebsiella pneumonicae

Tỷ số coliform phân trên streptococci phân (tỷ số FC/FS) là chỉ thị cho nguồn gốc của

ô nhiễm nước bề mặt, tỷ số này lớn hơn 4 là chỉ thị sự nhiễm bẩn có nguồn gốc từ con người và dưới 0.7 là chỉ thị cho nguồn gốc ô nhiễm từ súc vật Và tỉ số này chỉ có giá trị cho ô nhiễm phân trong thời gian gần 24h

1.4.4 Vi khuẩn kị khí

Clostridium

perfringers Gram dương, sinhbào tử

Bào tử vi khuẩn rất bền vững nên không thể dùng làm vsv chỉ thị

Chỉ thị ô nhiễm phân trong môi trường nước biển

Bifidobateria Gram dương

Không sinh bào tử

Chỉ thị ô nhiễm phân

Phân biệt được nhiễm bẩn do người

và súc vật

Bacteroides spp Xuất hiện ở đường

tiêu hóa ơ nồng độ khoảng 1010 tế bào trong mỗi gram phân

Chỉ thị ô nhiễm phân trong nước

1.4.5 Bacteriophage (xạ khuẩn)

Chúng dễ dàng phát hiện trong mẫu môi trường (nước thải và các môi trường khác)

Dùng colipghage ( thực khuẩn ) làm:

- Chỉ thị nước sông, cửa biển, nước uống…

- Chỉ thị hiệu quả loại bỏ của nhà máy XLN

- Cung cấp thông tin về độ hiệu quả của quá trình XLN ( keo tụ, kết bông, lọc, hấp phụ, khử trùng )

Hình 3: Streptococcus faecalis Hình 4: Enterococci

Hình 5: Clostridium perfringers

Hình 6: Bifidobateria

Hình 7: Bacteroides spp

1.4.6 Nấm men và VSV kháng axit

Nấm men Mycobacteria Mycobacteria tortuitum

Chỉ thị hiệu quả khử trùng Đề kháng tốt với clor và ozon ( chưa

rõ )

1.4.7 Đếm sinh vật dị dưỡng (HPC)

- Đếm tổng số vi khuẩn yếm khí và hiếu khí tùy tiện

- Bao gồm các vi khuẩn gram âm thuộc các chi: Pseudomonas, aeromonas,

Kleibisella…

- Bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, clor dư, nồng độ chất hữu cơ có thể đồng hóa

- HPC thông số có hữu dụng:

+ Đánh giá hiệu quả các quá trình xử lý

+ Giám sát chất lương vi sinh của nước trong bể chứa và hệ thống phân phối

+ Xác định sự phát triển của VK trên bề mặt của chất liệu dùng và hệ thống phân phối

+ Xác dịnh khả năng vsv phát triển trở lại trong nước đã xử lý ở hệ thống phân phối

1.4.8 Chỉ thị hóa học của chất lượng nước

Chỉ thị hóa học của chất lượng nước

Các chất sterol phân:

+ Coprostanol

+ Coprosterol

+ Cholesteron

+ Coprostanone

Sterol phân có thể thoái hóa

sau sau thao tác xử lý nước và

nước thải Không bị ảnh hưởng

bởi clor hóa

Chlor dư tự do:

chất chỉ thị của tốt của chất lượng nước uống

Nồng độ nội độc tố:

Là những lipopolysacharies tồn tại trong màng ngoài VK gram âm Nồng độ nội độc tố được đo bằng thí nghiệm LAL ( tăng độ đục và phân tích đo lường bằng quang phổ kế)

2 Phát hiện những VSV chỉ thị

2.1 Phương pháp MPN (Most probable number)

Là phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu Phương pháp này có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau (Thông thường, là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3=9 ống nghiệm) Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn

Quy trình thực hiện phương pháp này như sau:

- Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích xác định dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp - Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (phản ứng dương tính), ghi nhận số lượng ở từng độ pha loãng

- Sử dụng số liệu này dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu

Phương pháp MPN được sử dụng phổ biến trong định lượng Coliforms tổng, Coliforms phân, e.coli và các vi sinh vật khác

2.2 Phương pháp ELISA ( Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

Là một kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu Theo thuật ngữ đơn giản, trong kỹ thuật ELISA, một lượng của kháng nguyên được gắn liền với một bề mặt, và sau

đó là một kháng thể đặc hiệu được cho vào trên bề mặt để nó có thể liên kết với các kháng nguyên Kháng thể này sẽ liên kết với một loại enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất

để enzyme phân giải cơ chất và phát ra những tín hiệu, phổ biến nhất là sự đổi màu một chất hóa học

Để thực hiện một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết được cố định trên một bề mặt vững chắc- giá thể rắn (thường là một tấm polystyrene vi chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) hoặc đặc hiệu (thông qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên tương tự trong thí nghiệm ELISA sandwich)

Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một phức hợp với các kháng nguyên Các kháng thể phát hiện có thể liên kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học Các phần của kháng thể ELISA là tương tự với phương pháp western blot Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu

2.3 Phương pháp đếm đĩa

Các phương pháp đếm đĩa dị dưỡng cung cấp một phương tiện chuẩn hóa để xác định mật độ vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí trong nước Phương pháp đếm đĩa tiêu chuẩn được thực hiện bằng cách đổ môi trường thạch agar hóa lỏng vào một đĩa petri

và thêm mẫu Sau khi mẫu được hòa trộn với môi trường, đĩa được để cho đông đặc lại trước khi chúng được đảo ngược và ủ Số lượng được tính của các khuẩn lạc phát triển và được báo cáo là đơn vị khuẩn lạc (CFU) trên 1 mL mẫu nước

2.4 Phương pháp màng lọc (Membrane-filter)

Phương pháp màng lọc yêu cầu lọc một thể tích mẫu thích hợp qua một màng lọc có kích thước đủ nhỏ để giữ lại các sinh vật cần phân tích Sau đó, màng lọc được đặt trong một môi trường agar thích hợp, hoặc đệm bão hòa với môi trường dinh dưỡng, sau đó được ủ Nếu sinh vật cần phân tich có mặt, các khuẩn lạc sẽ phát triển trên màng lọc Các khuẩn lạc được kiểm tra với kính hiển vi có độ phóng đại 10-15X, và sau đó được xác định bởi kích thước, màu sắc và độ bóng Các khuẩn lạc điển hình được đếm và số lượng được báo cáo là số lượng khuẩn lạc trong 100 mL mẫu

2.5 Phương pháp PCR

Phương pháp vPCR: đầu tiên tế bào sẽ được nhuộm với ethidium monoazide (EMA)

hoặc propidium monoazide (PMA) Các chất như EMA và PMA sẽ bám vào DNA, tuy nhiên chúng không thể xuyên qua lớp màng tế bào nguyên vẹn nên chỉ có thể bám vào DNA của tế bào có lớp màng không còn nguyên vẹn

Khi được chiếu sáng, các đoạn DNA bị bám bởi EMA hoặc PMA sẽ bị tổn thương không thể phục hồi dẫn đến ức chế mạnh mẽ phản ứng PCR Không chỉ có PCR, cả các kỹ thuật qPCR và LAMP cũng có thể sử dụng EMA hoặc PMA để phân biệt tế bào sống với tế bào chết theo nguyên lý tương tự

Dù vậy, kỹ thuật vPCR chỉ dựa trên tính toàn vẹn của màng tế bào nên phát hiện các

tế bào trạng thái tổn thương không hiệu quả (âm tính giả) và lại cho tín hiệu PCR với các

tế bào đã bất hoạt (dương tính giả) Hơn nữa, trong một số giai đoạn sinh trưởng thì thành

tế bào vi khuẩn cũng bị đục lỗ một cách tự nhiên nên nếu mẫu được lấy ở các giai đoạn này sẽ cho kết quả không chính xác (âm tính giả)

Phương pháp RT-PCR: cũng được đưa vào sử dụng nhằm phát hiện "tế bào sống"

thông qua sự hiện diện của RNA thông tin (mRNA), mRNA là bằng chứng cho hoạt động sinh tổng hợp của tế bào Trong kỹ thuật RT-PCR, mRNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA (giai đoạn RT) rồi sau đó được khuếch đại nhờ phản ứng PCR Dù vậy, kỹ thuật RT-PCR không thật sự được ưa chuộng trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm, một phần có thể là do mRNA dễ bị phân hủy nên dễ gây ra âm tính giả

2.6 Phương pháp lai phân tử

Phương pháp lai phân tử được thực hiện dựa trên tính chất của ADN: tách sợi khi ở