Theo thời gian các sảnphẩm này ngày càng được mở rộng về phương pháp chế biến và cả chủng loại.Trong những thức ăn truyền thống của người Việt Nam thì nước tương là mộttrong những loại n
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN,VẬT LIỆU
Dùng giống đậu nành Phương Lâm, hạt to tròn, có màu sắc và kích cỡ hạt đồng đều.
Sử dụng giống Aspergillus oryzae A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16 được cung cấp bởi phòng Sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh.
Chọn loại bột mì mịn, màu trắng ngà, không có tạp chất.
Các loại nguyên liệu được mua với số lượng nhiều ở cùng một nơi để đảm bảo tính đồng nhất.
1.4 Các loại môi trường dùng trong thí nghiệm [5,8,13]
1.4.1 Môi trường cấy chuyền-giữ giống
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát và nấu chín trong 30 phút Lọc, chiết lấy nước Cho agar vào nấu tan, trong khi nấu phải khuấy đều Cho glucose vào, khuấy đều cho tan Cho vào ống nghiệm 10 ml môi trường, đậy nút bông Hấp khử trùng 1 atm trong 30 phút Để nghiêng.
❖ Môi trường bán rắn cám trấu
Trộn đều cám gạo và trấu, cho nước vào bóp tơi cho nước ngấm đều Cho vào bình tam giác dung tích 1000 ml thành lớp dày khoảng 1-2 cm Đậy nút bông, hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở áp suất 1 atm trong 60 phút.
❖ Môi trường đậu nành Đậu nành mua về đem rửa sạch, để ráo nước rồi đem rang cho chín vàng.Rang xong để nguội, xay nhỏ Thêm nước cho đủ độ ẩm 60% Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở 1 atm trong thời gian 60 phút.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1 Cấy chuyền giống trên ống thạch nghiêng
Dùng que cấy cấy chuyền từ ống giống gốc Aspergillus oryzae sang ống thạch nghiêng, sau khi cấy xong nuôi ở nhiệt độ 30-32 o C trong khoảng 5-6 ngày. Trong quá trình nuôi, ta có thể loại bỏ những ống xấu (mọc yếu, nhiễm tạp), ống giống có thể bảo quản trong tủ lạnh 4-5 o C để dùng dần được 2-3 tháng Nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng thì chỉ dùng được trong khoảng 20-30 ngày, sau đó phải cấy lại.
2.1.2 Nhân giống trong bình tam giác
Cho vào các ống nghiệm nghiêng 8-9 ml nước vô trùng Sử dụng que cấy vô trùng khuấy đều bào tử vào nước Dùng pipet vô trùng hút huyền phù bào tử này nhỏ vào môi trường trong bình tam giác, với tỷ lệ 1 ml huyền phù bào tử cho 12-15 g môi trường Sau khi gieo cấy, lắc đều và nuôi cấy ở nhiệt độ 30 độ C.
32 o C, trong khoảng 5-6 ngày Trong thời gian nuôi cần kiểm tra các bình, loại bỏ những bình mọc chậm hoặc bị nhiễm Mốc giống phải có nhiều bào tử vàng lục hoặc vàng nâu Nếu để quá 6 ngày mà vẫn ít bào tử thì nên loại những bình đó ủi.
2.2 Phương pháp sản xuất nước tương
2.2.1 UÛ moác Đậu nành sau khi đã hấp xong để nguội đến khoảng 38 o C, đem trộn đều với bột mì đã rang chín theo tỷ lệ 10% so với trọng lượng đậu nành, rồi trộn với 10% mốc giống trong bình tam giác Trộn đều, trải mỏng ra khay thành lớp dày khoảng 1,5-2 cm, dùng vải phủ lên Trong quá trình nuôi nếu thấy nhiệt độ khối mốc lên cao quá có thể phun nước lên bề mặt vải để hạ nhiệt dộ cho khối mốc trong khoảng 30-32 o C là được Thời gian nuôi mốc trong khoảng 36-42 giờ Mốc có màu vàng lục.
2.2.2 Ủ ẩm và ngâm rút Đem mốc bóp tơi và trộn đều với nước muối có nồng độ 20% đã đun sôi và để nguội xuống 60 o C Cứ 1 kg nguyên liệu trộn với 0,3 lít nước muối có nồng độ trên Trộn đều với nước muối xong cho vào chai, lọ có nắp đậy Khi ủ ẩm cần phải để ở nơi có nhiệt độ 35-40 o C như phơi nắng, để gần bếp hoặc dùng trấu mùn cưa và bao tải phủ kín Thời gian ủ khoảng 3-4 ngày.
Sau khi ủ xong lấy nước muối có nồng độ 25% đun sôi để nguội xuống
60 o C, dội đều vào khối mốc đang ủ, cứ 1 kg nguyên liệu cho vào 1,3 lít nước muối Ngâm trong 8-18 giờ rồi rút lấy nước ra, gọi là nước lần 1 Tiếp đó lại đun nước muối như trên để nguội xuống 60 o C, rồi lại dội đều vào khối mốc ngâm trong 8-18 giờ nữa, rút lấy nước lần 2, và lại tiếp tục như trên rút được nước lần
3 Đem nước rút được của cả ba lần đun cách thủy ở nhiệt độ 75-80 o C trong khoảng 1,5-2 giờ.
Sơ đồ 3.1: Qui trình sản xuất nước tương từ đậu nành Đậu nành
Bột mì Xay nhuyễn Giống gốc
Rang chớn Haỏp thanh truứng Moỏc gioỏng trong
1 atm/60 phút ống thạch nghiêng độ ẩm 60%
Moácgioángtrong Làm nguội Tỷ lệ 10% Trộn bột mì bình tam giác
1kg nguyên liệu : 0,3 lít nước muối
1kg nguyên liệu : 1,3 lít nước muối
Ngâm 8-18 giờ Nước 1 Rút nước 2 Bã
Ngaâm Thanh trùng Nước 2 8-18 giờ75-80 o C Rút nước 3
2.3.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 2.3.1.1 Nguyeân taéc
Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng amoniium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac.
(NH4)2SO4 + 2NaOH ∧ 2NH4OH + Na2SO4
Lượng amoniac phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas-Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4 Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH4OH + H2SO4∧ (NH4)2SO4 + H2O
2.3.1.2 Dụng cụ và hóa chất
❖ Duùng cuù Máy Parnas-Wargner
Tủ hút khí độc (Hoffe)
Thuốc thử đỏ metyl 0,5% pha trong rượu etanol
Thuốc thử phenolphtalein 1 % trong etanol
Lấy 6 bình Kjeldahl, thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không Hút chính xác vào ba bình thử thật mỗi bình 1 ml nếu là nguyên liệu lỏng (hoặc 0,1 g nguyên liệu khô nghiền nát), ba bình thử không mỗi bình 1 ml nước cất Tiếp theo cho vào 6 bình Kjeldahl mỗi bình 5 ml H2SO4đậm đặc và khoảng 0,5 g chất xúc tác (hỗn hợp 9 K2SO4: 1 CuSO4) Đem để vào tủ Hoffer đun cho đến khi dung dịch thành trong suốt (khoảng 2-3 giờ) Để nguội.
Lấy 6 bình Kjeldahl ra, mỗi bình được pha loãng với nước cất thành 100 ml bằng bình định mức Sau đó dung dịch đạm được đem xác định lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl.
Thực hiện ba sự thử thật, ba sự thử không để lấy trị số trung bình Phải xác ủũnh heọ soỏ hieọu chổnh x cuỷa dung dũch NaOH N/100 baống dung dũch (COOH)2
Tính lượng Nitơ-tổng số có trong 1 lít nguyên liệu
Gọi Vo là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử khoâng)
Gọi V1 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử thật)
Vậy △V = Vo V1 là lượng NaOH tương đương với lượng đạm amoniac phóng thích bởi 10 ml dịch vô cơ pha loãng
1 mol amonac tương đương với 1 mol NaOH
Do đó số mol amoniac phóng thích bởi 10 ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:
1000 mol =△V x l0 -5 mol Số gam đạm tổng số có trong 10 ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:
Số gam đạm tổng số có trong 10 ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1 ml nguyeõn lieọu :
10 = 14 △V x 10 -4 g Số gam đạm tổng số có trong 1 lít nguyên liệu :
10 = 1,4 x △V g/l 2.3.2 Xác định hàm lượng đạm amoniac bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 2.3.2.1 Nguyeân taéc
Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm nằm dưới dạng “vô cơ” (muối amonium hay những amin dễ bay hơi) Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể, nếu có sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất”.
Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với
MgO sẽ hoạt động theo cơ chế đẩy những loại đạm khỏi dung dịch, khiến đạm bị cuốn theo hơi nước và dẫn vào bình chứa lượng acid dư Thông qua việc xác định lượng acid dư, ta có thể xác định được loại đạm cụ thể.
2(NH4) + + Mg(OH)2 ∧ 2NH3 + 2H2O + Mg 2+
2.3.2.2 Dụng cụ và hóa chất
Bộ chưng cất đạm amoniac
❖ Hóa chất Dung dòch NaOH N/100
Thuốc thử Tashiro (0,1 g đỏ metyl + 0,2 g xanh methylen pha trong 100 ml coàn 96 o )
Lấy 50 ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần (hay cân chính xác một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình cầu 500 ml, thêm vào đó 150 ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5 g MgO, dung dịch phải có màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang một erlen có chứa sẵn 10 ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10 Chưng cất trong 15-20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu sôi Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hất thụ vào dung dịch H2SO4 Lấy erlen ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi laáy ra). Định phân lượng acid dư bằng NaOH có chuẩn độ là x.N/10 từ màu xanh tím sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai Thực hiện ba thử thật và ba thử không.
Gọi Vo ml là thể tích NaOH N/10 trung bình của ba lần thử không
Gọi Vt ml là thể tích NaOH N/10 trung bình của ba lần thử thật
Hiệu số △V = Vo _ Vt là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã được hấp thụ trong H2SO4
Số mol NaOH chính là số mol đạm amoniac phóng thích:
Số gam đạm phóng thích:
Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:
( 2,5) g/l hay số gam đạm có trong 100 g nguyên liệu:
△V x 14 10 -4 100 m △V.x.10 -2 m g/100g x là hệ số hiệu chỉnh của NaOH N/10
2.3.3 Xác định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen
Trong một hỗn hợp gồm protein, peptid, acid amin, amin, amoniac… để xác định gần đúng loại đạm “phi protein” người ta thường dùng phương pháp Sorensen.
Trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu chức là carboxylic (_COOH) như là một acid còn đầu kia là chức amin (_NH2) xem như là một base; còn các amin tự do cũng như amoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng amonium NH4 + kết hợp với 1 anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol sẽ tác dụng lên nhóm _NH2 để tạo thành phức chất metilen (mono, tri hoặc hexametilen).
HCOOC_CH_NH2 + HCHO ∧ HOOC_CH_N=CH2 + H2O
R_NH4 +Cl + HCHO ∧ R_N = CH2 + H2O + HCl