Việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết DNA sẽ giúp tăng hàm lượng cũng như độ tinh sạch DNA thu được Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt tron
TỔNG QUAN
METAGENOMICS
Metagenomics là ngành nghiên cứu về metagenome, vật liệu di truyền được thu nhận một cách trực tiếp từ mẫu môi trường thay vì nuôi cấy
Các nghiên cứu đã cho thấy rằng chỉ có 0,001-0,1% của tổng số vi khuẩn trong nước biển, 0,25% trong nước ngọt, 0,25% trong trầm tích và chỉ 0,3% vi sinh vật đất là có thể nuôi cấy được trong ống nghiệm, còn lại là không thể nuôi cấy được[2] Nghiên cứu về metagenomics giúp cho việc nuôi cấy các vi sinh vật từ các môi trường trở nên dễ dàng hơn và có thể ứng dụng chúng trong việc phát triển các sản phẩm mới Hiện nay việc nghiên cứu metagenomics phát triển mạnh do đã tạo ra được các vector tạo dòng hiệu quả như chromosomes nhân tạo của vi khuẩn (BACs), cosmids [26] cho phép ta tạo dòng và biểu hiện một lượng lớn các đoạn DNA phức tạp, nhờ đó tạo được thư viện metagenome chứa toàn bộ DNA của vi sinh vật lấy từ môi trường nghiên cứu
2 CÁC ỨNG DỤNG CỦA METAGENOMICS
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất thải, tạo ra các loại thuốc mới, sản xuất các nhựa thân thiện với môi trường, hoặc thậm chí được dùng làm thức ăn
Nghiên cứu về metagenomics có thể cải thiện các chiến lược để theo dõi ảnh hưởng của các chất gây ô nhiễm trên các hệ sinh thái và từ đó có các biện pháp thích hợp để xử lý môi trường
Việc thu nhận được nguồn gen từ những vi sinh vật không nuôi cấy được đã dẫn đến sự phát hiện ra các gen mới, các enzyme và các sản phẩm mới từ đó tác động đến sự phát triển trong các lĩnh vực hóa chất, nông nghiệp và dược phẩm
Khám phá ra những enzyme mới cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học, hoặc hỗ trợ việc tìm hiểu động lực học của quần thể vi sinh vật ảnh hưởng tới sự lây lan nguồn bệnh, vệ sinh an toàn thực phẩm, hiệu quả thức ăn và sự thải khí nhà kính
Một số ứng dụng cụ thể của metagenomics:
2.1 Thuốc kháng sinh và dược phẩm
Nguồn genome từ đất là tiềm năng to lớn tác động đến việc sản xuất thuốc đặc biệt là thuốc kháng sinh Một dòng được phát hiện trong thư viện metagenomics từ đất sản xuất được deoxyviolacein và kháng sinh phổ rộng
10 violacein [4] Thư viện metagenomics cũng được dùng để tách các gen đề kháng với các thuốc kháng sinh tự nhiên
Một nghiên cứu metagenomics về sự đa dạng của vi khuẩn trong môi trường có khả năng sử dụng 4-hydroxybutyrate đã phát hiện ra 5 dòng biểu hiện được enzyme 4-hydroxybutyrate dehydrogenase dưới dạng hoạt động [10] Chất xúc tác sinh học alcohol oxidoreductases có khả năng oxy hóa những chuỗi polyols ngắn rất hữu ích trong công nghiệp dùng để sản xuất các ester chiral hydroxyl, hydroxyl acid, amino acid và cồn [13]
Trong một nghiên cứu về sự sàng lọc thư viện metagenomics từ đất đã phát hiện ra một dòng amidase dương tính [22] Amidase được dùng trong sinh tổng hợp các kháng sinh β-lactam Một phương pháp nghiên cứu chuyên biệt về amidases bằng cách làm giàu metagenome từ đất đã phát hiện ra 7 dòng amidase dương tính, một trong số đó mã hóa cho enzyme penicillin acylase [9]
Nghiên cứu về metagenomic từ đất đã được áp dụng để tìm kiếm các gen mới mã hóa tổng hợp các Vitamin như biotin [9] 7 cosmid đã được phát hiện trong thư viện metagenomics sau khi làm giàu avidin từ các mẫu môi trường và trong nghiên cứu này đã phát hiện ra một cosmid thu được từ đất rừng sản xuất được lượng biotin cao nhất [9]
2.5 Giảm mạch polysaccharide/biến đổi enzyme/gen thủy phân tinh bột:
Cellulase có rất nhiều ứng dụng trong các nghành công nghiệp: hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, bia rượu, thức ăn chăn nuôi, dệt may và quần áo, giấy và bột giấy, nông nghiệp Chọn lọc trong thư viện metagenomics từ đất đã xác định ra
8 dòng cellulolytic, một trong số đó đã được tinh sạch và đặc trưng [23] Enzyme agarase cũng được xác định trong quá trình chọn lọc thư viện metagenomics từ đất, trong đó có 4 dòng agarolytic chứa 12 gen agarase được xác định [22]
Phân tích thư viện metagenome đã phát hiện được một số gen mã hóa cho enzyme lipolytic (esterase và lipase) Esterase EstCE1 bắt nguồn từ metagenome từ đất [7] Sự ổn định cao của enzyme này rất hữu ích cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học
3 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ METAGENOMICS
3.1 Lấy mẫu và tách chiết nucleic acid
Trong quá trình nghiên cứu về metagenomics mẫu thí nghiệm có thể lấy từ các môi trường khác nhau: đất, nước,… Hệ vi sinh vật trong đất rất đa dạng với các thành phần cấu tạo tế bào khác nhau, do đó rất nhạy cảm trong quá trình tách chiết vì vậy cần có các phương pháp tách chiết thích hợp Mặc dù có rất nhiều bộ kit thương mại dùng để tách chiết DNA từ các mẫu môi trường nhưng cần có các phương pháp tách chiết chuyên biệt được tối ưu hóa nhằm thu được lượng DNA cao nhất Có 2 phương pháp tách chiết:
− tách trực tiếp: ly giải các tế bào trong mẫu đất để thu nhận DNA
− tách gián tiếp: thu lấy các tế bào vi sinh vật từ đất sau đó ly giải để thu nhận DNA Đất là môi trường đặc biệt phức tạp, chứa rất nhiều vi sinh vật và các hợp chất khác nhau rất dễ bị ly giải trong quá trình tách chiết ví dụ như acid humic, một chất có thể được thu nhận đồng thời trong quá trình tách chiết DNA Cần phải loại bỏ acid humic trước khi tiến hành tinh sạch DNA Một trong những cách tốt nhất để loại bỏ các tạp chất trong DNA đất là sử dụng cột sắc ký Sephadex G-200 [15] Gần đây một kỹ thuật khác được sử dụng là dùng gel aragose gồm 2 pha trong đó có 1 pha dùng polyvinylpyrrolidone (PVP) để loại bỏ acid humic [18]
3.2 Xây dựng thư viện metagenome
Ly trích toàn bộ DNA vi sinh vật có trong môi trường nghiên cứu (đất, nước , côn trùng hay người) Dùng enzyme giới hạn cắt DNA thành từng đoạn ngắn, sau đó chèn vào vector thích hợp (plasmid, cosmid, phage, BAC) Chuyển những vector này vào tế bào ký chủ (thường là E.coli) Tiến hành giải trình tự rồi so sánh tổng hợp các dữ liệu Kết quả là tạo thư viện metagenome chứa toàn bộ DNA của vi sinh vật lấy từ môi trường nghiên cứu
LACCASE
Laccase (p-benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học [14]
2 Cấu trúc phân tử của laccase
Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 - 45% so với khối lượng của thành phần protein Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kD Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% [12]
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên
15 tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Hình 1.2, 1.3) [14]
Hình 1.2- Hình ả nh không gian ba chi ề u c ủ a laccase t ừ M Albomyces Ti ể u ph ần A, B, C đượ c kí hi ệu đỏ , xanh l ụ c và xanh lá cây
Hình 1.3 - Trung tâm ho ạt độ ng c ủ a laccase
3 Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [1] Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu 2+ ) trở thành dạng Cu + , hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu + ) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.4)
Hình 1.4 - Cơ chế xúc tác c ủ a laccase
Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator) Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [19] Sau đó
17 mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác Ngược lại , laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.5) Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonic acid) (ABTS), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N- hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v [19] Sự tham gia của mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase
Hình 1.5 - Các ki ể u xúc tác c ủ a laccase
A Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator
B Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator
Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên tử và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn Các hợp chất chứa sulfurhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được coi là các chất ức chế laccase
4 Tính ch ấ t hóa sinh c ủ a laccase
Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis - Menten (Km) Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2 – 500àM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất Giỏ trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử 2,6- dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide) Ái lực đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong khoảng 20 - 50àM
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 - 6 đối với cơ chất phenolic Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị
18 giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 - 3 Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 - 9
Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50 o C và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60 o C Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là
100 phút ở 70 o C và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80 o C Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 70 o C và dưới 10 phút ở 80 o C [1,14,20]
5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây
Rhus vernicifera Việc nghiên cứu laccase trên đối tượng thực vật và nấm đảm rất phổ biến Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces Ngoài ra các các loài nấm như Ascomyces, Deuteromyces, Basidomyces và các loài nấm có khả năng phân hủy ligincellulose như Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotus ostrotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tượng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase được miêu tả ở phụ lục 1
Trong vài thập kỷ gần đây, gene sinh tổng hợp laccase đã bắt đầu đƣợc nghiên cứu Cho đến nay đã có hơn 100 gene sinh tổng hợp laccase được đánh giá và so sánh Các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên đối tượng vi sinh vật Năm 1998 gene laccase đầu tiên được phân lập và giải trình tự từ nấm đảm Neurospora crassa và nấm sợi Aspergillus nidulans Tuy nhiên các gene tương ứng với các protein laccase hoàn chỉnh mới chỉ có khoảng 20 gene, phần lớn trong số đó là từ nấm đảm (Phụ lục 2)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
1.1 Đất rừng Nam Cát Tiên
Vị trí 1: cây gõ bác Đồng Vị trí 2 : Bầu Sấu Vị trí 3 Độ sâu
B ả ng 2.1 – V ị trí l ấ y m ẫu đấ t r ừ ng Nam Cát Tiên
1.2 Đất rừng ngập mặn Cần Giờ
Vị trí 1: Đảo khỉ Vị trí 2 : rừng Vàm
Sát Vị trí 3 Độ sâu
B ả ng 2.2 – V ị trí l ấ y m ẫu đấ t r ừ ng ng ậ p m ặ n C ầ n Gi ờ
− Máy đo quang phổ hấp thụ (HP845X UV – visible, HEWLLETT PackaRD 8453)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Tách chiết Genomic DNA theo Protocol [24]
▪ Cân 5 g mẫu đất vào erlen 50 ml
▪ Thờm 13,5 ml lysis buffer + 100 àL proteinase K (10 mg/ml) vào erlen Đem vào máy lắc, ủ ở 37 o C trong 30 phút
(Lysis buffer: 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM sodium EDTA pH 8.0, 100 mM sodium phosphate pH 8.0, 1,5 M NaCl và 1% CTAB )
▪ Thêm 1,5 ml 20% SDS Ủ ở 65 o C trong 30 phút, lắc trộn nhẹ nhàng sau mỗi
15 phút Giai đoạn này nhằm phá vỡ màng tế bào và màng nhân Các DNA sẽ được giải phóng ra môi trường Các protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy
▪ Chuyển toàn bộ dịch đất từ erlen sang ống ly tâm 50 ml Ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
▪ Thu dịch sau khi ly tâm và chuyển sang ống ly tâm sạch khác
▪ Thêm vào trong ống ly tâm hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (tỉ lệ thể tích là 24:1) với tỉ lệ 1:1 nhằm làm biến tính protein Sau khi ly tâm loại protein
(nằm giữa pha nước và chloroform/isoamyl alcohol) sẽ thu được nucleic acid (ở pha nước)
▪ Ly tâm ở 6500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C
▪ Thu dịch nổi (chứa nucleic acid) và chuyển sang ống ly âm sạch khác
▪ Thêm vào trong ống ly tâm isopropanol với tỉ lệ 1 dung dịch:0,6 isopropanol nhằm tủa DNA Các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khỏi dịch chiết bằng cách này
▪ Ly tâm ở 13000 vòng /phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
▪ Thu tủa, rửa tủa với 3 ml cồn lạnh 70 o Chuyển dịch sang ống eppendorf sạch Giai đoạn này nhằm loại bỏ các muối và các dấu vết isopropanol
▪ Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
▪ Để tủa DNA khô ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
▪ Pha loóng tủa DNA với 200 àl nước cất 2 lần Vortex cho tủa DNA tan hoàn toàn Bảo quản ở 4 o C
2 Tinh sạch DNA bằng phương pháp khoét giếng [17]
Mục tiêu: Tinh sạch một lượng lớn genomic DNA từ vi sinh vật trong môi trường tự nhiên tạo điều kiện cho việc xây dựng thư viện metagenomics
Phương pháp và kết quả: Tách chiết genomic DNA từ đất sau đó tinh sạch DNA bằng phương pháp khoét giếng bằng cách chạy điện di trên gel agarose với sự hiện diện của PEG8000 30% Phương pháp này đơn giản, tinh sạch được một lượng lớn DNA và ít thất thoát DNA
▪ Chạy điện di 30 àl mẫu DNA đất (đó tỏch chiết từ 5 g đất) trong gel agarose 0,8% với 0,1 – 0,5 àg/ml ethidium bromide ở 100 volt trong 40 phỳt
▪ Quan sát vạch DNA dưới đèn UV Dùng dao lam khoét 1 giếng trên gel agarose rộng 1cm ngay sau vạch DNA
▪ Hút hết gel agarose trong giếng đó, cho vào đầy giếng 30% PEG8000 trong dung dịch đệm TAE
( PEG8000 là polyethylene glycol có trọng lượng phân tử = 8000 )
▪ Tiếp tục chạy điện di thêm 30 phút cho đến khi băng DNA vào hết trong giếng chứa PEG8000
▪ Thu toàn bộ dịch trong giếng sang eppendorf sạch
▪ Thêm vào hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol ( tỉ lệ thể tích là 24:1)
▪ Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C
▪ Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf sạch khác
▪ Thờm vào eppendorf 2 àl glycogen (10 mg/ml), 50 àl sodium acetate 3 M, trộn đều Tiếp tục thêm 1 ml cồn lạnh 96 o Ủ ở -80 o C trong 20 phút
▪ Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C
▪ Thu tủa DNA, rửa tủa với 1ml cồn lạnh 70 o
▪ Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C
▪ Để tủa DNA khô ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
▪ Pha loóng tủa DNA với 35 àl TE Vortex cho tủa tan hoàn toàn Bảo quản ở
Hình 2.1 – Tinh s ạ ch DNA b ằng phương pháp khoét giế ng
3 Phương pháp xác đị nh ho ạ t tính enzyme laccase
Mục đích: xác định xem trong đất có vi sinh vật sản xuất enzyme lasscase không, hoạt tính có cao hay không để từ đó tiến đến việc thu nhận nguồn gen cho sản xuất enzyme trên quy mô công nghiệp
Mẫu thí nghiệm: tiến hành thu nhận các mẫu đất rừng Nam Cát Tiên ở các vị trí khác nhau, mỗi mẫu đất dùng 3 ống nghiệm trong một lần đo và lấy giá trị trung bình Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Sau đó DNA được tách chiết với chloroform/isoamyl alcohol, kết tủa bằng ethanol và pha loãng trong nước
Chạy điện di trên gel agarose
Khoét giếng và cho đầy giếng 30% PEG8000 trong TAE
Chạy điện di tiếp đến khi DNA vào hết trong giếng
− Pha 50 mM dịch đệm natri acetate pH 5.0 (dùng HCl để điều chỉnh pH ) Bảo quản đệm ở 4 o C và thường xuyên kiểm tra pH
− Pha 20 – 50 ml ABTS 5 mM trong chai có màu tối để tránh bị oxy hóa, đậy kín và bảo quản ở 4 o C
− Trộn mẫu đất với 91 ml đệm acetate 50 mM
− Đồng nhất với máy trộn trong 1 phút, ngưng trộn và lắc tròn để loại bỏ đất bị dính ớ mép, đánh tan thêm 1 phút
− Đổ dịch vào bình và giữ lạnh cho tới khi sử dụng
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxi hóa ABTS (2,2’-azino-bis 3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) bởi laccase thành hợp chất được hấp thụ ánh sáng mạnh tại bước sóng 420 nm Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành 1 àM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phỳt, ở điều kiện thớ nghiệm
Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml) Đệm acetate (50 mM), pH 5 2,4 1,8
B ả ng II.3 – Các thành ph ần trong xác đị nh ho ạ t tính enzyme laccase
Phản ứng xảy ra khi cho ABTS vào hỗn hợp Giá trị OD đo sau 3 phút
Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l) ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 420 nm, ε = 36.000 (M -1 cm -1 )
Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)
VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) Odτ: Giá trị OD đo được tại thời điểm τ
ODo: Giá trị OD đo được tại thời điểm τ = 0
Df: Độ pha loãng t: Thời gian phản ứng
4 Công thức tính hàm lượng DNA trong 5 g đất
▪ Nồng độ DNA (ng/àl) = OD260 x độ pha loóng x 50 ng/àl
Tất cả các thí nghiệm trong bài đều được đo OD với độ pha loãng = 100 lần
Vỡ tủa DNA được pha loóng với 200 àl nước cất 2 lần nờn
▪ Hàm lượng DNA (mg)/5 g đất = nồng độ DNA x 200 /10 -6
5 Tách chiết và tinh sạch 5 g mẫu đất rừng Nam Cát Tiên và rừng ngập mặn Cần Giờ
− Tiến hành tách chiết theo như các bước trong Protocol
− Chạy điện di các mẫu DNA đất
− Đo OD260, OD280 để xác định mức độ tinh sạch và hàm lượng DNA trong 5 g đất
− Tiến hành tinh sạch 2 mẫu DNA đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 10 cm) và đất rừng ngập mặn Cần Giờ (độ sâu 10 cm)
− Đo OD260, OD280 để xác định hàm lượng DNA sau khi tinh sạch, tính hiệu suất tinh sạch
6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết genomic DNA đất
6.1 Kh ả o sát th ờ i gian ủ SDS
SDS có vai trò phá hủy màng tế bào và màng nhân Thời gian ủ SDS dài hay ngắn đều có ảnh hưởng đến quá trình tách chiết cũng như hàm lượng DNA thu
28 được Việc xác định thời gian ủ SDS thích hợp là cần thiết trong mục đích tối ưu hóa tách chiết
− Tách chiết 3 mẫu đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 30 cm) theo như Protocol, mỗi mẫu đất ứng với thời gian ủ SDS lần lượt là 30, 45 và 60 phút
− Đo OD260, OD280 để xác định hàm lượng DNA trong 5 g đất, từ đó so sánh xác định được thời gian ủ SDS tối ưu nhất
− Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn 1 kết quả thí nghiệm tiêu biểu nhất
6.2 Kh ả o sát n ồng độ SDS
Việc khảo sát nồng độ SDS thích hợp sẽ giúp tiết kiệm được chi phí đồng thời làm tăng hàm lượng DNA thu được
− Tách chiết 3 mẫu đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 30 cm) theo như Protocol, mỗi mẫu đất ứng với nồng độ SDS lần lượt là 10%, 20%, 40% SDS
− Đo OD260, OD280 để xác định hàm lượng DNA trong 5 g đất, từ đó xác định được nồng độ SDS tối ưu nhất
− Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn 1 kết quả thí nghiệm tiêu biểu nhất
6.3 So sánh tác độ ng c ủ a proteinase K, lysozyme và không có b ổ sung enzyme
Proteinase K có vai trò phân giải protein của vi sinh vật và loại bỏ các chất tạp nhiễm, lysozyme có khả năng phân giải vách tế bào của vi khuẩn Thí nghiệm nhằm khảo sát xem enzyme nào hoạt động tốt nhất cho việc tách chiết DNA
− Tách chiết 3 mẫu đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 30 cm) theo như Protocol, mẫu 1 thêm proteinase K, mẫu 2 thêm lysozyme, mẫu 3 không thêm enzyme
− Đo OD260, OD280 để xác định hàm lượng DNA trong 5 g đất, từ đó xác định được enzyme nào hoạt động tốt nhất
− Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn 1 kết quả thí nghiệm tiêu biểu nhất
6.4 Kh ả o sát th ờ i gian ủ proteinase K
Chọn được thời gian ủ proteinase K tối ưu nhất cho quá trình tách chiết
− Tách chiết 4 mẫu đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 30 cm) theo như Protocol, mỗi mẫu đất ứng với thời gian ủ proteinase K lần lượt là 15, 30, 45 và 60 phút
− Đo OD260, OD280 để xác định hàm lượng DNA trong 5 g đất, từ đó xác định thời gian ủ proteinase K tối ưu nhất
− Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn 1 kết quả thí nghiệm tiêu biểu nhất
7 Khuếch đại gene bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được sử dụng rất phổ biến trong công nghệ sinh học và đóng góp to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử Trong nghiên cứu này ta dùng cặp mồi Cu1F/Cu2R [16] để khuếch đại đoạn gen dựa vào trình tự có tính bảo thủ cao của gen 16S rDNA của sinh vật eukaryote
Mồi xuôi Cu1F: 5’-CAT(C) TGG CAT(C) GGN TTT(C)TTT(C) CA-3’
Mồi ngược Cu2R: 5’-G G(A)CT GTG GTA CCAGAA NGT NCC-3’
Thành phần Nồng độ Thể tớch sử dụng (àl)
Thiết lập phản ứng PCR trên máy luân nhiệt như sau:
❖ Giai đoạn 2: 35 chu kỳ gồm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Tách chiết 2 mẫu đất rừng Nam Cát Tiên và rừng ngập mặn Cần Giờ
1: Đất rừng Cát Tiên độ sâu 10 cm 2: Đất rừng Cát Tiên độ sâu 30 cm 3: Đất rừng Cát Tiên độ sâu 60 cm
Hình 3.1 - K ế t qu ả ch ạy điệ n di r ừ ng Nam Cát Tiên
1.2 Kết quả đo OD và hàm lượng DNA trong 5 g đất
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280
Hàm lượng DNA (mg)/5g đất
B ả ng 3.1 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a 2 lo ại đấ t r ừ ng
1: Đất rừng ngập mặn Cần Giờ độ sâu 10 cm 2: Đất rừng ngập mặn Cần Giờ độ sâu 30 cm 3: Đất rừng ngập mặn Cần Giờ độ sâu 60 cm
Hình 3.2 - K ế t qu ả ch ạy điệ n di r ừ ng ng ậ p m ặ n C ầ n Gi ờ
34 Đồ th ị 3.1 – So sánh hàm lượ ng DNA gi ữ a 2 lo ại đấ t ở các độ sâu khác nhau
▪ Các mẫu đất đều có OD260/OD280 nằm ngoài khoảng 1,8 – 2,0 nên đều chưa sạch còn lẫn tạp chất
▪ Đất rừng Nam Cát Tiên (độ sâu 10 cm) và đất rừng ngập mặn Cần Giờ (độ sâu
10 cm) có hàm lượng DNA cao nhất so với các độ sâu còn lại trong cùng loại đất do có sự giảm dần về thành phần và số lượng vi sinh vật theo độ sâu vào 34ell đất
▪ Đất rừng Nam Cát Tiên có hàm lượng DNA cao hơn đất rừng Cần Giờ do Cần Giờ là vùng đất ngập mặn có mật độ vi sinh vật thấp, đa số là các vi sinh vật chịu mặn, sự đa dạng về hệ vi sinh vật đất thấp
▪ Ở các độ sâu 30 cm và 60 cm của 2 loại đất rừng hàm lượng DNA chênh lệch không đáng kể do có thể là mật độ vi sinh vật phân bố tương đối đồng đều
Tinh sạch DNA 2 loại đất rừng
2.1 Kết quả chạy điện di
2.2 Kết quả đo OD của trước và sau tinh sạch của 2 loại đất rừng
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280
Cát Tiên 10 cm 0,306 0,157 1,95 Cần Giờ 10cm 0,033 0,0175 1,88
B ả ng 3.2 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a 2 m ẫu DNA đã tinh sạ ch
✴ Đất rừng Nam Cát Tiên 10 cm:
▪ Ta dựng 30 àl dịch DNA để tinh sạch DNA nờn hàm lượng DNA trong 30 àl bằng 0,799 x 30 /200 = 0,11985 (mg)
▪ Nồng độ DNA tinh sạch (ng/àl) = 0,306 x 100 x 50 = 1530 (ng/àl)
1: Đất rừng Cát Tiên độ sâu 10 cm trước tinh sạch 2: Đất rừng Cát Tiên độ sâu 10 cm sau tinh sạch 3: Đất rừng ngập mặn Cần Giờ độ sâu 10 cm trước tinh sạch 4: Đất rừng ngập mặn Cần Giờ độ sâu 10 cm sau tinh sạch
Hình 3.3 – K ế t qu ả ch ạy điệ n di c ủ a 2 lo ại đấ t r ừng trướ c và sau tinh s ạ ch
Vỡ DNA sau khi tinh sạch được pha loóng với 35 àl TE nờn
▪ Hàm lượng DNA tinh sạch (mg) = 1530 x 35 /10 -6 = 0.05355 (mg)
✴ Đất rừng ngập mặn Cần Giờ 10 cm:
▪ Hàm lượng DNA trong 30 àl dịch DNA = 0,111 x 30 /200 = 0,01665 (mg)
▪ Nồng độ DNA tinh sạch (ng/àl) = 0,033 x 100 x 50 = 165 (ng/àl)
▪ Hàm lượng DNA tinh sạch (mg) = 165 x 35 /10 -6 = 0.005775 (mg)
Hiệu suất tinh sạch của phương pháp này tương đối thấp so với tinh sạch bằng bộ kit vì phương pháp này thao tác qua nhiều giai đoạn gây mất mát DNA trong suốt quá trình tinh sạch, không thể kết tủa hết được lượng DNA bằng isopropanol ngoài ra có thể do sai sót trong thao tác khoét giếng Tuy nhiên phương pháp này lại có nhiều ưu điểm như: đơn giản, rẻ tiền, không đòi hỏi dụng cụ thí nghiệm phức tạp, có thể tinh sạch được một lượng lớn DNA do đó có thể được ứng dụng rộng rãi
Mẫu đất Hàm lượng DNA (mg) Hiệu suất tinh sạch
B ả ng 3.3 – Hàm lượ ng DNA c ủ a 2 lo ại đất trướ c và sau tinh s ạ ch
37 Đồ th ị 3.2 – So sánh hàm lượ ng DNA c ủ a 2 lo ại đấ t r ừng trướ c và sau tinh s ạ ch
3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết genomic DNA đất
3.1 Khảo sát thời gian ủ SDS
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280
Hàm lượng DNA (mg)/5g đất
B ả ng 3.4 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát th ờ i gian ủ SDS
Cát Tiên 10 cm Cần Giờ 10 cm
Mẫu đất trước tinh sạch sau tinh sạch
38 Đồ th ị 3.3 – So sánh hàm lượ ng DNA c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát th ờ i gian ủ SDS
Nếu ủ SDS trong thời gian ngắn (≤ 30 phút) thì lượng DNA thu được thấp Thời gian ủ SDS tăng lên thì hàm lượng DNA thu được cũng tăng, tuy nhiên nếu ủ SDS quá lâu thì lượng DNA thu được lại giảm do một phần DNA bị cắt đứt Thực tế thí nghiệm cho thấy mẫu đất CT30_45’SDS có hàm lượng DNA cao hơn so với
2 mẫu còn lại ⇒ Thời gian ủ SDS 45 phút là tối ưu cho quá trình tách chiết genomic DNA
3.2 Khảo sát nồng độ SDS
3.2.1 Kết quả chạy điện di
CT30_30'SDS CT30_45'SDS CT30_60'SDS
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280 Hàm lượng DNA
B ả ng 3.5 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát n ồng độ SDS
1: Đất rừng Cát Tiên 30 cm với 10% SDS 2: Đất rừng Cát Tiên 30 cm với 20% SDS 3: Đất rừng Cát Tiên 30 cm với 40% SDS
Hình 3.4 – K ế t qu ả ch ạy điệ n di kh ả o sát n ồng độ SDS
40 Đồ th ị 3.4 – So sánh hàm lượ ng DNA c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát n ồng độ SDS
Khi tăng nồng độ SDS thì lượng DNA thu được tăng lên, tuy nhiên nếu tăng quá nhiều thì lượng DNA thu được sẽ giảm do một phần DNA bị cắt đứt Bên cạnh đó việc tăng thể tích SDS sẽ làm tăng chi phí mà lượng DNA lại tăng lên không đáng kể Thực tế thí nghiệm cho thấy mẫu đất CT30_20% SDS có hàm lượng DNA cao hơn so với 2 mẫu còn lại ⇒ Dùng 1,5 ml 20% SDS là tối ưu cho quá trình tách chiết genomic DNA
3.3 So sánh tác động của proteinase K, lysozyme và không có bổ sung enzyme
3.3.1 Kết quả chạy điện di
CT30_10% SDS CT30_20% SDS CT30_40% SDS
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280
Hàm lượng DNA (mg)/5g đất
B ả ng 3.6 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a thí nghi ệ m so sánh tác độ ng c ủ a proteinase K, lysozyme và không có b ổ sung enzyme
Hình 3.5 – K ế t qu ả ch ạy điện di so sánh tác độ ng c ủ a proteinase K, lysozyme và không có b ổ sung enzyme
42 Đồ th ị 3.5 – S o sánh hàm lượ ng DNA c ủ a thí nghi ệ m so sánh tác độ ng c ủ a proteinase K, lysozyme và không b ổ sung enzyme
Enzyme proteinase K có tác dụng làm tan màng protein của vi sinh vật còn lysozyme chỉ có tác dụng phá hủy vách tế bào của nhiều loài vi khuẩn Trong đất tồn tại nhiều loài vi sinh vật khác nhau do đó proteinase K có tác động bao quát hơn lysozyme Thực tế thí nghiệm cho thấy proteinase K có hoạt tính cao hơn lysozyme: mẫu đất CT30_proteinase K có hàm lượng DNA cao hơn so với 2 mẫu còn lại ⇒ Nên dùng proteinase K cho quá trình tách chiết genomic DNA
3.4 Khảo sát thời gian ủ proteinase K
CT30_lysozyme CT30_proteinase K CT30_không enzyme
B ả ng 3.7 – S ố li ệ u OD 260 và OD 280 c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát th ờ i gian ủ proteinase K Đồ th ị 3.6 – So sánh hàm lượ ng DNA c ủ a thí nghi ệ m kh ả o sát th ờ i gian ủ proteinase K
Thời gian ủ proteinase K tăng lên không có tác dụng làm tăng hàm lượng DNA vì nếu ủ quá lâu dễ dẫn đến DNA bị cắt đứt bởi các enzyme có trong môi trường Ngược lại nếu ủ proteinase K quá ngắn thì lại không đủ thời gian làm tan màng protein Thực tế thí nghiệm cho thấy mẫu đất CT30_30’ pro K có hàm lượng DNA cao hơn so với 2 mẫu còn lại ⇒ Ủ proteinase K trong thời gian 30 phút là tối ưu cho quá trình tách chiết genomic DNA
Mẫu đất OD260 OD280 OD260/OD280 Hàm lượng DNA
Xác định hoạt tính enzyme laccase
Để tiến hành xác định hoạt tính enzyme laccase tốt ta nên thu mẫu đất rừng Nam Cát Tiên ở các vị trí khác nhau trong cùng điều kiện khí hậu, nhiệt độ và nên lấy mẫu đất có độ ẩm thích hợp (tốt nhất nên lấy mẫu vào màu mưa) tiến hành đo hoạt tính ngay sau khi lấy mẫu về để đảm bảo hoạt tính enzyme còn cao Mẫu đất được thu nhận chủ yếu ở 2 khu vực Gõ Bác Đồng và Bầu Sấu Mỗi mẫu đất dùng 3 ống nghiệm để đo hoạt tính trong một lần đo và lấy giá trị trung bình Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và chọn 1 kết quả tiêu biểu nhất Trong các lần thí nghiệm hoạt tính enzyme giữa các mẫu đất có sự chênh lệch nhưng tổng thể thì mẫu đất ở Bầu Sấu có hoạt tính enzyme cao hơn mẫu đất ở Gõ Bác Đồng [phụ lục 3]
Thí nghiệm cho thấy các mẫu đất đều có enzyme laccase do đó có thể tiến hành thu nhận nguồn gen từ các mẫu đất này cho việc sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng trong công nghiệp
B ả ng 3.7 – Ho ạ t tính enzyme laccase c ủ a các m ẫu đấ t
45 Đồ th ị 3.7 – So sánh ho ạt độ enzyme laccase gi ữ a các m ẫu đấ t
Khuếch đại gen quy định enzyme laccase bằng kỹ thuật PCR
Hình 3.6 - Tinh s ạ ch DNA t ừ các m ẫu đấ t
Các mẫu DNA sau khi tinh sạch được dùng để chạy PCR khuếch đại đoạn gen quy định enzyme laccase dựa vào trình tự bảo tồn 16S rDNA với cặp mồi Cu1F và Cu2R Tuy nhiên sau khi chạy PCR nhiều lần vẫn không có kết quả Lý
46 do là có thể trong quá trình tách chiết và tinh sạch đã làm mất đoạn gen cần thiết nên kết quả là PCR âm tính