Metagenomics có thể định nghĩa là “sự áp dụng những kỹ thuật genomic hiện đại để nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường sống tự nhiên của chúng”, đường t
TỔNG QUAN
KHÁI NIỆM METAGENOMIC
Metagenomics là gì ? Được đúc kết bởi Handelsman và những thành viên trong trường đại học Wisconsin, khoa bệnh lý thực vật trong năm 1982, Metagenomics là lĩnh vực nghiên cứu mới nó cho phép nghiên cứu bộ gen được thu về từ mẫu môi trường Metagenomics có thể định nghĩa là “sự áp dụng những kỹ thuật genomic hiện đại để nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường sống tự nhiên của chúng”, đường tắc để phân lập và sự nuôi cấy cá thể loài vi sinh vật trong phòng thí nghiệm Kỹ thuật Metagenomic phân tích hỗn hợp bộ gen vi sinh vật không dựa vào sự nuôi cấy [15]
Phương pháp Metagenomics khai thác công nghệ gien hiện đại để phân tích DNA từ các mẫu môi trường mà không cần nuôi cấy vi sinh vật Kỹ thuật này ban đầu được sử dụng để nghiên cứu DNA cổ đại và hệ vi sinh vật chưa nuôi cấy, nhưng hiện nay đã mở rộng ứng dụng trong khám phá đa dạng hệ vi sinh ở các môi trường như biển sâu, đất và hệ tiêu hóa của người và động vật.
Nhiều cuộc nghiên cứu chứng tỏ chỉ 0,001 – 0,1% tổng số vi sinh vật trong nước biển, 0,25% trong nước sạch, 0,25% trong trầm tích và chỉ 0,3% số vi sinh vật trong đất có thể được nuôi cấy trong ống nghiệm những nghiên cứu hiện hành của kỹ thuật Metagenomic đã có một tiến triển lớn lao nhờ những cấu trúc vector tạo dòng gen hiệu quả như là nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BACs) hay cosmids Nó cho phép tạo dòng và biểu hiện những đoạn DNA lớn và phức tạp [15]
Sự đa dạng vi sinh vật toàn cầu hiện diện với số lượng lớn, phần lớn chưa định danh được tính di truyền và tính sinh hóa chung mà có thể khai thác cho việc nghiên cứu những gen mới, những phân tử sinh học cho con đưuờng biến dưỡng và những sản phẩm với giá tri khác nhau Mặt dù tính quan trọng rõ ràng của vi sinh vật, nhưng chỉ rất ít sự hiểu biết về sự đa dạng của chúng Ví dụ là có bao nhiêu loài hiện diện trong môi trường và mỗi loài có chức năng gì đối với sinh thái mà chúng đang sống? Cho đến gần đây, không có một kỹ thuật thích hợp nào có thể dùng được để trả lời những câu hỏi quan trọng này Bởi do sự giới hạn trong việc nuôi cấy vi sinh vật Theo phương pháp truyền thống nuôi cấy vi sinh vật trong thì sự phân tích sẽ bị giới hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm
Phương pháp thực hiện Metagenomics mang ý nghĩa của sự nghiên cứu có hệ thống phân loại và tận dụng toàn bộ vật liệu di truyền được phân tách từ mẫu thu được trong môi trường sống Phương pháp thực hiện bao gồm sự phân tách DNA từ những nguồn môi trường và tạo dòng chúng vào vectors Để tăng bản sao bằng việc nuôi cấy vi sinh vật chứa vector tạo dòng đó
Phương pháp Metagenomics dựa vào tính hiệu quả của 3 bước chính :
1 Sự chuẩn bị mẫu và sự tách chiết acids nucleic
3 Phân tích thư viện Metagenomics
❖ Sự chuẩn bị mẫu và tách chiết acids nucleic
Trong phương pháp Metagenomics Những mẫu có thể từ bất kỳ môi trường nào, đất hay môi trường sống kể cả hệ thống sinh thái trong ruột Một cách rõ ràng, cộng đồng vi sinh vật đất là hỗn hợp vi sinh vật thái cổ, vi khuẩn và sinh vật nguyên sinh, thể hiện sự đa dạng đặc tính thành tế bào và sự khác nhau về tính tan của chúng Vì thế, cần có mộ yêu cầu kỹ thuật đặc biệt được cho việc tách chiết đối với chúng Mặc dù, những kit khác nhau đã được thương mại sẵn sàng
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 11 cho sự tách chiết DNA từ mẫu môi trường Nhiều phòng thí nghiệm đã phát triển những phương pháp tách chiết riêng của họ với mục đích tách chiết được khả quan và giảm bớt khuynh hướng tan thất thường của các thành viên khác nhau trong cộng đồng vi sinh vật đất
Có hai loại kỹ thuật tách chiết :
1 Trực tiếp, tại chỗ, việc tách chiết nơi mà những tế bào được hòa tan ngay trong mẫu đất và sau đó DNA được thu lại
2 Gián tiếp, kỹ thuật tách chiết nơi mà những tế bào được tách từ đất và sau đó được làm tan để thu nhận DNA Đất là một phức hỗn hợp đặc biệt chứa đựng nhiều chất như humics acids
Nó có thể được ly trích phụ trong suốt quá trình phân tách DNA Việc loại bỏ humics acids là cần thiết trước khi DNA có thể được tiến hành các bước tách chiết tiếp theo Với mục đích này, việc sắp xếp những kỹ thuật trong việc tinh sạch DNA đã được phát triển Sephadex G-200 ly tâm đã tỏ ra là một trong các hướng tốt nhất để loại bỏ các chất ô uế từ DNA đất Gần đây, lĩnh vực điện di sử dụng 2 pha thạch agarose, trong đó có một pha chứa polyvinylpyrrolidone, được phát triển để loại bỏ humics
1.3 Cộng đồng vi sinh vật đất và kỹ thuật Metagenomic Đất là một môi trường phức tạp, nó là kho dữ trữ chủ yếu về đa dạng di truyền vi sinh vật Đất được chiếm ưu thế bởi pha rắn và những vi sinh vật định cư liên kết với tiền tố đất, chẳng hạn với những phức chất hữu cơ đất sét Những vi sinh vật có thể được tìm thấy như là những tế bào đơn hoặc là những tập đoàn vi sinh vật Biến đổi của chúng và những tác động qua lại với những sinh vật khác và với tiền tố đất đã dựa trên những điều kiện sống ở cấp độ vi mô, nó thường khác nhau giữa các môi trường sống vi mô dù chỉ cách nhau một khoảng cách rất nhỏ Môi trường sống vi mô cho những vi sinh vật đất bao gồm những vi lỗ và những bề mặt tập hợp đất với thành phần và những kích thước khác nhau.[15]
Tính đa dạng vi sinh vật đất vượt trội hơn so với các môi trường khác và phong phú hơn vi sinh vật nhân thực Một gram đất có thể chứa tới 10 tỷ vi sinh vật, thuộc hàng nghìn loài khác nhau Sự phức tạp di truyền của quần xã vi sinh vật đất đã được chứng minh thông qua tái tổ hợp DNA, cùng sự xuất hiện của các gen hiếm và vi sinh vật chưa được phát hiện, với kích thước hệ gen chung của đất tương đương với 6.000 - 10.000 bộ gen E.coli.
Phân tích trình tự tái tổ hợp DNA trong 30g đất đã tiết lộ sự hiện diện của hơn 500.000 loài, cho thấy sự đa dạng di truyền khổng lồ và chưa được khám phá của đất Vi sinh vật đất chứa từ 3.000 đến 11.000 bộ gen trên 1 gam đất, trong đó chỉ có dưới 1% có thể nuôi cấy bằng các phương pháp truyền thống Tuy nhiên, tiếp cận nuôi cấy có hạn chế vì hầu hết vi sinh vật trong đất không thể phát triển trong điều kiện phòng thí nghiệm, hạn chế việc khám phá tiềm năng ứng dụng của chúng như nguồn kháng sinh, chất chống ung thư và chất tăng miễn dịch trong công nghệ sinh học.
1.4 Ứng dụng của Metagenomic đất :
Sơ đồ - 1.1 - ứng dụng của Metagenomics [15]
Sự phát triển và ứng dụng của Metagenomic đã cho phép tiến hành không cần nuôi cấy cộng đồng vi sinh vật đất, giúp ích làm giàu nguồn phân tử sinh học mới và hữu dụng một vài ví dụ về ứng dụng của Metagenomic đất là :
❖ Kháng sinh và dượ c ph ẩ m :
Metagenomic đất có tiềm năng ảnh hưởng chủ yếu đến sản phẩm kháng sinh Hai nghiên cứu trước đã báo cáo sự thành công hữu hiệu về sự biểu hiện những thư viện Metagenomic của kháng sinh indirubin, trong lúc sắp xếp các kháng sinh mới đã được xác định trong những thư viện Metagenomic Dòng được tìm thấy trong thư viện Metagenomic đất sản xuất deoxyviolacein và phổ kháng sinh violacein rộng ( trong biểu hiện 7 thư viện Metagenomic khác nhau ) [15]
Xác định biến thể gen mới
Phân tích sự gen vận chuyển tương đồng
Tổng thể bộ gen các vi sinh vật chưa qua nuôi cấy
Phân tích sự đa dạng vi sinh vật Ứng dụng vào công nghệ sinh học mới Hiểu sâu hơn về tế bào vi sinh vật
(Kỹ thuật không dựa vào nuôi cấy)
Metagenomic nghiên cứu sự đa dạng vi khuẩn trong môi trường có sử dụng 4 – hydroxybutyrate để tìm kiếm năm dòng biểu hiện hoạt tính 4 – hydroxybutyrate dehydrogenase mới Enzyme alcolhol oxidoreductase có khả năng về sự oxy hóa chuỗi rượu ngắn Nó được ứng dụng như chất xúc tác trong sản xuất công nghiệp về chiral hydroxy esters, hydroxy acids, acid amin và alcohols [15]
ENZYME CELLULASE
Cellulase là một phức hợp enzyme thủy phân cellulose thông qua quá trình thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid, tạo ra glucose như sản phẩm cuối cùng.
Hệ enzyme phân hủy cellulose này được các nhà khoa học phân ra làm ba nhóm chủ yếu:
Enzym 1,4 β-D-glucan-4-glucanohydrolase, hay còn gọi là endoglucanase (EC.3.2.1.4), đóng vai trò phân cắt liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose, lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình này là cellodextrin, cellobiose và glucose Enzym này tác động mạnh đến cellulose vô định hình, nhưng lại tác động yếu đến cellulose kết tinh Các tên gọi khác của endoglucanase bao gồm endo-1,4-β-D-glucanase và C-cellulase.
⮚ 1,4 β-D-glucan celluobiohydrolase hay còn gọi là exocellulase (EC.3.2.1.91): Enzym cắt đặc hiệu liên kết β-1,4 glucosid ở đầu không khử của chuỗi để tạo thành cellobiose Không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng Enzyme này có một số tên khác như: exoglucanase, cellobiohydrolase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase [11]
⮚ β-D-glucosidase glucohydrolase hay còn gọi là cellobiase (EC.3.2.1.21): enzyme này tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β- glucosidase [11]
Cellobiohydrolase, enzyme được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ, gồm 2 loại: Cbh I và Cbh II [11]
⮚ Cbh I chiếm đến 60 % lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei, chúng có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, điểm đẳng điện là 4,4
(PI=4,4), enzyme này tác động cả lên cả cellulose vô định hình và cellulose kết tinh Nhưng chúng không tác động đến cellulose biến tính như CMC hay hydroxyethylcellulose, cellohexaose β- nitrophenyl, β-glucoside hay β-glucan [11]
⮚ Cbh II có trọng lượng phân tử là 53KD, PI= 5,0 Chúng không tác động lên CMC, có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan Cbh I chứa khoảng 496 amino acid, Cbh II chứa khoảng 471 amino acid [11] Endoglucanase, có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei Chia thành 2 loại Egl I và Egl II Egl I chứa 459 amino acid, trọng lượng phân tử là 48,212KD Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử là 42,2KD Các enzyme này hoạt động được nhiệt độ khá cao [11] β- glucosidase, là nhóm enzym khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở
Nấm SVTH Lạc Kiện Hỷ 18 cho hiệu quả hoạt động tốt trong khoảng pH khá rộng từ 4,4 - 8,4 Enzyme β - glucosidase của loài nấm này có đến 713 amino acid với trọng lượng phân tử là 75,341KD Trong dịch chiết thô, β - glucosidase chiếm khoảng 1% so với lượng protein thu được.
Cellulose là hợp chất cơ bản của thực vật ngoài ra người ta còn tìm thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật, ở tế bào thực vật và VSV chúng tồn tại ở dạng sợi [11]
Cellulose không tìm thấy ở tế bào động vật, chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bởi liên kết α- 1,4 glucoside [11]
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp, các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất Chúng thường tồn tại hai vùng: vùng kết tinh và vùng vô định hình [11]
Cellulose trong vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao và bền vững, do đó, tác dụng của cellulase chỉ giới hạn ở bề mặt hệ sợi thuộc vùng này.
⮚ Vùng vô định hình, cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước chúng dễ bị trưng phồng lên, cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng
Hình 1.2 : Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian
2.4 Cơ chế tác dụng của cellulase
Trong tự nhiên, thủy phân cellulose cần có sự tham gia của tất cả 3 loại enzyme endoglucanase, exolglucanase và β- glucosidase Mỗi loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần trong cellulose
Các loại enzyme này thay phiên nhau thủy phân cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.[10] [11]
Hình 1.3: Cơ chế tác động của cellulase theo Erikson
Hình 1.4: Sự thủy phân cellulose của cellulase
2.5 Vi sinh v ậ t tham gia t ổ ng h ợ p cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, hầu hết các vi sinh vật chỉ có khả năng tổng hợp một số ít loại enzyme trong phức hệ cellulase, dẫn đến quá trình phân giải cellulose chậm và không triệt để Mỗi loại vi sinh vật thường có thế mạnh tổng hợp các loại enzyme khác nhau, khiến cho quá trình phân giải cellulose trở nên phức tạp và phụ thuộc vào sự góp mặt của nhiều chủng vi sinh vật cùng hoạt động.
SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN
3.1 Môi trường đất Đất là môi trường thích hợp nhất đối với vi sinh vật, bởi vậy nó là nơi cư trú rộng rãi nhất của vi sinh vật, cả về thành phần cũng như số lượng so với các môi trường khác Sở dĩ như vậy vì trong đất nói chung và trong đất trồng trọt nói riêng có một khối lượng lớn chất hữu cơ Đó là nguồn thức ăn cho các nhóm vi sinh vật dị dưỡng, ví dụ như nhóm vi sinh vật các hợp chất cacbon hữu cơ, nhóm vi sinh vật phân hủy các hợp chất Nitơ hữu cơ Các chất vô cơ có trong đất cũng là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi sinh vật tự dưỡng Đó là các nhóm phân huỷ các chất vô cơ, chuyển hoá các chất hợp chất S, P, Fe [7]
Các chất dinh dưỡng không những tập trung nhiều ở tầng đất mà còn phân tán xuống các tầng đất sâu Bởi vậy ở các tầng đất khác nhau, sự phân bố vi sinh vật khác nhau phụ thuộc vào hàm lượng các chất dinh dưỡng
Mức độ thoáng khí của đất cũng là một điều kiện ảnh hưởng đến sự phân bố của vi sinh vật Các nhóm háo khí phát triển ở nhiều nơi có nồng độ ôxy cao Những nơi yếm khí, hàm lượng oxy thấp thường phân bố nhiều loại vi sinh vật kị khí.[3] Độ ẩm và nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật đất Đất vùng nhiệt đới thường có độ ẩm 70 - 80% và nhiệt độ 20 0 C - 30 0 C Đó là nhiệt độ và độ ẩm thích hợp với đa số vi sinh vật Bởi vậy trong mỗi gram đất thường có hàng chục triệu đến hàng tỷ tế bào vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm, khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt tính sinh lý, sinh hoá Đó là cả một thế giới phong phú chứa trong một nắm đất nhỏ bé mà bình thường ta không thể hình dung ra được Chúng ta có thể tưởng tượng: một nắm đất là một vương quốc bao gồm các sắc tộc khác nhau sống chen chúc, tấp nập và hoạt động sôi nổi.[7]
3.2 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất và mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật
3.2.1 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất
3.2.1.1 Phân bố theo chiều sâu:
Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật Theo số liệu của Hoàng Lương Việt: ở tầng đất 9 - 20 cm của đất đồi Mộc Châu - Sơn La có tới 70,3 triệu vi sinh vật trong 1 gram đất Tầng từ 20 – 40 cm có chứa 48,6 triệu, tầng 40 – 80 cm có 45,8 triệu, tầng 80 – 120 cm có chứa 40,7 triệu Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn háo khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật háo khí càng giảm mạnh.[7]
3.2.1.2 Phân bố theo các loại đất
Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau Bởi vậy sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng Chỉ có mộ lớp mỏng ở trên, khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng dưới quá trình khử oxy chiếm ưu thế Bởi vậy, trong đất lúa nướcc ác loại vi sinh vật kị khí phát triển mạnh Ví dụ như vi khuẩn amôn hoá, vi khuẩn phản nitrat hoá Ngược lại, các loại vi sinh vật háo khí như vi khuẩn nitrat hoá, vi khuẩn cố định nitơ, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí/ yếm khí luôn luôn nhỏ hơn 1 Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình ôxy hoá chiếm ưu thế, bởi thế các loài sinh vật háo khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu Tỷ lệ giữa vi khuẩn háo khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp đạt tới 4 - 5 [7]
3.2.1.3 Phân bố theo cây trồng
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 26 Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh nhất so với vùng không có rễ Sở dĩ như thế vì rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ Ví dụ như ở vùng rễ lúa số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa hồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ cũng lớn - đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín [7]
3.2.2 Mối quan hệ giữa đất, vi sinh vật và thực vật Đất có kết cấu từ những hạt nhỏ liên kết với nhau thành cấu trúc đoàn lạp của đất Vậy yếu tố nào đã liên kết các hạt đất với nhau Có quan điểm cho rằng vi sinh vật đóng vai trò gián tiếp trong sự liên kết các hạt đất với nhau Hoạt động của vi sinh vật, nhất là nhóm háo khí đã hình thành nên một thành phần của mùn là axit humic Các muối của axit humic tác dụng với ion Canxi tạo thành một chất dẻo gắn kết những hạt đất với nhau Sau này người ta đã tìm ra vai trò trực tiếp của vi sinh vật trong việc tạo thành kết cấu đất: Trong quá trình phân giải chất hữu cơ, nấm mốc và xạ khuẩn phát triển một hệ khuẩn ti khá lớn trong đất [7]
3.2.2.1 Tác động của phân bón đến vi sinh vật đất
Khi ta bón các loại phân hữu cơ và vô cơ vào đất, phân tác dụng nhanh hay chậm đến cây trồng là nhờ hoạt động của vi sinh vật Vi sinh vật phân giải hữu cơ thành dạng vô cơ cho cây trồng hấp thụ, biến dạng vô cơ khó tan thành dễ tan Ngược lại các loại phân bón cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong đất.[3]
Phân hữu cơ như phân chuồng, phân xanh, bùn ao đóng vai trò quan trọng trong việc làm tăng số lượng vi sinh vật trong đất vì chúng vốn đã chứa một lượng lớn vi sinh vật Ngoài ra, chất hữu cơ trong phân hữu cơ cũng kích thích sự phát triển của các vi sinh vật sẵn có trong đất, đặc biệt là vi khuẩn.
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 27 sinh vật phân giải cenlulose, phân giải protein và nguyên sinh động vật Tuy vậy, các loại phân hữu cơ khác nhau tác động đến sự phát triển của vi sinh vật đất ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào tỷ lệ C/N của phân bón
Phân vô cơ cung cấp các nguyên tố thiết yếu như N, P, K, Ca và vi lượng cho vi sinh vật đất, thúc đẩy sự phát triển của chúng Bón vôi cải thiện tính chất lý hóa của đất, đặc biệt là đối với đất chua, mặn và bạc màu, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của vi sinh vật.
3.2.2.2 Tác động của chế độ nước đối với vi sinh vật đất: Đại đa số các loại vi khuẩn có ích đều phát triển mạnh mẽ ở độ ẩm 60 - 80% Độ ẩm quá thấp hoặc quá cao đều ức chế vi sinh vật Chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là có thể phát triển được ở điều kiện khô Ở các ruộng lúa nước các loại vi khuẩn đã thích hợp với độ ẩm cao, tuy nhiên ở những ruộng có tính thấm nước cao được làm ẩm, sự phát triển vi sinh vật cũng tốt hơn Đặc biệt là cân đối được tỷ lệ giữa hai loại háo khí và yếm khí.[7]
3.2.2.3 Tác động đến chế độ canh tác khác tới vi sinh vật
Ngoài các chế độ phân bón, nước, làm đất, các chế độ canh tác khác cũng có tác dụng rõ rệt tới hoạt động của vi sinh vật Ví dụ như chế độ luân canh cây trồng Mỗi loại cây trồng đều có một khu hệ vi sinh vật đặc trưng sống trong vùng rễ của nó Bởi vậy luân canh cây trồng làm cho khu hệ vi sinh vật đất cân đối và phong phú hơn Người ta thường luân canh các loại cây trồng khác với cây họ đậu để tăng cường hàm lượng đạm cho đất Các loại thuốc hoá học trừ sâu, diệt cỏ gây tác động có hại tới vi sinh vật cũng như hệ sinh thái đất nói chung Việc dùng các loại thuốc hoá học làm ô nhiễm môi trường đất, tiêu diệt phần lớm các loại vi sinh vật và động vật nguyên sinh trong đất.[7]
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
1.1 Vật liệu : Đối tượng nghiên cứu : Đất nông nghiệp
Vị trí lấy mẫu : Khánh Hậu _ Long An
Thời gian lấy mẫu : Tháng 1 - 7
Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA bộ gen từ đất :
• Lysis buffer ( 100 mM Tris_HCl pH= 8; 100 mM sodium EDTA* pH= 8;
100 mM sodium phosphate pH= 8; 1,5M NaCl và 1% CTAB**)
* EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt
Hóa chất dùng trong tinh sạch DNA bộ gen từ đất :
• TAE ( Tris-acetate-EDTA ) hay TBE ( Tris-borate-EDTA )
• PEG 8000 ( polyethylene glycol, khối lượng phân tử 8000 (pha 30%))
• 3 M sodium acetate ( hay 2,5 M ammonium acetate)
• Nước cất 2 lần hay đệm TE
Hóa chất phân tích hoạt tính cellulase tổng (FPA)
• Thuốc thử DNS ( 3,5 dinitro salicylic acid ) Hòa tan 10,6 g DNS và 19,8 g NaOH trong 1.416 ml nước cất Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm 306 g muối Rochelle ( sodium potassium tartrate ), 7,6 ml phenol nóng chảy ở
50 o C, và 8,3 g sodium metabisulfite và trộn đều Chuẩn độ 3,0 ml thuốc thử DNS : sử dụng 0,1 M HCl và chất chỉ thị phenolphthalein để kiểm tra pH Nó cần 5 – 6 ml HCl để chuyển chất chỉ thị màu từ đỏ sang không màu
• Citrate buffer ( 1 M, pH 4,5 ) Hòa tan 210 g citric acid monohydrate trong
750 ml nước cất 2 lần và thêm 50 – 60 g NaOH để đạt pH 4,3 Pha loãng dung dịch tới 1000 ml và kiểm tra pH, nếu cần thiết thêm NaOH điều chỉnh pH tới 4,5
• Citrate buffer ( 50 mM, pH 4,8 ) Pha loãng 1 M citrate buffer (pH 4,5) bằng cách thêm vào nước cất 19 lần thể tích so với thể tích 1 M citrate buffer
• Giấy lọc ( 50 mg, 1,0 x 6,0 cm ) Cắt 1,0 x 6,0 cm giấy hiệu Whatman No.1 với kéo cắt giấy
• Dung dịch sử dụng trong việc dựng đường chuẩn glucose (2 g/L )
Hóa chất phân tích endoglucanase bằng việc sử dụng cơ chất carboxyl methyl cellulose (CMC)/thuốc thử DNS
• CMC ( 2% w/v ) pha trong đệm citrate buffer
• Dung dịch sử dụng dựng đường chuẩn glucose ( 1 g/L )
Hóa chất định tính endoglucanase (CMCase) trên môi trường thạch CMC/agar:
• Agar 1,5% + CMC 1% ( cân 1,5 g agar và 1 g CMC pha trong 100 ml cất)
• Thuốc thử Lugol ( 2,5 g/L Iot, 5 g/L potassium iot (KI) )
1.2 Thiết bị và dụng cụ :
• Cân phân tích, máy khuấy từ, lò điện, máy votex, máy đo pH
• Tủ lắc có điều nhiệt
• Máy ly tâm lạnh loại lớn (dùng cho ống ly tâm lớn) và loại nhỏ (dùng cho tube eppendorf )
• Máy chiếu UV và hệ thống chụp hình điện di
• Hệ thống máy đo quang phổ hấp phụ (OD), bước sóng nhỏ nhất có thể đo là 230 nm
• Cỏc loại pipetman cú dung tớch từ 0,2 – 1000 àl và cỏc đầu tube tương ứng
• Ống tube ly tâm lớn, eppendorf loại 1 ml
• Các loại dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt ( erlen, burcher, pipet, )
• Cuvet sạch dùng đo OD
• Găng tay, khẩu trang, đồ bảo hộ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp tách chiết DNA bộ gen từ đất [4] [18]
Dựa vào các thành phần phức tạp trong đất, đặc điểm hóa lý chung của các vi sinh vật sống trong đất và DNA bộ gen của chúng, nhằm thu tách được DNA bộ gen của các vi sinh vật người ta đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA như sau:
• Cân 5 g đất cho vào ống tube 50 ml
• Thêm 13,5 ml lysis buffer ( 100 mM Tris_HCl pH= 8; 100 mM sodium EDTA* pH= 8; 100 mM sodium phosphate pH= 8; 1,5M NaCl và 1% CTAB**) thờm 100 àl proteinase K (10 mg/ml) Lắc theo chiều nằm ngang ở 37 o C trong 30 phút
*EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt
• Thêm 1,5 ml 20% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Ủ nhẹ ở 65 o C trong 30 phút, đảo trộn sau mỗi 15 phút
• Ly tâm ở 7.000 rpm trong 5 phút ở 4 o C
• Chuyển toàn bộ dịch nổi đến một cái ống tube sạch 50 ml
• Chiết tách dịch nổi bằng hổn hợp dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24 :1 v/v) với thể tích cần bỏ vào tương đương với thể tích dịch nổi
• Ly tâm ở 6.500 rpm trong 10 phút ở 4 o C
• Chuyển toàn bộ pha nước ở phần trên cùng đến một cái ống sạch ( ống dùng cho siêu ly tâm )
• Kết tủa DNA bộ gen bằng isopropanol với thể tích bỏ vào bằng 0,6 lần thể tích dịch tách chiết, ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
• Ly tâm ở 13.000 rpm trong 20 phút, ở nhiệt độ phòng (~ 22 – 25 C )
• Loại bỏ dịch nổi Rữa DNA kết tủa với khoảng 3 ml ethanol 70% lạnh
• Ly tâm ở 13.000 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (~ 22 – 25 o C )
• Thổi khô DNA kết tủa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
• Khụi phục lại DNA kết tủa với khoảng 300 àl nước cất 2 lần ( thể tớch nước cất 2 lần có thể khác nhau dựa vào lượng DNA kết tủa và nguồn tách chiết DNA )
❖ Ghi chú : sử dụng nước cất hai lần đã được làm ấm trước (~ 50 o C ) để giúp hòa tan tốt DNA bộ gen
2.2 Phương pháp tinh sạch DNA bộ gen từ đất bằng phương pháp khoét giếng trên thạch agarose [17] [18]
Lượng DNA bộ gen tách chiết thô ban đầu còn lẫn nhiều tạp chất sẽ ảnh hưởng đến các mục đích nghiên cứu tiếp theo, dựa vào khả năng phân tách khác nhau trong các thành phần tách chiết DNA bộ gen thô ban đầu trên điện di agarose gel mà ta có thể loại bỏ các tạp chất khác ngoài DNA bộ gen nhằm thu lấy DNA bộ gen ở mất độ tinh sạch
• Mẫu DNA bộ gen tách chiết từ đất chưa tinh sạch được đem đi chạy điện di trong TAE hay TBE thạch agarose (0,8 – 1%), thể tích cho mỗi lần chạy điện di để tinh sạch mẫu DNA là 30 àl, bổ sung 0,1 – 0,5 àg/ml ethidium bromide, ở hiệu điện thế 100 Volt trong khoảng 40 phút
Nếu lượng DNA cần tinh sạch lớn khi chuẩn bị đổ thạch có thể đặt 2-3 cây lược chung với nhau để tăng kích thước của giếng
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 34 Đổ dung dịch đệm TAE hay TBE hơi lắp đầy mặt trên cùng của thạch, không được làm ngập hoàn toàn thạch trong dung dịch đệm
• Hiện hình dải băng DNA bằng tia UV Khoét một cái giếng hình chữ nhật bằng một vật nhọn sắc, rộng khoảng 0,5 – 1 cm gần sát dải băng DNA, hướng nằm trước phần DNA di chuyển ( chiều dài của giếng khoét sẽ dựa vào kích thước của giếng nạp mẫu DNA cần tinh sạch vào )
Hình 2.1 Sơ đồ diễn giải thể hiện giếng được khoét ngay trước phần DNA điện di
• Loại bỏ hoàn toàn thạch agarose trong giếng khoét, lấp đầy giếng với một dung dịch đệm PEG 8000 ( 25 – 30% PEG 8000 trong TAE hay TBE )
PEG 8000 là polyethylene glycol, khối lượng phân tử 8000 PEG với trọng lượng phân tử thấp hơn (e.g.PEG 4000) không thể được sử dụng cho phương pháp khoét giếng
Hãy cẩn thận là không được có dung dịch đệm TAE hay TBE trong giếng được khoét
• Tiến hành điện di thêm khoảng 30 phút Cho đến khi băng DNA nằm ở giữa giếng
• Thu nhận DNA vào ống tube eppendorf sạch
• Tách chiết DNA bằng dung dịch chloroform/isoamyl alcohol ( 24 : 1 v/v) với thể tích bỏ vào bằng với thể tích thu nhận được ở trên
• Ly tâm 12.000 rpm, ở 4 o C trong 10 phút
• Chuyển pha nước ở phần trờn cựng vào ống tube eppendorf ( 500 àl/tube)
• Thờm 2 àl glycolgen ( 10 mg/ml) và 50 àl 3M sodium acetate ( hay 2,5M ammonium acetate) trong mỗi tube; trộn kỹ Thêm 1 ml ethanol lạnh vào mỗi tube và kết tủa DNA ở –80 o C trong 25 phút
• Ly tâm 12.000 rpm trong 15 phút ở 4 o C
• Loại bỏ dịch nổi Rửa DNA kết tủa với cồn lạnh 70% ( 1 ml/mỗi tube ) Ly tâm ở 12.000 rpm ở 4 o C trong 10 phút
• Thổi khô DNA kết tủa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
• Bảo quản DNA trong 35àl nước cất 2 lần hay đệm TE
- Như trờn đó núi, mỗi lần chạy điện di mẫu chỉ là 30 àl ta sẽ thu được một thể tớch DNA tinh sạch pha trong 35 àl TE, mà tổng thể tớch mẫu DNA tỏch chiết được ở trờn là 300 àl/5 g đất, do đú tổng thể tớch DNA tinh sạch được là 350 àl/5 g đất
- Việc xác định nồng độ DNA tinh sạch có thể được đo bằng máy quang phổ hấp phụ ở bước súng 260/280 nm Với cụng thức tớnh C DNA (àg/ml) Abs.50*.độ pha loãng
50* àg/ml cho một dung dịch DNA sợi đụi
2.3 Phương pháp phân tích hoạt tính cellulase tổng sử dụng giấy lọc làm cơ chất ( FPA ) [18] [21]
Sự phân tích này dựa trên sự chuyển đổi cấp độ của cơ chất trong khoảng 2 mg glucose, dựa trên đường khử giải phóng được đo bởi thuốc thử DNS (Hình 2.2 )
Hình 2.2 : sự phân tích hoạt tính cellulase tổng dựa vào phản ứng giữa lượng đường khử được giải phóng cuối cùng với thuốc thử DNS tạo sản phẩm vàng nâu và đo ở bước sóng 540nm
⮚ Tiến trình thí nghiệm “ống mẫu (E)” :
• Đặt mảnh giấy lọc được cuộn tròn vào mỗi ống nghiệm
• Thêm 1 ml citrate buffer (50 mM, pH 4,8) vào ống nghiệm, giấy lọc phải ngập chìm trong buffer
• Chuẩn bị dịch đất ( cân 10 g đất pha trong 10 ml citrate buffer lắc trên máy 1 giờ, ở nhiệt độ phòng ly tâm 6.000 vòng/phút, trong 5 phút, thu dịch nổi, bỏ cặn Lượng dịch nổi có thể chứa enzyme cellulase tổng, với thể tích dịch nổi thu được là 7 ml/10 g đất )
• Chuẩn bị các dung dịch dựng đường chuẩn glucose (GSs) như sau :
GS0 : 5 ml buffer = 0 mg/ml ( 0 mg/ 0,5 ml ) Đường khử Đường bị oxy hóa (Sản phẩm vàng nâu)
GS1 : 1,0 ml glucose ( 2 mg/ml ) + 4,0 ml buffer = 0,4 mg/ml ( 0,2 mg/0,5 ml ) GS2 : 1,0 ml glucose ( 2 mg/ml ) + 2,0 ml buffer = 0,66 mg/ml ( 0,33 mg/0,5 ml) GS3 : 1,0 ml glucose ( 2 mg/ml ) + 1,0 ml buffer = 1,0 mg/ml ( 0,5 mg/0,5 ml ) GS4 : 1,0 ml glucose ( 2 mg/ml ) + 0,5 ml buffer = 1,34 mg/ml ( 0,67 mg/0,5 ml)
• Chu ẩ n b ị ố ng blank và controls :
Reagent blank (RB) : 1,5 ml đệm citrate buffer 50 mM dùng để chỉnh giá trị
Enzyme control (EC) : 1,0 ml đệm citrate buffer 50 M + 0,5 ml dịch đất
Substrate control (SC) : 1,5 ml đệm citrate buffer 50 mM + miếng giấy lọc
• Làm ấm dịch đất, blank, và controls đến khi đạt trạng thái cân bằng
• Thêm 0,5 ml dịch đất vào ống tube chứa miếng giấy lọc (E); thêm 0,5 ml dịch đất vào ống tube không có miếng giấy lọc (EC)
• Đem ủ các ống tube E, GSs, RB, EC, và SC trong nồi đun cách thủy 50 o C trong thời gian 60 phút
• Thêm 3,0 ml thuốc thử DNS để ngừng phản ứng và trộn đều
• Đun sôi cách thủy 5 phút
• Chuyển các ống nghiệm vào bể nước đá lạnh
• Hút 0,5 ml dung dịch thí nghiệm vào eppendort 1,5 ml và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 3 phút
• Sau ly tâm, hút 0,2 ml dịch nổi phía trên cho vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2,5 ml nước cất, trộn đều Đem đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm và ống RB được sử dụng làm ống blank
Vẽ đường chuẩn glucose ( hàm lượng glucose nằm trục x, độ hấp phụ OD 540nm nằm trục y )
Tính độ hấp phụ OD 540nm của sản phẩm glucose tạo ra bởi dịch đất phân giải cơ chất (giấy lọc) :
Từ giá trị OD 540nm của △E tính được ở trên chúng ta suy ra hàm lượng glucose thực được giải phóng ra bởi ống (E) dựa vào đường chuẩn glucose :
Bảng 2.1 : Kết quả đo OD 540nm đường chuẩn glucose của FPA
GS OD Trung bình OD Glucose (mg)
Từ lượng đường được giải phóng ra chúng ta tính được hoạt tính enzyme phân giải cellulose tổng của dịch đất, với công thức tính như sau :
FPA = số mg glucose giải phóng x 0,185 ( IU/ml )
1,0 mg glucose giải phóng ra = 1,0/(0,18 x 0,5 x 60) = 0,185 IU/ml dịch đất
Chú thích o 1,0 : lượng glucose được giải phóng (mg) o 0,18 : khối lượng phõn tử glucose (mg/àmol) o 0,5 : lượng dịch đất bỏ vào (ml) o 60 : thời gian phản ứng (phút)
Cứ 10 g đất ta thu được 7 ml dịch đất, mỗi ml dịch đất chúng ta tính được hoạt tính (FPA)
Vậy hoạt tính phân giải cellulose tổng / 1 gram đất = FPU x 7 / 10 ( IU/g)
Hàm lượng glucose (mg) Đường chuẩn Glucose (FPA)
2.4 Phương pháp định tính endoglucanase (CMCase) trên môi trường thạch CMC/agar [21]
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả khảo sát hàm lượ ng SDS sử dụng ảnh hưởng như thế nào đến việc tách chiết DNA từ đất nông nghiệp
⮚ Kết quả chạy điện di :
Hình 3.2 Điện di kiểm tra khả năng tách chiết DNA với các hàm lượng SDS sử dụng khác nhau
1: Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Dưa Gang với hàm lượng SDS sử dụng là
2: Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Dưa Gang với hàm lượng SDS sử dụng là
3: Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Dưa Gang với hàm lượng SDS sử dụng là
Nhận xét kết quả điện di :
Từ kết quả điện di trên ta thấy mẫu điện di ở vị trí giếng số 2 có vạch DNA đậm nhất vạch điện di của hai giếng 1 và 3 mờ hơn
Bảng 3.2 : Khảo sát hàm lượng SDS ảnh hưởng như thế nào đến việc tách chiết DNA bộ gen từ đất nông nghiệp dựa vào kết quả đo OD ở 260nm
Mẫu thí nghiệm Độ sâu
Abs C DNA (àg/ml) àgDNA/5g đất Đất trồng
( Tất cả các mẫu DNA tách chiết được từ các loại đất trồng khác nhau ở B ả ng 3.2 đều được pha trong 0,3 ml nước cất 2 lần ) Đồ th ị 3.2 - Khảo sát hàm lượng SDS ảnh hưởng đến khả năng tách chiết DNA
Qua kết quả điện di và OD về khảo sát hàm lượng SDS ảnh hưởng như thế nào đến việc tách chiết DNA bộ gen từ đất nông nghiệp ta thấy :
Hàm lượng SDS tối ưu sử dụng cho việc tách chiết DNA đất là 0,3 g
Hàm lượng SDS không có hoặc quá ít sẽ không đủ làm biến tính hoàn toàn màng tế bào và các protein gồm các enzyme và protein liên kết với DNA, do đó làm giảm hiệu suất tách chiết DNA
Hàm lượng SDS quá nhiều cũng không tốt, sẽ ảnh hưởng đến các bước tách chiết DNA tiếp theo, do lượng SDS dư sẽ bám trên DNA mẫu
Kết quả khả o sát sự tách chiết DNA từ đất nông nghiệp có sử dụng lysozyme,
sử dụng lysozyme, proteinase K và không sử dụng enzyme
⮚ Kết quả chạy điện di :
Hình 3.3 - Điện di kiểm tra khả năng tách chiết DNA của các loại Enzyme và không sử dụng Enzyme nào
1 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Củ Cải lấy ở độ sâu 30 cm ( mẫu tách có sử dụng Lysozyme)
2 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Củ Cải lấy ở độ sâu 30 cm ( mẫu tách có sử dụng Proteinase K)
3 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Củ Cải lấy ở độ sâu 30 cm ( mẫu tách không sử dụng Enzyme)
Nhận xét kết quả điện di :
Ta thấy mẫu điện di ở giếng số 2 sử dụng proteinase K có vạch DNA đậm nhất, kế đó là mẫu giếng số 1 và mờ nhất ở giếng số 3
Bảng 3.3 : Kh ả o sát vi ệ c s ử d ụ ng E ảnh hưởng như thế nào đế n vi ệ c tách chi ế t DNA b ộ gen t ừ đấ t nông nghi ệ p d ự a vào k ế t qu ả đo OD ở 260nm
Mẫu thí nghiệm Độ sâu (cm) Điều kiện E Abs C DNA (àg/ml) àgDNA/5g đất Đất trồng
Tất cả các mẫu DNA tách chiết thành công đều được pha trong 0,3ml nước cất 2 lần rồi đem phân tích bằng phương pháp phổ quang UV-Vis trên máy UV-Vis Spectrophotometer Super Aquarius CE (Hitachi, Nhật).
C D N A (àg/ml) điều kiện sử dụng Enzyme
Từ kết quả điện di và OD ta thấy :
Mẫu tách không sử dụng enzyme thì lượng DNA tách chiết được ít hơn mẫu tách có bổ sung enzyme ( proteinase K hay lysozyme ) trong quá trình tách chiết Vậy việc bổ sung enzyme (proteinase K hay lysozyme) là cần thiết trong việc tách chiết DNA từ đất nông nghiệp để đạt được hiệu quả cao trong thu nhận DNA
Việc không sử dụng enzyme để tách chiết thì lượng DNA tách được ít hơn nhiều lần so với có sử dụng enzyme
Lượng DNA tách được khi sử dụng proteinase K cao hơn lysozyme, nhưng chệnh lệch không nhiều Dó đó trong trường hợp này có thể xem như khả năng tách chiết DNA của 2 enzyme này tương đương nhau Nhưng sử dụng Proteinase
K cho hiệu quả tốt hơn
Kết quả khảo sát thời gian ủ SDS ảnh hưởng như thế nào đến việc tách chiết
Bảng 3.4 : Kh ả o sát th ờ i gian ủ SDS ảnh hưởng như thế nào đế n vi ệ c tách chi ế t DNA b ộ gen t ừ Đấ t nông nghi ệ p d ự a vào k ế t qu ả đo OD ở 260nm
Mẫu thí nghiệm Độ sâu
Thời gian ủ SDS (phút) Abs C DNA
(àg/ml) àgDNA/5g đất Đất trồng
( Tất cả các mẫu DNA tách chiết được ở B ả ng 3.4 đều được pha trong 0,3 ml nước cất 2 lần ) Đồ th ị 3.4 - Khảo sát thời gian ủ SDS
Từ kết quả đo OD ta thấy :
Thời gian ủ SDS càng dài lượng DNA tách được càng hiệu quả
Thời gian ủ SDS ngắn sẽ không làm biến tính hoàn toàn màng tế bào và các protein liên kết với DNA, do đó khi ly tâm sẽ loại bỏ một lượng lớn DNA cùng với protein chưa biến tính hoàn toàn
Kết quả khảo sát thời gian ủ proteinase K ảnh hưởng như thế nào đến việc tách DNA bộ gen từ đất nông nghiệp
Bảng 3.5 : Nồng độ DNA tách được sau các thời gian ủ proteinase K
( Tất cả các mẫu DNA tách chiết được ở B ả ng 3.5 đều được pha trong 0,3 ml nước cất 2 lần ) Đồ th ị 3.5 - Khảo sát thời gian ủ proteinase K
Mẫu thí nghiệm Độ sâu
(àg/ml) àgDNA/5g đất Đất trồng Củ
Thời gian ủ proteinase K tốt nhất là 30 phút
Thời gian ủ proteinase K quá ngắn, do đó thành tế bào của một số vi sinh vật còn chưa phân giải hết, DNA không được giải phóng ra ngoài tế bào, dẫn đến sự thất thoát DNA khi ly tâm
Thời gian ủ proteinase K quá dài cũng không tốt đến quá trình tách chiết DNA vì một số yếu tố trong môi trường tách chiết sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc DNA, làm cho DNA bị đứt gây hoặc không tan trong môi trường tách chiết, dẫn đến sự thất thoát DNA khi ly tâm
Kết quả So sánh và kiể m tra các mẫu DNA tách chiết từ các loại đất nông nghiệp khác nhau trước và sau bước tinh sạch
⮚ Kết quả chạy điện di :
Hình 3.4 - Điện di so sánh trước và sau tinh sạch DNA
1 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Lúa ở độ sâu 10 cm trước tinh sạch
2 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Lúa ở độ sâu 10 cm sau tinh sạch
3 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Dưa Gang ở độ sâu 10 cm trước tinh sạch
4 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Dưa Gang ở độ sâu 10 cm sau tinh sạch
5 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Củ Cải ở độ sâu 10 cm trước tinh sạch
6 : Mẫu DNA tách chiết từ đất trồng Củ Cải ở độ sâu 10 cm sau tinh sạch
Nhận xét kết quả điện di :
Trong các mẫu DNA sau bước tinh sạch của các loại đất nông nghiệp khác nhau thì vạch băng điện di không còn các smear so với mẫu trước tinh sạch Chứng tỏ đã loại bớt những tạp chất không phải là DNA bộ gen
Bảng 3.6 : N ồng độ DNA bộ gen tách chiết từ các loại đất nông nghiệp khác nhau chưa và đã qua bước tinh sạch
Tình trạng tinh sạch Độ sâu (cm)
Thể tích DNA bộ gen thu từ
/ml) àgDNA /5gđất Đất trồng
Nghiên cứu này đã tiến hành so sánh nồng độ DNA bộ gen trước và sau tinh sạch của các loại đất nông nghiệp khác nhau Kết quả cho thấy, nồng độ DNA bộ gen sau tinh sạch cao hơn đáng kể so với nồng độ DNA ban đầu Ngoài ra, lượng DNA tách chiết được cũng khác nhau giữa các loại đất nông nghiệp, trong đó đất có độ pH cao cho lượng DNA cao nhất.
Tỷ số OD 260/280 trong phạm vi 1,8 – 2 cho thấy mẫu sau bước tinh sạch đã đạt độ tinh sạch chấp nhận được Thông số này nằm trong ngưỡng cho phép, chứng tỏ quá trình tinh sạch DNA đã đạt được mục tiêu mong muốn về độ tinh khiết.
Lượng DNA sau tinh sạch luôn luôn thấp hơn lượng DNA trước tinh sạch
Do đã loại bớt các tạp chất có cùng bước sóng hấp phụ như DNA trong quá trình tinh sạch và một lượng DNA thất thoát trong quá trình tinh sạch
1600 Đất Lúa Đất Củ Cải Đất Dưa
C D N A (à g /m l) trước tinh sạch sau tinh sạch
Hiệu suất thu hồi DNA sau tinh sạch = số àgDNA sau tinh sạch/số àgDNA trước tinh sạch x100% Hiệu suất thu hồi DNA đối với đất Lỳa là 191,77/205,64 x100% = 93,25% ; đối với đất Củ Cải là 200,38/209,78 x100% 95,51% ; đối với đất Dưa Gang là 419,03/432,41 x100% = 96,9%
Từ kết quả đo OD ta thấy hàm lượng DNA tinh sạch được từ đất trồng Dưa Gang là cao nhất, kế đó là đất trồng Củ Cải, sau cùng là đất trồng Lúa Chứng tỏ rằng hàm lượng vi sinh vật có trong đất trồng Dưa Gang cao hơn so với đất trồng Củ Cải và Lúa
Ngoài ra, ở đất trồng Dưa Gang có phủ lớp nylon màu đen trên bề mặt là điệu kiện giữ cho đất có độ ẩm cao và tránh được một số tác động ngoại cảnh ( ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, mưa rữa trôi,…) Do đó tạo thuận lợi cho vi sinh vật trong đất phát triển mạnh và nhiều hơn so với đất trồng Lúa và Củ Cải không có phủ lớp nylon màu đen trên bề mặt
Kết quả định tính endoglucanase (CMCase)
Hình 3.5 : Định tính CMCase của dịch đất (chiết xuất từ đất nông nghiệp) trên môi trường Agar/CMC Chú thích hình 3.5 :
Giếng nằm giữa là giếng đối chứng (mẫu thử không)
Bốn giếng xung quanh chứa dịch đất (mẫu thật), gồm 4 mẫu đất nông nghiê ̣p khác nhau ( đất trồng Đâ ̣u Bắp(1), đất trồng Dưa Leo(2), đất trồng Thanh Long(3) và đất trồng Lúa(4)
Nhâ ̣n xét (a) : Ở giếng số 1 (đất trồng Đâ ̣u Bắp) và giếng số 3 (đất trồng Thanh Long) với vòng phân giải cơ chất CMC lớn và đường kính vòng phân giải giếng 1 lớn hơn giếng 3 với khoảng cách không nhiều
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 72 Ở giếng số 2 (đất trồng Dưa Leo) và giếng số 4 (đất trồng Lúa) với vòng phân giải cơ chất CMC ở mức trung bình và đường kính vòng phân giải như nhau
Hình 3.6 : Định tính CMCase của dịch đất (chiết xuất từ đất nông nghiệp) trên môi trường Agar/CMC Chú thích hình 3.6 :
Giếng nằm giữa và giếng 2 là giếng đối chứng (mẫu thử không)
Ba giếng xung quanh chứa dịch đất (mẫu thật), gồm 3 mẫu đất nông nghiê ̣p khác nhau (đất trồng Chuối (1), đất trồng Rau Quế (4) và đất trồng Hoa Màu(3)
Nhâ ̣n xét (b) : Ở giếng số 1 (đất trồng Chuối) và giếng số 4 (đất trồng Rau Quế) với vòng phân giải cơ chất CMC ở mức nhỏ và đường kính vòng phân giải như nhau Ở giếng số 3 (đất trồng Hoa Màu) với vòng phân giải cơ chất CMC ở mức nhỏ nhưng đường kính vòng phân giải cao hơn ở giếng số 1 và giếng số 4
Từ 2 hình (a), (b) đi ̣nh tính CMCase của 7 mẫu đất n ông nghiê ̣p khác nhau ta thấy:
+ Đều có vòng phân giải cơ chất CMC, chứng tỏ trong đất nông nghiê ̣p có sự hiê ̣n diê ̣n của vi sinh vâ ̣t sản xuất enzyme endoglucanase (CMCase)
+ Vòng phân giải cơ chất của các mẫu đất nông nghiệp khác nhau thì khác nhau, do 2 nguyên nhân : ( 1)hàm lượng enzyme CMCase trong đất hay (2)hoạt tính CMCase mạnh yếu khác nhau trong các mẫu đất nông nghiệp Từ đó, liên quan đến số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t phân giải cơ chất CMC nhiều hay ít và khả năng sản x uất ra enzyme CMCase với hoa ̣t tính cao hay thấp , nhiều hay ít trong các loại đất nông nghiệp
Kết quả xác đi ̣nh hoa ̣t tính cellulase tổ ng ( FPA )
B ả ng 3.7 : Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng ( FPA ) như sau :
Mẫu thí nghiệm OD
Giá trị OD của △E = E - (EC+SC)
( DL : đất trồng Dưa Leo ; ĐB : đất trồng Đậu Bắp )
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 75 Đồ th ị 3.7 : So sánh hoạt tính cellulase tổng (FPA) của các mẫu đất nông nghiệp
Từ kết quả đo hoạt tính cellulase tổng (FPA) của đất trồng Đậu Bắp và đất trồng Dưa Leo ta thấy cả hai loại đất đều có khả năng phân giải cơ chất cellulose tổng nhưng hoạt tính phân giải rất thấp chỉ từ 0,02 – 0,025 IU/g đất
Khả năng phân giải cellulose tổng của đất trồng Đậu Bắp và đất trồng Dưa Leo có thể do 2 nguyên nhân chính :
+ Số lươ ̣ng vi sinh vâ ̣t sản xuất ra cellulase tổng (FPA) trong đất trồng ở mất độ thấp
+ Vi sinh vâ ̣t trong đất trồng sản xuất ra cellu lase tổng (FPA) với hoa ̣t tính thấp
Qua kết quả trên chứng tỏ trong đất trồng có sự hiện diện của vi sinh vật phân giải cellulose tổng ở mật độ thấp
0.03 Đất Dưa Leo (DL) Đất Đậu Bắp (ĐB)
Kết quả xác định hoạt tính endoglucanase (CMCase)
B ả ng 3.8 : Kết quả đo hoạt tính endoglucanase ( CMCase ) như sau :
Mẫu thí nghiệm OD
( L : đất trồng Lúa; TL : đất trồng Thanh Long; HM : đất trồng Hoa Màu; RQ: đất trồng Rau Quế; Ch : đất trồng Chuối)
SVTH : Lạc Kiện Hỷ 77 Đồ th ị 3.8 : So sánh hoạt tính endoglucanase (CMCase) của các mẫu đất nông nghiệp
Các mẫu đất nông nghiệp khi đo hoạt tính enzyme endoglucanase (CMCase) đều cho thấy enzyme này có hoạt tính phân giải cơ chất đa dạng, tùy thuộc vào từng loại mẫu đất Tuy nhiên, nhìn chung hoạt tính này tương đối thấp, chỉ dao động trong khoảng 0,005 – 0,02 IU/g đất.
Từ kết quả định tính và xác định hoạt tính endoglucanase (CMCase) của đất nông nghiệp ta thấy :
+ Có sự hiện diện của enzyme endoglucanase chứng tỏ có sự tồn tại của vi sinh vật sản xuất enzyme đó
+ Tùy loại đất nông nghiệp mà mật độ tồn tại của vi sinh vật sản xuất enzyme endoglucanase trong đất là khác nhau
Long (TL) Đất Hoa Màu
Kết quả khuếch đa ̣i gen endo-β-1,4-glucanase (Cel5G)
⮚ Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA bộ gen của các mẫu đất nông nghiệp :
Hình 3.7 DNA bộ gen tinh sạch được của các mẫu đất nông nghiệp
⮚ Kết quả chạy PCR của các mẫu DNA tinh sạch được :
Kết quả sản phẩm khuếch đại PCR : kết quả đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR âm tính, không khuếch đa ̣i được gen mục tiêu
1 : DNA của mẫu đất trồng Đậu Bắp
2 : DNA của mẫu đất trồng
3 : DNA của mẫu đất trồng
4 : DNA của mẫu đất trồng
Kết quả khuếch đại gen mục tiêu Cel5G âm tính chủ yếu do các nguyên nhân chính sau :
✔ Do gen Cel5G tồn tại với mật độ quá ít trong mẫu tách chiết DNA, không đủ số lượng cho việc thực hiện một phản ứng khuếch đại PCR
Cần thiết kế cặp mồi khuếch đại gen Cel5G đặc hiệu để sử dụng sản phẩm khuếch đại đó với cặp mồi chứa đoạn enzyme cắt giới hạn Từ đó, có thể khuếch đại ra sản phẩm với mục đích tạo dòng.
✔ DNA mẫu thu nhận từ đất có thể làm đứt gẫy gen mục tiêu cần khuếch đại
✔ DNA mẫu thu nhận từ đất có thể không chứa gen mục tiêu cần khuếch đại do quá trình tách chiết, tinh sạch làm thất thoát DNA chứa gen đó
✔ Chu kỳ luân nhiệt PCR cần điều chỉnh một số bước, thông số (như thời gian tách mạch DNA, mồi bắt cặp vào, kéo dài mạch) cho phù hợp với mẫu DNA thu nhận từ đất