nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất thu nhận và hoạt độ enzym amylase từ nấm mốc aspergillus oryzae

- Nhóm 6 : Ligaza syntetaza : xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự.I.1.5 Trung tâm hoạt động enzym [13] Không phải toàn bộ phân tử enzym tham gia trực

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Đề Tài:

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HIỆU SUẤT THU NHẬN VÀ HOẠT ĐỘ ENZYM AMYLASE

TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HÓA

KHÓA HỌC : 2001-2005

Lời Cảm Ơn

Luận văn tốt nghiệp này được hoàn thành với sự quan tâm và giúp đỡ của các thầy cô cùng bạn bè Nhân đây em xin chân thành cảm ơn:

✔ Cô Đồng Thị Thanh Thu đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

✔ Các Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở-Bán Công Tp.HCM đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong 4 năm Đại học

✔ Các anh cùng các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh hóa đã hết lòng giúp đỡ và động viên mình trong thời gian qua

Sự chỉ bảo, giúp đỡ và những tình cảm trên là nguồn cổ vũ, động viên rất lớn cho em trong thời gian sắp tới Em xin trân trọng cảm ơn.

Mở Đầu

Enzym Amylase là enzym phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Amylase có thể được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau; từ vi sinh vật, nấm men, nấm mốc hoặc từ ngũ cốc Tuỳ từng nguồn nguyên liệu khác nhau mà ta có thể thu được lượng enzym Amylase khác nhau

Aspergillus Oryzae là một trong những chủng nấm mốc có khả năng sản

sinh α-amylase nhiều nhất và người ta đã ứng dụng tính ưu việt này của nấm mốc vào ngành xay xát để cải thiện các bột nghèo α-amylase ; hoặc trong các ngành công nghiệp bia, làm tăng khả năng lên men của các loại hạt, các đặc tính của bia v.v… và còn rất nhiều ứng dụng khác

Ngày nay chúng ta thấy vi khuẩn và nấm mốc được sử dụng rộng rãi hơn cả, phần lớn là do đặc tính lý hoá của chúng, vì vi khuẩn và nấm mốc có khả năng chịu nhiệt cao Do đó, trong đề tài này tôi đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số các yếu tố như nhiệt độ, pH, loại chất tủa đến hiệu suất thu nhận của

enzym Amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae

Tuy nhiên vì thời gian có hạn nên tôi chỉ mới nghiên cứu tới đây Nếu có thời gian, xin được triển khai thêm theo một số hướng như trong đề nghị nêu ra

Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 1

I.1 Khái quát chung về Enzym……….2

I.1.1 Lịch sử………2

I.1.2 Định nghĩa………2

I.1.3 Cấu tạo……….3

I.1.4 Phân loại……….3

I.1.5 Trung tâm hoạt động của Enzym………4

I.1.6 Bản chất hoá học……….4

I.1.7 Tính chất lý hoá chung của Enzym……….5

I.1.8 Cường lực xúc tác của Enzym………5

I.1.9 Tính đặc hiệu xúc tác của Enzym……….6

I.1.10 Tính ưu việt……….6

I.1.11 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym ……….7

I.2 Khái quát chung về Aspergillus Oryzae………9

I.2.1 Đặc điểm và phân loại………9

I.2.2 Hệ enzym Amylase của nấm mốc………10

I.2.3 Ứng dụng của nấm mốc trong công nghiệp thực phẩm………11

I.3 Hệ Enzym Amylase và Ứng dụng………12

I.3.1 Định nghĩa………12

I.3.2 Phân loại……….12

I.3.3 Tính chất và cơ chế tác dụng………12

I.3.3.1 α-Amylase………12

I.3.3.2 β- Amylase……….14

I.3.3.3 Glucoamylase……….………15

I.3.4.2 Trong sản xuất bia……….17

I.3.4.3 Trong sản xuất bánh mì……….17

I.3.4.4 Trong sản xuất glucose và mật……….17

I.3.4.5 Trong công nghiệp dệt, giấy……… 17

I.3.4.6Trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc……….18

I.3.4.7 Trong công nghiệp dược phẩm……….18

I.4 Phương pháp thu nhận Enzym………18

I.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym……….21

PhầnII: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ………22

II.1 Vật liệu……… 23

II.1.1 Nguyên liệu dùng tách chiết và thu nhận enzym amylase……23

II.1.2 Nguyên liệu dùng làm cơ chất………23

II.2 Thiết bị……… 23

II.3 Phương pháp nghiên cứu……….23

II.3.1 Phương pháp tách chiết enzym từ nấm mốc Aspergillus Oryzae………23

II.3.1.1 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc với tác nhân tủa là cồn 96o……….24

II.3.1.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc với tác nhân tủa là Aceton 24

II.3.1.3 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc với tác nhân tủa là muối amoni sulfat………24

II.3.1.4 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc với tác nhân tủa là PEG……….25

II.3.2.2 Hóa chất……….25

II.3.2.3 Cách tiến hành………26

II.3.2.4 Dựng đường chuẩn……….26

II.3.2.5 Tính kết quả………26

II.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ Amylase theo Smith & Ross.27 II.3.3.1 Nguyên tắc………27

II.3.3.2 Hóa chất………27

II.3.3.3 Cách tiến hành……….27

II.3.3.4 Tính kết quả………28

II.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzym Amylase………28

II.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzym Amylase………28

II.3.6 Phương pháp khảo sát quá trình thủy phân cơ chất bởi enzym Amylase………29

II.3.6.1 Nguyên tắc………29

II.3.6.2 Hoá chất………29

II.3.6.3 Cách tiến hành……….29

II.3.6.4 Tính kết quả………30

Phần III: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN………31

III.1 Xác định hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường Aspergillus Oryzae với các loại tác nhân tủa khác nhau………32

III.1.1 Tác nhân tủa là cồn 96o……… 32

III.1.4 Tác nhân tủa là PEG……… 34 III.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry……… 34 III.2.1 Dựng đường chuẩn Albumin……… 34 III.2.2 Xác định hàm lượng protein trong canh trường………35

III.2.3 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm enzym (tủa bằng cồn)……… 35 III.2.4 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm enzym (tủa bằng Aceton)……… 36 III.2.5 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm enzym (tủa bằng muối amoni sulfat)……… 37

III.2.6 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm enzym (tủa bằng PEG)……… 38 III.2.7 So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzym…39

III.3 Xác định hoạt độ Amylase theo Smith & Ross……….41 III.3.1 Xác định hoạt độ Amylase trong canh trường nấm mốc………41

III.3.2 Xác định hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym tủa bằng cồn 96o……… 42 III.3.3 Xác định hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym tủa bằng Aceton……… 42 III.3.4 Xác định hoạt độ Amylase của chế phẩm enzymtủa bằng muối amoni sulfat……… 43

III.3.5 Xác định hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym tủa bằng PEG……… 44 III.3.6 So sánh hoạt độ Amylase của các loại chế phẩm enzym…… 46

Phần IV: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ………54

IV.1 Kết luận……….55

IV.2 Đề nghị………56

Trang

I Danh mục các Bảng

Bảng 2.1: Trình tự tiến hành xây dựng đường chuẩn Albumin……… 26

Bảng 3.1: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym với tác nhân tủa là cồn 96o……… 32

Bảng 3.2: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym với tác nhân tủa là Aceton……… 33

Bảng 3.3: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym với tác nhân tủa là muối amoni sulfat……… 33

Bảng 3.4: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym với tác nhân tủa là PEG……… 34 Bảng 3.5: Sự biến thiên mật độ quang theo nồng độ Albumin 34

Bảng 3.6: Hàm lượng protein của canh trường nấm mốc Aspergillus

Bảng 3.10: Hàm lượng protein của chế phẩm enzym tủa bằng PEG………39 Bảng 3.11: So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzym

nhau………40

Bảng 3.13: Hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng cồn 96o……… 42 Bảng 3.14: Hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng Aceton………43 Bảng 3.15: Hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng muối amoni sulfat………44

Bảng 3.16: Hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng PEG……… …45 Bảng 3.17: So sánh hoạt độ Amylase của các loại chế phẩm enzym …46

Bảng 3.18: So sánh hoạt độ riêng Amylase của các loại chế phẩm enzym……….47 Bảng 3.19: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ Amylase vào nhiệt độ………48

Bảng 3.20: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ Amylase vào pH………49 Bảng 3.21: Sự biến đổi hàm lượng đưởng khử theo thời gian thủy phân………50

II Danh mục các Hình vẽ

Hình 3.1: Đồ thị chuẩn Albumin………35 Hình 3.2: Sự phụ thuộc hoạt độ enzym Amylase vào nhiệt độ…… ………48 Hình 3.3: Sự phụ thuộc hoạt độ enzym Amylase vào giá trị pH……….50 Hình 3.4: Quá trình thủy phân của enzym Amylase trêncác cơ chất khác nhau……… 53

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 1 PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 2 I.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYM:

I.1.1 Lịch sử [11]

- Từ thế kỉ 19 đã có những nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học – enzym trong quá trình tiêu hoá ở nước bọt, dạ dày và ruột

- 1850, Pasteur đã đưa ra nhận định là quá trình lên men đường thành rượu bởi nấm men được yếu tố xúc tác sinh học gọi là ferment ( từ chữ fermentation – sự lên men ) xúc tác Sau này yếu tố trên được gọi là enzym

- 1897, Buchner đã chứng minh chính dịch chiết nấm men có khả năng lên men đường thành rượu

- 1926, lần đầu tiên Sammer đã nhận được tinh thể enzym urease - 1930, Northrop nhận được tinh thể pepsin và trypsin đã chứng minh bản chất của enzym là protein và đặt nền móng cho những nghiên cứu cơ bản về enzym

- Cuối thế kỉ 20, các nghiên cứu được tập trung vào vai trò xúc tác của enzym trong các quá trình chuyển hoá trao đổi chất của tế bào Đã tinh sạch được hàng nghìn enzym và nhờ vậy đã làm sáng tỏ cấu trúc không gian & chức năng xúc tác của hàng trăm enzym khác nhau

I.1.2 Định nghĩa [13]

Enzym hay còn gọi là Men là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzym có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật Enzym không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào trao đổi chất: gọi là “invivo” mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro”) Vì có nguồn gốc từ sinh vật do đó enzym thường được gọi là xúc tác sinh học ( biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hoá học khác

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 3

Cơ thể thiếu enzym thì mọi quá trình chuyển hoá sẽ đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản, phát triển bình thường được, sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại

Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2000 enzym trong đó hơn 200 enzym thu được ở dạng tinh thể Enzym ngày nay được ứng dụng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương, chao, nước chấm, nước mắm, v.v…

I.1.3 Cấu tạo [13]

Từ những nghiên cứu các tính chất lý hoá của enzym người ta đã đi đến kết luận “bản chất hoá học của enzym là protein”.Dựa vào thành phần hoá học của enzym người ta chia enzym ra hai nhóm lớn :

Enzym một cấu tử : là enzym trong thành phần cấu tạo chỉ có protein Các enzym đơn cấu tử thường gặp như ureaza, pepsin, amylase,…

Enzym hai cấu tử : là enzym trong thành phần của nó ngoài protein còn có một phần phi protein ( hay nhóm prostetic ) Các enzym hai cấu tử như Catalaza, Peroxydaza, Xitocrom, Polyphenol-oxydaza… Trong nhóm ngoại có chứa Cu, Fe (Metaloenzym) Có enzym trong nhóm ngoại có dẫn xuất Vitamin

I.1.4 Phân loại [13]

Hội nghị Sinh hoá Quốc tế lần thứ 5 tiến hành phân loại Enzym theo 6 nhóm lớn (nhóm chính ) Trong mỗi nhóm chính còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ

6 nhóm lớn gồm :

- Nhóm 1 : Oxydroreductaza : xúc tác cho phản ứng oxi hoá khử - Nhóm 2 : Transferaza : xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm hay gốc nào đó từ chất này sang chất khác

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 4

- Nhóm 3 : Hydrolaza : xúc tác cho phản ứng thuỷ phân (sự phân giải có nước tham gia)

- Nhóm 4 : Liaza :xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đo ùra khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước

- Nhóm 5 : Izomeraza : xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng phân này sang dạng đồng phân khác

- Nhóm 6 : Ligaza (syntetaza) : xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự.

I.1.5 Trung tâm hoạt động enzym [13]

Không phải toàn bộ phân tử enzym tham gia trực tiếp liên kết với cơ chất quyết định hoạt tính xúc tác của enzym mà chỉ có một phần, phần này gọi là “trung tâm hoạt động của enzym” Số trung tâm hoạt động của enzym có thể là một hay nhiều hơn

Với enzym một cấu tử thì trung tâm hoạt động gồm một số nhóm chức của acid amin liên kết lại với nhau Với enzym hai cấu tử ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm ngoại tham gia tham gia trung tâm hoạt động enzym

Một số nhóm định chức thường tham gia tạo thành trung tâm hoạt động enzym như :

SH của xystein OH của serin

Vòng Imidazol của histidin ε- NH2 của lizin

ω- COOH của acid aspactic và acid glutamic α- COOH của acid amin ( cuối mạch )

I.1.6 Bản chất hoá học [1]

Bản chất enzym là những protid đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức tạp,

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 5

những yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng, nhiệt độ cao, các dung môi hữu cơ như rượu, aceton,… đều làm cho enzym bị biến tính và mất tác dụng xúc tác Các chất gây kết tủa thuận nghịch protein như amon sunfat, clorua Natri và các dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp cũng có tác dụng tương tự đối với các chế phẩm enzym

Người ta có thể dùng các chất này để kết tủa và thu nhận enzym Khi kết hợp với một số chất hữu cơ đặc hiệu khác thì một số tính chất lý hoá của phân tử enzym có thể bị thay đổi như tính bền với nhiệt, tính quang hoạt, khả năng kết hợp với các chất kháng thể của phân tử enzym.

I.1.7 Tính chất lý hoá chung của enzym [13]

Enzym có cấu tạo là protein do vậy chúng có đầy đủ tính chất của protein : dễ biến tính, dễ kết tủa, dễ mất hoạt tính sinh học,hoạt tính xúc tác khi chịu những tác động bên ngoài hoặc các tác nhân hoá học

Enzym không thẩm tích qua màng bán thấm

Enzym không chịu được nhiệt độ cao, dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao và có thể mất hoạt tính xúc tác

Enzym có tính lưỡng tính ( do có –COOH và NH2- )

Tan trong nước, dung môi hữu cơ có cực khác, dung dịch muối loãng, glyxerin Đa số có dạng hình cầu

M lớn thường từ 2.000-1.000.000

I.1.8 Cường lực xúc tác của enzym [13]

Enzym là một chất xúc tác sinh học, do vậy nó có đầy đủ tính chất của một chất xúc tác nghĩa là chỉ cần một lượng nhỏ đã làm tăng đáng kể vận tốc phản ứng, sau phản ứng chất xúc tác sẽ được hoàn lại với lượng và cấu tạo như ban đầu Tuy nhiên enzym có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều lần so với xúc tác vô cơ, nghĩa là lượng enzym cần rất ít, nhưng xúc tác chuyển hoá một

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 6

lượng cơ chất rất lớn trong một thời gian rất ngắn

Người ta có thể khẳng định rằng, enzym tham gia vai trò chất xúc tác, có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hoá và làm cho phản ứng xảy ra nhanh chóng dễ dàng.

I.1.9 Tính đặc hiệu xúc tác của enzym [13]

(Hay tính chuyên biệt cơ chất của enzym)

Khác với xúc tác vô cơ, enzym chỉ tác dụng lên một số loại cơ chất nhất định hoặc chỉ một cơ chất duy nhất hoặc chỉ xúc tác một kiểu phản ứng hoá học nhất định, đây gọi là tính đặc hiệu Người ta thường phân biệt các dạng đặc hiệu sau :

Đặc hiệu quang học Đặc hiệu tương đối Đặc hiệu nhóm Đặc hiệu tuyệt đối

I.1.10 Tính ưu việt [13]

Enzym có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như từ động vật (ta có chimotrypsin, trypsin, renin, pepsin…) hay từ thực vật (papain, bromelin, amilaza, ureaza,…) hoặc sinh vật (gần như đủ loại enzym với hoạt tính cao) Do có nguồn gốc từ sinh vật, từ các loại thực phẩm rau quả thông dụng nên hầu như enzym không có tính chất độc hại

Enzym hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện “nhẹ nhàng”: nhiệt độ thường trong khoảng30-450C, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính…

Enzym có tính đặc hiệu cao nên hiệu suất thu sản phẩm chính khá cao

Vận tốc phản ứng do enzym xúc tác co ùthể dễ dàng điều chỉnh thậm chí

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 7

ngừng phản ứng bằng các yếu tố tác động như nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm, hoạt hoá, nồng độ cơ chất… do vậy chỉ cần dùng một lượng nhỏ enzym có thể chuyển hoá một lượng cơ chất lớn trong khoảng thời gian ngắn Điều này rất cần thiết để rút ngắn thời gian sản xuất, hạ chi phí cho sản xuất sản phẩm

I.1.11 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của Enzym [1], [13], [19]

⮚ Nhiệt độ :

Trong các phản ứng enzym, nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng lên tốc độ cực đại và cũng giống như những phản ứng hoá học nói chung: chừng nào enzym chưa bị biến tính thì mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10 độ, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần, khi tăng nhiệt độ lên khoảng 60-700C thì phần lớn enzym mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ này gọi là nhiệt độ tới hạn

Mỗi enzym đều có một nhiệt độ thích hợp nhất ( nhiệt độ tối ưu ) cho sự hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng đạt tốc độ cao nhất Nói chung, nhiệt độ thích hợp của enzym gần với nhiệt độ của cơ thể Các enzym của động vật có nhiệt độ thích hợp vào khoảng 400C Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzym của chúng có nhiệt độ thích hợp cao Nhiều enzym thực vật có nhiệt độ thích hợp khá cao, thí dụ : papain hoạt động mạnh nhất ở 800C

Nhiệt độ thích hợp của một số enzym không cố định, mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzym thấp dần Nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym cũng có thể làm thay đổi tác dụng của nhiệt độ đối với enzym Nói chung, enzym ở dung dịch loãng, không có cơ chất thường kém bền vững nhất, enzym có cơ chất thì khá bền với nhiệt độ

Ở nhiệt độ thấp, hoạt độ của enzym giảm đi Ở 00C, hoạt độ của enzym còn không đáng kể Khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính enzym tăng theo vì

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 8

enzym không bị biến tính ở nhiệt độ lạnh Người ta sử dụng đặc tính này để bảo quản enzym, thường là ở 00C, hoặc nhiều khi ở -200C hay -300C hoặc thấp hơn nữa.

⮚ pH

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, do đó pH có tác dụng rất lớn đối với tốc độ phản ứng enzym Mỗi enzym có một trị số tối ưu cho sự hoạt động của nó, với những trị số lớn hoặc nhỏ hơn trị số của pH đó, tốc độ phản ứng enzym giảm dần Đối với một enzym nhất định, pH tối ưu của nó không phải lúc nào cũng cố định, mà có thể thay đổi tuỳ theo tính chất và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ phản ứng và bản chất của các loại dung dịch đệm

Aûnh hưởng của pH đối với hoạt động của enzym có thể do nhiều tác động rất khác nhau, pH có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá của phân tử enzym( nhất là các nhóm hoạt động của enzym) và trạng thái ion hoá của cơ chất, ảnh hưởng đến sự bền vững của phân tử enzym và đến sự kết hợp giữa enzym và phần phụ không phân giải protein.

⮚ Nồng độ cơ chất:

Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzym xúc tác, tuân theo quy luật của phương trình Michaelis-Menten

⮚ Chất kìm hãm:

Chất kìm hãm là chất làm yếu hay chấm dứt tác dụng xúc tác của enzym.Các chất kìm hãm có bản chất hoá học khác nhau, người ta chia chất kìm hãm thành các loại sau:

- Kìm hãm thuận nghịch: là khi có mặt chất kìm hãm, hoạt tính enzym sẽ yếu đi, nhưng khi tách bỏ chất kìm hãm thì hoạt tính enzym sẽ hoạt dộng trở lại như ban đầu

- Kìm hãm bất thuận nghịch: thì nguợc lại, nếu loại bỏ chất kìm hãm

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 9

thì enzym không trở lại hoạt tính như ban đầu Gồm có hai dạng:

+ Kìm hãm bất thuận nghịch cạnh tranh: xảy ra khi enzym thiếu đặc tính tuyệt đối, chất kìm hãm có cấu tạo gần giống cấu tạo cơ chất

+ Kìm hãm bất thuận nghịch không cạnh tranh: trong trường hợp này chất kìm hãm(I) ít giống với cơ chất (S), do vậy không xảy ra cạnh tranh, chất kìm hãm có thể gắn với enzym(E) ở trung tâm khác với cơ chất Do vậy tạo ra đồng thời phức EI và cả phức IES nên làm chậm vận tốc phản ứng từ ES tạo ra sản phẩm P khi ái lực S với E và EI như nhau

Chất kìm hãm có thể gắn vào enzym trùng với vị trí của cơ chất hoặc có thể chất kìm hãm gắn vào “tâm dị không gian” trên enzym Cả hai trường hợp này đều ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym hoặc ảnh hưởng đến ái lực liên kết giữa cơ chất và tâm hoạt động của enzym.

⮚ Chất kích thích hay chất hoạt hoá:

Chất hoạt hoá là những chất có tác dụng làm cho enzym từ trạng thái không hoạt động trở thành trạng thái hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn Chất hoạt hoá có bản chất rất khác nhau Có thể là ion kim loại, một số chất hữu cơ nào đó, các dẫn xuất vitamin, các enzym protease tách bỏ “peptid kìm hãm” trong tiền enzym,…

II.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ASPERGILLUS ORYZAE

II.2.1.Đặc điểm và phân loại [6]

▪ Chủng nấm mốc Asp.Oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm rất mảnh

(chiều ngang 5-7 µm) có vách ngăn, chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào ), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi hay khuẩn ty ▪ Phân loại nấm mốc :

Siêu giới : Eukaryote Giới : Fungi

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 10

Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Dezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae ▪ Điều kiện phát triển của nấm mốc :

+Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45% +Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzym : 55-58% +Độ ẩm không khí : 85-95%

+PH môi trường : 5.5-6.5 +Nhiệt độ nuôi cấy : 27-300C +Hiếu khí hoàn toàn

+Thời gian tạo bào tử : 60-70h

I.2.2 Hệ enzym Amylase của nấm mốc [8]

▪ Amylase của nấm mốc trội hơn hạt nẩy mầm ở chỗããå có cả gluco amylase

α-amylaza (-1,4 glucan –glucanhydrolaza, mã số 3.2.1 thủy phân liên kết α-1,4 glucozit ở bất kỳ vị trí nào trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysaccarit Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột có thể chuyển thành mantoza, glucoza và các dextrin có phân tử lượng thấp Nhưng kết quả này không phải đạt được dễ dàng, mà thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin có phân tử thấp, không đổi màu iôt, mantoza và một ít glucoza Do vậy α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá)

Sơ đồâ thủy phân tinh bột bằng α-amylase có thể biễu diễn như sau: Tinh bột α-amylase α-dextrin + mantoza + glucoza

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 11

Hoặc glycogen (nhiều) (ít)

PH tối thích đối với tác dụng của α-amylaza nấm mốc là 4.5-4.7, nhưng trong dung dịch nó đường hoá thích hợp ở vùng pH 5-5.5 ; ở pH 2.5 nó bị mất hoạt tính sau 30 phút Trong công nghiệp rượu amylase của nấm mốc được dùng để đường hoá ở nhiệt độ 50-520C, còn amylase của thóc nầm có thể đường hoá ở 58-600C

▪ Glucoamylase (amyloglucozidase) (α-1,4 glucan-glucohydrolase, mã số 3.2.1.3)

Trong thóc nầm không có enzym này Glucoamylase phân hủy tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp liên tục tách gốc glucoza và cuối cùng tạo thành glucoza mà không cần có một enzym amylase nào khác tham gia Enzym này có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysaccarit đồng loại ở các mối liên kết α-1,4-glucozit và α-1,6-glucozit Nó có tác dụng đặc biệt trong sản xuất rượu , chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men thành những hợp chất lên men được và do đó nâng cao được hiệu suất nấu rượu từ các nguyên liệu tinh bột

▪ α-glucozidase (mantase): mã số 3.2.1.20 Chủ yếu thủy phân mantose thành glucose

▪ Dextrinase (oli -1,6-glucozidase; mã ï số 3.2.1.10)

Thủy phân liên kết α-1,6-glucozit trong izomantose, panose và dextrin thành những đường có thể lên men được

I.2.3 Ứng dụng của nấm mốc trong công nghiệp thực phẩm [9]

Trong công nghiệp thực phẩm nấm mốc được sử dụng cho các ngành sản xuất chính như:

-Sản xuất acid hữu cơ -Sản xuất chất kháng sinh

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 12

-Sản xuất nước chấm, tương, chao…

-Sản xuất rượu từ nguyên liệu là tinh bột , nấm mốc đóng vai trò là tác nhân cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường, và đường dưới tác dụng của nấm men sẽ lên men tạo thành rượu và CO2

I.3 HỆ ENZYM AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG

R-R’ + H-OH → R-H + R’-OH

I.3.2 Phân loại [15], [20]

Hiện nay người ta đã biết rõ có sáu loại enzym amylase, trong đó có 3 amylase (α –amylase, β –amylase, γ-amylase hay glucoamylase) thủy phân các liên kết α-1,4-glucozit của tinh bột và các polysaccarit đồng loại Ba amylase còn lại (dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucozit trong polysaccarit và các dextrin cuối

I.3.3 Tính chất và cơ chế tác dụng [15]

Các enzym amylase từ các nguồn gốc khác nhau thì thườngkhác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân Ngay cả các amylase cùng loại do vi sinh vật tổng hợp nên cũng có nhiều điểm khác biệt về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động

I.3.3.1 α- Amylase (α-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolase, mã số EC.3.2.1.1)

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 13 ⮚ Tính chất [15], [17], [20]

pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn gốc của enzym Nói chung pH tối ưu nằm trong khoảng acid yếu 4.8-6.9

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4.5-4.8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4.5-5.8) , của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5.3 ( hoạt động tốt trong vùng pH 4.7-5.4) và của vi khuẩn là 5.8-6.0 ( hoạt động tốt trong vùng pH 5.8-7.0) Ở pH=3.6 và 00C α-amylase của malt bị vô hoạt hoá hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoá 50% , trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm mốc hầu như không giảm bao nhiêu

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau cũng không đồng nhất α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của nhiệt Nhiết độ tối thích của nó là 500C α-amylase của thóc mầm và của malt bền với nhiệt hơn và nhiệt độ tối thích ở 58-600C α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C α-amylase của vi khuẩn chỉ bắt đầu bị vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 770 C Ở 700C α-amylase của nấm mốc đã bị mất hoạt tính 50% hoạt lực, còn α-amylase malt hầu như chưa bị mất hoạt lực

Điểm đẳng điện của α-amylase nằm trong vùng pH 4.2-5.7

Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau rất gần nhau ( của nấm mốc 45.000-50.000; của malt 59.000)

Các α-amylase đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam Ca/ mol Song không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzym thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzym, duy trì cấu hình hoạt động của enzym Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 14

những tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzym phân giải protein Tất cả α-amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng ( Cu2+, Ag+, Hg2+, )

⮚ Cơ chế tác dụng [15]

α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucozit nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên , không theo một trật tự nào cả Vì thế người ta gọi là enzym nội phân

α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ chậm

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccarit gồm 6-7 gốc glucose Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục, nên các mạch polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm maltotetraose, maltotriose và maltose

Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự Nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên ( 72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%)

I.3.3.2 β-amylase : (α-1,4-glucan-maltohydrolase, mã số EC.3.2.1.2)

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 15

β-amylase rất bền khi không có cả Ca , β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urê, iôt…

Khối lượng phân tử của β-amylase là 60.000

β-amylase phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong hạt nảy

mầm Gần đây người ta đã tách chiết được β-amylase từ vi khuẩn như Bacillus

pseudomonas, Bacilllus streptomyces

⮚ Cơ chế [15]

β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết (α-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharid đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose từ đầu không khử của mạch

β-amylase không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên lành mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose Quá trình thuỷ phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Khi gặp liên kết α-1,4-glucozit đứng kế cận liên kết α-1,6-glucozit thì β-amylase ngừng tác dụng Phần saccharid còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucozit và được gọi là β-dextrin β-dextrin cho màu tím đỏ với iode

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột được biểu diễn bằng sơ đồ sau : Tinh bột β-amylase Maltose (54-58%) + β-dextrin (12-46%)

I.3.3.3 Glucoamylase :(α-1,4-glucan-glucohydrolase, mã số EC.3.2.1.3.)

⮚ Tính chất [15], [20]

Đa số glucoamylase đã biết thuộc loại enzym acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3.5-5.5 Ở pH 7.0 hoặc kiềm hơn sẽ làm vô hoạt enzym nhanh chóng So với α-amylase, glucoamylaseđbền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etilic, aceton

Glucoamylaseđkhông được bảo vệ bằng Ca2+

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 16

Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylaseđloại bền acid là 50 C Hầu hết glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70đ0C

Điểm đẳng điện của glucoamylaseđ từ các nguồn khác nhau cũng không

đồng nhất: glucoamylaseđtừ Aspergillus niger là 6.5, của Asp Awamori là 7.5

Hiện nay nguời ta chỉ biết được phân tử lượng của một số chế phẩm

glucoamylase tinh thể Chẳng hạn phân tử lượng của đ glucoamylaseđ tách từ Asp

niger là 97.000, Asp.awamori là 62.000

Các enzym này chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật, đặc biệt là nấm

mốc kiểu Aspergillus, Penicillum và Rhizopus Ngoài ra enzym này còn có trong

mô gan động vật

⮚ Cơ chế tác dụng [15], [17]

Glucoamylaseđlà những enzym có thể thủy phân được cả hai kiểu liên kết α-1,4 và α-1,6-glucan giải phóng ra glucose Các enzym này còn được gọi là amyloglucosidase hay glucan amylase

Glucoamylase là enzym ngoại phân , nó thủy phân polysaccarit từ đầu không khử để tạo ra glucose

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin cuối, isomaltose và maltose tới glucose

I.3.4 Ứng dụng của hệ enzym amylase:

I.3.4.1 Trong sản xuất rượu: [16], [18]

Đối với công nghiệp sản xuất rượu cồn, enzym đường hóa có vai trò đặc biệt quan trọng Trong sản xuất rượu trước đây, malt đại mạch được dùng làm tác nhân đường hoá Nhưng gần đây chế phẩm amylase của nấm mốc đã hoàn toàn thay thế malt Chế phẩm enzym dùng ở dạng thô, không cần phải tinh chế Để đường hóa hoàn toàn tinh bột có trong nguyên liệu, lượng chế phẩm enzym phải chiếm khoảng 6-6,5% tinh bột

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 17

Nguồn enzym thường là từ Aspergillus awamori, Asp oryzae, Asp usamii

Trong sản xuất rượu vai trò của glucoamylase rất quan trọng, nó có thể đường hoá tinh bột đến cùng, còn α-amylase thì không thể chuyển hoá hoàn toàn tinh bột thành đường

Dùng amylase của nấm mốc có thể tiết kiệm nguyên liệu, tăng hiệu suất rượu, giảm thời gian sản xuất, giảm giá thành

I.3.4.2 Trong sản xuất bia: [4], [14], [16]

Trước đây malt đại mạch là nguyên liệu chính , hiện nay ở nhiều nước trên thế giới đã thay thế 25-50% malt bằng nguyên liệu phi malt ( hạt chưa nảy nầm) Trong trường hợp này người ta đã dùng chế phẩm amylase để có được mức độ đường hoá cần thiết cho chất lượng bia Nguồn enzym từ chế phẩm amylase của vi khuẩn và của nấm mốc

I.3.4.3 Trong sản xuất bánh mì [4], [16]

Thêm vào bột nhào 0,002-0,003% chế phẩm amylase, sẽ làm thay đổi hoàn toàn chất lượng của bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp… tăng lên một cách rõ rệt

Trong sản xuất bánh mì người ta thường dùng chế phẩm enzym từ

Aspergillus oryzae vì nó có hoạt độ cao , có thể đạt đến độ đường hoá một cách

nhanh chóng, mặt khác nhiệt độ vô hoạt thấp (gần 70oC) do đó có thể dùng enzym này với một lượng lớn mà vẫn không có hiện tượng dextrin hoá khi nướng

I.3.4.4 Trong sản xuất glucose và mật:[4], [16]

Khi thủy phân tinh bột bằng enzym của malt ta sẽ thu được mật glucose hay mật maltose Mật maltose thường dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất các sản phẩm ăn kiêng cho trẻ em và người bệnh

Hiện nay, nhiều nước đã sản xuất glucose từ tinh bột bằng enzym

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 18

glucoseamylase của nấm mốc Asp awamori,Rhizopus, nấm men Endomycopsis

I.3.4.5 Trong công nghiệp dệt, giấy [4], [16]

Trong công nghiệp dệt, chế phẩm amylase được dùngđể rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Chúng ta đều biết trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác Để làm cho mềm vải, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì cần phải tách tinh bột Rũ hồ bằng enzym không những nhanh, mà còn không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng năng suất lao động

Trong công nghiệp giấy dùng amylase để dịch hoá hồ tinh bột ở nồng cao sẽ thu được hồ có độ nhớt cần thiết dùng sản xuất cho các loại giấy tốt

I.3.4.6 Trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc [4], [16]

Người ta sử dụng amylase để xử lý sơ bộ thức ăn tươi hoặc trộn enzym vào thức ăn gia súc trước khi cho ăn; sản xuất thức ăn tổng hợp nuôi gia súc, gia cầm; phối hợp protease, cellulase để chế biến thức ăn tổng hợp thay thế sữa nuôi bê con

I.3.4.7 Trong công nghiệp dược phẩm:[4], [14]

Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh thiếu enzym, kém khả năng chuyển hoá chất, bệnh về tiêu hoá, tim, thần kinh…

Ngoài ra chế phẩm amylase dùng để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học

I.4 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM: [5], [7], [13]

Thu nhận chế phẩm enzym là một quá trình gồm nhiều giai đoạn: thu nhận, tách chiết, tinh sạch để loại bỏ các tạp chất không cần thiết nhưng vẫn giữ được hoạt tính enzym và phải quan tâm tới một số tính chất cơ bản của enzym như : hoạt tính và độ ổn định của enzym đối với pH, nhiệt độ, lực ion, tính hòa tan và tính bền vững trong dung môi hữu cơ, trong dung dịch muối…

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 19

Enzym không có khả năng di chuyển qua màng tế bào để đi vào dung dịch chiết, vì vậy việc đầu tiên là phá vỡ cấu trúc tế bào; có thể dùng một số phương pháp sau: biện pháp cơ học ( nghiền xay với bột thuỷ tinh, cát thạch anh, hoặc dùng máy xay đồng hóa,…) bằng dung môi hữu cơ ( butanol, aceton, glycerin,…), bằng sóng siêu âm,

Sau khi nghiền nhỏ, enzym được chiết rút bằng nước hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính,…

Dung dịch thu được sau khi chiết, ngoài enzym còn có các hợp chất khác như: protein phi enzym, muối, glucid,…Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận enzym có độ tinh khiết cao, có nhiều phương pháp tinh sạch enzym, sau đây là một số phương pháp cơ bản, được dùng rộng rãi và có hiệu quả:

+Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ, ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm Tính chất của màng sẽ cho những chất có phân tử nhỏ đi qua, các chất có trọng lượng phân tử lớn như enzym, protein sẽ bị giữ lại +Để loại bỏ protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như: sắc ký hấp thụ, sắc khí trao đổi ion, điện di, lọc gel, kết tủa phân đoạn bằng muối hay dung môi hữu cơ, biến tính chọn lọc bằng các tác nhân nhiệt độ, pH,…

Cần lưu ý các chế phẩm enzym sau khi tinh sạch cần được bảo quản ở dạng bột khô, cần sấy chân không, hay sấy quạt gió ở khoảûng nhiệt độ 30-400C để giữ được hoạt tính xúc tác của enzym Enzym cần được bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, chống tiếp xúc ánh sáng và các tác nhân lý hoá học có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 20

❖ Quy trình thu nhận enzym: Nguyên liệu

Chiết enzym bằng dung dịch

Nước Lọc Bã

Chế phẩm enzym

Bảo quản lạnh

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 21 I.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM [5], [16]

Trong enzym học, nguời ta không định lượng enzym một cách trực tiếp, mà thường xác định một cách gián tiếp thông qua mức độ hoạt động ( hoạt độ) của enzym Mức độ hoạt động của enzym được xác định thông qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hoặc lượng sản phẩm được tạo thành sau phản ứng

⮚ Đơn vị hoạt độ của enzym:

Theo qui định của Hiệp hội Sinh hoá thế giới:

Đơn vị hoạt tính quốc tế UI ( International Unit) của bất kỳ enzym chính là số lượng enzym cần thiết xúc tác cho phản ứng chuyển hoá một micromol(µmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tối ưu (pH, nhiệt độ)

1 UI=1 µmol cơ chất (10-6 mol)/ phút

Katal (Kat): là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hoá được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây

1 UI= 1/60 * 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanoKatal)

Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym là tổng số đơn vị UI( hoặc số đơn vị Katal)trong1 mg protein của chế phẩm enzym

Nếu chế phẩm enzym đã tinh sạch, hoạt độ được biểu thị bằng số UI( hoặc Katal) trên 1 g enzym Khi đã biết khối lượng phân tử của enzym thì có thể tính hoạt độ riêng của phân tử

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 22 PHẦN II

VẬT LIỆU &

PHƯƠNG PHÁP

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 23 II.1 VẬT LIỆU:

II.1.1 Nguyên liệu dùng tách chiết & thu nhận enzym Amylase:

Canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae của Viện sinh học Nhiệt đới

Tp.Hồ Chí Minh Cồn 96o

Aceton

Muối amoni sulfat (NH4)2SO4.

Polyethylen glycol(PEG)

II.1.2 Nguyên liệu dùng làm cơ chất:

Tinh bột tan, bột năng, bột gạo, bột mì, bột sắn dây

II.2 THIẾT BỊ:

Máy ly tâm Máy quang phổ Máy đo pH

Tủ sấy_ Bình hút ẩm

Các dụng cụ thủy tinh thông thường

II.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

II.3.1 Phương pháp tách chiết enzym từ nấm mốc Aspergilllus oryzae

Cân chính xác 50g canh trường nấm mốc, cho vào cối với một ít nước cất cùng một ít bột thuỷ tinh, nghiền nhuyễn bằng cối chày sứ khoảng 15 phút Thêm nước vào và lọc thô Lặp lại tương tự từ hai đến ba lần (để tận thu enzym), ta được một thể tích nhất định Sau đó lấy dịch này đem ly tâm 4000 vòng/ 10 phút Lấy dịch, bỏ xác Đo thể tích dịch chiết này ta được thể tích dịch chiết tư( canh trường nấm mốc Sau đó ta sử dụng dung dịch này để kết tủa

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 24

enzym bởi các tác nhân như: cồn, aceton, muối, PEG

II.3.1.1 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae với tác nhân tủa là cồn 96o

Tiến hành tương tự phần II.3.1

Sau khi kết tủa bằng cồn với tỷ lệ 1:3 (1 dịch lọc: 3 cồn 96o) Khuấy đều hỗn hợp trên bằng đũa thuỷ tinh và đem để trong tủ lạnh khoảng 30 phút, lấy ra và đem ly tâm khoảng 4000 vòng/ 10 phút Sau đó lấy phần tủa, bỏ dịch bên trên

Phần tủa thu được ta dàn mỏng trên đĩa petri, hong gió cho khô Đến khi tủa khô, ta cạo phần tủa này, được enzym thô Nghiền mịn enzym bằng cối và chày sứ, sau đó đem bảo quản trong tủ lạnh

II.3.1.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc Aspergilus oryzae với tác nhân tủa là Aceton

Tiến hành tương tự phần II.3.1

Tiếp theo cho dịch chiết và aceton vào tủ lạnh (to=5-10oC) sau 30 phút lấy ra và kết tủa enzym với tỷ lệ 1:2 (1 dịch chiết: 2 aceton) , dùng đũa thủy tinh trộn đều rồi để lạnh khoảng 30 phút Sau đó đem ly tâm, lấy tủa, bỏ dịch Kế đến là hong gió cho khô, nghiền nhuyễn và bảo quản trong tủ lạnh

II.3.1.3 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc Aspergilus oryzae với tác nhân tủa là muối amoni sulfat (NH4)2SO4

Tiến hành tương tự phần II.3.1

Xác định thể tích dịch chiết thu được, sau đó cân lượng muối amoni sulfat với khối lượng bằng 68,3% thể tích dịch chiết Cho từ từ lượng muối này vào dịch chiết và khuấy đều(tủa trong lạnh) Khuấy cho đến khi tan hết muối, rồi để vào tủ lạnh (5-10oC) khoảng 30 phút Sau đó ly tâm, thu tủa rồi hong khô, nghiền nhuyễn, và bảo quản trong tủ lạnh

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 25

II.3.1.4 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym thô từ canh trường nấm mốc Aspergilus oryzae với tác nhân tủa là polyethylen glycol(PEG)

Tiến hành tương tự phần II.3.1

Xác định thể tích dịch chiết thu được, sau đó cân lượng PEG với khối lượng bằng 25% thể tích dịch chiết Cho từ từ lượng PEG này vào dịch chiết và khúây đều(tủa trong lạnh) Khuấy cho đến khi tan hết, rồi để vào tủ lạnh (5-10oC) khoảng 30 phút Sau đó ly tâm, thu tủa rồi hong khô, nghiền nhuyễn, và bảo quản trong tủ lạnh

II.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Lowry [2], [10], [12]

Dùng để xác định hàm lượng proein có trong 1g chế phẩm enzym hay 1ml chế phẩm enzym lỏng Từ đó xác định hoạt tính riêng của enzym

II.3.2.1 Nguyên tắc:

Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan, hàm lượng của những acid amin này phụ thuộc vào các loại protein, vì vậy cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau

Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức có màu, màu này tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein

II.3.2.2 Hoá chất:

+ Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1g Albumin pha trong nước cất thành 100ml dung dịch

+Dung dịch A: cân chính xác 2g Na2CO3 hoà tan trong NaOH 0,1N thành 100ml

+Dung dịch B: cân 0,5g CuSO4.5H2O hoà tan trong Citrat Natri 0,1% thành 100ml