Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hiệu suất thu nhận và hoạt độ enzym amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYM

Enzym có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như từ động vật (ta có chimotrypsin, trypsin, renin, pepsin…) hay từ thực vật (papain, bromelin, amilaza, ureaza,…) hoặc sinh vật (gần như đủ loại enzym với hoạt tính cao) Do có nguồn gốc từ sinh vật, từ các loại thực phẩm rau quả thông dụng nên hầu như enzym không có tính chất độc hại. Trong các phản ứng enzym, nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng lên tốc độ cực đại và cũng giống như những phản ứng hoá học nói chung: chừng nào enzym chưa bị biến tính thì mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10 độ, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần, khi tăng nhiệt độ lên khoảng 60-700C thì phần lớn enzym mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ này gọi là nhiệt độ tới hạn.

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ASPERGILLUS ORYZAE

+ Kìm hãm bất thuận nghịch không cạnh tranh: trong trường hợp này chất kìm hãm(I) ít giống với cơ chất (S), do vậy không xảy ra cạnh tranh, chất kìm hãm có thể gắn với enzym(E) ở trung tâm khác với cơ chất. Nó có tác dụng đặc biệt trong sản xuất rượu , chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men thành những hợp chất lên men được và do đó nâng cao được hiệu suất nấu rượu từ các nguyên liệu tinh bột.

HỆ ENZYM AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG 1. ẹũnh nghúa [2], [15]

-Sản xuất rượu từ nguyên liệu là tinh bột , nấm mốc đóng vai trò là tác nhân cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường, và đường dưới tác dụng của nấm men sẽ lên men tạo thành rượu và CO2. Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục, nên các mạch polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm maltotetraose, maltotriose và maltose. Nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên ( 72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%).

Trong sản xuất rượu vai trò của glucoamylase rất quan trọng, nó có thể đường hoá tinh bột đến cùng, còn α-amylase thì không thể chuyển hoá hoàn toàn tinh bột thành đường. Trước đây malt đại mạch là nguyên liệu chính , hiện nay ở nhiều nước trên thế giới đã thay thế 25-50% malt bằng nguyên liệu phi malt ( hạt chưa nảy nầm). Trong sản xuất bánh mì người ta thường dùng chế phẩm enzym từ Aspergillus oryzae vì nó có hoạt độ cao , có thể đạt đến độ đường hoá một cách nhanh chóng, mặt khác nhiệt độ vô hoạt thấp (gần 70oC) do đó có thể dùng enzym này với một lượng lớn mà vẫn không có hiện tượng dextrin hoá khi nướng.

Trong công nghiệp giấy dùng amylase để dịch hoá hồ tinh bột ở nồng cao sẽ thu được hồ có độ nhớt cần thiết dùng sản xuất cho các loại giấy tốt. Người ta sử dụng amylase để xử lý sơ bộ thức ăn tươi hoặc trộn enzym vào thức ăn gia súc trước khi cho ăn; sản xuất thức ăn tổng hợp nuôi gia súc, gia cầm; phối hợp protease, cellulase để chế biến thức ăn tổng hợp thay thế sữa nuoâi beâ con.

PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM: [5], [7], [13]

Rũ hồ bằng enzym không những nhanh, mà còn không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng năng suất lao động. Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh thiếu enzym, kém khả năng chuyển hoá chất, bệnh về tiêu hoá, tim, thần kinh…. SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 19 Enzym không có khả năng di chuyển qua màng tế bào để đi vào dung dịch chiết, vì vậy việc đầu tiên là phá vỡ cấu trúc tế bào; có thể dùng một số phương pháp sau: biện pháp cơ học ( nghiền xay với bột thuỷ tinh, cát thạch anh, hoặc dùng máy xay đồng hóa,…) bằng dung môi hữu cơ ( butanol, aceton, glycerin,…), bằng sóng siêu âm,.

Sau khi nghiền nhỏ, enzym được chiết rút bằng nước hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính,…. Tính chất của màng sẽ cho những chất có phân tử nhỏ đi qua, các chất có trọng lượng phân tử lớn như enzym, protein sẽ bị giữ lại. +Để loại bỏ protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như: sắc ký hấp thụ, sắc khí trao đổi ion, điện di, lọc gel, kết tủa phân đoạn bằng muối hay dung môi hữu cơ, biến tính chọn lọc bằng các tác nhân nhiệt độ, pH,….

Cần lưu ý các chế phẩm enzym sau khi tinh sạch cần được bảo quản ở dạng bột khô, cần sấy chân không, hay sấy quạt gió ở khoảûng nhiệt độ 30-400C để giữ được hoạt tính xúc tác của enzym. Enzym cần được bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, chống tiếp xúc ánh sáng và các tác nhân lý hoá học có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.

VẬT LIỆU

Canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae của Viện sinh học Nhiệt đới Tp.Hoà Chí Minh.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan, hàm lượng của những acid amin này phụ thuộc vào các loại protein, vì vậy cùng loại với nhau sẽ chứa hàm lượng acid amin này như nhau. Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo một phức có màu, màu này tỷ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan, vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. Hút 0,4ml dung dịch có chứa protein, cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khô, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên nhiệt độ phòng 10 phút.

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ Albumin chuẩn(γ/ml) (trục Oy là giá trị ∆OD, trục Ox là nồng độ Albumin). Từ đồ thị chuẩn, trên cơ sở giá trị mật độ quang (trục tung) đo được của mẫu thí nghiệm có chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein của mẫu cần đo(tương ứng với giá trị trục hoành) (γ/ml). Amylase là một enzym thuỷ phân tinh bột thành glucose, maltose và các dextrin…Hoạt độ của amylase được tính theo số lượng maltose sinh ra do tinh bột bị thủy phân bởi lượng enzym amylase có trong 1g cơ chất trong 1 phút.

Định phân lượng thừa bằng dung dịch Na2S2O3 N/20, thêm vài giọt hồ tinh bột làm chỉ thị màu cho thêm vào lúc cuối phản ứng định phân đến mất màu. SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 31 Bình 2 (thử không): thay 5ml hỗn hợp cần xác định lượng maltose bằng 5ml nước cất, các bước tiếp theo thực hiện tương tự bình1.

XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM TỪ CANH TRƯỜNG ASPERGILLUS ORYZAE VỚI CÁC LOẠI

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 35 Bảng 3.4: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym với tác nhân tủa là PEG Laàn Theồ tớch dũch. Nhận xét: trong các loại chế phẩm enzym thu được, ta nhận thấy tủa enzym bằng Aceton đạt hiệu suất cao nhất là 4,28%.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY

Nhận xét: Vậy hàm lượng protein của chế phẩm enzym được tủa bằng cồn thu được là 114,77mg/gCPE. Nhận xét: Vậy hàm lượng protein của chế phẩm enzym được tủa bằng Aceton thu được là 88,42mg/gCPE. Nhận xét: Vậy hàm lượng protein của chế phẩm enzym được tủa bằng muối thu được là 93,76mg/gCPE.

Nhận xét: Vậy hàm lượng protein của chế phẩm enzym được tủa bằng PEG thu được là 103,97mg/g CPE(giá trị trung bình). So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzym So sánh hàm lượng protein của các chế phẩm enzymthu nhận với tác nhân tủa khác nhau. + CPE.c: chế phẩm enzym được tủa bằng cồn 96o +CPE.a: chế phẩm enzym được tủa bằng Aceton.

+ CPE.m: chế phẩm enzym được tủa bằng muối amoni sulfat + CPE.p: chế phẩm enzym được tủa bằng PEG. Nhận xét: Qua bảng so sánh trên ta thấy hàm lượng protein được tủa bằng tác nhân cồn là cao nhất, đạt 114,77mg/g CPE.

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLASE THEO SMITH & ROSS

SVTT: Kiều Mỹ Hạnh Trang 44 Bảng 3.14: Hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng Aceton. Nhận xét: Vậy hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng Aceton là 160,13 UI/g CPE(giá trị trung bình).

3.4: Xác định hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym tủa baèng muoái amoni sulfat

Nhận xét: Vậy hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng muối là 157,13 UI/g CPE(giá trị trung bình). Nhận xét: Vậy hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng PEG là 150,82 UI/g CPE (giá trị trung bình). So sánh hoạt độ Amylase của các loại chế phẩm enzym Bảng 3.17: So sánh hoạt độ Amylase các loại chế phẩm enym.

Nhận xét: Qua bảng so sánh trên ta nhận thấy hoạt độ Amylase của chế phẩm enzym được tủa bằng tác nhân Aceton là cao nhất, đạt 160,13 UI/g CPE. Nhận xét: Qua bảng so sánh trên ta thấy hoạt độ riêng của chế phẩm enzym amylase được tủa bằng Aceton là cao nhất, đạt giá trị 1,81 UI/mg-pr. Nhận xét: Từ đồ thị 3.2 ở trên, ta nhận thấy nhiệt độ tối ưu của chế phẩm enzym Amylase là 40oC.

+ Với 5 cơ chất như trờn ta thấy: với cơ chất là Bột Gạo thỡ hàm lượùng đường sinh ra là nhiều nhất.