Điều Chế Phức Chất Của Ag-Qunine Và Thử Hoạt Tính Kháng Khuẩn.pdf

Các phức chất của quinin và kim loại được chỉ là có hoạt tính sinh học, tạo ra nhiều triển vọng nghiên cứu ứng dụng chúng trong y học.. Người ta đã tổng hợp được một số phức chất của qui

MỤC LỤC

Trang

I MỞ ĐẦ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ BÁN CÔNG TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐÀO NGỌC ANH PHƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Th S Bùi Trọng Đạt đã luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và đóng góp các ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

PGS TS Nguyễn Thanh Hồng, phòng hóa hợp chất thiên nhiên - Viện công nghệ hóa học đã đóng góp các ý kiến quý báu trong quá trình hoàn thành luận văn

Th S Nguyễn Minh Hoàng đã tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thực tập

Thầy Nguyễn Văn Minh đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho quá trình thực tập

Cám ơn tất cả các cán bộ phòng hóa hợp chất thiên nhiên – Viện công nghệ hóa học đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi diều kiện thuận lợi từ vật chất đến tinh thần trong suốt thời gian thực tập

Trang

I MỞ ĐẦU 1

II TỔNG QUAN 2

II.1 BỆNH SỐT RÉT VÀ KÝ SINH TRÙNG PLASMODIUM 2

II.2 CÁC ANCALOIT CỦA CÂY CANH KI NA 3

II.3 TÍNH CHẤT CỦA QUININ 10

II.4 TÍNH CHẤT CỦA AgNO3 12

II.5 TỔNG HỢP PHỨC CHẤT GIỮA QUININE VỚI CÁC KIM LOẠI 13

II.5.1 Sự tạo phức tại nguyên tử N của vòng quinuclidine 13

II.5.2 Phức chelat N,O 14

II.5.3 Tạo phức tại vị trí nguyên tử N vòng quinoline 15

II.5.5 Tạo phức tại C=C 16

II.5.4 Phức hai nhân 16

III THỰC NGHIỆM 20

III.1 DỤNG CỤ- THIẾT BỊ- HÓA CHẤT 20

III.1.1 Dụng cụ- Thiết bị 20

III.1.2 Hóa chất 20

III.1.3 Các phương pháp phổ học trong khảo sát cấu trúc phức chất 20

III.2 TỔNG HỢP PHỨC CHẤT 21

III.2.1 Phương pháp 21

III.2.2 Các vấn đề 21

III.2.2.1 Khảo sát độ hòa tan 21

III.2.2.2 Điều chỉnh pH của dung dịch quinine trong dung môi 22

III.2.3 Thực nghiệm 22

III.2.3.1 Tổng hợp phức chất giữa quinine và muối bạc nitrat 22

III.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 23

III.4.1 Vật liệu 23

III.4.1.1 Mẫu 23

III.4.1.2 Vi khuẩn kiểm định 24

III.4.1.3 Môi trường 24

III.4.2 Phương pháp 24

III.4.3 Chuẩn bị 24

III.4.3.1 Đĩa kháng sinh 24

III.4.3.2 Dung dịch chuẩn độ đục Mac Farland 25

III.4.3.3 Chuẩn bị dịch khuẩn thử nghiệm 26

III.4.4 Phương pháp thử 26

III.4.5 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn 27

IV KẾT QUẢ 30

IV.1 PHÂN GIẢI CẤU TRÚC QUININ 30

IV.1.1 Dữ kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân 30

IV.1.2 Dữ kiện phổ hồng ngoại 34

IV.2 PHÂN GIẢI CẤU TRÚC PHỨC CHẤT Ag-QUININ 34

IV.2.1 Tính chất chung 34

IV.2.2 Dữ kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân 34

IV.2.3 Dữ kiện phổ hồng ngoại 38

V KẾT LUẬN 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

Với từ 300-500 triệu ca mắc bệnh và 1,1 - 2,7 triệu ca tử vong hàng năm, sốt rét là bệnh nhiễm ký sinh trùng quan trọng nhất của con người Tác nhân gây bệnh sốt rét là ký sinh trùng, có nhiều dòng khác nhau, và cường độ tấn công

khác nhau Plasmodium falciparum tác nhân gây bệnh sốt rét nặng là loài ký

sinh trùng chiếm ưu thế, lây truyền sang cho người qua muỗi Anophen

Quinin là một loại thuốc được chiết từ rễ của cây canh ki na Một số khác cũng được tổng hợp từ cây canh ki na bao gồm: quinidin, cinchonin, và cinchonidin Trước năm 1600, những người Ấn Độ ở Pêru đã dùng nước ngâm của cây canh ki na để trị bệnh, và cũng đã nhận thấy hiệu quả điều trị cũng như ngăn ngừa đối với bệnh sốt rét Vào thời điểm đó, không ai biết rằng đó là do tác dụng của quinin Tuy nhiên dần dần, quinin tự nhiên gần như bị thay thế bởi các thuốc tổng hợp hóa học như chloroquine, mefloquine Giờ đây, hiếm khi quinin được sử dụng để chữa trị sốt rét Tuy nhiên trong vài năm gần đây, với sự kháng thuốc ngày càng tăng, quinin một lần nữa được sử dụng trong việc điều trị bệnh sốt rét

Ngày nay, phức chất được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, rất nhiều chất xúc tác, dược phẩm, chất màu… là phức chất Các phức chất của quinin và kim loại được chỉ là có hoạt tính sinh học, tạo ra nhiều triển vọng nghiên cứu ứng dụng chúng trong y học

Người ta đã tổng hợp được một số phức chất của quinin với các kim loại chuyển tiếp Trong báo cáo này, chúng tôi đã tổng hợp phức chất của quinin với các muối đồng, bạc Đồng thời thử hoạt tính kháng khuẩn của các phức chất này

II.1 BỆNH SỐT RÉT VÀ KÝ SINH TRÙNG PLASMODIUM [20]

Bệnh sốt rét là một tai họa mà loài người phải gánh chịu, số người chết

do bệnh này hơn cả người chết do chiến tranh và các bệnh dịch khác cộng lại

Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium, một ký sinh trùng đơn bào gồm 4 chủng loài Plasmodium falciparum tác nhân gây bệnh sốt rét nặng là loài ký

sinh trùng chiềm ưu thế ở Sahara, Đông Nam Á , một số nước vùng Nam Thái

Bình Dương và Trung Mĩ P.vivax là loài phổ biến hơn ở các nước Trung Mĩ khác và khu vực Ấn Độ Dương Gần đây loài P.falciparum cũng dần phổ biến hơn ở Ấn Độ gây dịch nặng với nhiều ca tử vong do sốt rét ác tính - thể não P

malariae ít phổ biến hơn nhưng hiện diện ở phần lớn khu vực sốt rét, đặc biệt là

đặc biệt là Tây và Trung Phi P ovale ít phổ biến và hiếm thấy bên ngoài lục địa

châu Phi

Ký sinh trùng sốt rét lây truyền cho người qua vết đốt của muỗi Anophen cái có chứa đựng các thoa trùng trong tuyến nước bọt từ đó chúng đi vào dòng máu, sinh sôi phát triển trong gan rồi trở lại dòng máu và gây nên các triệu

chứng bệnh Ở sốt rét do P.vivax và P ovale, một số thể ký sinh trùng tồn tại

tiềm ẩn trong gan qua nhiều tháng và có thể tái phát bệnh sau khi điều trị Ký sinh trùng sốt rét xâm nhập các tế bào hồng cầu, nhân bội và phát triển cho tới khi hồng cầu bị vỡ, phóng thích một loại ký sinh trùng mới xâm chiếm các hồng cầu khác, cứ thế lập đi lập lại cho tới khi phát sinh các triệu chứng lâm sàng Ở người chưa miễn dịch, cơ thể chống đỡ bằng những cơ chế chống đỡ không đặc hiệu Khi có sự tiếp tục lặp đi lặp lại với sốt rét, một sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ có tác dụng hạn chế mức xâm chiếm, dẫn đến miễn dịch từng phần

Thời gian ủ bệnh là 8 - 20 ngày với P.falciparum (tối đa 2 tháng), 12 - 18

vong), sốt rét do P.falciparum thường tự hết trong vòng 6 - 8 tháng nhưng có thể tồn tại đến 3 năm Sốt rét P.vivax và P.ovale có thể tồn tại đến 5 năm,

P.malariae có thể tồn đến 40 năm Những trường hợp tái phát sốt rét sau hàng

chục năm ở rừng về có thể là do P.malariae Tuy nhiên trị liệu loại trừ

P.falciparum và P.malariae tong máu một cách hữu hiệu (bằng quinin hay

artemisinin) sẽ chữa lành được bệnh vì 2 loài này chỉ có giai đoạn đầu là đi vào

gan Ngược lại, P.vivax có một loài giai đoạn nằm trú lâu ngày hơn trong gan,

dẫn đến những đợt tái phát sau điều trị, vì thế muốn chữa tiệt phải loại trừ cả ký sinh trùng trong huyết cầu lẫn ký sinh trùng trong gan ( dùng thêm primaquin)

Trong sốt rét P.vivax ( sốt cách nhật lành tính) và sốt rét P.falciparum

( sốt cách nhật ác tính), các hồng cầu bị vỡ và các cơn diễn ra mỗi 48 giờ, trong

khi ở sốt rét P.malariae chu kỳ là 72 giờ Nhưng lúc ban đầu các chu kỳ thường

không đều, với sự tiếp diễn bệnh thường xuất hiện chứng gan, lách to

Sốt rét P.falciparum nghiêm trọng hơn các sốt rét khác, do mức độ phổ

biến và độ nặng của các biến chứng nguy hiểm Nó cũng khó nhận diện hơn về mặt lâm sàng, nhiều khi với dạng bệnh giống như cảm cúm, với các triệu chứng không đặc thù như sốt, nhức đầu, đau cơ, buồn nôn, tiêu chảy; sốt có thể không thành cơn mà liên tục, không cao lắm, và có thể không kèm theo lạnh, run; các ký sinh trùng đôi khi khó tìm trên lam máu

Các biến chứng nghiêm trọng chủ yếu xảy ra với P.falciparum, đặc biệt

ở những người đã trãi qua những cơn kịch phát lặp đi lặp lại mà không được chữa trị thích đáng

II.2 CÁC ANCALOIT CỦA CÂY CANH KI NA [3],[7],[12],[13]

Tên khoa học là Cinchona spp thuộc họ cà phê Rubiaceae Tên gọi này

là do Linnaeus đặt vào năm 1742 từ tên của nữ bá tước Chinchon, vợ một phó

vương người Pêru, người được điều trị sốt bằng cách sử dụng vỏ cây canh ki na vào năm 1638 Có nguồn gốc từ dãy Andes ở Nam Mỹ, mọc hoang dại trên các sườn núi thuộc Columbia, Peru, Bolivia … Vùng có canh ki na mọc hoang có độ cao từ 1500 – 3000 m, mưa nhiều và có độ ẩm cao Có khoảng 40 loài canh ki

na, là những cây nhỡ hoặc to có thể cao 15 – 20 m Lá mọc đối, hình tròn hay hình mũi giáo, có cuống, thường sớm rụng Trong một số loài như canh ki na xám, ở góc gân chính và gân phụ có các túi nhỏ mang lông Hoa nở sau 3 – 4 năm, hoa nhỏ, thơm, có màu vàng, trắng hoặc hồng nhiều tạo thành các chùy hoa, tương tự như cây tử đinh hương Đài có 5 răng, tràng hình ống, loe ở miệng với vòi nhị dài hoặc ngắn không đều Quả là loại quả nang nhỏ, chứa nhiều hạt

Không phải tất cả các loài cây canh ki na đều sản sinh quinin Thật ra, nhiều loài không chứa chút quinin nào Loài quan trọng và hữu ích nhất là:

Cinchona officinalis, C calisaya, C pubescens

Thành phần các chất được tìm thấy trong vỏ cây canh ki na bao gồm: aricin, caffeic acid, cinchofulvic acid, cincholic acid, cinchonain, cinchonidin, cinchonin, cinchophyllamin, cinchotannic acid, cinchotin, conquinamin, cuscamidin, cuscamin, cusconidin, cusconin, epicatechin, javanin, paricin, proanthocyanidins, quinacimin, quinamin, quinic acid, quinicin, quinin, quininidin, quinovic acid, quinovin, and sucirubin

Vỏ cây canh ki na thường chứa từ 8 - 10% nước, 4 - 5% chất vô cơ, một ít tinh bột, tinh dầu, các chất sterola

Hoạt chất chính của cây canh ki na là các ancaloit chiếm từ 3 - 15% trong vỏ cây Việc nghiên cứu những cây canh ki na này đa được nghiên cứu từ lâu và trước năm 1850, người ta đã chiết được 4 loại ancaloit chính

Hiện nay, người ta xếp những ancaloit trong vỏ cây canh ki na thành 2

Thực tế, đây là 2 cặp đồng phân lập thể: cặp quinin, quinidin và cặp cinchonin, cinchonidin Tất cả đều có nhân quinoline nối bằng một cầu ancol cấp

2 với một nhân quinuclidin có mang một dãy vinyl Công thức gồm 4 C không đối xứng ở 3, 4, 8, và 9 Trong quinin và quinidin, nhân quinoleic có một nhóm metoxy ở C6 và nhóm này không có ở cinchonin và cinchonidin

N

N

3 4

(p-Cl)-benzoyldihydroquinin C2H5 OCH3 pClBzO H

(p-Cl)-benzoyldihydroquinidin C2H5 OCH3 pClBzO H

(dimetylcarbamol)dihydroquinidin C2H5 OCH3 OCONMe H

Chuỗi vinyl có thể halogen hóa thành nhóm etyl và được 4 hidrobazơ tương ứng với 4 ancaloit chính: hydroquinin, hydroquinidin, hydrocinchonin, hydrocinchonidin có ở trạng thái thiên nhiên trong vỏ

Năm 1881 Gomes, một người Tây Ban Nha lần đầu tiên đã chiết được

Pelletier và Caventou cũng chiết được từ canh ki na xám Cinchona officinalis,

chất cinchonin nhưng tinh khiết hơn

Đến 1820, Pelletier và Caventou đã chiết từ vỏ một loài canh ki na

C.cordifolia một ancaloit mới và đặt tên là quinin

Năm 1833, Henry và Delondre chiết được ancaloit gọi là quinidin Nhưng đến năm 1853, Pasteur đã nghiên cứu lại và từ quinidin đã tách ra 2 chất, một là quinidin chính thức, hai là cinchonidin ( chất này đã được Winkler tách ra được từ năm 1827)

Ngoài 4 loại trên, còn khoảng 20 ancaloit khác với hàm lượng ít hơn Các epibazơ tương ứng với quinin và quinidin cũng được tách ra từ năm 1936

Từ nước lọc sau khi tách chiết tinh thể các ancaloit, người ta còn thu được những phần không có tinh thể gọi là quinoidin, và từ chất quinoidin này người ta lại tách ra những ancaloit xetonic như quinotoxin, quininon ( chiếm từ 3-10% ancaloit toàn phần) Những ancaloit nói trên thấy trong những chế phẩm bào chế và hình như vốn không có trong quá trình xử lý chế biến

Vỏ cây canh ki na là một loại thuốc bổ chát (do tanin) và đắng, tác dụng chữa sốt, sốt rét của vỏ canh ki na là do các ancaloit chủ yếu là quinin Ngoài ra, vỏ canh ki na còn làm thuốc bổ đắng và dùng cho phụ nữ sau khi sinh ( làm tăng cường sự co bóp tử cung) rất thông dụng

Một chất đắng gọi là quinovin được Pelletier và Caventou chiết ra từ năm 1821 Năm 1859 Hlasivetz đã chứng minh rằng đây là một glucozit Chất quinovin còn gọi là quinovozit thủy phân bằng axit sẽ cho một đường quinovoza ( dezoxy 6-glucoza hay D- glucomrtyloza) và axit quinovic (tritecpen gồm 2 axit carboxyl) chất này phối hợp với các ancaloit cho vị đắng của vỏ canh ki na

Năm 1963, Tschesche đã chứng minh rằng chất quinovin thô chứa gulometylozit của axit quinovic, gulometyloat của axit cincholit ( một axit gần

- Những ancaloit nhân indol:

Chỉ thấy trong những vỏ canh ki na làm thuốc Trong vỏ C pelleteriana

người ta chiết được trên 3% arixin kèm theo một số ancaloit nhân indol khác như xinchonamin

Các ancaloit của cây canh ki na, nhìn ở góc độ thương mại, là những ancaloit quan trọng nhất Chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm, trong thức uống, trong các tổng hợp bất đối xứng, chất ức chế hóa học

• Yersin và cây canh ki na tại Lâm Đồng

Alexandre John Emile Yersin đã sang làm việc tại Việt Nam từ năm

1891, lập ra những cơ sở nghiên cứu vi trùng học đầu tiên ở Việt Nam, sáng lập và là giám đốc viện Pasteur Nha Trang Yersin là một nhà thám hiểm, khám phá

ra cao nguyên LangBian ngày 21 - 6 - 1893 Ông là người xây dựng các trại chăn nuôi thuộc viện Pasteur Đông Dương, di thực cây cao su, canh ki na vào Đông Dương để nghiên cứu và khai thác

Năm 1886, Paul Bert - toàn quyền Đông Dương chỉ thị thí nghiệm trồng cây canh ki na ở miền Bắc Việt Nam với những cây con mang từ Pháp sang nhưng không thành công Ở miền Nam Việt Nam, Yersin mong muốn du nhập cây canh ki na vào Đông Dương để tự túc nguồn thuốc chống sốt rét sau này

Năm 1917, Yersin đã mua một số hạt giống canh ki na và 30 cây ghép từ vườn thực vật Buitenzorg đưa gieo trồng tại Hòn Bà trên độ cao 1500 m về

phía Tây Suối Dầu Ba giống cây trồng ở Hòn Bà là Cinchona leggeriana,

Cinchona succirubra và một giống lai Cây canh ki na không phát triển được trên

Hòn Bà vì tỉ lệ đạm thấp và bị một số loài nấm phá hoại

Năm 1923, Yersin đưa 300 gốc Cinchona leggeriana, Cinchona

succirubra và một giống lai trồng tại Hòn Bà trước đây đến Dran trên độ cao

tỏ ra hiệu quả nhất Tất cả số cây trồng tại Dran sau 2 năm trổ hoa ào ạt Sự trổ hoa này xảy ra sớm vì ở Java phải mất từ 10 đến 15 năm mới ra hoa Năm 1926, Yersin nhờ viện Pasteur Paris phân tích thấy tỉ lệ sunfat quinin trong vỏ cây

Cinchona leggeriana 3 tuổi sau khi ra hoa ngang với quinin của Java 8 – 10%

Để nghiên cứu về giống, năm 1927, Yersin tổ chức trạm thực nghiệm canh ki na tại Xuân Thọ ( thành phố Đà Lạt) ở độ cao 1600 m với diện tích 15

ha Ông tổ chức gieo trồng và nghiên cứu ảnh hưởng của độ cao đối với cây canh

ki na ở đây nhằm mở rộng diện tích thực nghiệm trên đất đỏ bazan Sau thất bại

ở Hòn Bà, Yersin đã tạo ra 686 ha đất thích hợp để thử nghiệm và trồng cây canh ki na tại Lâm Đồng trên các vùng Petit LangBian, Dran, Di Linh và Drom

Vào năm 1931, Yersin thu hoạch được tại Dran và Di Linh 2100 tấn vỏ canh ki na, gửi về Pháp chiết xuất, cho được 137 kg sunfat quinin có chất lượng cao hơn loại thu hoạch từ các đồn điền ở Java Năm 1932, thu hoạch 2300 tấn vỏ 1936, Yersin cho khai thác một lượt vỏ canh ki na, kết quả được 29600 kg vỏ (tỉ lệ sunfat quinin 7,4%), sản xuất được 2045 kg sunfat quinin kết tinh Cũng dùng phương pháp này, năm 1938, ông thu được 21000 kg vỏ và sản xuất được

1793 kg sunfat quinin kết tinh ( tỉ lệ 8,5% sunfat quinin) Từ đó về sau, Yersin đã có thể thu hoạch hằng năm

Những công trình nghiên cứu của Yersin vẫn còn giá trị cho loài người Đáng tiếc ở vùng Petit LangBian, Dran và Drom, diện tích trồng cây canh ki na

bị cắt xén bớt, bị bỏ hoang không canh tác vào năm 1966 nên vùng canh ki na truớc đây bị phá bỏ gần hết Hiện nay chỉ còn sót lại một số cây canh ki na mà Yersin đã trồng tại Xuân Thọ

Những năm gần đây, theo chủ trương của Bộ y tế và UBND tỉnh Lâm Đồng, nhiều đề tài nghiên cứu phục hồi canh ki na tại Lâm Đồng đã và đang thực hiện

II.3 TÍNH CHẤT CỦA QUININ [3],[7]

Trọng lượng phân tử: 324,43 g/mol

Dung dịch quinin có vị đắng và có tính bazơ nên có thể tạo muối với các axit

Quinin (và các ancaloit như quinidin, cinchonin, cinchonidin) có tính huỳnh quang mạnh trong dung dịch nước, nhưng nhạy cảm với môi trường

Sau khi khử metyl, quinin sẽ cho cuprein là một ancaloit phenolic

Đun sôi dung dịch quinin sunfat một thời gian dài trong mội trường axit sẽ thu được quinotoxin ( hay quinixin) Đây là một đồng phân của quinin, trong

Dung dịch nước của muối có huỳnh quang màu xanh Khi được xử lý với nước clo và amoniac tạo nên sản phẩm có màu xanh lục

Vỏ của các cây hoang dại chứa lượng quinin cao nhất là 7%, trong khi những cây gieo trồng cho năng suất lên đến 15% Thành phần quinin trong các loài canh ki na:

quinin với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum mãi đến những năm 1800

mới được phát hiện bởi Laveran Từ đó, người ta mới hiểu được cơ chế chữa bệnh sốt rét Quinin chủ yếu tác dụng cắt cơn sốt rét, và còn ức chế những trung tâm sinh nhiệt, do đó được dùng làm thuốc giảm sốt Nhưng đối với người bình thường thì liều điều trị không có tác dụng làm hạ nhiệt

Ngoài tác dụng hạ sốt, chữa sốt rét, quinin còn có tác dụng chống nhiễm trùng, chữa cúm và tác dụng an thần Liều lượng lớn nó khá độc, có thể gây hiện tượng chóng mặt, ù tai, hoa mắt…

II.4 TÍNH CHẤT CỦA AgNO 3[2]

Trọng lượng phân tử: 169,87 g/mol

Nhiệt độ nóng chảy: 212oC

Nhiệt độ sôi: 440oC

Dạng tinh thể tà phương, không màu Dễ tan trong nước, ete, etanol, aceton, độ tan biến đổi nhiều theo nhiệt độ

Khi đun nóng đến 300oC, bạc nitrat bị phân hủy:

2AgNO3 = 2Ag + 2NO2 + O2Bạc nitrat dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, nhiệt độ

Trong dung dịch kiềm, tạo nên bạc hydroxit, hydroxit này không bền tách ra thành oxit và nước:

2AgNO3 + 2NaOH = Ag2O  + 2NaNO3 + H2O AgNO3 được điều chế bằng cách hòa tan bạc kim loại trong axit nitric và làm bay hơi dung dịch

Do tác dụng được với các mô cơ thể, người ta dùng dung dịch AgNO3làm thuốc sát trùng, có tính ăn mòn cao, không gây độc cho người, nhưng có hại tới môi trường

Bạc nitrat được sử dụng như một chất diệt khuẩn, nhỏ vào mắt trẻ sơ sinh sẽ ngăn ngừa nhiều bệnh từ mẹ với nồng độ loãng khoảng 1%

Đây là một trong những thuốc thử quan trọng nhất trong phòng thí nghiệm và là chất đầu để điều chế các hợp chất khác của bạc

II.5 TỔNG HỢP PHỨC CHẤT GIỮA QUININ VỚI CÁC KIM LOẠI

Các ancaloit chiết xuất từ cây canh ki na như quinin, quinidin, cinchonin,

Bùi Quang Cư, Đỗ Thị Thu Hương[1] đã chọn quinin để tạo phức với các muối sulfat của Fe, Zn, và Ce, do tính chống sốt rét của quinin

Quinin là thuốc chống sốt rét được sử dụng rộâng rãi và những dẫn xuất của nó như là chất trợ quang trong những phản ứng bất đối xứng Rolan Hubel, Kurt Polborn, và Wolfgang Beck [21] đã nghiên cứu và báo cáo về sự tổng hợp phức của quinin trong cả bốn vị trí cho điện tử của quinin: -OH, N bậc ba và N của vòng pyridine, cũng như tại C=C Qua nghiên cứu phổ 1H-NMR của các phức chất thu được cho biết thông tin mà nguyên tử cho điện tử đã tham gia vào sự tạo phức

II.5.1 Sự tạo phức tại nguyên tử N của vòng quinuclidine [21]

Vị trí cho điện tử cơ bản nhất của quinin là nguyên tử N của vòng quinuclidine Cơ chế của sự tạo phức có thể hiểu rõ từ phân tích phổ 1H-NMR Tín hiệu của nguyên tử H gần N bậc ba dịch chuyển về phía từ trường thấp so với phổ của quinin tự do

OMe

N

OH H

MLn

1 AuPPh3 NO3

-2 AgPPh3 NO3

-3 PdCl(COD)+NO3

-4 PdCl(allyl) II.5.2 Phức chelat N,O

Theo tài liệu [21], để tránh tạo phức tại vị trí của nguyên tử N vòng pyridine, phản ứng được thực hiện ở -78oC Việc tạo vòng chelat 5 cạnh được xác nhận do sự dịch chuyển về phía từ trường thấp trong phổ 1H-NMR ở proton

H9, và không còn vân hấp thu của nhóm –OH trong phổ IR

II.5.3 Tạo phức tại vị trí nguyên tử N vòng quinoline [21]

Nguyên tử N vòng quinuclidin của quinin được bảo vệ có chọn lọc bằng cách ankyl hóa bằng Me3O+ BF4- Việc bảo vệ N vòng quinuclidin của quinin sẽ dễ dàng hơn nếu proton hóa với F3CSO3H Sự tạo phức tại vị trí này cũng gây ra sự dịch chuyển về phía từ trường thấp ở các proton H2’ và H8’ trong phổ cộng hưởng 1H-NMR Trong phổ IR, vân hấp thụ của nhóm –NH xuất hiện ở 2600 –

2700 cm-1, và vân dãn rộng ở 3600 cm-1 là của nhóm –OH

OMe

N M

OH H

Cl Cl

L

+ BF4

II.5.4 Tạo phức tại C=C[21]

Sự tạo phức của ion kim loại tại vị trí nối đôi C=C của quinin bằng cách dùng phương pháp đơn giản để hình thành nên phức (olefin)platinum Kết quả tạo phức ở nối đôi C=C là dịch chuyển upfield của ba proton thuộc nhóm olefin trong phổ 1H-NMR Khi đó C10 trở thành carbon bất đối xứng, và hai chất đồng phân không đối quang được hình thành

OMe

N

OHH

N + H

Pt

Cl-H

+

Cl-II.5.5 Phức hai nhân [21]

NML

ClCl

Phức Q.2CuCl2 hoà tan tron dung môi DMF có cấu trúc như sau:

DMF Cu

Cu

Cl Cl

N CH

Cấu trúc ở trạng thái rắn, độ bền nhiệt, của Cu5Cl9(H2Quinin)2 ở chất (1)

và của Cu3Br7(H2Quinin)2(H2O) ở chất (2)

H OMe

N

N OH H

CuCl / HCl, 60 C Sealed tubes / MeOH

o

N H OH H N

H

2

OMe

(Cu5Cl9)

Sản phẩm (1) được hình thành bằng phản ứng của CuCl, quinin và HCl

trong metanol ở 60 – 70oC

H OMe

N

N OH H

CuBr / HBr, 60 C Sealed tubes / MeOH

o

N H OH H N

H

2

OMe

(Cu3Br7)(H2O)

Sản phẩm (2) được hình thành bằng phản ứng của CuBr, quinin và HBr

trong cùng điều kiện như trên

III.1 DỤNG CỤ- THIẾT BỊ- HÓA CHẤT

III.1.1 Dụng cụ- Thiết bị

- Becher 250 ml, 500 ml, 1000 ml

- Erlen 250 ml

- Lọc chân không

- Buret chuẩn độ

- Máy pH Inolab WTW 720

- Máy khuấy từ VELP

- Máy đo điểm nóng chảy Electrothermal 9700

- Đèn UV Upland UVGL-55

- Cân phân tích Precisa XB 220A

III.1.2 Hóa chất

III.1.3 Các phương pháp phổ học trong khảo sát cấu trúc phức chất

- Phổ hồng ngoại IR

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC

- Xác định thành phần % nguyên tố bằng phổ hấp thu nguyên tử AS

III.2 TỔNG HỢP PHỨC CHẤT

III.2.1 Phương pháp

Quinin có thể tổng hợp phức với các muối kim loại chuyển tiếp tại 4 vị trí cho điện tử của quinin: -OH, nguyên tử N bậc ba, N của vòng pyridin và cầu nối C=C Vị trí dễ tạo phức nhất của quinin là phân tử N bậc ba của vòng quinuclidin Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi cho quinin phản ứng với các muối kim loại theo tỉ lệ 1:1 bằng phương pháp nhỏ giọt chậm để khảo sát sự chọn lọc các vị trí phản ứng trên

III.2.2 Các vấn đề

III.2.2.1 Khảo sát độ hòa tan

Việc khảo sát độ hòa tan nhằm tìm ra dung môi phù hợp để hòa tan hoàn toàn các chất, và không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

- Khảo sát độ hòa tan của quinin tự do trong các dung môi ở nhiệt độ phòng Cân 0,1g quinin hòa vào 10 ml dung môi, lắc trên máy khuấy từ

Nói chung quinin tự do tan tốt trong dung môi, độ hòa tan trong rượu nhanh hơn trong aceton và nó không tan trong nước Trong thực tế để quinin tan trong nước người ta phải chuyển quinin sang dạng muối bằng các axít

Cân 0,1g AgNO3 hòa vào 10 ml dung môi, lắc trên máy khuấy từ

Cả quinin và hai muối kim loại tham gia phản ứng đều tan tốt trong aceton, ethanol, và metanol Do aceton còn đôi điện tử tự do của nhóm C=O, có thể tham gia tạo phức với các kim lọai chuyển tiếp nên ta không chọn làm dung môi phản ứng Ethanol 95% của Việt Nam lẫn nhiều nước ảnh hưởng đến kết quả cũng không được sử dụng Ta không dùng etanol của Merck để làm dung môi hòa tan chất phản ứng cũng như để rửa sản phẩm do giá thành cao Muối bạc hòa tan tốt trong nước nhưng quinin lại không tan trong nước Vì thế không sử dụng làm dung môi hoà tan

Sau cùng, metanol của Trung Quốc được chọn làm dung môi hòa tan do giá thành rẻ, và chất lượng tương đối tốt

III.2.2.2 Điều chỉnh pH của dung dịch quinin trong dung môi

Ở giá trị pH cao, môi trường kiềm các muối kim loại sẽ tạo hydroxit Khi đó, muối bạc nitrat sẽ tạo thành hydroxit AgOH, tiếp theo sẽ phân hủy tạo kết tủa Ag2O

- Khảo sát pH thích hợp cho phản ứng

Cho 0,8109 g quinin hòa tan vào 15 ml methanol, đo pH dung dịch là 12 Sau đó, dùng H2SO4đđ điều chỉnh pH đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa đục Dung dịch lúc này có pH = 3,7 Để thực hiện phản ứng đồng pha nên cuối cùng chọn pH ở 5,5 nhằm tránh tạo muối quinin sunfat rắn

Cho 0,4052 g AgNO3 hòa tan trong 25 ml metanol, pH dung dịch là 5,2 III.2.3 Thực nghiệm

III.2.3.1 Tổng hợp phức chất giữa quinin và muối bạc nitrat

Lượng tác chất ban đầu: 4,0015 g AgNO3 (0,024 mol) ; 8,1079 g quinin (0,024 mol) ; 550 ml metanol

Hoà tan quinine trong 300 ml metanol, pH = 9,75 Chỉnh pH bằng

Hoà tan AgNO3 trong 250 ml metanol Khuấy trên máy khuấy từ cho đến khi muối bạc tan hết, đo pH là 5,1

Cho dung dịch muối bạc vào buret, nhỏ dung dịch muối vào dung dịch quinin, đặt trên máy khuấy từ, từng giọt trong 2 giờ, bình phản ứng được chắn ánh sáng bằng giấy cacbon Dung dịch kết tủa trắng đục Sau khi nhỏ hết dung dịch muối, tiếp tục khuấy trong 30 phút nữa

Lọc lấy cặn tủa Sản phẩm kết tủa trắng được rửa với từng lượng nhỏ của 100 ml meanol ( dung dịch metanol có pH thấp ) trên máy khuấy từ Rửa sản phẩm cho đến khi chấm bản mỏng không còn vết của quinin Sau đó rửa sản phẩm trong phễu lọc có hút chân không Đem kết tủa sấy khô Sản phẩm thu được 1,39 g

III.2.3.2 Khảo sát bằng sắc ký bản mỏng

Kết tủa thu được trong thí nghiệm trên, hòa tan vào dung môi DMSO, đem chấm trên bản mỏng; giải li bằng hệ dung môi Cloroform : Dimetylamin = 9:1 Phun thuốc thử hiện hình là 10% H2SO4 trong etanol Sấy bản mỏng ở 100oC trong vài phút, cùng chất đối chứng quinin Kết quả ở vết chấm của quinin, xuất hiện vệt hơi tròn ở Rf = 0,5 sau khi phun thuốc thử hiện hình và đốt bản mỏng Phức chất thu được có một vệt kéo dài, có khoảng Rf = 0,3 nhỏ hơn của quinin, đồng thời không còn xuất hiện vết của quinin trong sản phẩm thu được Vết của phức chỉ thấy được khi soi trên đèn UV, không hiện hình sau khi đốt

III.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

III.4.1 Vật liệu

II.4.1.1 Mẫu

- Phức quinin-bạc

- Quinin tự do ( đối chứng)

III.4.1.2 Vi khuẩn kiểm định

- Bacillus cereus

Là trực khuẩn gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi

Vi khuẩn hiện diện trong đất, bụi, các loài thực phẩm ( sữa, thịt, rau quả, sản phẩm khô,…)

Vi khuẩn có thể tiết ra 2 loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa

III.4.1.3 Môi trường

- Muller Hinton Agar

- DMSO (Merck)

III.4.2 Phương pháp

Phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên thạch của Kirdy – Bauer Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy theo nồng độ chuẩn cho từng loại Kháng sinh sẽ được khuếch tán chung quanh mặt thạch môi trường nuôi cấy vi khuẩn Đường kính vòng vi khuẩn bị ức chế diễn đạt tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Trường hợp không có vòng ức chế chứng tỏ vi khuẩn đề kháng với kháng sinh

III.4.3 Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh Enrofloxacine, quinin, phức Ag-quinin trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau Việc chọn dung môi là DMSO do tính tan của phức Ag-quinin trong dung môi này Tẩm dung dịch thuốc kháng sinh vào đĩa giấy với các nồng độ khác nhau

Ngoài ra, ta còn tẩm dung môi DMSO vào đĩa giấy nhằm xác định tính kháng khuẩn của dung môi này, để có thông tin kết quả chính xác

Kháng sinh Enrofloxacine 100

III.4.3.2 Dung dịch chuẩn độ đục Mac Farland

Số lượng tế bào vi khuẩn thí nghiệm phải đạt 108 tế bào/ml, để tiêu chuẩn hóa số lượng khi cấy, ta dùng phương pháp so sánh độ đục theo ống đục chuẩn Mac Farland 0,5

Dựa trên nguyên tắc phản ứng giữa:

H2SO4 + BaCl2  BaSO4  + HCl Chọn 10 ống nghiệm lớn ( cùng kích cỡ) pha dung dịch chuẩn như bảng sau

III.4.3.3.Chuẩn bị dịch khuẩn thí nghiệm

Dùng nước muối sinh lý chỉnh độ đục của ống vi khuẩn ngang với độ đục của ống Mac Farland 0,5 để có được mật độ tế bào 108/ml Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi chuẩn độ

III.4.4 Phương pháp thử

Dùng môi trường thạch dĩa MHA, không nhiễm khuẩn lạ

Dùng tăm bông vô khuẩn tẩm canh khuẩn thí nghiệm có độ tương đương Mac Farland 0,5 ép hết nước bằng cách ép tăm bông lên thành ống nghiệm

Trãi đều vi khuẩn trên mặt thạch bằng tăm bông và đánh nhẹ lên mặt thạch từ trái sang phải, từ trên xuống dưới, cuối cùng vòng tăm bông tròn theo mép thạch đĩa Khi mặt thạch đã khô, dùng kẹp hơ nhẹ trên lửa, để nguội rồi cấy đĩa kháng sinh mỗi loại , đặt đĩa kháng sinh trên mặt thạch Dùng kẹp đè nhẹ đĩa kháng sinh lên thạch sao cho mặt đĩa tiếp xúc phẳng với mặt thạch

Để sau 15 phút, đặt thạch đĩa kháng sinh vào tủ ấm, ủ 35oC/16-18 giờ

Đo đường kính vòng vô khuẩn trong các mẩu ở các nồng độ khác nhau Tác dụng kháng khuẩn của các phức đối với vi khuẩn

STT Bacillus cereus (mm) E.coli (mm)

Sau khi điều chế phức chất Ag-quinin, chúng tôi tiến hành thử tính kháng

khuẩn của phức với hai vi khuẩn đại diện là Bacillus cereus (Gram dương) và

E.coli (Gram âm)

Kháng sinh Enrofloxacine có vòng kháng khuẩn rộng đối với vi khuẩn

Bacillus cereus (30 mm) và yếu hơn với E.coli (11 mm) Cả chất đối chứng

quinin và dung môi hòa tan DMSO đều không có khả năng kháng lại hai vi khuẩn này, vòng kháng khuẩn là 0 mm

Đối với phức chất của Ag-quinin, vòng kháng khuẩn lớn hơn ở Bacillus

cereus là 9; 11; 14 mm tương ứng với các nồng độ 400; 200; 100 µg/ml Ở vi

khuẩn E coli đường kính vòng kháng khuẩn là 11; 10; 8,5 mm tương ứng với nồng độ 400; 200; 100 µg/ml vòng kháng khuẩn hiện rõ hơn kháng sinh chuẩn Qua kết quả thu được, ta thấy phức chất Ag-quinin có hoạt tính kháng khuẩn nhưng không mạnh, do bản thân quinin là thuốc chống lại ký sinh trùng sốt rét

Hình 3.1: Tác dụng kháng khuẩn của mẫu và đối chứng đối với vi khuẩn E.coli

Hình 3.2: Tác dụng kháng khuẩn của mẫu và đối chứng với vi khuẩn B.cereus

IV.1 PHÂN GIẢI CẤU TRÚC QUININE

Tính chất vật lý của quinin

- Quinin tự do của Merck ở dạng bột màu trắng

- Độ tinh khiết 98,5%

- Nhiệt độ nóng chảy: 174 – 178oC

Phổ hồng ngoại ( IR) đo trên máy Bruker tại Viện công nghệ hóa học dưới dạng viên nén KBr Phổ hồng ngoại cho mũi hấp thu rộng của nhóm –OH tại 3521 cm-1 Mũi hấp thu ở 2932 cm-1, 2864 cm-1 là dao động của các nhóm

CH mạch béo Mũi hấp thu ở 3075 cm-1 là đặc trưng của nhóm CH vòng thơm (Phụ lục 1)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy NMR 500 MHz của hãng Bruker trong DMSO tại phòng NMR Viện hóa học Hà Nội

Trên phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) cho biết sự

(phụ lục 2), có tất cả 20 mũi phân biệt, tương ứng với 20 carbon trong phân tử quinin C20H24N2O2 Từ phổ HSQC, ta thấy có những tương tác giữa C và H trực tiếp qua một liên kết như sau: 5 nhóm –CH2 (phụ lục 9), 11 nhóm –CH và –CH3 (phụ lục 10), còn lại là 4 C tứ cấp

Căn cứ theo các tài liệu giải phổ của quinin [1],[12][17], kết hợp với các giá trị độ chuyển dịch hóa học trên phổ 1H (phụ lục 5), 13C, HSQC (phụ lục 8), chúng tôi đề nghị độ chuyển dịch hóa học của các vị trí trên cấu trúc quinin trong bảng 4.1

Phổ HMBC ( Heteronuclear Multiple Bond Cohrence) cho ta thấy tương tác giữa H nối với C qua 2 hoặc 3 liên kết, đôi khi qua 4 liên kết ( cường độ yếu và đôi lúc không có) Từ các gía trị phổ 1H-NMR (phụ lục5), 13C-NMR (phụ lục 2), ta kiểm tra trên phổ HMBC (phụ lục 14) có những tương tác thể hiện trong bảng 4.2

Vị trí

Carbon

Loại carbon

Bảng 4.2: Tương tác giữa C và H qua 2, 3, hoặc 4 liên kết trong phân tử quinin

Từ các dữ liệu phổ của quinin, chúng tôi gán các giá trị chuyển dịch của

13C, 1H vào từng vị trí của nguyên tử C, H trong quinin Cách đánh số của nguyên tử carbon dựa theo tài liệu tham khảo [21]

N

N OH

H

CH3O

2 3 4

5 6

7 8 9

10 11

2' 3'

4'

5' 6'

hằng số 3JH2,H3 = 13,5Hz Mặt khác, trên phổ HMBC, chúng tôi thấy sự tương tác giữa C2 và proton H10 tại 5,88 ppm với hằng số 4JH2,H10 = 2,5 Hz

- Tại vị trí C3:

Trên phổ 1H-NMR, tại vị trí 2,19 ppm là proton H3, C3 là carbon bất đối, nên 2 proton ở C2 kế cận là không tương đương về môi trường hóa học nên 2 proton ở C2 sẽ là H2a, H2b có độ chuyển dịch hóa học khác nhau, và H3 bị tách tiếp do H10

- Tại vị trí của C4:

Hai proton của nhóm -CH2 tại vị trí C5 do đứng cạnh carbon bất đối C4nên chúng không cùng môi trường hóa học, proton ở C5 sẽ bị tách thành H5a, H5btại 1,45 ppm và 1,6 ppm, và chúng tôi đo được hằng số 3JH4,H5a = 3JH4,H5b =2,5 Hz

- Tại vị trí C8:

Hai proton của nhóm -CH2 tại vị trí C7 do đứng cạnh carbon bất đối C8nên chúng không cùng môi trường hóa học, độ dịch chuyển hóa học là H7a, H7btại 1,77 ppm và 1,68 ppm, và chúng tôi đo được hằng số 3JH8,H7a = 3JH8,H7b = 8 Hz

- Tại vị trí C7’:

Trên phổ HMBC, ta thấy sự tương tác qua ba liên kết giữa C7’ ( 156,73 ppm) và H5’ ở độ dịch chuyển 7,51 ppm Trên phổ cộng hưởng 1H-NMR chúng tôi đo được hằng số tương tác 4J5’,7’ = 6,5 (Hz) Sau đó C7’ lại tiếp tục tương tác cùng H8’ ( 7,92 ppm) qua hai liên kết và trên phổ 1H-NMR, đo được hằng số

Ở proton của quinin tại độ chuyển dịch 5,60 ppm là nhóm –OH, điều đó được xác nhận qua phổ HSQC do tại vị trí 5,6 ppm không có sự tương tác trực tiếp với bất kỳ C nào, đồng thời trong phổ HMBC ở vị trí 5,6 có một tương tác với C9 là 71,00 ppm

Từ các kết quả trên chúng tôi đã thiết lập chính xác các giá trị độ chuyển dịch hóa học tương ứng cho các vị trí trong phân tử quinine để tiếp tục dùng làm chuẩn để so sánh với độ chuyển dịch của phức chất tổng hợp tiếp theo

IV.2 PHÂN GIẢI CẤU TRÚC PHỨC CHẤT Ag-QUININ

Phức chất Ag-quinin thu được ở dạng bột vô định hình, màu trắng có các tính chất như sau:

- Nhiệt độ nóng chảy ở 203oC, bị phân hủy thành màu đen

- Đo sắc ký bản mỏng không thấy hiện vết khi dùng thuốc hiện hình là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol Có vết tại Rf = 0,3 trong hệ dung môi Cloroform : Dietylamin (9:1), thấy được khi soi dưới đèn UV

Phổ hồng ngoại: mũi dãn rộng từ 3222 – 3552 cm-1 là dao động của nhóm –OH, chứng tỏ trong phức Ag-quinin vẫn còn nhóm -OH Mũi hấp thụ của

CH vòng thơm tại 3075 cm-1 CH của mạch béo hấp thụ ở 2932 cm-1, 2869 cm-1 Xuất hiện mũi mới tại 1120 cm-1, đây là mũi rất mạnh đặc trưng cho nhóm sunfat SO4 (phụ lục 21)

Từ kết quả thiết lập các giá trị độ chuyển dịch hóa học tương ứng với các

vị trí trong phân tử quinin, chúng tôi gán các giá trị H và C từ số liệu phổ

1H-NMR (phụ lục 25), 13C-NMR (phụ lục 22), và HSQC (phụ lục 27) của phức Ag-quinin như trong bảng 4.3

Vị trí

carbon

Độ dịch chuyển (ppm)

Bảng 4.4: Tương tác giữa C và H qua 2, 3, hoặc 4 liên kết

Ở giá trị 4 ppm, số proton định lượng là 4 H, đây là một mũi đơn Trên phổ HSQC cho CH và CH3 tại 4 ppm có tương tác với giá trị của C6 ở 43,18 ppm Trên HSQC, từ 43,18 ppm ta thấy có 2 tương tác ở 4,00 ppm và 3,30 ppm Đây là

2 proton H6a và H6b khác nhau về môi trường hóa học do C6 đứng cạnh NH+, đây là N của vòng quinuclidin đã bị proton hóa trong môi trường phản ứng là acid

Trên phổ proton của phức Ag-quinin, mũi -OH tại vị trí 6,63 ppm chứng