Cndt2_Nguyễn Hoài An_21126267_Thứ 2 Ca 3.Pdf

Ứng dụng công nghệ sinh học đã tạo ra giống bắp chuyển gene có khả năng kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường, giống bắp chuyển gene đã được trồng rộng rãi tại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Ngô biến đổi gene 3

2.2 PCR 3

2.2.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR 4

2.2.2 Quy trình phản ứng và chu kì nhiệt 4

2.2.3 Các phương pháp PCR 5

2.2.4 Các lưu ý khi thực hiện phản ứng PCR 5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6

3.1 Buổi 1 6

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 6

3.1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 6

3.1.2.1 Vật liệu nghiên cứu 6

3.1.2.2 Nội dung thực hiện 6

3.2 Buổi 2 9

3.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10

3.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 10

3.2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 10

3.2.2.2 Nội dung thực hiện 10

3.2.3 Điện di và đọc kết quả 10

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.2 Biện luận 13

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 5 Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số và đo OD buổi 1 (mẫu 5) 12 Hình 4.2 Kết quả điện di buổi 2 (mẫu 5) 12

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Chương trình nhiệt để thiết lập cho máy PCR 10

1.1 Đặt vấn đề

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Trên thế giới, ba cây lương thực quan trọng nhất là lúa, bắp và lúa mì Ở nước ta điều kiện tự nhiên không phù hợp cho cây lúa mì trồng trên diện rộng, do đó chỉ còn hai cây lượng thực lấy hạt có thể phát triển trên diện rộng với sản lượng lớn là lúa và bắp Trong đó cây bắp được trồng mọi nơi, nhưng thực sự chưa có những vùng nguyên liệu tập trung, sản xuất ra lượng hạt hàng hóa lớn thỏa mãn nhu cầu tiêu dùng trong nước, đặc biệt là chế biến thức ăn cho gia súc và thủy sản

Trong khoảng hai thập niên qua, tỷ lệ diện tích sử dụng giống bắp lại tăng lên nhanh chóng, cùng với các giải pháp kĩ thuật phù hợp về cung cấp dinh dưỡng, BVTV, đặc biệt

là trồng ngô bầu trên chân đất ướt sau khi đã thu hoạch lúa đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất và sản lượng bắp tại Việt Nam Tuy nhiên năng suất trung bình của bắp tại Việt Nam 4,08 T/ha chỉ bằng 82,3% năng suất trung bình của thế giới 4,96% T/ha và tương đương 43,1% của Mỹ 9,46 T/ha Tỷ lệ cây bắp còn khiêm tốn so với lúa Năm 2006, diện tích gieo trồng bắp 1,03 triệu ha chỉ bằng 14,1% diện tích gieo trồng lúa 7,32 triệu ha và sản lượng chỉ bằng 10,6% so với lúa và chiều hướng này vẫn còn duy trì cho đến nay

Cây bắp có năng suất cao như hiện nay là nhờ thành tựu khoa học trong lai tạo chọn giống mới đã thành công rất sớm trên cây bắp lai so với cây lúa mì và cây lúa Vào năm

1938, năng suất bình quân của bắp trên toàn thế giới chỉ đạt 0,96 T/ha thấp hơn lúa 1,6 T/ha và lúa mì Ứng dụng công nghệ sinh học đã tạo ra giống bắp chuyển gene có khả năng kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường, giống bắp chuyển gene đã được trồng rộng rãi tại Mỹ, Châu Âu và một số nước khác trên thế giới

Các cuộc tranh cãi về cây trồng chuyển gene vẫn còn, đặc biệt ở Châu Âu Tuy nhiên mức độ gay gắt đã giảm dần Những phong trào chống đối chỉ dựa vào những dự đoán phòng xa các nguy cơ có thể xảy ra cho sự đa dạng sinh học, con người và môi trường Tuy nhiên những nhận định đó không dựa trên cơ sở khoa học

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Kiểm tra mẫu xem có phải là thực vật biến đổi gene hay không bằng phương pháp sinh học phân tử phân tử

1.3 Nội dung thực hiện

Li trích DNA

Điện di tổng số

Chạy PCR

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Ngô biến đổi gene

Ngô biến đổi gen là một sản phẩm nông nghiệp mới được tạo ra để phục vụ mục đích cải tiến trong sản lượng, chất lượng và để nghiên cứu trong khoa học Cách thức tạo ra giống ngô GMO dựa vào việc biến đổi cấu trúc DNA theo mục đích mong muốn Các vấn đề khó khan khi trồng ngô đó là ngô cho năng xuất thấp hay bị nhiều sâu bệnh hại tấn công Đặc biệt là các vấn đề như sâu bệnh và sản lượng đều được nâng cao hơn khi cải tiến giống bằng biến đổi DNA của cây ngô Đồng thời mẫu mã của các giống thực vật biến đổi gen có xu hướng đẹp và đều hơn Các loại trái cây cấy ghép thay đổi tính trạng cho thấy vòng đời được kéo dài hơn ban đầu ngoài những hợi ích của ngô GMO trên thì song đó vẫn còn nhiều trở ngại trong việc phát triển nguồn giống GMO này Vì những tranh cãi “Thực phẩm GMO có thực sự an toàn cho sức khỏe con người hay không?” chưa đưa ra được nhận định rõ ràng Có nguồn thông tin đã cho rằng đã có tới bốn giống ngô GMO biến đổi gen nhằm chịu được thuốc diệt cỏ glyphosate được Hội đồng an toàn Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi biến đổi gen Việt Nam cho là không

có ảnh hưởng bất lợi nào đối với con người và vật nuôi theo đúng trình tự được quy định theo thông tư 02/2014/TT-BNNPTNT Đây là 4 sự kiện GMO đầu tiên được công nhận

đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam Gồm BT 11 và MIR 162 của công ty TNHH Syngenta Việt Nam và MON 89034 và NK603 của công

ty Dekalb Việt Nam Nhưng song đó cũng có các nhà nghiên cứu gần đây đã phát hiện rằng một loại bắp ngô biến đổi gen nhằm chịu được thuốc diệt cỏ glyphosate (được cho

là có nguy cơ gây ung thư cao) có sự khác biệt đáng kể về phân tử so với loại bắp ngô truyền thống Các phát hiện của nhóm nghiên cứu do Tiến sĩ Michael Antoniou tại Đại học Hoàng gia Luân Đôn, Anh đã được công bố trên Tạp chí khoa học Nature Magazine Theo nghiên cứu, ngô NK603 đã có mặt tại Việt Nam phát hiện ra “có tổng số 117 protein và 91 chất chuyển hóa đã bị thay đổi trong ngô bởi quá trình biến đổi di truyền” Kết quả của những nghiên cứu về thực phẩm GMO còn khá ít nên vẫn chưa giúp người

sử dụng trả lời cho câu hỏi “Thực phẩm GMO có thực sự an toàn cho sức khỏe con người hay không?” Vì thế cần phải phân biệt các thực phẩm GMO và thực phẩm không GMO

để có sự lựa chọn cho phù hợp với mục đích

2.2 PCR

PCR là tên viết tắt của “Polymerase Chain Reaction” , là chuỗi phản ứng khuếch đại gen thông qua các chu kì nhiệt PCR được phát minh vào năm 1983 bởi Kary Mullis PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng phổ biến nhằm khuếch đại gen bên ngoài cơ thể sống (tạo ra nhiều bản sao) mà không sử dụng đến các sinh vật sống như

E coli , nấm men Được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như nghiên cứu sinh học, y

tế, tội phạm học, xác định huyết thống, dễ thấy nhất là được sử dụng để xét nghiệm Covid 19 và giúp sản xuất vaccine

2.2.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR

Phản ứng PCR diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ với một hỗn hợp dung dịch Hỗn hợp dung dịch ấy bao gồm:

Enzyme polymerase : Taq polymerase hoạt động tối ưu ở 72oC

Template: chứa DNA mẫu, mục tiêu muốn khuếch đại

Cặp mồi xuôi – ngược: là những đoạn DNA ngắn được thiết kế thủ công hoặc phần mềm để xác định vùng giới hạn khuếch đại Đây là một thành phần rất quan trọng đối với kết quả PCR, cần chú ý khi thiết kế để đảm bảo mồi thỏa được các điều kiện, cho ra kết quả khuếch đại đặc hiệu và tốt nhất

Nucleotides (dNTP) cung cấp các nucleotide tự do cho quá trình tổng hợp DNA mới Dung dịch đệm cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase

Cation Mg2+: Đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả Sau khi đã có được hỗn hợp dung dịch phản ứng, người ta sẽ đặt ống nghiệm ủ trong máy PCR, nhiệt độ bên trong máy PCR sẽ thay đổi, từ đó quá trình nhân đôi sẽ diễn ra

2.2.2 Quy trình phản ứng và chu kì nhiệt

Một phản ứng PCR diễn ra từ 20-30 chu kỳ, gồm 3 bước chính

Giai đoạn biến tính : Nhiệt độ trong khoảng 90-95oC để có thể tách 2 mạch DNA mẫu ra, phá vỡ cầu nối hydrogen, giai đoạn này thường diễn ra từ 1-2 phút trước khi bắt đầu chu kì 1 để đảm bảo rằng DNA mẫu và mồi đều được tách thành mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ của giai đoạn này giảm xuống còn 55-65oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ lại tăng lên 72oC, Taq polymerase hoạt động gắn các nucleotide tự do vào chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Như vậy, cứ qua một chu kì thì số lượng mạch DNA sẽ được nhân đôi, sau nhiều chu kì thì sẽ tạo ra một số lượng lớn bản sao DNA mục tiêu

Kết quả PCR có thể được nhìn quan sát bằng mắt thường khi nhuộm mẫu với chất phát tín hiệu như Gel Red, trên gel điện di và dưới đèn UV

2.2.3 Các phương pháp PCR

PCR đơn mồi: sử dụng một cặp mồi để khuếch đại

PCR đa mồi: sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều DNA mục tiêu trong cùng một phản ứng

Real-time PCR: Là quy trình sử dụng khi trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR, giai đoạn này gọi là giai đoạn RT

2.2.4 Các lưu ý khi thực hiện phản ứng PCR

Bảo quản các thành phần tham gia phản ứng và các thiết bị sử dụng sạch sẽ, riêng biệt, để tránh bị tạp nhiễm

Cần sử dụng găng tay và có đèn UV khi thực hiện chuẩn bị hỗn hợp

Thuốc thử chỉ dành cho mục đích nhất định

Cần có chứng âm để kiểm soát sự tạp nhiễm

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Buổi 1

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8h-15h ngày 22/05/2024

Địa điểm nghiên cứu: Phòng 101 Viện công nghệ sinh học và môi trường, tòa nhà A2, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu bắp (mẫu 5), ống Eppendorf, PCI Buffer, dung dịch CI, Isopropanol, Ethanol 70%, TE Buffer, mồi xuôi, mồi ngược, H2O, Master mix, Gel agarose 1%, dung dịch TBE 0,5X, Gel Red, ladder, bồn điện di, máy ly tâm, máy PCR, micropipet, dụng cụ nghiền

3.1.2.2 Nội dung thực hiện

Bước 1: Lấy 0,05 g mẫu bắp (5) đã được nghiền mịn cho vào eppendorf 1,5

Bước 2: Thêm 600 µL dịch li trích SDS và tiếp tục nghiền

Bước 4: Ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 5: Hút 500 µL dịch nổi cho vào tube mới

Bước 6: Thêm 500 µL CI trộn đều li tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 7: Hút 400 µL dịch nổi cho vào tube mới

Bước 8: Thêm 0,6Vdịch nổi 0,6x400 µL=240 µL Isopropanol vào tube và đảo nhẹ, đem ủ ở -20oC trong 30 phút

Bước 9: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó đổ bỏ dịch nổi

Bước 10: Cho 500 µL Ethanol 70o li tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ dịch nổi (lặp lại thêm 1 lần)

Bước 11: Phơi khô, hòa tan tủa DNA với 30 μl TE Buffer -> đem điện di và đo OD

3.2 Buổi 2

3.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8h15 - 13h30 ngày 29/05/2024

Địa điểm nghiên cứu: Phòng 101 Viện công nghệ sinh học và môi trường, tòa nhà A2, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Tube PCR, máy PCR, bồn điện di, gel agarose, pipet, đầu típ, ladder, master mix, Primer F (P35S), primer R, Gel Red, nước khử ion

3.2.2.2 Nội dung thực hiện

Thực hiện phản ứng PCR

Bước 1: Chuẩn bị hóa chất ( mẫu, primer,…) và công cụ PCR

Bước 2: Thực hiện mix các thành phần phản ứng PCR theo mẫu

Bước 3: Cho mẫu sau khi mix vào máy PCR

Bước 4: Thiết lập chu kì nhiệt như sau:

Bảng 3.1 Chương trình nhiệt để thiết lập cho máy PCR

Bước 5: Thu nhận sản phẩm PCR

3.2.3 Điện di và đọc kết quả

bộ hỗn hợp trên (cho vào bồn điện di một lượng TBE Buffer 0,5X đủ ngập miếng gel)

Bước 5: Cho vào giếng 5 μL ladder đã được nhuộm với 10 μL Gel red và 10µL Bước 6: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100 V trong 20-30 phút

Bước 7: Đọc kết quả dưới tia UV

Bước 8: Chụp gel để lưu lại kết quả

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số và đo OD buổi 1 (mẫu 5)

4.2 Biện luận

Theo như kết quả điện di tổng số (buổi 1) cho thấy, giếng có xuất hiện band chứng

tỏ trong mẫu ly trích có DNA và có thể tiến hành phản ứng PCR

Theo như kết quả điện di cho thấy, ở giếng số 5 có xuất hiện band mờ do quá trình thao tác primer bị tạp nhiễm, và mẫu số 5 hoàn toàn không phải là GMO

TÀI LIỆU THAM KHẢO

https://www.dairyvietnam.com/vn/Giai-phap-cho-nha-dau-tu-chinh-sach/Bap-chuyen- gen-Thanh-tuu-khoa-hoc.html

https://lamviet.com.vn/tin-tuc/Tong-Quan-Ve-Pcr-3666.html