Cndt 2_Phan Hoàng Yến Nhi_21126141_Thứ 2 Ca 3.Pdf

Kết quả kiểm tra điện di DNA tổng số của mẫu .... Đặt vấn đề Trong bối cảnh hiện nay, nhằm cải thiện chất lượng và sản lượng giống cây trồng, việc ứng dụng công nghệ biến đổi gen đã đưa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

TP Thủ Đức, 6/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

MỤC LỤC HÌNH ii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 KỸ THUẬT LY TRÍCH VÀ ĐIỆN DI DNA TỪ MẪU THỰC VẬT 2

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 2

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 2

2.2 Kết quả kiểm tra điện di DNA tổng số của mẫu 3

2.3 Thảo luận 3

CHƯƠNG 3 KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH CỦA DNA 4

3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 4

3.1.1 Vật liệu 4

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu 4

3.2 Kết quả 4

3.3 Thảo luận 5

CHƯƠNG 4 KỸ THUẬT ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR VÀ ĐỌC KẾT QUẢ ĐIỆN DI 6

4.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 6

4.1.1 Vật liệu 6

4.1.2 Phương pháp nghiên cứu 6

4.2 Kết quả 7

4.3 Thảo luận 7

ii

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1 Mẫu bắp được chọn để kiểm tra 2

Hình 2.2 Mẫu bắp sau khi nghiền nhuyễn 2

Hình 2.3 Kết quả điện di (giếng số 5) 3

Hình 3.1 Kết quả đo mật độ quang 4

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di từ sản phẩm PCR để phát hiện GMO 7

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong bối cảnh hiện nay, nhằm cải thiện chất lượng và sản lượng giống cây trồng, việc ứng dụng công nghệ biến đổi gen đã đưa đến những kết quả vô cùng khả quan Trong đó, việc tiếp cận thêm thông tin về giống cây trồng biến đổi gen,

từ đó có những sự lựa chọn giống cây trồng thích hợp để ứng dụng vào sản xuất khi những giống cây trồng biến đổi gen chính thức được thương mại hóa tại Việt Nam là yêu cầu cấp thiết

Cây trồng biến đổi gen là một thành tựu khoa học hiện đại của nhân loại đã được nghiên cứu thành công từ những năm 80 của thế kỷ XX Đến năm 1996, cây trồng biến đổi gen chính thức được thương mại hóa trên thế giới và việc ứng dụng cây trồng biến đổi gen đã phát triển với tốc độ nhanh chưa từng có trong lịch sử ngành nông nghiệp toàn cầu Theo thống kê của tổ chức ISAAA, năm 2013, hơn 18 triệu nông dân tại 27 quốc gia canh tác các loại cây trồng biến đổi gen trên tổng diễn tích khoảng 170 triệu héc ta (ha)

Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số gen chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn Các tính năng thường bao gồm tính kháng sâu bệnh, kháng thuốc trừ cỏ, một

số loại bệnh, chống chịu với các điều kiện môi trường bất thuận hoặc cải thiện giá trị dinh dưỡng của cây trồng

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Kiểm tra mẫu thực vật có chứa GMO từ phương pháp PCR và điện di 1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Ly trích DNA từ mẫu thực vật

Nội dung 2: Kiểm tra độ tinh sạch của DNA

Nội dung 3: Kỹ thuật điện di sản phẩm PCR và đọc kết quả điện di

2

CHƯƠNG 2 KỸ THUẬT LY TRÍCH VÀ ĐIỆN DI DNA TỪ

MẪU THỰC VẬT 2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

 Vật liệu: mẫu được chọn kiểm tra là mẫu bắp số 4

 Hóa chất: dung dịch đệm ly trích bao gồm Tris HCL pH 8, EDTA pH 8, NaCl 5M, SDS 10% ( 10:10:2:10); Phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1); Isopropanol; Ethanol 70°; dung dịch TE (Tris-EDTA); Gel agarose; dung dịch đệm TAE 0,5X; Gel red

 Dụng cụ: pipet 5 ml, pipet 1 ml, ống tube, dụng cụ nghiền

mẫu Thiết bị: máy ly tâm, máy điện di, máy votex

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Bước 1: Cân 0,05g mẫu cho vào tube, thêm 600 μL dung dịch đệm buffer vào nghiền mẫu

Hình 2.1 Mẫu bắp được chọn để kiểm tra Hình 2.2 Mẫu bắp sau khi nghiền nhuyễn.

Bước 2: Ly tâm 10000 rpm trong 5 phút, hút dịch nổi qua tube mới

Bước 3: Cho 1V PCI (Phenol/CHCl3/Isoanyl) tỷ lệ (25:24:1) vào trộn đều,

ly tâm 10000 rpm trong 5 phút

Bước 4: Hút dịch nổi sang ống mới

Bước 5: Cho 1V CI (Chloroform/ Isoamyl alcohol) tỷ lệ (24:1) vào trộn

đều, ly tâm 10000 rpm trong 5 phút

Bước 6: Hút dịch nổi sang tube mới, cho vào 0,6V Isopropanol Ủ ở -200C trong

30 phút, ly tâm 10000 rpm trong 10 phút

Bước 7: Loại bỏ dịch nổi, thêm 500 μL Ethanol 700 ly tâm 10000 rpm trong 3 phút, bỏ dịch nổi

Bước 8: Lặp lại bước 7

Bước 9: Đem phơi khô, thêm 500 μL TE vào bảo quản -200C

Bước 10: Đem điện di DNA vừa ly trích

2.2 Kết quả kiểm tra điện di DNA tổng số của mẫu

Hình 2.3 Kết quả điện di (giếng số 5)

2.3 Thảo luận

Kết quả điện di không xuất hiện band chỉ có vệt sáng có thể trong lúc làm thao tác bị sai, mẫu không có DNA hoặc hàm lượng DNA trong mẫu quá thấp nên không hiện rõ band

4

CHƯƠNG 3 KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH CỦA DNA

3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu

 Vật liệu: mẫu bắp

 Dụng cụ: micropipet, ống tube

 Thiết bị: máy đo quang phổ

 Hóa chất: dung dịch TE (Tris-EDTA)

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu

Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base

Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid có trong mẫu dựa vào mối tương quan Một đơn vị OD 260 nm tương ứng với nồng độ: 50 μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi, 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn

Định tính: độ tinh sạch dựa trên tỉ số OD260 /OD280 , tính chất của nucleic acid (mạch đôi/đơn) 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất

3.2 Kết quả

Hình 3.1 Kết quả đo mật độ quang

3.3 Thảo luận

Kết quả kiểm tra trên máy BioDrop, cho thấy tỉ số OD260 /OD280 = 2,024 là bước sóng có độ hấp thụ tốt nằm trong ngưỡng 1,8 ~ 2,0 cho thấy DNA trong mẫu là sạch và không bị nhiễm protein hay RNA cùng với tạp chất khác Còn nồng độ DNA trong mẫu là 67,21 ng/μL, hàm lượng này vừa đủ để chạy PCR

6

CHƯƠNG 4 KỸ THUẬT ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR VÀ ĐỌC

KẾT QUẢ ĐIỆN DI 4.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4.1.1 Vật liệu

 Vật liệu: mẫu bắp số 4

 Hóa chất: thuốc nhuộm gelRed, Master Mix, Primer F, Primer R, DNA, nước khử ion

 Dụng cụ: pipet, ống tube, dụng cụ nghiền mẫu

 Thiết bị: máy điện di, máy PCR

4.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Bước 1: Chuẩn bị vật liệu có thể tích và nồng độ như Bảng 4.1

Bảng 4.1 Bảng thành phần dung dịch pha mẫu tương ứng trong phản ứng PCR

Bước 2: Đem các tube chứa mẫu vào máy chạy PCR

Bước 3: Hút 1 μL gel red và 5 μL dung dịch mẫu DNA, mix đều hỗn hợp Bước 4: Sử dụng pipette hút hỗn hợp dung dịch trên cho vào giếng tương ứng, sau đó thực hiện điện di

4.2 Kết quả

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di từ sản phẩm PCR để phát hiện GMO.

4.3 Thảo luận

Nhận thấy kết quả điện di ở giếng số 9 không xuất hiện gì cả có thể do thao tác trong quá trình hút mẫu sai dẫn đến không hút được DNA, nên khi chạy điện

di không xuất hiện band sáng Nhưng khi đối chiếu với các kết quả khác của cùng mẫu tương tự Ta có thể kết luận rằng mẫu bắp số 4 là thực vật chuyển gene Cần phải chú ý rèn luyện thêm thao tác thật kỹ để lần sau khi chạy điện di không bị ảnh hưởng đến kết quả