Cndt2_Trịnh Thị Huyền Trâm_21126545_Thứ 2 Ca 3.Pdf

Ngày nay, thực phẩm biến đổi gen có thể được xác định bằng nhiều phương pháp như PCR, Realtime-PCR, ELISA,... Mục tiêu thí nghiệm Tìm hiểu phương pháp xét nghiệm một sản phẩm để xác địn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Giáo viên hướng dẫn : TS Phạm Đức Toàn Sinh viên thực hiện : Trịnh Thị Huyền Trâm

Mã số sinh viên : 21126545

TP Thủ Đức, 06/2024

i

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thí nghiệm 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Thực phẩm biến đổi gen 2

2.2 Phương pháp xét nghiệm thực phẩm biến đổi gen 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Thời gian và địa điểm 4

3.2 Vật liệu và phương pháp 4

3.2.1 Ly trích và điện di tổng số DNA 4

3.2.2 Xét nghiệm mẫu đậu nành kiểm tra GMO bằng phương pháp PCR 7

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

4.1 Kết quả và thảo luận điện di DNA tổng số 9

4.2 Kết quả và thảo luận định lượng DNA bằng máy đo quang phổ BioDrop 9

4.3 Kết quả kiểm tra GMO bằng phương pháp PCR 10

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GMO : Genetically Modified Organism

iii

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Trình tự cặp primer đặc hiệu xác định GMO cho đậu nành 7

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 3.5 Dung dịch sau khi thêm isopropanol 6

Hình 4.2 Kết quả định lượng DNA bằng máy đo quang phổ 9

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO 10

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Thực phẩm GMO là những thực phẩm đã được sửa đổi cấu trúc gen bằng phương pháp kỹ thuật di truyền Việt Nam là quốc gia thứ 29 trồng cây biến đổi gen và tính đến năm 2021, đã có 28 sự kiện biến đổi gen được công nhận tại Việt Nam Hiện nay, bắp GMO là một thực phẩm phổ biến tại Việt Nam Ước tính hơn 90% các loại bắp phát triển ngày nay là sản phẩm của GMO Tuy vậy, việc trồng và sử dụng sản phẩm GMO vẫn còn nhiều tranh cãi về vấn đề GMO có gây hại đến sức khoẻ con người hay không? Ngày nay, thực phẩm biến đổi gen có thể được xác định bằng nhiều phương pháp như PCR, Realtime-PCR, ELISA, trong đó phương pháp PCR được xem là phương pháp đơn giản và ít tốn kém so với các phương pháp khác

1.2 Mục tiêu thí nghiệm

Tìm hiểu phương pháp xét nghiệm một sản phẩm để xác định thực phẩm biến đổi gen

1.3 Nội dung thực hiện

Ly trích DNA tổng số, PCR và điện di để xác định sự có mặt của DNA trong sản phẩm

Xét nghiệm sản phẩm bằng phương pháp PCR để kết luận GMO hay Non-GMO

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thực phẩm biến đổi gen

Sinh vật biến đổi gen (GMO) được xác định là những sinh vật có vật liệu di truyền

đã được biến đổi không theo cách tự nhiên để tăng năng suất, giảm thiểu các yếu tố tiêu cực ảnh hưởng đến chất lượng cây trồng Ngày nay, GMO đã được ứng dụng khá rộng rãi, chúng được sử dụng trong nghiên cứu y sinh, sản xuất các loại thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp Thực phẩm biến đổi gen được sử dụng để chỉ những loại cây trồng được nhân giống để phục vụ nhu cầu ở người và động vật Các loại cây này đã được biến đổi trong phòng thí nghiệm để tăng các tính trạng mong muốn Cây trồng biến đổi gen thương mại đầu tiên là Cà chua Flavr Savr được phép tiếp thị vào năm 1994 (Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm, 1994) Năm 2007, GMO chiếm hơn 143 triệu

ha ở 23 quốc gia với đậu tương, bông, ngô và hạt cải dầu và những cây trồng phổ biến

Một ví dụ điển hình về GMO là việc sử dụng gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

(B.t.) chuyển vào ngô để sản sinh ra protein tinh thể gây tê liệt ấu trùng của côn trùng

GMO được sản xuất theo nhiều phương pháp khác nhau Gen ngoại lai được chèn vào trong tế bào của vi sinh vật, cây trồng hoặc một loài động vật Gen chuyển là những gen biểu hiện tính trạng đã biết hoặc những đột biến gen đã biết Việc chuyển gen có thể được thực hiện bằng các phương pháp sau: Chuyển gen sử dụng virus và plasmid biến đổi gen, dùng phương pháp xung điện để đạt độ thấm của màng tế bào cao hơn hay sử dụng phương pháp vi tiêm giai đoạn tiền thân Thực phẩm biến đổi gen được phân loại như sau: (a) Thực phẩm bao gồm hoặc có chứa các sinh vật sống/có thể tồn tại; (b) Thực phẩm có nguồn gốc hay có chứa các thành phần có nguồn gốc từ GMO; (c) Thực phẩm

có chứa các thành phần hay phụ gia được sản xuất bằng vi sinh vật biến đổi gen; (d) Thực phẩm có chứa các thành phần được chế biến bằng enzyme được sản xuất bằng vi sinh vật biến đổi gen

Việc đưa thêm vào cây trồng những đặc tính mới có tiềm năng dẫn đến tăng năng suất của cây trồng, nâng cao chất lượng của sản phẩm, điều đó có thể đáp ứng nguồn cung cấp cũng như tăng cường sức khoẻ cho con người Sản xuất cây trồng hiện đại giúp giảm sử dụng hoá chất độc hại, tăng thu nhập trong canh tác nông nghiệp và phát triển bền vững an ninh lương thực Tuy nhiên, các tính trạng mới trong sinh vật biến đổi gen

3

cũng có nguy cơ gây ra một số nguy hiểm cho con người và môi trường Vì vậy, tranh cãi về sử dụng thực phẩm biến đổi gen vẫn luôn là vấn đề khó có thể giải quyết trên thế giới

2.2 Phương pháp xét nghiệm thực phẩm biến đổi gen

Việc kiểm tra GMO có thể phục vụ một số mục đích nhất định Xét nghiệm định tính có thể được sử dụng để phân biệt được vật liệu được cấp phép và vật liệu trái phép hoặc việc sử dụng vật liệu, để xác định vật liệu đó có an toàn hay không hoặc để chứng nhận độ tinh khiết của vật liệu Xét nghiệm định lượng có thể được sử dụng để kiểm soát việc tuân thủ các ngưỡng theo quy định của pháp luật

Các công cụ áp dụng cho xét nghiệm GMO chủ yếu là các xét nghiệm sinh học, xét nghiệm dựa trên protein (chủ yếu là miễn dịch) và xét nghiệm dựa trên DNA (áp dụng công nghệ phản ứng chuỗi polymersase) Trong đó, xét nghiệm dựa trên DNA được các cơ quan xét nghiệm áp dụng rộng rãi Ưu điểm của xét nghiệm dựa trên DNA chủ yếu là độ đặc hiệu và độ nhạy Ngoài phương pháp PCR dựa vào DNA, các phương pháp khác như khuếch đại đẳng nhiệt, phát hiện trực tiếp DNA bộ gen bằng cảm biến điện hoá, phân tích cDNA bằng microarray cũng được đề xuất

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: 8 giờ đến 16 giờ 30 ngày 23 và 30 tháng 5 năm 2024

Địa điểm: Phòng 101, Toà nhà A2, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp

Mẫu thí nghiệm: Mẫu đậu nành số 5

Hoá chất: PCI, CI, Isopropanol, TE, EtOH, Agarose, Gelred,…

Dụng cụ và thiết bị: Máy PCR, máy quang phổ, bồn điện di, Máy ly tâm, micropipette, tube, chày nghiền mẫu,…

Phương pháp thực hiện: Sử dụng kỹ thuật ly trích DNA, kỹ thuật PCR và điện di

để xác định mẫu bắp dựa trên cặp primer 35S-1 (5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’)

và 35S-2 (5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’) Cặp primer này sẽ nhận diện được mẫu bắp GMO và kết quả PCR sẽ được hiển thị thông qua kết quả điện di mẫu

3.2.1 Ly trích và điện di tổng số DNA

Vật liệu: Mẫu đậu nành số 5

Các bước thực hiện:

Bước 1: Nghiền nhỏ mẫu đậu nành số 5 trong túi zip, cho 0,05g mẫu vào tube Bước 2: Cho vào 600 μl dịch trích SDS, dùng chày nghiền mịn mẫu

Hình 3.1 Sau khi thêm dịch trích SDS

5

Bước 3: Thêm 600 μl PCI gồm Phenol/CHCl3/Isoamyl theo tỷ lệ 25:24:1 (Hút

400 μl vào trước, trộn đều, sau đó thêm 200 μl để tránh trường hợp bị đổ), trộn đều, đem

ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút Hỗn hợp PCI sẽ làm biến tính protein được giải phóng trong quá trình ly trích, giúp thu được DNA

Hình 3.2 Dung dịch cho PCI vào a) Vừa cho PCI vào; b) Lắc đều hỗn hợp PCI và mẫu

Bước 4: Hút dung dịch nổi sang tube mới

Hình 3.3 Dung dịch thu được. a) Dung dịch sau ly tâm; b) Hút dịch nổi qua tube mới

Bước 5: Thêm 500 μl dung dịch CI gồm CHCl3/Isoamyl theo tỷ lệ 24:1 vào tube, trộn đều, đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút CI có vai trò lọc lượng phenol đã

bị tan một ít ở bước 4, với đặc điểm CI nặng hơn nước, CI sẽ kéo theo phenol chìm xuống và tách lớp với dung dịch phía trên chứa DNA

Hình 3.4 Dung dịch sau khi thêm CI

Bước 6: Hút 300 μl dịch nổi sang tube mới

Bước 7: Thêm 180 μl dịch nổi Isopropanol vào tube, đảo nhẹ để tránh làm hỏng DNA, ủ ở 20oC trong 30 phút Isopropanol làm kết tủa DNA, sau khi ly tâm, kết tủa DNA sẽ chìm xuống đáy tube

Hình 3.5 Dung dịch sau khi thêm isopropanol

Bước 8: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đổ bỏ dịch nổi

Bước 9: Cho 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, đổ bỏ dịch nổi (bước này lặp lại 2 lần) Ethanol giúp mẫu DNA sạch hơn

Bước 10: Đem phơi khô, thêm 30 μl TE, bảo quản ở -20oC

7

Bước 11: Tiến hành điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích DNA tổng số của mẫu bắp Trộn đều 10 μl hỗn hợp gelred + loading dye và 5 μl mẫu, bơm vào giếng điện di Tiến hành điện di trong 20 phút

Bước 12: Đọc kết quả điện di bằng hình ảnh được chụp từ máy chiếu UV Đồng thời xác định hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ BioDrop

3.2.2 Xét nghiệm mẫu đậu nành kiểm tra GMO bằng phương pháp PCR

Cặp primer: 35S-1 và 35S-2

Bảng 3.1 Trình tự cặp primer đặc hiệu xác định GMO cho đậu nành

Tên

Kích thước sản phẩm Tham khảo 35S-1 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’

195 bp (Hurst và cộng

sự, 1999) 35S-2 5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’

Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích (𝛍l)

Bước 1: Thực hiện mix 1 µl mẫu cùng với 11,5 µl dung dịch hỗn hợp PCR (6,25

µl Master Mix, 0,25 µ Primer F, 0,25 µl Primer R, 4,75 µl nước)

Bước 2: Pin-down tube đựng mẫu để đảm bảo mẫu không bị dính trên thành tube Bước 3: Tiến hành PCR, với 40 chu kỳ

Bảng 3.3 Quá trình phản ứng PCR

Giai đoạn tiền

40 chu kỳ

Bảng 3.3 (tt) Quá trình phản ứng PCR

40 chu kỳ

Giai đoạn

kéo dài kết thúc 72

Bước 4: Tiến hành điện di trên gel agarose 0,8% Trộn đều 10 μl hỗn hợp gelred + loading dye và 5 μl mẫu, bơm vào giếng điện di Tiến hành điện di trong 20 phút

Bước 5: Đọc kết quả điện di bằng hình ảnh được chụp từ máy chiếu UV

9

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả và thảo luận điện di DNA tổng số

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số

Qua quan sát hình, kết quả điện di DNA tổng số cho mẫu đậu nành số 5 rõ ràng, band sáng, đậm Có thể xác định được trong mẫu đậu nành số 5 có chứa DNA Ngoài ra

có những vệt mờ, kéo dài là RNA Có thể loại bỏ RNA bằng cách để trong nhiệt độ phòng khoảng một ngày vì RNA dễ phân hủy hoặc sử dụng enzyme RNase ủ trong 30 phút ở 37oC để mẫu DNA sạch hơn

4.2 Kết quả và thảo luận định lượng DNA bằng máy đo quang phổ BioDrop

Hình 4.2 Kết quả định lượng DNA bằng máy đo quang phổ a) Kết quả hàm lượng DNA; b) Đồ thị hàm lượng DNA.

Từ giá trị OD đo được, ta có thể đánh giá chất lượng DNA có trong mẫu DNA hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm và kém ở 280 nm trong khi protein thì ngược lại Một mẫu được đánh giá là tinh sạch khi có tỷ số OD260/OD280 trong khoảng 1,8 – 2,0 Nếu mẫu nhiễm phenol hay protein thì tỉ lệ này sẽ thấp hơn; sự hiện diện của guanidine

sẽ làm tăng giá trị OD260 Theo kết quả OD thu được, ta có OD260/OD280 của mẫu là 2,043 Như vậy, DNA của mẫu đậu nành số 5 đã được ly trích khá tinh sạch, không nhiễm protein, tuy nhiên vẫn còn lẫn một ít RNA Ta có thể loại bỏ RNA bằng cách để

ở nhiệt độ phòng trong một ngày hoặc sử dụng enzyme Rnase Hàm lượng DNA thu được sau ly trích là 123,4 ng/µl

4.3 Kết quả kiểm tra GMO bằng phương pháp PCR

Ladder được sử dụng có kích thước 100 bp Vạch cuối cùng là primer dimer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau), điều này có thể dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu Band mục tiêu thường đạt ở 200 bp nhưng band mục tiêu trong hình cao hơn 200 bp, lý

do có thể hóa chất đã bị hỏng Tuy nhiên vẫn có band sáng tầm 200 – 300 bp nên có thể kết luận mẫu đậu nành số 5 là đậu nành GMO

a) b) c)

d)

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO a) Ladder; b) Đối chứng

dương; c) Đối chứng âm; d) DNA mẫu đậu nành 5.