Cndt2_Lê Quốc Đạt_21126300_Thứ 2 Ca 3.Pdf

Câu hỏi về thực phẩm biến đổi gen thường gây tranh cãi trong cộng đồng khoa học, vì một số người cho rằng chúng có thể mang lại lợi ích lớn cho nông nghiệp và dinh dưỡng, trong khi lại c

TP Thủ Đức, 06/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC: THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số sinh viên 21126300 Niên khóa : 2021 – 2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC: THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS PHẠM ĐỨC TOÀN LÊ QUỐC ĐẠT

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUẢN TÀI LIỆU 2

2.1 Sinh vật chuyển gene (GMO) 2

2.2 Phương pháp xác định thực phẩm GMO/Non-GMO 2

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 4

3.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 4

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 4

3.2.2 Dụng cụ sử dụng 4

3.2.3 Thiết bị sử dụng 4

3.2.4 Hóa chất sử dụng 4

3.3 Phương pháp nghiên cứu 5

3.3.1 Ly trích DNA tổng số của mẫu 5

3.3.2 Điện di DNA ly trích, kiểm tra DNA tổng số (Buổi 1) 7

3.3.3 Đo mật độ quang (OD), kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA (Buổi 1) 8

3.3.4 Phản ứng PCR mẫu (Buổi 2) 8

3.3.5 Điện di mẫu sau PCR, kiểm tra GMO (Buổi 2) 9

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

4.1 Điện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu 10

4.1.1 Kết quả 10

4.1.2 Thảo luận 10

4.2 Đo mật độ quang OD 11

4.2.1 Kết quả 11

4.2.2 Thảo luận 11

4.3 Điện di kiểm tra GMO 12

4.3.1 Kết quả 12

4.3.2 Thảo luận 12

iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Mẫu sau khi được nghiền nhuyễn 5

Hình 3.2 Dịch nổi tách ra sau li tâm 6

Hình 3.3 Cho 500 µL ethanol 70% để rửa mẫu 7

Hình 4.1 Kết qua điện di kiểm tra nồng độ DNA tổng số 10

Hình 4.2 Kết quả đo mật độ quang (OD) 11

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO 12

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong phản ứng PCR 8 Bảng 3.2 Thông số chu trình nhiệt 9

1

1.1 Đặt vấn đề

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Thực phẩm biên đổi gen, thường được viết tắt là GMO (Genetically Modified

Organism)hay G-EMO (Genetically Engineered Modified Organism), là những loại thực phẩm mà di truyền của chúng đã được can thiệp để thay đổi bằng kỹ thuật di truyền Các thay đổi này có thể là để cải thiện chất lượng, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh, tăng sản lượng, hoặc thậm chí để cải thiện giá trị dinh dưỡng

Các loại thực phẩm biến đổi gen thường gặp nhất là các loại cây trồng như ngô, đậu nành, cà chua, và đậu phụ Mặc dù đã được can thiệp di truyền, các thực phẩm này vẫn phải tuân thủ các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trước khi được phép tiếp cận thị trường Câu hỏi về thực phẩm biến đổi gen thường gây tranh cãi trong cộng đồng khoa học,

vì một số người cho rằng chúng có thể mang lại lợi ích lớn cho nông nghiệp và dinh

dưỡng, trong khi lại có người lo ngại về tác động của chúng đối với sức khỏe con người và môi trường

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đơn giản hơn, mục tiêu của nghiên cứu về GMO bao gồm: đảm bảo an toàn và tác động môi trường của các sản phẩm GMO Nâng cao năng suất và chất lượng của cây trồng Phát triển cây trồng chống chịu bệnh tật và biến đổi khí hậu Hiểu rõ cơ chế hoạt động và biểu hiện gen để áp dụng hiệu quả Đánh giá và quản lý các rủi ro đối với sức khỏe và môi trường

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Ly trích mẫu theo quy trình, điện di - đo quang phổ (OD) kiểm tra chất lượng DNA tổng số và đọc kết quả

Nội dụng 2: Phản ứng PCR, điện di mẫu kiểm tra GMO và đọc kết quả

CHƯƠNG 2: TỔNG QUẢN TÀI LIỆU

2.1 Sinh vật chuyển gene (GMO)

Thực phẩm biến đổi gen (GMO - Genetically Modified Organism) là những thực

phẩm đã được sửa đổi cấu trúc gen bằng phương pháp kỹ thuật di truyền Những thực phẩm này ra đời nhằm mục đích làm tăng năng suất, kháng sâu bệnh, giúp cây khỏe hơn và sản phẩm có ngoại hình đẹp hơn Các nhà khoa học sẽ chỉ biến đổi ở những gen không ảnh hưởng đến giá trị về mặt dinh dưỡng của thực phẩm Do đó, chúng được tin rằng sẽ cung cấp đủ lượng lương thực cũng như tiết kiệm được đất đai sản xuất, giảm thuốc trừ sâu và phân bón hóa học GMO là từ viết tắt của “Genetically Modified Organism” hay còn gọi là sinh vật biến đổi gen Mặt khác, trong GMO bao gồm cả thực vật, động vật, vi sinh vật đã được lai tạo dựa vào kỹ thuật di truyền hoặc công nghệ chuyển gen Nhằm tạo ra các sản phẩm khác biệt so với các sản phẩm tự nhiên trước kia Mặc dù khái niệm về thực phẩm biến đổi gen nhờ công nghệ mới xuất hiện trong thế kỷ 20, trên thực tế, loài người đã can thiệp vào gen của cây trồng để cho ra tính trạng như mong muốn từ rất lâu bằng phương pháp chọn lọc nhân tạo, hay còn gọi là chọn giống Đặc biệt, sự ra đời của công nghệ gen với thí nghiệm cắt dán gen kháng kháng sinh giữa hai loài vi khuẩn của Boyer và Cohen vào năm 1973 mở đầu một bước đột phá trong công nghệ sinh học Tới năm 1982, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) lần đầu tiên phê duyệt dược phẩm đầu tiên được sản xuất bởi sinh vật biến đổi gen, Humulin, có thể dùng trong y học lên con người

Humulin được sản xuất bằng cách đưa gen người, Insulin vào vi khuẩn Escherichia coli Vi

khuẩn này có thể được nuôi và nhân lên số lượng lớn để có thể sản xuất đủ lượng hoocmon

để lọc, đóng gói và kê toa cho bệnh nhân tiểu đường Năm 1992, cây trồng biến đổi gen đầu tiên, giống cà chua FLAVR SAVR với độ chắc chắn và tuổi thọ cao, được Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ phê duyệt sản xuất ra thị trường Kể từ đó, công nghệ gen được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp lẫn dược phẩm, tạo ra các chế phẩm và thực phẩm có ích và giải quyết nhiều vấn đề toàn cầu Một số ví dụ tiêu biểu như giống ngô kháng sâu hại lá, thực vật kháng thuốc diệt cỏ, đậu tương giàu axit béo, gạo vàng hay thuốc chống đông máu Atryn được sản xuất từ dê Cây trồng biến đổi gen được bắt đầu trồng thương mại đại trà từ năm 1996

2.2 Phương pháp xác định thực phẩm GMO/Non-GMO

Kiểm định thực phẩm biến đổi gen (GMO) là quá trình nhằm xác định sự có mặt và/hoặc lượng các thành phần biến đổi gen trong sản phẩm thực phẩm Các phương pháp kiểm định này quan trọng để đảm bảo tính chính xác và an toàn của thực phẩm GMO trước khi được phân phối và tiêu thụ Nói cách khác, sự tồn tại của sinh vật biến đổi gen cần phải được kiểm chứng trong toàn bộ chuỗi cung ứng để các sinh vật này không vô tình xâm nhập vào quá trình sản xuât thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen Promoter 35S từ CaMV là nhân tố điều hòa khơi đầu phiên mã, dùng để biểu hiện gen chuyển, thường được sử dụng

3

trong thực vật biến đổi gen (Genetically modified organism, GMO) được phê duyệt bởi Liên minh châu Âu (EU), thực vật tự nhiên không có trình tự này CaMV P-35S được

sử dụng rộng rãi trong quá trình sàng lọc vật liệu chuyển gen trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và dược phẩm

Quy trình xét nghiệm cơ bản được thực hiện với 3 bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA

Bước 2: Nhân bản vùng trình tự muc tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR

Bước 3: Phân tích kết quả

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: 8h00 – 15h00, ngày 21/05/2024 (Buổi 1) và 04/06/2024 (Buổi 2)

Địa điểm nghiên cứu: Phòng 101, tòa nhà A2, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu giống cây như đậu nành và ngô được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh học và Phân tử , Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Mẫu được sử dụng trong báo cáo này là mẫu hạt ngô (mẫu 4)

3.2.2 Dụng cụ sử dụng

Các ống tube kích thước 1.5 µL; micropipette 100-1000 µL; micropipette 10-100 µL, găng tay y tế; đầu típ micropipette; khay đựng ống tube, dụng cụ nghiền

3.2.3 Thiết bị sử dụng

Máy kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA BioDrop; Máy PCR; buồng điện di; máy

li tâm

3.2.4 Hóa chất sử dụng

Tris HCl pH 8 (1M); EDTA pH 8 (0.5M); NaCl (5M); SDS (10%); Phenol/CHCl3/Isoamyl (25:24:1); dung dịch IC; Isopropanol; TE buffer pH 8; Ethanol 70%; Master mix; Gelred; Loading dye; gel agarose; môi xuôi; mồi ngược; Ladder

5

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Ly trích DNA tổng số của mẫu

Bước 1: Đánh số một ống tube mới được hấp khử trùng, tiến hành cho mẫu đã chọn vào tube để nghiền nhỏ (mẫu 4) cùng với 600 µL buffer

Hình 3.1 Mẫu sau khi được nghiền nhuyễn

Bước 2: Cho thêm 600 µL Phenol/CHCl3/Isoamyl (25:24:1) vào tube chứa mẫu đã nghiền cùng với buffer

PCI Buffer ( Phenol Chloroform Isoamyl alcohol ): gồm có phenol và chloroform gây biến tính protein, tuy nhiên phenol làm biến tính mạnh hơn Bên cạnh đó, Chloroform còn giúp giảm sự giao pha (tức là phân lớp rõ ràng hơn với các phân tử không xác định tồn tại

ở pha nào như protein biến tính, ) Ngoài ra còn có isoamyl alcohol giúp làm giảm bọt khí

và làm quá trình tách lớp diễn ra tốt hơn

Bước 3: Tiến hành đi li tâm ở 10000 vòng trong 5 phút

Hình 3.2 Dịch nổi tách ra sau li tâm

Bước 4: Hút 500 µL phần dịch nổi cho vào tube mới

Bước 5: Hút 500 µL CHCl3 cho vào tube mới chứa 500 µL dịch nổi

Bước 6: Li tâm 10000 vòng trong 5 phút và hút ra ra 300 µL dịch nổi sau li tâm cho vào tube mới

Bước 7: Thêm vào tube 180 µL Isopropanol và đem đi ủ lạnh 30 phút ở nhiệt độ âm khoảng -20oC

Isopropanol: kết tủa DNA (DNA ít tan hơn trong isopropanol nên nó kết tủa nhanh hơn với nồng độ thấp hơn so với ethanol), tuy nhiên muối ở trong mẫu cũng bị kết tủa nhanh theo DNA

Bước 8: Đem đi li tâm 14000 rpm trong 10 phút

Bước 9: Ta quan sát thấy có một đốm nhỏ ở đáy, loại bỏ dịch trong tube, cho 500 µL ethanol 70% vào trong tube để rử a

7

Hình 3.3 Cho 500 µL ethanol 70% để rửa mẫu

Ethanol 70%: hòa tan muối Nacl đã bị kết tủa cùng với DNA, giúp tránh nhiễm muối trong mẫu DNA

Bước 10: Sau khi rử a bẳng Ethanol ta sẽ cho bay hơi hết Ethanol trong tube

Bước 11: Cho 30 µL TE buffer vào tube và bảo quan trong tủ đông ở -20oC

TE: cân bằng pH và bảo quản DNA

3.3.2 Điện di DNA ly trích, kiểm tra DNA tổng số (Buổi 1)

Bước 1: Chuẩn bị gel Cần xác định lượng agarose cần dùng để đạt được nồng độ agarose và thể tích mong muốn Cho dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến khi các hạt agarose tan hoàn toàn Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước khi đổ gel vào khay có mang lược gel

Bước 2: Chuẩn bị bồn điện di Khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn điện di, ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho mẫu điện di vào

Bước 3: Chuẩn bị mẫu Hút 5μL mẫu DNA trộn cùng với 10 μL loading dye (bromophenol blue, glycerol)

Bước 4: Hút 15 μL hỗn hợp trên vào giếng điện di, điện di trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100V

Bước 5: Điện di sau đó chụp gel và quan sát kết quả

3.3.3 Đo mật độ quang (OD), kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA (Buổi 1)

Sau khi điện di để đánh giá định tính hàm lượng DNA có trong mẫu, ta sử dụng máy BioDrop để định lượng chính xác nồng độ và chất lượng của DNA trong mẫu

Tiến hành đo nồng độ bằng máy Biodrop, hút 2 - 3 μL mẫu bỏ vào máy và đợi kết quả

đo được

3.3.4 Phản ứng PCR mẫu (Buổi 2)

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ cuối Thể tích (μL)

Master Mix 2X 1X 6,25

Primer F 10 (μM) 0,2 (μM) 0,25

Primer R 10 (μM) 0,2 (μM) 0,25

DNA Template X 50 ng/μL 1,0

H2O khử ion - - 4,75

Tổng thể tích 12,5 Cặp primer được sử dụng trong phản ứng là đặc hiệu với vùng promoter 35S Đây là vùng khởi động đứng trước vùng chèn gene vào sinh vật như gene kháng côn trùng hay gene chống chịu thuốc bảo vệ thực vật

Trình tự primer: 35S-1 5’-TCATTGCGATAAAGGAAAGG- 3’

Trình tự có kích thước 189 bp

Bước 1: Hút lần lượt 6,25 µL My TaqMix; 0,25 µL Reverse Primer, 0,25 µL Forward Primer; 1 µL DNA template; 4,75 µL H2O khử ion vào 1 cái tube

9

Bảng 3.2 Thông số chu trình nhiệt

Giai đoạn Nhiệt độ ( o C) Thời gian Số chu kì

Tiền biến tính 95 5 phút 1

Biến tính 95 30 giây

Bắt mồi 60 30 giây 40

Kéo dài 72 30 giây

Hậu kéo dài 72 7 phút 1

Bước 3: Sau khi thực hiện quá PCR ta tiến hành đổ gel agarose 1% Cho mẫu vào bồn điện di, tiến hành điện di trong 20 phút ở hiệu điện thế 100V Chụp kết quả

3.3.5 Điện di mẫu sau PCR, kiểm tra GMO (Buổi 2)

Sau khi PCR Điện di với 5 µL mẫu + Gelred 10 µL và điện di trong vòng 35 phút ở 100V

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Điện di kiểm tra nồng độ DNA tổng số của mẫu

4.1.1 Kết quả

Hình 4.1 Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Qua kết quả điện di cho thấy, xuất hiện band mờ

4.1.2 Thảo luận

Đối chiếu với các kết quả khác của mẫu tương tự, có thể do thao tác thực hiện làm DNA bị trôi hoặc hút dịch DNA ít dẫn đến kết quả band xuất hiện mờ

Mẫu số 4 (26)

11

4.2 Đo mật độ quang OD

4.2.1 Kết quả

4.2.2

Hình 4.2 Kết quả đo mật độ quang (OD)

Kết quả kiểm tra trên máy BioDrop, cho thấy nồng độ DNA đạt 256,5 ng/μl, tỉ lệ A260/A280 là 1.996

4.2.3 Thảo luận

Với nồng độ DNA đạt 256,5 ng/μl, đây là mức nồng độ trung bình thấp cho DNA được chiết xuất từ tế bào Tỉ lệ A260/A280 là 1,996, đây là tỉ lệ DNA nằm trong khoảng 1,8-2,2 thì DNA trong mẫu không bị nhiễm, nồng độ DNA có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

4.3 Điện di kiểm tra GMO

4.3.1 Kết quả

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO

Qua kết quả điện di cho thấy, có sự xuất hiện của band nhưng khá mờ

4.3.2 Thảo luận

Dựa vào Hình 4.1 cho thấy band DNA xuất hiện mờ tuy nhiên khi kiểm tra

bằng OD có sự hiện diện của DNA Có thể do hàm lượng DNA trong mẫu thấp hoặc trong lúc thao tác mix mẫu, load mẫu vào giếng không đúng cách dẫn đến tràn mẫu, làm hao hụt thể tích mẫu trong giếng

Mẫu số 4 (26)