Cndt2_ Thứ 2 Ca 3 _Thạch Vinh _ 21126259.Pdf

Kết quả đo điện di kiểm tra nồng độ DNA.. Nội dung thực hành Thu mẫu: tiến hành thu hạt của bắp GMO Ly trích DNA: tiến hành ly trích DNA từ đậu nành GMO làm nguồn nguyên liệu cho điện d

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2021 – 2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

TP Thủ Đức, 06/2024

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TP Thủ Đức, 06/2024

BÀI BÁO CÁO CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hành 1

1.3 Nội dung thực hành 1

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2

2.1 Vật liệu nghiên cứu 2

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2

2.1.2 Thiết bị và dụng cự 2

2.1.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 2

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2

2.3 Các bước tiến hành 2

2.3.1 Ly trích DNA 2

2.3.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD 4

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6

3.1 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 6

3.2 Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA 6

3.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO 7

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Mẫu bắp GMO đã nghiền 3

Hình 2.2 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDS 3

Hình 2.3 Mẫu sau khi đem li tâm 4

Hình 2.4 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 6

Hình 3.2 Kết quả đo điện di kiểm tra nồng độ DNA 6

Hình 3.3 Kết quả đo điện di kiểm tra GMO 7

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dân số thế giới dự kiến đạt 9,7 tỷ người vào năm 2050, gia tăng 26% so với hiện nay Nhu cầu về thực phẩm, đặc biệt là ngũ cốc, sẽ tăng 40% để đáp ứng nhu cầu này Biến đổi khí hậu, hạn hán, và suy thoái đất đai cũng ảnh hưởng đến sản lượng cây trồng

Để đối phó trước tình hình đó, việc áp dụng kĩ thuật chuyển gen trên thực vật để tăng sản lượng lương thực được áp dụng sản xuất Trong bắp GMO có thể được lai tạo để tăng khả năng chống chịu sâu bệnh, cỏ dại và hạn hán, dẫn đến năng suất cao hơn Bắp GMO có thể được lai tạo để tăng hàm lượng vitamin, khoáng chất hoặc các chất dinh dưỡng khác

1.2 Mục tiêu thực hành

Xác định được bắp GMO, phân biệt được bắp GMO và bắp hữu

cơ bằng phương pháp PCR

1.3 Nội dung thực hành

Thu mẫu: tiến hành thu hạt của bắp GMO

Ly trích DNA: tiến hành ly trích DNA từ đậu nành GMO làm nguồn nguyên liệu

cho điện di và PCR

Điện di lần 1: Tiến hành điện di nhầm kiểm tra mẫu ly trích có chứa DNA hay

không

Đo quang phổ: đo lường nồng độ mẫu DNA

PCR: nhầm khuếch đại vật liệu DNA, các đoạn gene mong muốn bằng các cặp mồi chuyên biệt

Điện di lần 2: tiến hành điện di mẫu PCR nhầm phát hiện GMO

Đọc kết quả: đọc kết quả dựa vào đối chứng dương của cây GMO

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu bắp GMO

2.1.2 Thiết bị và dụng cự

Máy điện di, máy PCR, máy ly tâm và máy đo quang phổ

2.1.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất gồm: PCI buffer; CI; Isopropanol; Ethanol 70oc; TE buffer, Master mix; Gelred; SDS; loading dye; gel agarose; dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số Xuất hiện band sáng là do có DNA trong mẫu, DNA sẽ được glycerol nặng hơn kéo lắng xuống đáy giếng, giúp DNA tránh khuếch tán ra bên ngoài, đồng thời làm băng điện di đẹp và gọn hơn Cuối cùng,

để quan sát được DNA cần phải nhuộm phân tử này bằng các chất nhuộm như gelred, Và ngược lại nếu không có DNA trong mẫu những phản ứng trên sẽ không xảy

ra và đồng thời band sáng cũng không xuất hiện Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA

ly trích có dương tính hay âm tính với gen chuyển vào hay không Thông qua điện di sản phẩm PCR có ladder, có band sáng xuất hiện nếu mẫu ly trích DNA dương tính Và ngược lại nếu mẫu âm tính, band sáng không xuất hiện

2.3 Các bước tiến hành

2.3.1 Ly trích DNA

Bước 1: Sau đó chuẩn bị tube sạch và cho vào tube một lượng nhỏ vừa đủ (quá nhiều hay quá ít cũng sẽ khiến cho quá trình ly trích và điện di trở nên khó khăn)

Hình 2.1 Mẫu bắp GMO đã nghiền

Bước 2: thêm 400 μL SDS sau đó dùng chày nghiền mẫu trong dung dịch Sau

đó bổ sung thêm 200 μL SDS

Hình 2.2 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDS

Bước 3: Đem tube trên đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút Sau ly tâm hút 500μL dịch nổi qua tube mới

Hình 2.3 Mẫu sau khi đem li tâm

Bước 5: thêm 500 μL CI vào tiếp tục đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút, sau đó hút 300 μL dịch nổi qua tube mới

Bước 6: bổ sung Isopropanol (Vmẫu*0,6 = VIsopropanol), như vậy sẽ thêm 180

μL Isopropanol sau đó đảo nhẹ và quan sát, có lợn cợn thì đó là DNA

Isopropanol: kết tủa DNA (DNA ít tan hơn trong isopropanol nên nó kết tủa nhanh hơn với nồng độ thấp hơn so với ethanol), tuy nhiên muối ở trong mẫu cũng bị kết tủa nhanh theo DNA

Bước 7: ủ lạnh ở 20oC trong vòng 30 phút Đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong

10 phút

Bước 8: sau đó đổ từ từ dịch ra (đổ nhẹ vì đổ mạnh có thể làm cho DNA đi ra ngoài) rồi thêm 500 μL Ethanol 70oC vào để rửa (xoay theo ngang chiều và cần rửa nhẹ)

Ethanol 70%: hòa tan muối Nacl đã bị kết tủa cùng với DNA, giúp tránh nhiễm muối trong mẫu DNA

2.3.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD

Đem mẫu đậu nành sau khi ly trích sẽ được đem đi điện di để xác định có DNA hay không

Nguyên tắc: các đoạn DNA mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường theo chiều từ cực âm sang cực dương Trên bảng gel agarose, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường Sau khi tách chiết được DNA của đậu nành, ta tiến hành thực hiện điện di Tiến hành:

Bước 1: chuẩn bị gel

Cần xác định lượng agarose cần dùng để đạt được nồng độ agarose và thể tích mong muốn Cho dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến khi các hạt agarose tan hoàn toàn Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước khi đổ gel vào khay có mang lược gel

Bước 2: chuẩn bị bồn điện di

Bước 3: chuẩn bị mẫu

Hút 5μL mẫu DNA trộn cùng với 10 μL loading dye (bromophenol blue, glycerol)

Bước 4: hút 15 μL hỗn hợp trên vào giếng điện di, điện di trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100V

Bước 5: điện di sau đó chụp gel và quan sát kết quả

Bước 6: tiến hành đo nồng độ bằng máy Biodrop, hút 2 - 3 μL mẫu bỏ vào máy

và đợi kết quả đo được

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích

Hình 2.4 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích

Ta có tỷ số OD260/OD280= 2,102 Quá trình tinh sạch DNA với nồng độ 612,2 ng/μL, nồng độ DNA có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

3.2 Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA

Hình 3.2 Kết quả đo điện di kiểm tra nồng độ DNA

Kết quả có xuất hiện band sáng chứng tỏ thao tác làm chính xác không bị lủng giếng hay bị tràn DNA tuy nhiên vẫn còn 1 số RNA tồn dư gây nên vệt sáng ở dưới band

3.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO

Kết qua điện di cho thấy 2 band sáng có thể kết luận mẫu bắp số 5 là thực vật chuyển gene

Hình 3.3 Kết quả đo điện di kiểm tra GMO