Cndt2 - Nguyễn Minh Đức - 21126305 - T2 - 789.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỞNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỞNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

TP Thủ Đức, 06/2024

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Sinh vật biến đổi gen - Genetically modified organism ( GMO) 2

2.2 Phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR 2

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2.3.2 Điện di kiểm tra DNA tổng số 11

3.2.3.3 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số 11

3.2.3.4 PCR khếch đại vùng trình tự promoter 35S 11

3.2.3.5 Điện di kiểm tra sự có mặt của vùng trình tự promoter 35S từ mẫu PC 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Kết quả 13

4.1.1 Ly trích và điện di DNA tổng số 13

4.1.2 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số 13

4.1.3 Kết quả PCR và điện di phát hiện promoter 35S 13

4.2 Thảo luận 14

4.2.1 Ly trích và điện di DNA tổng số 14

4.2.2 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số 14

4.2.3 PCR và điện di phát hiện promoter 35S 14

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 11 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát hiện thực vật GMO 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Sau khi nghiền mẫu trong 600 µl extraction buffer 8

Hình 3.2 Sau khi thêm 600 µl PCI và lắc mạnh tay 9

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly tâm 10000 rpm/ 5 phút 11

Hình 3.4 Hút 500 µl dịch nổi sang tube mới 12

Hình 3.5 Sau khi Ly tâm 10000 rpm/ 3 phút 12

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu số 4 15

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên máy BioDrop 15

Hình 4.3 Kết quả điện di phát hiện vùng trình tự Promoter 35S 16

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Quá trình sản xuất thực phẩm ngày nay đã phát triển hiện đại và phức tạp hơn so với trước đây Theo đó, các sản phẩm biến đổi gen ( GMO - Genetically modified organisms) không ngừng tăng lên về số lượng và sự đa dạng, khiến việc phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm ngày càng khó khăn

Kiểm định thực phẩm biến đổi gen cần được thực hiện thường xuyên vì các sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen có thể vô tình được trộn lẫn với thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen Nói cách khác, sự tồn tại của sinh vật biến đổi gen cần phải được kiểm chứng trong toàn bộ chuỗi cung ứng để các sinh vật này không vô tình xâm nhập vào quá trình sản xuất thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen

Các doanh nghiệp hiện đang thường xuyên thực hiện kiểm tra thực phẩm biến đổi gen với một số sản phẩm nhất định theo các quy định pháp lý để đáp ứng được các yêu cầu quy định về thực phẩm và đảm bảo rằng nhãn thực phẩm của doanh nghiệp cũng đáp ứng các yêu cầu liên quan đến thực phẩm biến đổi gen Đồng thời cũng nhằm tối ưu kinh tế vì sản phẩm biến đổi gen có giá bán thấp hơn sản phẩm không biến đổi gen nhưng hạt giống lại mắc hơn

1.2 Mục tiêu thực hiện

Phát hiện thực phẩm biến đổi gen GMO trên hạt bắp

1.3 Nội dung thực hiện

Thực hiện ly trích DNA tổng số, PCR và điện di xác định có sự hiện diện của vùng trình tự promoter 35S, từ đó kết luận mẫu bắp có phải là GMO hay không

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sinh vật biến đổi gen - Genetically modified organism ( GMO)

Theo National Human Genome Research Institute, GMO là thực vật, động vật hoặc vi khuẩn trong đó một hoặc nhiều thay đổi được thực hiện đối với bộ gen, thường sử dụng kỹ thuật di truyền công nghệ cao, nhằm thay đổi các đặc tính của sinh vật Các gen có thể được đưa vào, tăng cường hoặc xóa bỏ trong một loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các giới GMO có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, chẳng hạn như sản xuất insulin cho người, sản xuất đồ uống lên men và phát triển khả năng kháng thuốc trừ sâu ở cây trồng

Căn cứ khoản 2 Điều 1 Nghị định 118/2020/NĐ – CP quy định: Sinh vật biến đổi gen là kết quả của quá trình lai quy tụ bằng phương pháp lai tạo truyền thống từ hai hoặc nhiều sự kiện chuyển gen được cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học, Giấy xác nhận sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm, Giấy xác nhận sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thức ăn chăn nuôi đồng thời tuân thủ các quy định về điều kiện đầu tư, kinh doanh thì được phóng thích vào môi trường, sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi

2.2 Phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR

Phụ lục quy trình kỹ thuật phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribonucleic ban hành kèm theo Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy định phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR bao gồm:

Phương pháp đặc hiệu taxon – đích: Taxon là cấp phân loại, đơn vị phân loại

Taxon đích là đơn vị phân loại của sinh vật biến đổi gen Đây là phương pháp thông thường để phát hiện trình tự ADN trong một taxon đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn Các phương pháp dựa vào taxon đích để đánh giá sự có mặt, chất lượng và số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon và đôi khi còn được sử dụng là đơn vị chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen

Phương pháp sàng lọc PCR để phát hiện ADN của sinh vật biến đổi gen: Phát

hiện các yếu tố di truyền thông thường đối với một số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn như gen khởi động, gen kết thúc hoặc một số yếu tố di truyền được quan tâm khác) Phương pháp sàng lọc nhanh và đáng tin cậy một số lượng lớn các mẫu thử

Phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR chủ yếu dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter và terminator Hầu hết các trình tự ADN chuyển vào hệ gen thực vật dưới sự điều khiển CaMV 35S promoter, chỉ có một vài trường hợp sử dụng các promoter biểu hiện đặc hiệu ở phần chuyển hóa như rễ, thân, hạt hay các promoter cảm ứng Hiện nay rất nhiều các cây trồng biến đổi gen đã được cấp phép trồng mang ít nhất một bản sao của 35S promoter và T-Nos terminator (phân lập từ gen tổng hợp nopaline ở Agrobacterium tumefaciens) Một gen khác được sử dụng khá phổ biến là gen chọn lọc kanamycin nptII phân lập từ Escherichia coli transposon 5 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và virus khảm súp lơ (Cauliflower mosaic virus) đều nằm trong các danh mục các loài gây hại cho thực vật và đặc biệt virus khảm súp lơ ngoài gây bệnh cho súp lơ còn gây bệnh cho các thành viên khác thuộc họ Brassicceae (Cruciferae) cũng như họ Resedaceae và Solanaceae Vì thế, kết quả dương tính từ các mẫu Brassicaceae, Resedceae và Solanaceae cần được xử lý cẩn thận Để phân biệt giữa nhiễm virus và vật liệu biến đổi gen cần có phương pháp phát hiện virus

Đối với động vật biến đổi gen, thường các promoter sử dụng có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, b-actin, amylase, insulin, b-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV) Tuy nhiên do các promoter có nguồn gốc từ động vật dễ gây ra nhầm lẫn với promoter nội sinh của vật chủ, nên các promoter có nguồn gốc từ virus động vật có thể được sử dụng để sàng lọc sự có mặt của ADN có nguồn gốc động vật

Phương pháp nhận dạng cấu trúc đặc thù (event specific) để phát hiện trình tự gen đích của các sản phẩm biến đổi gen: Được sử dụng nhằm phát hiện sự tổ hợp của

các trình tự ADN được đưa vào hệ gen vật chủ, cấu trúc này chỉ tìm thấy trong các dòng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Trường hợp để phát hiện ngô T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen trong các nguyên liệu thô bằng cách khuếch đại vùng nối giữa trình tự ADN có nguồn gốc từ promoter 35S-CaMV và gen pat (gen kháng thuốc trừ cỏ) Phương pháp này không phân biệt được các giống ngô mà chỉ sử dụng để phát hiện sự có mặt của đoạn gen chuyển trong hạt và cây ngô

Kích thước của đoạn gen đích sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR được xác định khi kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của đoạn ADN đích dự kiến Các sản phẩm PCR được phân tích và xử lý bằng phương pháp điện di trên gel agarose

và nhuộm bởi gel red Gel agarose 1,5 % là thích hợp để phân tích các sản phẩm của PCR từ 150-1000 bp

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Từ ngày 22/05/2024 đến 29/ 05/ 2024

Địa điểm: Phòng 101, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường ( tòa nhà A2), đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu hạt bắp đã nghiền mịn ( mẫu số 4)

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 3.2.2.1 Ly trích DNA tổng

Dụng cụ: tube, cây nghiền mẫu blue piston, micropipet Thiết bị: Máy ly tâm

Hoá chất: Extraction bufer (Tris HCl ph 8 (1M), EDTA PH 8 (0,5M), NaCl ( 5M), SDS (10%)), phenol, CHCl3, isoamyl, isopropenol, etanol, TE ( Tris – EDTA) buffer

3.2.2.2.Phản ứng PCR

Thiết bị: Máy PCR, khay đổ gel

Mẫu DNA, mồi xuôi và mồi ngược (để phát hiện DNA tổng số và 35S để phát hiện thực vật GMO), Master mix ( dNTPs; MgCl2; Taq polymerase)

3.2.2.3 Điện di

Thiết bị: Bồn điện di, gel agarose 1%, TBE 0,5X, gel red, lader

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu:

Buổi 1 ( 22/ 05/ 2024): Ly trích và điện di DNA tổng số từ mẫu hạt bắp đã nghiền mịn (mẫu số 4), tiến hành đo nồng độ DNA tổng số sau khi ly trích bằng máy Biodrop

Buổi 2 (29/ 05/ 2024): PCR khếch đại vùng trình tự promoter 35S, sau đó điện di để kiểm tra mẫu số 4 có phải GMO

3.2.3.1 Ly trích DNA tổng số từ mẫu số 4

Bước 1: Lấy khoảng 0,05 g mẫu bột hạt bắp số 4 bỏ vào tube Thêm 400 µl

extraction buffer nghiền trước để tránh tạo bọt, sau đó tiếp tục bổ sung 200 µl extraction buffer trộn đều

Hình 3.1 Sau khi nghiền mẫu trong 600 µl extraction buffer

Bước 2: Thêm 600 µl PCI ( Phenol/ CHCl3/ Isoamyl (25:24:1)) và lắc mạnh tay

Hình 3.2 Sau khi thêm 600 µl PCI và lắc mạnh tay

Bước 3: Ly tâm 10000 rpm/ 5 phút, sau đó hút 500 µl dịch nổi phía trên được ngăn

cách bởi 1 lớp protein biến tính sang tube mới

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly tâm 10000 rpm/ 5 phút

Hình 3.4 Hút 500 µl dịch nổi sang tube mới

Bước 4: Thêm 500 µ CHCl3/ Isoamyl (24: 1) vào tube và mix đều

Bước 5: Ly tâm 10000 rpm/ 3 phút và hút 400 µl dịch nổi sang tube mới

Hình 3.5 Sau khi Ly tâm 10000 rpm/ 3 phút

Bước 6: Thêm 240 µl isopropanol (0,6X thể tích dịch nổi) rồi đem ủ ở - 20oC/ 30 phút

Bước 7: Ly tâm 10000 rpm/ 10 phút và loại bỏ phần dịch nổi phía trên

Bước 8: Thêm 500 µl Ethanol 70o rồi tiến hành ly tâm 10000 rpm/3 phút Lặp lại bước này 1 lần nữa để đảm bảo DNA được rửa sạch tạp chất

Bước 9: Phơi khô hết Ethanol ở tủ hút, thêm 30 µl dung dịch TE (Tris HCl – EDTA

buffer pH 8 containing RNAse) và đặt ở - 20oC để bảo quản mẫu

3.2.3.2 Điện di kiểm tra DNA tổng số Bước 1: Lấy DNA sau khi ly trích

Bước 2: Chuẩn bị gel agarose 1% ( 0,2g agarose trong 20 ml TBE 0,5X) Đun dụng

dịch trong lò vi sóng sau đó đợi hỗn hợp gel đạt 60oC, tiến hành đổ vào khuôn và đợi khoảng 30 phút cho gel đông cứng lại Để gel ngập trong buffer TBE 0,5X

Bước 3: Tiến hành điện di Mix 5 μL mẫu DNA tổng số với 10 μL thuốc nhuộm

Loading dye Bơm hỗn hợp vào giếng Điện di ở 100V trong 25 phút Xem kết quả dưới tia UV

3.2.3.3 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Kiểm tra nồng độ DNA tổng số trên máy BioDrop Hút 3 μL DNA và tiến hành đo ở bước sóng 260 nm ( bước sóng phát hiện DNA) , lưu ý 260 : 280 (DNA/ protein) nằm trong khoảng 1,8 – 2,2

3.2.3.4 PCR khếch đại vùng trình tự promoter 35S

Bước 1: Chuẩn bị các thành phần của phản ứng PCR: DNA mẫu, master mix,

primer xuôi và ngược 35S, H20 và các dụng cụ: Tube, micropipet,…

Bước 2: Tiến hành mix các thành phần phản ứng PCR vào tube theo ( Bảng 3.1 )

và theo thứ tự: maxter mix hay nước đầu tiên và DNA mẫu là cuối cùng

Bước 3: Cho mẫu vào máy PGR và thiết lập chu trình nhiệt như ( Bảng 3.2), tổng

thời gian là khoảng 1 giờ 30 phút

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát hiện thực vật GMO

40

3.2.3.5 Điện di kiểm tra sự có mặt của vùng trình tự promoter 35S từ mẫu PCR Bước 1: Lấy DNA sau khi PCR

Bước 2: Chuẩn bị gel agarose 1% ( 0,2g agarose trong 20 ml TBE 0,5X) Đun dụng

dịch trong lò vi sóng sau đó đợi hỗn hợp gel đạt 60oC, tiến hành đổ vào khuôn và đợi khoảng 30 phút cho gel đông cứng lại Để gel ngập trong buffer TBE 0,5X

Bước 3: Tiến hành điện di Mix 5 μL mẫu DNA sau khi PCRvới 10 μL thuốc nhuộm

Loading dye Bơm hỗn hợp vào giếng Điện di ở 100V trong 25 phút Xem kết quả dưới tia UV

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Ly trích và điện di DNA tổng số

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu số 4

Có band sáng ở vị trí DNA tổng số nhưng rất mờ

4.1.2 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên máy BioDrop (a) hàm lượng DNA, (b) biểu

Hình 4.3 Kết quả điện di phát hiện vùng trình tự Promoter 35S 4.2 Thảo luận

4.2.1 Ly trích và điện di DNA tổng số

Mẫu số 4 có xuất hiện band ở vị trí DNA tổng số và chỉ xuất hiện duy nhất 1 band chứng tỏ mẫu không bị nhiễm Nhưng band rất mờ có thể vì: nồng độ DNA ít, tuy nhiên khi đo nồng độ DNA trên máy Biodrop ra kết quả: 35,33 ng/ µl, theo lý thuyết và tham khảo các bạn học khác: nồng độ DNA nằm trong khoảng 20 – 50 ng/ µl thì ra band rất rõ, sáng và đẹp Chứng tỏ band mờ chỉ có thể do thao tác: Khi hút mix DNA để điện di đã để hụt thể tích hay không hút được DNA, nghiền mẫu chưa kĩ,… Tuy khá mờ nhưng vẫn có thể thực hiện bước tiếp theo

4.2.2 Kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Nồng độ DNA tổng số là: 35,33 ng/ µL Tuy thấp hơn tất cả các bạn trong lớp nhưng được đánh giá là vẫn khá tốt vì nằm trong khoảng 20 – 50 ng/ µL, từ đó cho biết: khi điện di DNA tổng số nếu thao tác tốt sẽ cho ra band sáng trung bình và khi PCR khếch đại vùng promoter 35S không cần pha loãng và tăng thể tích mẫu DNA tổng số

Đồ thị chỉ xuất hiện 1 đỉnh tỏ mẫu DNA không bị nhiễm các tạp chất khác, tuy nhiên đường vẽ đồ thị không thẳng mà hơi bị nhiễu

Thông số A260 : 280 = 1.927 nằm trong khoảng 1,8 –2,2 Kết quả tốt, chứng minh DNA trong mẫu không bị đứt gảy và bị nhiễm protein

4.2.3 PCR và điện di phát hiện promoter 35S

Mẫu số 4 là GMO vì có xuất hiện band ở vị trí khoảng 200 bp ( vị trí của vùng trình tự promoter 35S) phù hợp với kết luận ban đầu của thầy: Mẫu số 4 là GMO Tuy nhiên mẫu cũng xuất hiện 2 band ở 2 vị trí khác, 1 band có kích thước bé hơn 200 bp có thể là dimer của primer… 1 band khác có kích thước lớn hơn 200 bp là DNA mẫu Trong lớp, tất cả các mẫu đều xuất hiện band vì nhiễm primer khi xài chung, nên có thời gian thì tiến hành kiểm tra lại