BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÀI THU HOẠCH
THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II
Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện :NGUYỄN LƯU VĨNH HẢO Mã số sinh viên :21126333
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2024
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÀI THU HOẠCH
THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS PHẠM ĐỨC TOÀN NGUYỄN LƯU VĨNH HẢO
Trang 3Phòng cháy chữa cháy trong phòng thí nghiệm: các phương pháp bảo vệ bản thân khi có cháy xảy ra, trách nhiệm của mỗi cá nhân trong phòng thí nghiệm đối với phòng tránh cháy nổ và khi cháy nổ xảy ra
1.2 Phương pháp thực hiện 1.2.1 Li trích DNA
Để li trích DNA từ mẫu thực vật cần tiến hành qui trình sau:
Bước 1: Nghiền mẫu hạt bắp đã chọn, nghiền cho tới khi hạt thật mịn Bước 2: Cho vào ống tuýt 0,05 g mẫu bắp vừa nghiền
Bước 3: Thêm vào ống tuýt 600 𝜇L dịch trích SDS và dùng dụng cụ hòa tan mẫu với dung dịch
Hình 1.1 Dung dịch chứa mẫu
Trang 4Bước 4: Thêm 600 𝜇L dung dịch Phenol/ CHCl3/ Isoamyl (25:24:1) vào ống tuýt, ly tâm dung dịch ở 10000 v/p trong 5 phút
Hình 1.2 Thêm Phenol/ CHCl3/ Isoamyl vào ống tuýt
Bước 5: Hút 400 𝜇L dịch nổi phía trên vào ống tuýt mới, thêm 400 𝜇L
Hình 1.3 Chuyển dịch nổi sang ống tuýt mới
Bước 6: Thêm 400 𝜇L dung dịch Chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm dung dịch ở 10000 v/p trong 5 phút
Hình 1.4 Thêm Chloroform/ isoamyl alcohol
Bước 7: Sau khi li tâm hút 300 𝜇L dịch nổi sang ống tuýt mới, thêm 180 𝜇L dung dịch Isopropanol, ủ ở - 20℃ trong 30 phút
Trang 53
Hình 1.5 Dung dịch sau khi thêm Isopropanol
Bước 8: Ống tuýt sau khi ủ sẽ được ly tâm ở 10000 v/p trong 5 phút
Bước 9: Bỏ dịch nổi phía trên, thêm 400 𝜇L ethanol 70°, ly tâm ở 10000 v/p trong 3 phút
Bước 10: Bỏ dịch nổi, phơi khô và thêm 30 𝜇L dung dịch TE, bảo quản ở - 20℃
1.2.2 Điện di kiểm tra DNA tổng số
Nhằm xác định sự hiện diện của DNA trong mẫu bắp đã li trích tiến hành chạy điện di trên gel agarose Để nhuộm màu DNA sử dụng gel red + loading dye, ngoài ra loading dye còn có tỉ trọng lớn giúp kéo DNA xuống trong quá trình điện di Tỉ lệ gel red + loading dye/ DNA (10 : 5)
Hình 1.6 Quá trình chuẩn bị điện di a) Đưa gel vào bồn điện di, b) Nhuộm
màu DNA, c) Bơm DNA vào giếng.
1.2.3 Đo OD kiểm tra hàm lượng và độ tinh khiết của DNA
Trang 6Sau khi chạy điện di DNA tổng số, mẫu điện di sẽ được đo mật độ quang để kiểm tra
hàm lượng DNA hiện diện trong mẫu Ngoài ra đo độ hấp thu mật độ quang còn giúp xác định độ tinh khiết của dung dịch li trích Sử dụng máy BioDrop
1.3 Kết quả
Hình 1.7 Kết quả chạy điện di DNA tổng số
Từ hình ảnh kết quả điện di không nhận thấy có band DNA điều này có thể do quá trình nạp mẫu vào giếng đã không trộn DNA đều làm cho lượng DNA vào giếng không đủ để hiện band Chưa thể kết luận có sự hiện diện của DNA trong dịch trích
Từ đồ thị có thể thấy dung dịch li trích có độ tinh khiết thấp, có nhiều chất tạp nhiễm Nồng độ DNA trong mẫu đạt 19,40 ng/μg
18-2
Trang 8BÀI 2 KIỂM TRA GENE GMO TRONG MẪU THÔNG QUA ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR
2.1 Kiến thức học được
Các thành phần của phương pháp PCR, thao tác sử dụng các vật dụng trong phòng thí nghiệm Hiểu được cơ chế của quá trình khuếch đại gen GMO, phân biệt được primer khuếch đại gene GMO và primer khuếch đại gen chống chịu thuốc diệt cỏ/ kháng sâu bệnh Hiểu được mục đích của việc pha loãng DNA trước khi chạy PCR và biết cách tính toán thể tích pha loãng
2.2 Phương pháp thực hiện
2.2.1 Khuếch đại sản phẩm DNA tổng số với mồi GMO
Tiến hành khuếch đại DNA đã li trích được ở trên, vì nồng độ DNA đo được là 19,40 ng/μg nên không cần pha loãng mẫu Các bước tiến hành bao gồm:
Bước 1: Pha dung dịch master mix gồm 6,25 μL My Taq mix 1X, 0,25 μL Primer R 10 μM, 0,25 μL Primer F 10 μM, 4,75 μL nước khử ion Mix đều hỗn hợp
Bước 2: Thêm 1 μL dung dịch DNA vào ống tuýt chứa Master mix
Bước 3: Chạy PCR trong 40 chu kì biến tính, bắt cặp, kéo dài với primer GMO
2.2.2 Chạy điện di sản phẩm khuếch đại PCR
Sau khi đoạn gen mục tiêu đã được khuếch đại, tiến hành chạy điện di sản phẩm PCR Các bước tiến hành điện di giống như chạy điện di kiểm tra DNA tổng số ở bài trước Ngoài ra cần có thêm giếng đối chứng âm và giếng đối chứng dương nhằm xác định mẫu có chứa gen GMO không Với giếng đối chứng âm sẽ tiến hành chạy mà không có DNA, đối chứng dương sẽ chạy với mẫu chắc chắn có GMO
Trang 97
Hình 2.1 Quá trình thao tác chạy điện di 2.3 Kết quả
Hình 2.2 Kết quả điện di kiểm tra gene GMO
Kết quả điện di cho thấy giếng đối chứng âm vẫn cho band trùng với band của đối chứng dương Điều này cho thấy giếng đối chứng âm đã bị nhiễm, có thể do quá trình thao tác dẫn đến nhiễm chéo hoặc bị nhiễm ngay từ nguồn hóa chất Quan sát các giếng còn lại gần như các giếng có mẫu khác nhau lại đều cho kết quả band đều là GMO vậy nguồn nhiễm là hóa chất
2.4 Kết luận
ĐC (-)
ĐC (+)
18-2
Trang 10Vì hóa chất bị nhiễm nên chưa thể kết luận mẫu bắp số 2 có phải là mẫu GMO hay không Cần tiến hành kiểm tra mẫu lại với hóa chất mới