Cndt2-Bùi Thùy Trang-21126549-Thứ 2-789.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÀI THU HOẠCH THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II Sinh viên thực hiện : BÙI THÙY TRANG TP...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Sinh viên thực hiện : BÙI THÙY TRANG

TP Thủ Đức, 06/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS PHẠM ĐỨC TOÀN BÙI THÙY TRANG – 21126549

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC BẢNG i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

BUỔI 1 LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ KIỂM TRA KẾT QUẢ LY TRÍCH 1

1.1.Vật liệu 1

1.1.1 Ly trích DNA bằng dịch trích SDS 1

1.1.2 Điện di tổng số 1

1.2 Phương pháp thực hiện 1

1.2.1 Điện di tổng số 1

1.2.2 Kiểm tra kết quả ly trích 4

1.2.2.1 Đo OD 4

1.2.2.2 Điện di tổng số 4

1.3 Kết quả 4

BUỔI 2 PCR PHÁT HIỆN GMO VÀ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR 6

2.1.Vật liệu 6

2.1.1 PCR 6

2.1.2 Điện di sản phẩm 6

2.2 Phương pháp tiến hành 6

2.2.1 PCR 6

2.2.2 Điện di sản phẩm PCR 7

2.3 Kết quả 7

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa chất ly trích DNA thực 1 Bảng 2.1 Thành phần PCR 6

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt PCR 7

ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Mẫu đậu nành 1

Hình 1.2 Sau khi thêm dịch 2

Hình 1.3 Sau khi thêm PCI 2

Hình 1.4 Sau khi ly tâm 3

Hình 1.5 Sau khi thêm CI 3

Hình 1.6 DNA thu được ở đáy tube 3

Hình 1.7 Kết quả đo OD 4

Hình 1.8 Kết quả điện di tổng số 5

Hình 2.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR 7

BUỔI 1 LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ KIỂM

TRA KẾT QUẢ LY TRÍCH

1.1 Vật liệu

Mẫu hạt đậu nành khô (số 3) được mua ở chợ nghi ngờ là GMO (thực vật chuyển gene) cần kiểm tra

1.1.1 Ly trích DNA bằng dịch trích SDS

Tris HCL pH 8 (1 M) 0,1 M 10 mL 10 mL Tris HCl pH 8 (1 M)

1.1.2 Điện di tổng số

Gel Agarose 1 %

Loadingdyte

Gel red

Thiết bị điện di

1.2 Phương pháp thực hiện

Bảng 1.1 Thành phần hóa chất ly trích DNA thực

vật

Hình 1.1 Mẫu đậu nành

2

1.2.1 Ly trích DNA bằng dịch trích SDS

Bước 1 Cho một lượng mẫu khoảng 0,05 g vào tube

Bước 2 Thêm 600 µL dịch trích vào tube, sử dụng chài nhựa nghiền mẫu

Bước 3 Sau khi nghiền nát mẫu, cho thêm 600 µL PCI vào và lắc mạnh

Bước 4 Tiến hành ly tâm 12000 vòng trong 5 phút Sau khi dụng dịch tách lớp hút

400 µL dịch nổi qua tube mới

Bước 5 Thêm 400 µL dung dịch CHCl3 và tube và lắc mạnh

Bước 6 Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút, thu dịch nổi sang tube mới

Hình 1.2 Sau khi thêm dịch

trích

Hình 1.3 Sau khi thêm PCI

Bước 7 Thêm 240 µL CI, ủ lạnh -300C trong vòng 20 phút

Bước 8 Sau khi ủ xong tiến hành ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, DNA sẽ lắng lạy dưới đáy tube và bỏ phần dịch nổi

Hình 1.4 Sau khi ly tâm

Hình 1.5 Sau khi thêm CI

Hình 1.6 DNA thu được ở đáy tube

4

Bước 9 Dùng 500 µL Ethanol 70% cho vào tube và ly tâm 10000 vòng 3 phút để rửa DNA (lặp lại 2 lần)

Bước 10 Loại bỏ hoàn toàn Ethanol, úp ngược tube phơi DNA trong vòng 5 - 10 phút

Bước 11 Thêm 30 µL TE buffer vào tube để hòa tan và bảo quản DNA

1.2.2 Kiểm tra kết quả ly trích

1.2.2.1 Đo OD

Tiến hành đo OD ở bước sóng 260 nm để kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trước khi điện di tổng số

Dựa vào kết quả đo OD có thể cho thấy:

• Nồng độ DNA trong dung dịch mẫu là 577,8 ng/L

• Tỉ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 chứng tỏ không bị tạp nhiễm

Từ kết quả này ta có thể thấy được quy trình ly trích đạt yêu cầu và có thể tiến hành điện di tổng số

1.2.2.2 Điện di tổng số

Bước 1 Hút 10 µL dung dịch hỗn hợp Loadingdyte + GelRed ra tấm ny long Bước 2 Hút 5 µL mẫu cho vào và mix đều hỗn hợp trên

Bước 3 Bơm cẩn thận vào miệng giếng để tránh lủng hoặc trào dịch ra ngoài Bước 4 Sau khi tất cả các mẫu được bơm vào, đậy nắp tiến hành điện di trong 30 phút với hiệu điện thế 100 V

1.3 Kết quả

Hình 1.7 Kết quả đo OD

Kết quả điện di cho thấy cho band sáng chứng tỏ trong dung dịch có chứa DNA đậu nành

Hình 1.8 Kết quả điện di tổng số

6

BUỔI 2 PCR PHÁT HIỆN GMO VÀ ĐIỆN DI SẢN

PHẨM PCR

2.1 Vật liệu

2.1.1 PCR

Máy luân nhiệt

Hóa chất PCR

Cặp Primer 35S-1 và 35S-2 :cặp mồi đặc hiệu phát hiện trình tự promotor 35S GMO và cho ra sản phẩm khuếch đại có kích thước 195bp

2.1.2 Điện di sản phẩm

Gel Agarose 1,2 %

Loadingdyte

Gel red

Ladder 1 kb

Đối chứng âm

Đối chứng dương

Thiết bị điện di

2.2 Phương pháp tiến hành

2.2.1 PCR

Bước 1 Tiến hành mix PCR Cho các thành phần của PCR (bảng 2) vào tube và mix đều Lưu ý DNA phải thêm vào sau cùng để tránh nhiễm chéo giữa các mẫu Bước 2 Cho các tube vào máy PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt Tổng thời gian PCR 2 tiếng 15 phút

Bảng 2.1 Thành phần PCR

2.2.2 Điện di sản phẩm PCR

Tiến hành điện di để kiểm tra sản phẩm Nếu sau khi điện di cho thấy band mục tiêu 195 bp chứng tỏ là mẫu GMO

Bước 1 Hút 10 µL dung dịch hỗn hợp Loadingdyte + GelRed ra tấm ny long

Bước 2 Hút 5 µL mẫu cho vào và mix đều hỗn hợp trên ( lặp lại với cả 2 đối chứng

âm dương)

Bước 3 Bơm cẩn thận vào miệng giếng để tránh lủng hoặc trào dịch ra ngoài Bước 4 Hút 10 µL GelRed + 5 µL Ladder mix đều và bơm cẩn thận vào giếng Bước 5 Sau khi tất cả các mẫu được bơm vào, đậy nắp tiến hành điện di trong 30 phút với hiệu điện thế 100 V

2.3 Kết quả

Hình 2.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR (L) Ladder

1kb; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Mẫu đậu nành

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt PCR

Chu trình nhiệt

8

Có thể thấy được không có sự xuất hiện band sáng ở vị trí giếng bơm mẫu Nhưng

so với kết quả của bạn khác cùng thực hiện mẫu đậu nành số 3 thì có sự xuất hiện band sáng mục tiêu

Có thể do nồng độ DNA quá cao (577,8 ng/L) nhưng không tiến hành pha loãng

khiến cho quá trình PCR bị ức chế và không khuếch đại được đoạn gene mục tiêu, cần tiến hành xem xét lại thao tác, pha loãng DNA để cho ra kết quả chính xác hơn

Từ đây có thể kết luận mẫu đậu nành trên là thực v