Cndt 2_Nguyễn Vương Huyền Trâm_21126213_ T2 Tiết 789.Pdf

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

TP Thủ Đức, 06/2024 Hướng dẫn khoa học

TS.PHẠM ĐỨC TOÀN

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN VƯƠNG HUYỀN TRÂM

21126213

1.3.Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Sản phẩm chuyển gen GMO 2

2.1.1 Khái niệm GMO 2

2.1.2 Quy trình tạo ra và đặc điểm sinh vật biến đổi gen 2

2.1.3 Những nghiên cứu về GMO và ứng dụng 3

2.2 Phương pháp kiểm tra GMO với promoter 35S 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7

3.2 Vật liệu và phương pháp 7

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 7

3.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất thí nghiệm 7

3.3 Quy trình thực hiện 8

3.3.1 Tách chiết DNA thực vật và điện di tổng số 8

3.3.2 Phản ứng PCR với primer cho vùng promoter 35S và điện di sản phẩm PCR 10

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GMO :Genetically modified organism PCR :Polymerase Chain Reaction SDS :Sodium Dodecyl Sulfate

PCI :Phenol: cloroform: isoamyl alcohol CI :Cloroform: isoamyl alcohol

TE :Tris-EDTA

TAE :Tris-acetate-EDTA

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt thực hiện PCR 11

Bảng 4.1 Kết quả đo OD mẫu sau khi tách chiết………12

v

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Các phương pháp phát hiện sinh vật biến đổi gen 5

Hình 3.1 5 mẫu thực phẩm tiến hành kiểm tra GMO……… 8

Hình 3.2 Mẫu được nghiền nhuyễn 8

Hình 3.3 Mẫu sau khi nghiền trong dung dịch SDS 9

Hình 4.1 Kết quả đo OD 12

Hình 4.2 Kết quả điện di tổng số 13

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 13

1.2 Mục tiêu

Nắm được quy trình cơ bản phát hiện GMO bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

Phát hiện và xác định được mẫu phân tích là GMO hay non-GMO dựa vào kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter và điện di sản phẩm

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA mẫu phân tích theo quy trình ly trích SDS và điện di tổng số mẫu

Nội dung 2: Thực hiện PCR với cặp primer đặc hiệu cho vùng trình tự promoter 35S Nội dung 3: Điện di sản phẩm PCR với gel Agarose 1,2% sử dụng leader 1kp

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sản phẩm chuyển gen GMO 2.1.1 Khái niệm GMO

Sinh vật biến đổi gen (GMO: Genetically modified organism) là sinh vật mà vật liệu di truyền của chúng đã được biến đổi theo những cách không xảy ra trong tự nhiên mà bằng các kỹ thuật chuyển nạp gen (Querci M và cs, 2004)

2.1.2 Quy trình tạo ra và đặc điểm sinh vật biến đổi gen

Sự biến đổi gen liên quan đến việc đưa vào hoặc bỏ đi những gen, khi những gen được đưa vào thường được lấy từ một loài khác gọi là hình thức biến đổi gen theo chiều ngang Trong tự nhiên, hiện tượng này cũng có thể xuất hiện vì một lý do nào đó, DNA ngoại lai thâm nhập qua màng tế bào Còn để biến đổi gen nhân tạo có thể đòi hỏi việc gắn gen vào một loài virus hoặc đơn thuần cấy ghép vật lý DNA ngoại lai vào nhân của một vật chủ đích bằng một loại kim nhỏ hoặc bằng một đoạn rất nhỏ được bắn bằng dụng cụ đặc biệt gọi là “súng bắn gen” (gene-cannon) Tuy nhiên, cũng có những phương pháp khác khai thác các dạng tự nhiên của chuyển đổi gen, thí dụ như khả năng của loài vi khuẩn thuộc chi Agrobacterum có thể chuyển vật liệu di truyền vào thực vật , hoặc khả năng của Lentivirus (một chi thuộc họ Retroviridae) để biến đổi gen vào các tế bào động vật Các Lentivirus này có thể mang một lượng đáng kể RNA virus vào trong DNA tế bào vật chủ và có khả năng duy nhất trong số các retrovirus để có thể gây nhiễm cho các tế bào không bị tách rời, vì vậy, chúng là một trong số những phương pháp lây nhiễm mang gen Các phân tử DNA trung gian được chuyển qua các màng tế bào nhờ súng bắn gen đặc biệt, xử lý hóa học hoặc bằng các tế bào biểu hiện dưới trường dòng điện Sau đó, những phân tử trung gian được chuyển vào các nhân tế bào để tiêm vào các nhiễm sắc thể của tế bào tiếp nhận

Đặc điểm : Để tiến hành biến đổi gen, sự tái tổ hợp và vật liệu mang gen cần được thiết lập, vật liệu tiến hành dự kiến để mang gen được đưa an toàn vào sinh vật đã lựa chọn và sắp đặt cho gen biểu hiện, nghĩa là sản xuất ra protein mà nó mã hóa Còn vật liệu mang, để bổ sung cho gen được chọn, sẽ kết hợp một lượng các phần tử DNA khác Điều này đòi hỏi có một phần tử đối chứng cần thiết để biểu hiện gen, còn một gen nữa được mã hóa để

3

kháng lại chất gây chết tế bào khác hoặc chất kháng sinh Để lựa chọn một tập hợp tế bào có chứa vật trung gian, chất kháng sinh được bổ sung Sau đó, những tế bào không biểu hiện gen kháng của vật trung gian được loại bỏ Những tế bào sống sót là cơ sở để phát triển thành những sinh vật biến đổi gen, trong đó toàn bộ tế bào của sinh vật này chứa đựng DNA vật trung gian đã hợp nhất và biểu hiện gen như mong muốn Ngoài ra, người ta có thể thêm bớt, sửa đổi, sắp xếp lại bộ gen khiến cho một loài sinh vật nào đó không bao giờ có thể bị nhiễm các loại bệnh hoặc kháng lại một loại chất kháng sinh

2.1.3 Những nghiên cứu về GMO và ứng dụng

o Những nghiên cứu :

Trong số vi sinh vật biến đổi gen được sử dụng, người ta đã tách, khuếch đại và khử

hoạt hóa gen ở vi khuẩn Pseudomonas siringae, sau đó cấy trở lại vi khuẩn tạo dòng chống

lại sự đóng băng tế bào thực vật Hoặc để tạo được vacxin viêm gan B, một trong những protein màng virus, kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg), chúng được tạo ra bởi các tế bào nấm men trong đó đã được cấy mã gen của HbsAg Cây trồng biến đổi gen được đưa vào sử dụng nhiều hơn Giống ngô biến đổi gen MON 810 được cho là giống có khả năng giảm được thiệt hại do sâu hại gây ra do hãng Mosanto đưa ra khắp thế giới Bản chất của

ngô biến đổi gen là do một gen từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis được cấy vào DNA

của MON810 đã cho phép giống ngô này tạo ra một protein gây hại cho những loài côn trùng ăn chúng, gen từ chủng vi khuẩn tạo ra độc tố Bt có độc tính đối với các loài sâu bướm hại trong đó có sâu đục ngô châu Âu Ngô biến đổi gen MON 809 là một trong số 25 cây trồng biến đổi gen đã được thương mại hóa từ năm 2011, được trồng ở Hoa Kỳ và

Canada từ năm 1997 Lúa vàng (Golden rice) biến đổi gen từ giống lúa thông thường Oryza

sativa, được tạo bởi công nghệ gen để tổng hợp beta-caroten (tiền thân của vitamin A) trong

những phần ăn được của lúa Cây bông biến đổi gen tạo ra được đánh giá là có triển vọng

hơn cả, đó là trường hợp chuyển gen mã hóa với độc tố BT (Bacillus thuringiensis) vào cây

bông có khả năng tạo ra thuốc trừ sâu tự nhiên trong mô tế bào chống lại các loài côn trùng gây hại

o Ứng dụng :

4

Làm thực phẩm : Ở Hoa Kỳ, có khoảng 40 loài thực vật biến đổi gen được chấp nhận

sử dụng như hàng hóa Trong số cây trồng sau khi được đưa vào sản xuất từ năm 1996, các giống đậu tương kháng cỏ dại đã chiếm gần 27%, ngô biến đổi gen chiếm khoảng 25% Năm 2011, các nhà khoa học Trung Quốc đã tạo ra được bò sữa biến đổi gen với các gen như người để tạo ra được sữa như ở người

Sử dụng làm thuốc chữa bệnh: Hóa chất trong thuốc lá gây hại cho sức khỏe, nhưng cây thuốc lá biến đổi gen có thể cung cấp loại kháng sinh chống virus gây bệnh dại Để làm được điều này, các nhà khoa học Anh đã gây đột biến gen của cây thuốc lá để chúng sản xuất một loại kháng sinh trong lá Loại kháng sinh này, được tạo nên bởi một số loại đường và protein, có khả năng ngăn chặn sự di chuyển của virus dại tới hệ thần kinh của người Thậm chí nó còn ngăn cản virus tiếp xúc với những dây thần kinh xung quanh vết cắn của động vật nhiễm bệnh dại

Chẩn đoán bệnh về gen ở con người : Chẩn đoán bệnh về gen nhắm tới các tế bào sinh dưỡng, được gọi là “Chẩn đoán bệnh về gen ở dạng phôi thai” và còn đang gây nhiều tranh cãi và dường như không chắc sẽ được phát triển trong tương lai gần Một số cơ sở nghiên cứu khoa học trên thế giới phát triển loài cá sọc biến đổi gen (có các sọc màu đỏ, xanh lá cây, vàng cam, xanh da trời và đỏ tía) với mục đích theo dõi ô nhiễm nước qua sự thay đổi màu sắc của chúng phụ thuộc vào các chất gây ô nhiễm và được sử dụng như một loại cảm biến

2.2 Phương pháp kiểm tra GMO với promoter 35S

Khái quát về một số phương pháp kiểm tra GMO hiện nay : Để đảm bảo truy xuất nguồn gốc GMO, một số chiến lược, được phân loại là gián tiếp (phương pháp dựa trên protein) hoặc trực tiếp (phương pháp dựa trên DNA), đã được phát triển để phát hiện GMO trong các mẫu thực phẩm/thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng công nghệ khác nhau Một số phương pháp hiện đại đang được phát triển bào gồm: khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng, phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu (ví dụ: điện di gel mao mạch PCR, microarray và Luminex), định lượng chính xác hơn các mục tiêu (PCR) hoặc mô tả đặc tính của GMO đã biết một phần (giải trình tự thế hệ tiếp theo -NGS)

Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm sẽ xác định trình tự DNA đã được đưa vào cây GMO , ngược lại với protein, DNA là 1 phân tử tương đối ổn định, do đó các đoạn DNA có thể được phân lập từ các sản phẩm đã được xử lý kỹ lưỡng và đủ nguyên vẹn để được khuếch đại bằng PCR Phản ứng chuỗi polymerase hay PCR được sử dụng để khuếch đại DNA thực phẩm nhằm xác định sự hiện diện hay vắng mặt của các trình tự biến đổi gen Việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn, khuếch đại, nhân số lượng

6

bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Sau đó, điện di trên gel sẽ kéo DNA đã khuếch đại qua ma trận gel agarose và tách các dải DNA có kích thước khác nhau tương ứng với các dấu hiệu đã được sửa đổi hoặc không được sửa đổi Kết quả điện di sản phẩm PCR sẽ giúp xác nhận nguồn gốc của vật liệu đánh giá (mẫu phân tích)

Bảng 2.1 Trình tự primer

35S-1 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’

195 bp 35S-2 5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’

7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8 giờ các ngày 20/5/2024 và 27/5/2024

Địa điểm: Phòng thí nghiệm RIBE 101, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực phẩm khô – hạt đậu nành thu mua từ thị trường

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu

Cặp primer đặc hiệu cho vùng promoter 35S

3.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất thí nghiệm

Dụng cụ: các tube, chày nghiền nhỏ, đầu tip, micropippet, giá đựng, cối, chày nghiền mẫu, dụng cụ đổ gel, ống đong

Thiết bị : tủ lạnh, bồn điện di, máy đo OD, máy PCR, máy ly tâm, lò vi sóng Hóa chất :

- Ly trích mẫu: dung dịch SDS, PCI, CI, Isopropanol, Ethanol 70o, TE

- Điện di tổng số và điện di sản phẩm PCR: Agarose, dung dịch đệm TAE 0,5X, leader 1kp, GelRed, loading dye

- Phản ứng PCR: Master mix, primer 35S-1, primer 35S-2, DNA mẫu, nước khử ion

Bảng 3.1 Hóa chất trong ly trích

Tris HCl pH 8 (1M) 0.1M 10ml 10ml Tris HCl pH 8 EDTA pH 8 (0.5M) 0.05M 10ml 10ml EDTA pH 8 (0.05M)

NaCl (5M) 0.1M 0.58g 2 ml NaCl (5M) SDS (10%) 1% 1g 10 ml SDS (10%)

Hình 3.1 5 mẫu thực phẩm tiến hành kiểm tra GMO (1) Bắp ăn; (2)

Bắp thức ăn gia súc; (3) Đậu nành – mẫu thực hiện thí nghiệm trong báo cáo; (4) Bắp chuyển gen kháng nấm; (5) Bắp tự nhiên

Hình 3.2 Mẫu được nghiền nhuyễn

9

Bước 2: Cho khoảng 0,05g mẫu trong túi vào tube Thêm 400 µl dịch trích SDS vào tube Dùng chày nghiền mẫu phá vỡ tế bào, thêm 200 µl dịch trích SDS còn lại vào hỗn hợp

Hình 3.3 Mẫu sau khi nghiền trong dung dịch SDS

Bước 3: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 4: Hút phần dịch nổi phía trên sang tube mới (ở thí nghiệm này thu được khoảng 300 µl)

Bước 5: Cho 1V PCI (phenol: cloroform: isoamyl alcohol 25:24:1) khoảng 300 µl vào dung dịch mix đều hỗn hợp, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 6: Hút dịch nổi sang tube mới, thêm 1V CI (cloroform: isoamyl alcohol 24:1) mix đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 7: Hút dịch nổi sang tube mới ( khoảng 200 µl), thêm 0.6V ( 120 µl ) dung dịch Isopropanol Tiến hành ủ ở -20oC trong 30 phút

Bước 8: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi phía trên

Bước 9: Thêm 500 µl dung dịch Ethanol 70o, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 3 phút Lặp lại bước 9

Bước 10: Phơi khô tube và thêm 50 µl dung dịch đêm TE ( pH 8 chứa RNAse) vào tube, bảo quản ở -20oC

10

Bước 11: Đo nồng độ mẫu bằng máy đo BioDrop Tiến hành rửa điện cực bằng nước 3 lần Hút 3 µl dung dịch blank để chuẩn máy về nồng độ 0.00 trước khi đo Hút 3 µl dung dịch mẫu đo nồng độ và tiến hành ghi nhận kết quả Trong quá trình thực hiện cần chỉnh đơn vị máy từ µg sang ng và không chạm vào điện cực

Thực hiện tất cả các bước trên cho cả mẫu đối chứng âm và đối chứng dương o Điện di tổng số

Bước 12: Chuẩn bị gel Agarose 0,8% với dung dịch TAE 0,5X

Bước 13: Hút dung dịch loading dye và mẫu số 3 sau khi ly trích theo tỷ lệ 10 µl:5 µl Mix đều và bơm 15 µl hỗn hợp vào giếng Che chắn bồn điện di Sau 20 -25 phút tiến hành chụp gel dưới tia UV và ghi nhận kết quả

3.3.2 Phản ứng PCR với primer cho vùng promoter 35S và điện di sản phẩm PCR

DNA mẫu X 50ng/ µl 1

11

Bước 2: Cho tube chứa hỗn hợp trên vào máy PCR và tiến hành cài đặt máy theo các thông số như bảng sau:

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt thực hiện PCR

Tiền biến tính 95oC 5 phút 1 Biến tính 95oC 30 giây

40 Bắt cặp 60oC 30 giây

Kéo dài 72oC 30 giây

Hậu kéo dài 72oC 7 phút 1

Bước 5: Hút dung dịch GelRed và leader lần lượt theo tỷ lệ 10 µl:5 µl Mix đều hỗn hợp và bơm vào giếng đầu tiên

Bước 6: Che chắn bồn điện di Sau 35 - 40 phút tiến hành chụp gel dưới tia UV và ghi nhận kết quả

13 o Kết quả điện di tổng số

14

Qua kết quả điện di thu được nhận thấy có sự xuất hiện rõ của band có kích thước gần 200bp không có sự xuất hiện của các band phụ trong giếng Ở đối chứng dương có sự xuất hiện của band phụ thứ 2

4.2 Thảo luận

o Đo OD

Từ bảng 4.1 giá trị thu được sau khi đo OD nhận thấy nồng độ có trong dung dịch sau ly trích khá cao 364 ng/µl, giá trị này chứng tỏ nồng độ DNA có trong dung dịch sau khi tách chiết là đủ cho quá trình thực hiện các phản ứng tiếp theo, thu được thành công lượng DNA cần thiết Tuy nhiên, giá trị A260/A280 = 2.094 >2.0, chất lượng DNA thu được và độ tinh khiết còn chưa đạt mức tốt nhất

o Điện di tổng số

Từ hình 4.2 cho thấy kết quả điện di tổng số mẫu có sự xuất hiện của band mờ hơn so với band của các mẫu khác, có sự xuất hiện 2 band phụ có kích thước ngắn hơn Do trong quá trình thao tác còn xảy ra sai sót chưa thực hiện cẩn thận, hút còn dư một phần hỗn hợp loading dye và mẫu sau khi mix dẫn đến lượng hỗn hợp bơm vào giếng ít hơn so với dự kiến làm band mẫu sau khi điện di bị mờ Bên cạnh đó sự xuất hiện của 2 band phụ khác trong giếng chính là 2 tiểu đơn vị của lượng RNA còn sót lại trong mẫu sau tách chiết

o Điện di sản phẩm sau khi PCR với cặp primer đặc hiệu

Từ hình 4.3 nhận thấy có sự xuất hiện rõ ràng của band có kích thước gần 200bp không có sự xuất hiện của các band phụ trong giếng Kết quả trên cho thấy mẫu số 3 – mẫu đậu nành được đem đi kiểm tra là sản phẩm GMO, chính vì thế khi thực hiện phản ứng PCR với cặp primer đặc hiệu có kích thước 195bp cho vùng promoter 35S– vùng được sử dụng rất rộng rãi để điều khiển các gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen sẽ bắt cặp khuếch đại và khi điện di sẽ tách thành đoạn có kích thước khoảng gần 200bp Kết quả tương ứng với đối chứng dương ở giếng thứ 3 trên gel Ở đối chứng dương ta nhận thấy có sự xuất hiện của band phụ thứ 2 có kích thước khác là do mẫu bắp GMO chuyển gen kháng nấm có thể được chuyển thêm 1 gen khác dẫn đến xuất hiện band phụ