Cndt2-Bàng Đức Quân-21126476-Thứ 2-789.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện :BÀNG ĐỨC QUÂN Mã số sinh viên :21126476

Niên khóa :2021-2025

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS PHẠM ĐỨC TOÀN BÀNG ĐỨC QUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2024

Phòng cháy chữa cháy trong phòng thí nghiệm: các phương pháp bảo vệ bản thân khi có cháy xảy ra, trách nhiệm của mỗi cá nhân trong phòng thí nghiệm đối với phòng tránh cháy nổ và khi cháy nổ xảy ra

1.2.Phương pháp thực hiện 1.2.1 Li trích DNA

Để li trích DNA từ mẫu thực vật cần tiến hành qui trình sau:

Bước 1: Nghiền mẫu hạt bắp đã chọn, nghiền cho tới khi hạt thật mịn Bước 2: Cho vào ống tuýt 0,05 g mẫu bắp vừa nghiền

Bước 3: Thêm vào ống tuýt 600 μL dịch trích SDS và dùng dụng cụ hòa tan mẫu với dung dịch

Bước 4: Thêm 600 μL dung dịch Phenol/ CHCl3/ Isoamyl (25:24:1) vào ống tuýt, ly tâm dung dịch ở 10000 v/p trong 5 phút

Bước 5: Hút 400 μL dịch nổi phía trên vào ống tuýt mới, thêm 400 μL

Hình 1.1 Sau khi ly tâm và hút dịch nổi chuyển qua tuýp mới

Bước 6: Thêm 400 μL dung dịch Chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm dung dịch ở 10000 v/p trong 5 phút

Hình 1.2 Sau khi thêm dung dịch Chloroform/ isoamyl alcohol và ly tâm

Bước 7: Sau khi li tâm hút 300 μL dịch nổi sang ống tuýt mới, thêm 180 μL dung dịch Isopropanol, ủ ở - 20°C trong 30 phút

Bước 8: Ống tuýt sau khi ủ sẽ được ly tâm ở 10000 v/p trong 10 phút

Bước 9: Bỏ dịch nổi phía trên, thêm 400 μL ethanol 70°, ly tâm ở 10000 v/p trong 3 phút Bước 10: Bỏ dịch nổi, phơi khô và thêm 30 μL dung dịch TE, bảo quản ở - 20°C

1.2.2 Điện di tổng số kiểm tra DNA

Mục đích của việc điện di DNA tổng số là nhằm xác định sự hiện diện của DNA trong

3

mẫu bắp ban đầu sau khi ly trích Việc điện di được tiến hành trên gell agarose Ta sử dụng gel red+loading dye để muộn màu DNA và kéo DNA xuống tránh trường hợp bị trôi ra ngoài gây ảnh hưởng đến kết quả do loading dye có tỷ trọng lớn Tỷ lệ gel red+ loading dye/ DNA (10:5)

1.2.3.Đo OD kiểm tra hàm lượng và độ tinh khiết của DNA trông mẫu

Sau khi chạy điên di tổng số thì mẫu sẻ được đem đi đo mật độ quang để kiểm tra hàm lượng DNA có trong mẫu ngoài ra từ độ hấp thụ quang của mẫu ta cũng có thể biết được DNA thu được độ tinh khiết của mẫu dung dịch ly trích Ta sử dụng mãy BioDrop để thực hiện quá trình kiểm tra

1.3 Kết quả

Hình 1.3 Kết quả sau khi chạy điện di tổng số trên gell agarose

Từ hình ảnh kết quẩ điện di cho thấy thì ta không ghi nhận được band rõ ràng mà chỉ thấy xuất hiện một vệt kéo dài không rõ Điều này có thể do quá trình hút mẫu cho vào giếng không trộn đều làm cho lượng DNA nạp vào giếng không đủ để hiện lên band rõ ràng Dẫn đến chưa thể kết luận được trong mẫu có sự hiện diện của DNA trong dịch ly trích hay không

Sau đó tao đưa dịch ly trích mẫu đi đo OD trên máy BioDrop để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu dung dịch ly trích cũng như xem thử mẫu có chứa DNA trong đó hay không Sau khi đo thì ta thu được đồ thị biểu hiện trong mẫu dung dịch ly trích quả thực có chứa một

28-4 8-4

)

lượng DNA, nhưng mẫu có độ tinh khiết thấp nghi là bị tạp nhiễm RNA Nồng độ DNA ghi nhận được trong mẫu là 80,49 ng/μg

Hình 1.4 Kết quả sau khi đo OD

Kết quả do OD đã giải thích cho kết quả của quá trình điện di Nồng độ thấp và thao táy tay trong lúc thực hiện không đều là những nguyên nhân dẫn đến khi điện di tổng số ta không ghi nhận được band của DNA

Ta có tỷ số OD260/OD280= 1,851 Quá trình tinh sạch DNA với nồng độ 80,49 ng/μL, nồng độ DNA có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

5

2.2 Phương pháp thực hiện

2.2.1 Khuếch đại sản phẩm DNA tổng số với mồi GMO

Tiến hành khuếch đại DNA đã li trích được ở trên, vì nồng độ DNA đo được là 80,49 ng/μg nên không cần pha loãng mẫu Các bước tiến hành bao gồm:

Bước 1: Pha dung dịch master mix gồm 6,25 μL My Taq mix 1X, 0,25 μL Primer R 10 μM, 0,25 μL Primer F 10 μM, 4,75 μL nước khử ion Mix đều hỗn hợp

Bước 2: Thêm 1 μL dung dịch DNA vào ống tuýt chứa Master mix

Bước 3: Chạy PCR trong 40 chu kì biến tính, bắt cặp, kéo dài với primer GMO

Bảng 2.1 Thông số chu trình nhiệt

Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kì Tiền biến tính 95 5 phút 1

Biến tính 95 30 giây 40 Gắn mồi 60 30 giây

Kéo dài 72 30 giây

Hậu kéo dài 72 7 phút 1 Bảo quản mẫu 4 1

2.2.2 Chạy điện di sản phẩm khuếch đại PCR

Sau khi đoạn gen mục tiêu đã được khuếch đại, tiến hành chạy điện di sản phẩm PCR Các bước tiến hành điện di giống như chạy điện di kiểm tra DNA tổng số ở bài trước Ngoài ra cần có thêm giếng đối chứng âm và giếng đối chứng dương nhằm xác định mẫu có chứa gen GMO không Với giếng đối chứng âm sẽ tiến hành chạy mà không có DNA, đối chứng dương sẽ chạy với mẫu chắc chắn có GMO

2.3 Kết quả

Hình 2.1 Kết quả điện di kiểm tra gen GMO

Kết quả điện di cho thấy cho ra band chứng tỏ mẫu kiểm tra(mẫu số 4) có chứa gen GMO vì khi so sánh với ladder cho thấy band nằm trong khoảng 200bp

28-4 8-4

)