Cndt2-Nguyễn Dương Phương Yến-21126593-T2-3.Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TP Thủ Đức, 06/2024

1.2.Phương Pháp xác định thực phẩm là GMO hoặc Non-GMO 2

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

2.1.Vật liệu và thiết bị 3

2.2.Quy trình phát hiện thực phẩm GMO 3

2.2.1.Ly trích DNA 3

2.3.Điện di mẫu DNA sau khi ly trích 6

2.3.1.Quy trình chung cho quá trình điện di DNA 6

2.3.2.Kết quả sau khi điện di 7

2.4.Đo hàm lượng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop 8

2.5.PCR khuếch đại vùng trình tự 35S phát hiện thực vật GMO 8

2.5.1.Kết quả điện di để phát hiện GMO: 9

2.6.Kết luận 9

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Cặp primer chuyên biệt cho GMO 9 Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR 9

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vật liệu bắp 3

Hình 2.2 Mẫu sau khi nghiền cho vào dung dịch đệm 4

Hình 2.3 Dịch nổi sau ly tâm 4

Hình 2.4 Sau ly tâm 4

Hình 2.5 Dịch chứa DNA 5

Hình 2.6 DNA kết tủa 5

Hình 3.1 Kết quả điện di giếng 29 mẫu 5 8

Hình 3.2 Thông số và biểu đồ khi đo OD 8

Hình 3.4 Kết quả điện di khuếch đại vùng 35s 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.Tìm hiểu về GMO

Sinh vật biến đổi gen (GMO), sinh vật có bộ gen đã được thiết kế trong phòng thí nghiệm để tạo điều kiện cho sự phát triển của các đặc điểm sinh lý mong muốn hoặc tạo ra các sản phẩm sinh học mong muốn Trong chăn nuôi gia súc, trồng trọt thông thường và thậm chí cả nhân giống vật nuôi, từ lâu đã là phương pháp nhân giống chọn lọc cá thể của một giống loài để sản xuất ra đời con cháu mang những đặc tính mong muốn Tuy nhiên, trong chỉnh sửa gen, các công nghệ di truyền tái tổ hợp được sử dụng để tạo ra các sinh vật có bộ gen đã bị thay đổi chính xác ở cấp độ phân tử, thường là bao gồm các gen từ các loài sinh vật không liên quan, mã hóa các tính trạng không dễ dàng có được thông qua nhân giống chọn lọc thông thường GMO là từ viết tắt của “Genetically Modified Organism” hay còn gọi là sinh vật biến đổi gen Mặt khác, trong GMO bao gồm cả thực vật, động vật, vi sinh vật đã được lai tạo dựa vào kỹ thuật di truyền hoặc công nghệ chuyển gen Nhằm tạo ra các sản phẩm khác biệt so với các sản phẩm tự nhiên trước kia

Sự ra đời của thực phẩm biến đổi gen (GMO) nhằm giải quyết vân đề sâu bệnh ở cây trồng và mong muốn của người dùng Bởi khi trồng giống biến đổi gen sẽ có khả năng chống chịu một số loài sâu bệnh hại ở cây trồng Đồng thời, giúp cây trồng sinh trưởng tốt hơn và bảo quản được lâu hơn Ngoài ra, các giống cây trồng được biến đổi gen GMO, sẽ tạo ra nhiều sản phẩm có màu sắc tươi tắn hơn; bắt mắt hơn và thời gian sử dụng được lâu hơn Cho nên, nhưng sản phẩm biến đổi gen GMO được sử dụng cho mục đích thương mại Mang lại giá trị kinh tế khá cao cho xuất – nhập khẩu nông sản Một số lợi ích của cây trồng biến đổi gen:

Đối với người nông dân: Tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng thuốc trừ sâu, kháng sâu bệnh hại, từ đó giúp giảm chi phí 60%-90% và dễ thương mại hóa hơn trên thị trường với lợi nhuận cao hơn 114% so với cây truyền thống (Theo ngân hàng phát triển Châu Phi)

Đối với người tiêu dùng: Hạn chế thực phẩm chứa quá nhiều thuốc trừ sâu, giá rẻ hơn,

tăng hương vị sản phẩm

Một số hạn chế của cây trồng biến đổi gen:

Do có khả năng kháng thuốc diệt cỏ, thời gian dài các loại cỏ sẽ bị tạp nhiễm nguồn gen và trở nên kháng thuốc, vì vậy cỏ sẽ khó tiêu diệt hơn Giảm hiệu quả của thuốc trừ sâu khi sâu bệnh tấn công cây trồng Mối lo ngại về môi trường

Cho đến nay, vẫn có nhiều ý kiến đồng tình và phản đổi việc trồng và sư dung cây GMO, tại Việt Nam hiên tại đa cho phép trồng các giống Ngô GMO để làm thức ăn gia súc,vì nó không tác động trực tiếp lên con ngươi.Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra nhưng tác dung phu về lâu dài như bị dị ứng,kháng kháng sinh,ung thư,rối loạn sinh sản, ảnh hương đến hệ thân kinh, và ột số bệnh kháng nguy hiểm như ung thư,…Các sinh vật biến đổi gen (GMOs) được sản xuất thông qua các công nghệ di truyền đã trở thành một phần của cuộc sống hàng ngày, tác động đến xã hội thông qua nông nghiệp, y học, nghiên cứu và quản lý môi trường Tuy nhiên, trong khi GMO đã mang lại lợi ích cho xã hội loài người theo nhiều cách, một số bất cập vẫn tồn tại; do đó, việc sản xuất GMO vẫn là một chủ đề gây tranh cãi ở nhiều nơi trên thế giới

1.2.Phương Pháp xác định thực phẩm là GMO hoặc Non-GMO

Kiểm định thực phẩm biến đổi gen cần được thực hiện thường xuyên vì các sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen có thể vô tình được trộn lẫn với thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen Nói cách khác, sự tồn tại của sinh vật biến đổi gen cần phải được kiểm chứng trong toàn bộ chuỗi cung ứng để các sinh vật này không vô tình xâm nhập vào quá trình sản xuât thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen Promoter 35S từ CaMV là nhân tố điều hòa khơi đầu phiên mã, dùng để biểu hiện gen chuyển, thường được sử dụng trong thực vật biến đổi gen (Genetically modified organism, GMO) được phê duyệt bởi Liên minh châu Âu (EU), thực vật tự nhiên không có trình tự này CaMV P-35S được sử dụng rộng rãi trong quá trình sàng lọc vật liệu chuyển gen trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và dược phẩm

Quy trình xét nghiệm cơ bản được thực hiện với 3 bước như sau: Bước 1: Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA

Bước 2: Nhân bản vùng trình tự muc tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR

Bước 3: Phân tích kết quả

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị

Các dụng cụ cần và đủ cho phản ứng PCR và điện di như :

Mẫu cần đánh giá là mẫu số 05, mẫu bắp thương mại hóa cho người sử dụng

Đối với phản ứng PCR cần có: mồi 35s( Xuôi và ngược), Master mix DNA khuôn mẫu (sau khi ly trích) và khuyếch dại trên máy PCR trong vòng 2 giờ

Đối với điện di mẫu trước và sau khi PCR cần có: Bồn điện di, micropipet, tube, dung dịch đệm, gel agarose, Gel Red, Loading dye và một số hóa chất dùng trong ly trích DNA

Hình 2.1 Vật liệu bắp

2.2 Quy trình phát hiện thực phẩm GMO 2.2.1 Ly trích DNA

Bước 1: Lấy 0,05g mẫu cho vào 600ml dịch trích

Hình 2.2 Mẫu sau khi nghiền cho vào dung dịch đệm

Bước 2: Ly tâm 10000 vòng trong 5 phút, hút dịch nổi bỏ sang tube khác

Hình 2.3 Dịch nổi sau ly tâm

Bước 3: Cho 1V PCI trộn đều ly tâm 10000 vòng trong 5 phút hút dịch nổi bỏ vào

tube mới

Hình 2.4 Sau khi ly tâm

Bước 4: Thêm 1V CI trộn đều ly tâm 10000 vòng trong 5 phút hút dịch nổi sang tube

mới thêm 0,6V iso propanol ủ ở 20˚C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, bỏ dịch nổi

Hình 2.5 Dịch chứa DNA

Bước 5: Thêm 500ml Ethanol 70˚, ly tâm 10000 vòng trong 3 phút ( lập lại bước 5) Bước 6: Pha thêm 50ml TE vào bảo quản - 20˚C

Hình 2.6 DNA kết tủa

Công dụng của PCI trong ly trích DNA:

Phenol- nói chính xác đây là chât đệm phenol bao hòa, có chứa 72% phenol và 28% nước, phenol bao hòa trong đệm có tỉ trọng cao hơn nước chút ít Vì phenol là một axit yếu, nên dung dịch phenol mà chúng ta sử dụng phải được cân bằng với đệm nhằm đưa pH về giá trị mong muốn, cu thể là pH axit trong trường hợp tách chiết RNA, khi pH của dung dịch có tính bazơ yếu thì chúng sẽ được sử dụng để tách chiết DNA Ngoài một lượng nước hòa tan vào phenol, thì cũng có một lượng phenol nhất định hòa tan vào trong nước, ở trạng thái cân bằng pha nước sẽ có chứa khoảng 7% phenol

àLượng phenol tan trong nước này giúp biến tính protein trong pha lỏng

Phenol/Chloroform : đây là hỗn hợp đệm – phenol và chloroform bảo hòa, thường sử dụng với tỷ lệ 25:24 cho tinh sạch DNA và đôi khi là ở tỉ lệ khác cho tinh sạch RNA

Isoamyl alcohol đôi khi được bổ sung vào với vai trò chống tạo bọt, tuy nhiên nó thường được coi như một chât phụ gia trơ không bắt buộc

Dung dịch Phenol/Chloroform thường được sử dụng thay thế cho dung dịch phenol bảo hòa vì 2 lí do: Trọng lượng của phenol bảo hòa chỉ cao hơn trọng lượng của nước một chút, do đó, nếu pha lỏng của bạn có chứa muối bao hòa hoặc các chât hòa tan khác, trọng lượng của pha này có thể tăng lên, khi đó có thể thành phần các dịch trong ống se bị đảo ngược, khi đó pha lỏng của bạn se ơ dưới lớp phenol chứ không phải ơ trên Trong pha lỏng bao hào luôn chứa 7% Phenol,nếu không loại bỏ hoàn toàn được phenol nó se ảnh hương đến các enzyme hoặc các DNA gắn với protein, vì bản chât phenol luôn phá hũy protein

Đẩy pha lỏng (dịch cần hút sang tube mới) lên bề mặt nổi

Chloroform có tỉ trọng nặng hơn nước nhiều, do đó việc bổ sung Chloroform vào pha hưu cơ se làm tăng toàn bộ trọng lượng của pha đó, giúp ngăn sự đảo pha,giúp phân lớp rõ ràng hơn và dễ thao tác hút dịch sang tube mới hơn.Hổ trợ loại phenol

àTránh sự lẫn tạp không mong muốn giưa các phân lớp

Không sử dụng dung dịch phenol hay phenol/chloroform nếu dung dịch đa chuyển sang màu hồng Nguyên nhân là do xuất hiện quá trình oxi hóa đa biến dung dịch này thành màu hồng/nâu và hợp chất này sẽ làm đứt gãy (nick) DNA và làm phân hủy RNA Hầu hết các chai phenol được bán dưới dạng thương phẩm đều có chứa chất chống oxi hóa Phenol trong môi trường pH axit có khả năng chống lại được sự oxi hóa Tuy nhiên việc chuyển phenol bao hòa (thường từ bình tối màu) sang một chai sạch hoặc một ống sạch để kiểm tra trước khi tách chiết luôn là điều nên làm

2.3 Điện di mẫu DNA sau khi ly trích

2.3.1 Quy trình chung cho quá trình điện di DNA Bước 1:Thu nhận vật liệu di truyền DNA đang cần điện di Bước 2:Chuẩn bị gel Agarose

Agarose là một loại polysaccharide tự nhiên được chiết tư tảo biển Gel agarose sư dung trong điện di thương ơ nồng độ 0.5 ~ 2%, tùy vào kích thước DNA cần phân tách Khi đổ gel agarose, một chiếc lược se được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel đa đông đặc để tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào

Pha 20ml dung dịch Gel agarose 1% pha tư 0,2g agarose và 20ml TBE 0,5X Đun trong lò vi sóng sau đó đợi hổn hợp gel tương đối nguội lại,sơ vào có cảm giác hơi âm,tiến hành rót vào khay và đợi 30p để gel đặc lại thành mảng

Lưu ý:Không nên để gel quá nguội có thể gây nên tình trạng vón cuc và miếng gel khi đem đi điện di se ảnh hương đến kết quả không mong muốn

Mix 5 µL DNA và 15 µL thuốc nhuộm(Tỉ lệ 1 gel red:0,5 loading die) Bơm hỗn hợp vào giếng.Điện đi 100v -25p

Bước 3:Chạy điện di trên gel

Miếng gel agarose được đặt trong bồn điện di, chứa dung dịch đệm (buffer) dẫn điện và ổn định pH, thương là Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc TrisBorate-EDTA (TBE) Mẫu DNA được pha với dung dịch nạp mẫu (loading dye) nhằm giưmẫu chìm trong giếng và cung câp chỉ thị màu để nhận biết sự điện di

Bước 4: Quan sát DNA sau khi điện di và đưa ra kết luận

Cần phải nhuộm gel để quan sát do DNA “vô hình” với mắt thương, phổ

biến nhât là nhuộm bằng hóa chất huỳnh quang, chẳng hạn như Ethidium Bromide (EtBr) Tùy vào loại hóa chất nhuộm huỳnh quang được sử dụng, có thể bổ sung chúng vào agarose trước khi đổ gel hoặc sau khi chạy điện di để nhuộm

Sau khi điện di và nhuộm gel xong, có thể thực hiện ghi nhận hình ảnh DNA thông qua hệ thống đọc gel (gel document system) hay còn gọi là hệ thống chup ảnh gel Hệ thống đọc gel gồm nguồn chiếu sáng (illumination source), bộ lọc (filter) để loại bỏ ánh sáng nền và camera để ghi nhận hình ảnh, đôi khi còn tích hợp PC và trang bị màn hình cảm ứng

2.3.2 Kết quả sau khi điện di

Hình 3.1 Kết quả điện di giếng 29 mẫu 5

35S-1 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’ 195bp (Hurst et al.,1999)

Tổng thể tích12.5

Cho các thành phần (Theo bảng 1) vào tube, lưu ý votex thật kĩ, sau đó tiến hành chu trình phản ứng khuyếch đại (Theo bảng 2) diễn ra trong máy PCR

2.5.1 Kết quả điện di để phát hiện GMO:

Hình 3.4 Kết quả điện di khuếch đại vùng 35s

2.6 Kết luận

Mẫu DNA từ buổi thứ nhất được trữ mẫu và tiến hành phản ứng khuyếch đại với mồi đặc hiệu để khuyếch đại vùng 35S, đây là vùng có tính bảo tồn cao và nó đóng vai

trò là yếu tố để sàng lọc các giống biến đổi gen được các nhà nghiên cứu khoa học gắn vào có chủ đích, để nhận biết các chủng GMO

Kết quả điện di bị nhiễm thang chuẩn do quá trình thao tác không thể đưa ra kết luận mẫu số 05 không phải giống bắp GMO

Mặt khác kết quả điện di có trường hợp ra band ở mẫu Non-GMO rất có thể khi trồng ngoài tự nhiên, cây Non-GMO bị lai tạp với cây GMO nhờ vào một số tác nhân như côn trùng, gió, giao phối gần Trong quá trình thao tác, cần tránh bơm mẫu bị tràn ra khỏi giếng để tránh kết quả ảnh hưởng đến các các giếng âm tính Trang bị áo blouse, găng tay, khẩu trang để tránh nguy cơ tạp nhiễm mẫu DNA đang khảo sát