nghiên cứu điều chế và đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao chiết xuất từ lá đàn hương trắng

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của đàn hương trắng,tuy nhiên cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để xây dựngquy trình chiết xuất và ngh

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:1 TS NGÔ KIẾN ĐỨC2 TS LÊ MINH QUÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫnkhoa học của TS Ngô Kiến Đức và TS Lê Minh Quân Kết quả và số liệu trong luậnvăn này là trung thực và chưa từng công bố ở bất kỳ nghiên cứu khoa học nào trước đây.

Tác giả luận văn

Đàng Ngọc Lam Bình

TÓM TẮT

Luận văn thạc sĩ – khóa: 2021 – 2023

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốcMã số: 8720202

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾTCỦA CAO CHIẾT XUẤT TỪ LÁ ĐÀN HƯƠNG TRẮNG

Đàng Ngọc Lam Bình

Người hướng dẫn khoa học: TS Ngô Kiến ĐứcTS Lê Minh QuânĐặt vấn đề

Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong phòng và chữa bệnhngày càng gia tăng Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và

đa dạng, nhiều loài có giá trị làm thuốc cao Đàn hương trắng (Santalum album L.) là

một loài cây đa tác dụng, có giá trị kinh tế rất cao và được đánh giá là cây hương liệusiêu hạng Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của đàn hương trắng,tuy nhiên cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để xây dựngquy trình chiết xuất và nghiên cứu hoạt tính sinh học của cao đàn hương trắng Do đó,đề tài “Nghiên cứu điều chế và đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao chiết xuất từlá đàn hương trắng” đã được thực hiện nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguồn dượcliệu, tối ưu hóa quy trình chiết, tiêu chuẩn hóa và đánh giá tác dụng hạ đường huyết củacao định chuẩn chiết từ quy trình này.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Lá đàn hương trắng được thu hái tại tỉnh Đắk Lắk vào tháng 7 năm 2022.

Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin Xây dựng tiêuchuẩn cơ sở cho lá đàn hương trắng Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và xây dựng tiêuchuẩn cơ sở cho cao định chuẩn với tiêu chí: cảm quan, độ ẩm, kim loại nặng, giới hạn

nhiễm khuẩn, định tính, định lượng Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng hạ đường huyếtcủa cao định chuẩn chứa vitexin và isovitexin trên mô hình động vật.

Kết quả

Quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin trong lá và cao định chuẩnchiết xuất từ lá đàn hương trắng đạt các tiêu chuẩn thẩm định đã đề ra Tiêu chuẩn cơ sởcho dược liệu lá đàn hương trắng đã được xây dựng Quy trình chiết tối ưu: phương phápđun hồi lưu, 2 lần chiết, nhiệt độ chiết là 66 oC, thời gian chiết 173 phút, nồng độ ethanol67 %, tỷ lệ dung môi/dược liệu 33 ml/g Cao định chuẩn được xây dựng tiêu chuẩn cơsở với các tiêu chí cảm quan, độ ẩm, kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính,định lượng Xác định được liều an toàn tối đa có thể cho uống của cao Liều cho uốngcao 1 g/kg và 2 g/kg có thể cải thiện trọng lượng và nồng độ glucose trong máu của chuộtmắc bệnh tiểu đường.

Kết luận

Đề tài đã định lượng hoạt chất chính trong lá đàn hương trắng, tối ưu hóa quy trìnhchiết, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho lá và cao định chuẩn chiết xuất từ lá đàn hươngtrắng, đánh giá độc tính cấp và tác dụng hạ đường huyết của cao trên mô hình động vật.

Từ khóa: Đàn hương trắng, vitexin, isovitexin, tối ưu hóa, hạ đường huyết.

Master’s degree - Academic course: 2021 – 2023Speciality: Pharmaceutical technology and Pharmaceutics

Speciality code: 8720202

FORMULATION AND EVALUATION OF HYPOGLYCEMIC ACTIVITY OF

EXTRACT FROM SANTALUM ALBUM LEAVES

Dang Ngoc Lam Binh

Supervisor: Kien Duc Ngo, Ph.DMinh Quan Le, Ph.DIntroduction

Santalum album L., is a mid-sized evergreen tree, has very high economic value

and is considered a high-quality aromatic plant There were reports about the biological

activities of the extract of Santalum album in foreign documents, which can be applied

to support treatment and health improvement However, there has been no research inVietnam conducted to develop an extraction process and aim to produce products fromthe extract Thus, the study of “Formulation and evaluation of hypoglycemic activity of

extract from Santalum album leaves” was conducted.

Materials and methods

Santalum album leaves were collected in Dak Lak in July 2022.

Validation of an HPLC method for simultaneous quantitation of vitexin andisovitexin Develop basis standards for sandalwood leaves Optimization of extractionprocess and develop quality standards for quantified extract Assessment of acutetoxicity and hypoglycemic effects on animal models.

The quantitative method for vitexin and isovitexin by HPLC were met therequirements for specificity, repeatability, accuracy and linearity Basis standards ofsandalwood leaves was determined Optimal extraction process: reflux method, two

extractions, extraction temperature (66 oC), extraction time (173 minutes), ethanolconcentration (67 %), solid:liquid ratio (1:33) The quality standards of quantified extracthave been established Acute toxicity was evaluated Oral doses of 1 g/kg and 2 g/kgimprove the weight and blood glucose concentration of diabetic mice.

The thesis quantifies the main activity in Santalum album, optimizes the extractionprocess, establishes quality standards for leaves and quantified extract from sandalwoodleaves, assessment of acute toxicity and hypoglycemic effects on animals.

Keywords: Santalum album L., vitexin, isovitexin, optimized, hypoglycemic.

1.4.Nghiên cứu tác động hạ đường huyết 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin 20

2.3.Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào 24

2.4.Nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao định chuẩn lá đàn hương trắng272.5.Tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn chứa vitexin và isovitexin 30

2.6.Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao định chuẩn lá đàn hương trắng trên môhình động vật 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 34

3.1.Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin 34

3.2.Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào 43

3.3.Nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao định chuẩn lá đàn hươngtrắng 48

3.4.Tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn chứa vitexin và isovitexin 59

3.5.Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao định chuẩn lá đàn hương trắng trên môhình động vật 61

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 66

4.1.Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin 66

4.2.Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào 67

4.3.Nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao định chuẩn lá đàn hươngtrắng 68

4.4.Tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn chứa vitexin và isovitexin 69

4.5.Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao định chuẩn lá đàn hương trắng trên môhình động vật 70

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

5.1.Kết luận 72

5.2.Kiến nghị 72TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Giải nghĩa

AP8CG Apigenin 8-C-glucosid

CMC Carboxy methyl cellulose

CYP3A Cytochrome P450 3A

DAD Detector Diod Array

DMSO Dimethyl sulfoxid

GABA Gamma-aminobutyric acid

HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan

HPLC High – Performance LiquidChromatography

HPTLC High – Performance Thin LayerChromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HSA Human Serum Albumin Albumin huyết tương người

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

ROS Reactive oxygen species Gốc tự do

SKLM Sắc ký lớp mỏngSTZ Streptozotocin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng vitexin và isovitexin 12

Bảng 1.2 Một số mô hình động vật đái tháo đường di truyền 18

Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.3 Thời gian và tỷ lệ pha động 21

Bảng 2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong quá trình chiết xuất 27

Bảng 2.5 Khai báo các biến của mô hình tối ưu hóa quy trình chiết xuất 28

Bảng 2.6 Thiết kế mô hình thực nghiệm tối ưu hóa quy trình chiết xuất 29

Bảng 2.7 Các chỉ tiêu chất lượng của cao định chuẩn lá đàn hương trắng 30

Bảng 2.8 Bố trí thử nghiệm đánh giá tác dụng hạ đường huyết 33

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống 34

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của isovitexin và vitexin 37

Bảng 3.3 Phân tích thống kê của phương trình hồi quy của isovitexin 38

Bảng 3.4 Phân tích thống kê của phương trình hồi quy của vitexin 39

Bảng 3.5 Kết quả xác định độ chính xác (mẫu nguyên liệu) 40

Bảng 3.6 Kết quả xác định độ chính xác (mẫu cao) 40

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng (mẫu nguyên liệu) 41

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng (mẫu cao) 42

Bảng 3.9 Độ ẩm của nguyên liệu đầu vào 45

Bảng 3.10 Tro toàn phần của nguyên liệu đầu vào 46

Bảng 3.11 Tạp chất trong nguyên liệu đầu vào 46

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật 46

Bảng 3.13 Giá trị Rf của dung dịch chuẩn và nguyên liệu đầu vào 47

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất 48

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời gian chiết 49

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của số lần chiết 49

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL (ml/g) 50

Bảng 3.18 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa của quy trình chiết xuất 51

Bảng 3.19 Kết quả phân tích sự phù hợp của các mô hình 52

Bảng 3.20 Mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất chiết 53

Bảng 3.21 Mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm lượng vitexin 55

Bảng 3.22 Mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm lượng isovitexin 57

Bảng 3.23 Các giá trị thống kê của mô hình 58

Bảng 3.24 Các điều kiện tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm 58

Bảng 3.25 Mô hình đề xuất, giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm 59

Bảng 3.26 Kết quả kiểm tra kim loại nặng trong cao định chuẩn lá đàn hương trắng 59

Bảng 3.27 Kết quả kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn của cao định chuẩn lá đàn hươngtrắng 60

Bảng 3.28 Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong thử nghiệm độc tính cấp 61

Bảng 3.29 Phân tích t-test so sánh sự thay đổi trọng lượng của chuột sau 14 ngày củalô sinh lý và lô thử độc tính cấp 61

Bảng 3.30 Trọng lượng trung bình của chuột trong thử nghiệm khảo sát tác dụng hạđường huyết (g) 62

Bảng 3.31 Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu của chuột trong 14 ngày điều trị(mg/dl) 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitexin 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của isovitexin 6

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác động hạ đường huyết thường gặp 15

Hình 3.1 Sắc kí đồ và phổ UV của mẫu chuẩn hỗn hợp 35

Hình 3.2 Sắc kí đồ của mẫu trắng 35

Hình 3.3 Sắc kí đồ và phổ UV của mẫu chuẩn đơn isovitexin 35

Hình 3.4 Sắc kí đồ và phổ UV của mẫu chuẩn đơn vitexin 36

Hình 3.5 Sắc kí đồ và phổ UV của mẫu thử nguyên liệu 36

Hình 3.6 Sắc kí đồ và phổ UV của mẫu thử cao chiết 36

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của isovitexin 38

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của vitexin 38

Hình 3.9 Lá đàn hương trắng 43

Hình 3.10 Vi phẫu cuống lá 44

Hình 3.11 Vi phẫu gân chính 44

Hình 3.12 Vi phẫu phiến lá 45

Hình 3.13 Các cấu tử trong bột lá đàn hương trắng 45

Hình 3.14 Sắc kí lớp mỏng của nguyên liệu đầu vào 47

Hình 3.15 Bề mặt đáp ứng của hiệu suất chiết 54

Hình 3.16 Bề mặt đáp ứng của hàm lượng vitexin 56

Hình 3.17 Bề mặt đáp ứng của hàm lượng isovitexin 57

Hình 3.18 Sắc ký lớp mỏng của cao định chuẩn lá đàn hương trắng 60

Hình 3.19 So sánh sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 14 ngày giữa các lô 63

Hình 3.20 So sánh sự thay đổi nồng độ glucose trong máu của chuột trong 14 ngày giữacác lô 65

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, xu hướng quay về với thiên nhiên, sử dụng thảodược trong phòng và chữa bệnh ngày càng gia tăng Cùng với sự phát triển của cácnghiên cứu khoa học, việc áp dụng phương pháp Đông – Tây y kết hợp trong trị liệuvừa mang lại hiệu quả cao vừa hạn chế tác dụng không mong muốn Việt Nam cónguồn tài nguyên dược liệu phong phú và đa dạng, người dân có nhiều kinh nghiệmvà truyền thống lâu đời sử dụng cây cỏ làm thuốc, có nhiều lợi thế trong lĩnh vựcnghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Tuy nhiên, sử dụng dượcliệu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có bằng chứng khoa học đôi khi gây tươngtác và tác dụng không mong muốn Bên cạnh đó, nhược điểm của thuốc từ dược liệulà khó sử dụng, tốn thời gian, chất lượng và độ ổn định khó đảm bảo Vì vậy, áp dụngcông nghệ khoa học để cải thiện và nâng cao chất lượng thuốc có nguồn gốc từ dượcliệu là rất cần thiết.

Đàn hương trắng (Santalum album L.) còn được gọi là bạch đàn hương hoặc

bạch đường Đàn hương trắng đã được trồng và sử dụng khoảng 5000 năm tại Ấn Độ,phân bố chính ở các vùng nhiệt đới khô như Đông Timor, Indonesia, Bắc Úc, TrungQuốc.1 Tại Việt Nam, đàn hương trắng mọc tự nhiên tại các vùng miền bắc, TâyNguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh Đàn hương trắng được các nhà khoa họcnghiên cứu từ năm 2005 nhưng phải đến năm 2014 mới được triển khai, nhân giốngthành công Đàn hương trắng là một loài cây đa tác dụng, được ứng dụng trong nhiềulĩnh vực như làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược liệu, mỹnghệ cao cấp, y học, là cây có giá trị kinh tế rất cao và được thế giới đánh giá là câyhương liệu siêu hạng.1,2 Các nghiên cứu trước đây về đàn hương trắng phần lớn về gỗvà tinh dầu với các hoạt chất: –santalol, -santalol, lanceol, bisabolol, nuciferol,hydrocarbon serquiterpen, teresantalol, aldehyd,… Gần đây, các flavonoid từ lá đànhương trắng đang được quan tâm và nghiên cứu, đặc biệt là hai hoạt chất vitexin vàisovitexin có nhiều tiềm năng trong bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống viêm, điều trịđái tháo đường và ung thư Tuy nhiên, vitexin và isovitexin có nhược điểm hấp thukém và thải trừ nhanh sau khi uống Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào

hướng đến các hoạt chất chiết xuất từ lá đàn hương trắng trong điều trị Để góp phần

vào nghiên cứu phát triển chế phẩm thuốc từ lá đàn hương trắng, đề tài “Nghiên cứuđiều chế và đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao chiết xuất từ lá đàn hươngtrắng” được thực hiện nhằm các mục tiêu:

− Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin.− Tiêu chuẩn hóa lá đàn hương trắng.

− Nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao định chuẩn từ lá đàn hươngtrắng.

− Tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn chứa vitexin và isovitexin.

− Đánh giá tác dụng hạ đường huyết của cao định chuẩn chiết xuất từ lá đàn hươngtrắng trên mô hình động vật.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Cây đàn hương trắng

1.1.1 Tổng quan thực vật học

Đàn hương trắng tên khoa học là Santalum album L., theo dữ liệu thực vật của

Bộ Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), đàn hương trắng được phân loại như sau3:Kingdom: Plantae – Giới Thực vật

Phylum: Tracheophyta – Ngành thực vật có mạch

Class: Magnoliopsida – Lớp Hai lá mầm (Ngọc Lan)Order (Bộ): Santalales

Family (Họ): SantalaceseGenus (Chi): Santalum

a Đặc điểm thực vật

Đàn hương trắng là cây thân gỗ, cây phát triển ở Úc cao 4 mét và lên đến 20mét ở Ấn Độ Cây có thể sống đến một trăm năm.1

Thân cây và lá cây: Thân cây hình trụ, có chu vi hơn 1,5 mét Đôi khi cây phát

triển ở dạng bụi thẳng đứng hoặc mọc nhánh và có thể xen kẽ với các loài khác Vỏcây có màu từ nâu đến nâu sẫm, xám đen đến gần như đen và nhẵn ở những cây non,sau đó trở nên nứt nẻ và lộ ra màu đỏ Tâm gỗ có màu xanh nhạt đến trắng Thân câybắt đầu tỏa hương sau khoảng 10 năm sinh trưởng Lá cây mỏng, mọc đối, được sắpxếp trên các nhánh, chia thành cuống lá và phiến lá Cuống lá tương đối mỏng, màuvàng dài từ 5 đến 15 cm và có hai luống Phiến lá đơn giản, thường dài từ 3 đến 8 cm,chiều rộng thường từ 3 đến 5 cm hình bầu dục hoặc hình trứng thuôn dài Mặt trêncủa lá sáng bóng, mặt dưới có màu xanh hơi nhạt.1

Hoa: Cây bắt đầu ra hoa sau 7 năm, hoa mọc chùm ở nách lá, có màu trắng vàng

khi cây còn non và chuyển sang màu đỏ hoặc cam khi cây già.1

Quả và hạt: Quả được tạo ra sau ba năm, hạt có thể sống được sau năm năm.

Quả đàn hương là loại quả hạch hình cầu với đường kính khoảng 1 cm, thịt nhiềunhựa, ban đầu có màu đỏ và tím, sau khi trưởng thành có màu xanh đến đỏ đen Mỗinăm, cây ra hoa đậu quả 2 lần vào tháng 5 và tháng 11.1,2

Sinh thái học: Đàn hương trắng có một đặc tính sinh học quan trọng là có rễ cái

ký sinh trên cây chủ Các rễ con sẽ bám chặt vào các rễ cái cây chủ bằng những giácmút Chúng hút dinh dưỡng từ cây chủ để sinh trưởng và phát triển Loài cây này sinhtrưởng tốt nhất trong điều kiện có nhiều ánh nắng mặt trời, thời tiết khô ráo.1

b Phân bố

Đàn hương trắng có nguồn gốc từ Ấn Độ, Sri Lanka và Indonesia Ở Indonesia,loài này có nguồn gốc từ phía đông quần đảo Timor, Flores và Sumba (Ratnaningrum

và cộng sự, 2015, Seran và cộng sự, 2018) Gần đây, loài này cũng đã được ghi nhận

có nguồn gốc ở Aceh, tây bắc Sumatra (Septiani và Setyawati, 2012) Ở Ấn Độ, vùngphân bố tự nhiên của loài là các bang Karnataka, Tamil Nadu, Andhra Pradesh và

Kerala (Srinivasan và cộng sự, 1992), sau đó được du nhập đến các vùng khác của

Ấn Độ Ở Sri Lanka, loài này được biết đến từ vùng Badulla Welimada ở tỉnh Uva,nhưng có thể được tìm thấy ở các địa điểm xa hơn từ đây (Subasinghe 2014) Ngoàira, loài này hiện diện ở Bắc Úc, nhưng nguồn gốc ở đây là không chắc chắn (Thomson

1.1.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Cây đàn hương trắng là loài cây đa công dụng Tất cả các bộ phận của cây từ rễ,thân, lá, hạt, gỗ đều có những giá trị sử dụng riêng.

Rễ và tâm gỗ (phần lõi của thân) là một nguồn giàu các tinh dầu dễ bay hơi, cáctinh dầu này được chiết xuất sau 30 năm cây sinh trưởng Tinh dầu có màu hơi vànghoặc không màu, nhớt, vị ngọt nồng Thành phần chính trong tinh dầu là santalol,gồm hỗn hợp của hai alcol serquiterpen chính: –santalol (19,6 %) và -santalol (16,0%); ngoài ra còn có các loại tinh dầu khác như lanceol, bisabolol, nuciferol,hydrocarbon serquiterpen, teresantalol, aldehyd,…5 Tinh dầu gỗ đàn hương trắng có

tác dụng kháng khuẩn (Okazaki và cộng sự, 1953; Winter, 1958), tác dụng lợi tiểu

(Okanishi, 1928), tác dụng kích thích tai thỏ (Okanishi, 1928), có tiềm năng làm dịuthần kinh, giãn cơ và giảm đau.6

Santalbic acid (ximenynic acid) và stearolic acid trong tinh dầu chiết xuất từ hạtSantalum album có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và chống lão hóa.7

Lá đàn hương chứa các flavonoid như vicenin-2, vitexin, isovitexin, orientin,isoorientin, chrysin-8-C--D-glucopyranosid, chrysin-6-C--D-glucopyranosid vàisorhamnetin Flavonoid chiết xuất từ lá đàn hương trắng có tiềm năng bảo vệ gan,kháng viêm, điều trị đái tháo đường và phòng ngừa bệnh tim mạch Ngoài ra, chiếtxuất lá đàn hương còn có saponin, catechin có tác dụng chống oxy hóa, phòng ngừahuyết khối.5

1.1.3 Vitexin và isovitexin

a Vitexin

Vitexin (Apigenin-8-C--D-glucopyranosid), là một flavon C-glycosyl hóa,

được tìm thấy trong nhiều loại dược liệu như kê lai (Pennisetum glaucum), sơn tra(Crateagus oxycanthus), đậu triều (Cajanus cajan L.), đậu xanh (Vigna radiate), lạctiên (Passiflora), rêu, tre, kiều mạch (Fagopyrum esculentum), lá lúa mì, cây trinh nữ(Vitex agnus-castus)…8

Tên IUPAC: trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]-4H-chromen-4-on.

5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-Công thức hóa học: C21H20O10.

Khối lượng trung bình: 432,381g/mol.

Tính chất: màu vàng nhạt hoặc không màu, tính acid yếu, pKa = 6,27.

Độ tan: ít tan trong nước (6,72 g/ml), tan trong DMSO, methanol, ethanol.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitexin9

b Isovitexin

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của isovitexin10

Tên IUPAC: trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]chromen-4-on.

5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-Isovitexin (Apigenin-6-C--glucopyranosid), là một đồng phân của vitexin,chứa 6-C-glycosid thay vì 8-C-glucosid trong vitexin Isovitexin đa phần được tìmthấy trong các dược liệu chứa vitexin Theo các nghiên cứu hiện tại, isovitexin có tácdụng dược lý tương tự với vitexin, một phần do cấu trúc hóa học của chúng tương tựnhau.8

c Dược động học

Vitexin và isovitexin có sinh khả dụng thấp, hấp thu kém trong đường tiêu hóa.Sau khi uống, vitexin và isovitexin bị thủy phân bởi hệ vi sinh đường ruột thông quaquá trình oxy hóa khử làm mở vòng dị vòng C Có khả năng là vitexin và isovitexinbị phân giải thành các phân tử nhỏ phenol và các acid thơm như phloretic acid (PA)10.

Ngoài ra, trong một số tài liệu cho thấy vitexin có thể bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn

uống Trong nghiên cứu của Jaroslaw Czubinski và cộng sự11, -conglutin trong hạtlupin có thể kết hợp với vitexin theo tỷ lệ 1:1, có thể ảnh hưởng đến quá trình phângiải của chymotrypsin.

Vitexin bị chuyển hóa lần đầu đáng kể tại ruột (khoảng 94 %), dạ dày (30 %)và gan (50 %) Mặt khác, sự ức chế của CYP3A và P-glycoprotein (P-gp) củaverapamil không ảnh hưởng đáng kể đến sự chuyển hóa lần đầu tại ruột của vitexin.Vitexin ức chế hoạt động của các Cytochrome P450 (CYP) bao gồm CYP3A1 vàCYP2C11, ngoại trừ CYP1A2.12

Khi được hấp thu vào máu, vitexin có thể liên kết với albumin huyết tươngngười (HSA), tỷ lệ phần trăm liên kết với HSA (PBHSA) là 97  3 %, PBHSA + AGP(AGP, 1-acid glycoprotein) là 100  1 %, PBplasma là 46  15 %.13

Khi tiêm tĩnh mạch và cho uống trên chuột cống hoặc chuột nhắt, vitexin đượcphân bố nhanh và rộng rãi vào các mô khác nhau mặc dù sinh khả dụng đường uốngcủa vitexin thấp hơn (khoảng 5 %) Sau khi uống 0,5 giờ, nồng độ vitexin cao nhấttrong ruột, tiếp theo là dạ dày, gan.14,15 Sau khi tiêm tĩnh mạch cho chuột, vitexinđược phân bố hầu hết vào gan và thận, thấp nhất ở não và mô mỡ; isovitexin phân bốnhiều nhất ở thận, gan, phổi và thấp nhất ở não.16 Vitexin và isovitexin được thải trừra khỏi cơ thể chủ yếu qua nước tiểu và mật.17

d Tác dụng dược lý

Trong các nghiên cứu trước đây đã chứng minh trong lá Santalum album L cóchứa vitexin và isovitexin (Yan và cộng sự, 2011) Vitexin và isovitexin có khả năngchống oxy hóa, chống tăng đường huyết và kháng viêm (Prabhakar và cộng sự, 1981;Kim và cộng sự, 2005; Lin và cộng sự, 2005; Conforti và cộng sự, 2009), có tác dụng

trên tim mạch, thần kinh, hô hấp, chống khối u,…7,8,18

Tác dụng trên bệnh tiểu đường:

Năm 2012, theo nghiên cứu của C.Y Choo và cộng sự, vitexin và isovitexinđược phân lập từ lá của Ficus deltoidea Thử nghiệm dung nạp sucrose trên chuột có

đường huyết bình thường và chuột mắc bệnh tiểu đường Kết quả cho thấy uống 1

mg/kg vitexin hoặc isovitexin làm giảm đáng kể mức đường huyết sau ăn ở nhómchuột có đường huyết bình thường được nạp sucrose sau 30 phút Tỷ lệ giảm đườnghuyết sau bữa ăn cao nhất ở chuột mắc bệnh tiểu đường do nạp sucrose dùng đườnguống với 200 mg/kg vitexin hoặc 100 mg/kg isovitexin Cả vitexin và isovitexinkhông gây ra bất cứ dấu hiệu độc tính nào ở liều cao nhất 2 g/kg dùng đường uốngđối với cả hai nhóm chuột.19

Tác dụng kháng viêm:

Nghiên cứu của Hongpeng Yang và cộng sự (2019) đã chứng minh rằng vitexin

làm giảm bớt các phản ứng viêm do IL-1β gây ra trong tế bào chondrocyte của bệnhnhân viêm xương khớp, có thể một phần là do ức chế con đường HIF-1α Kết quả chothấy vitexin thúc đẩy khả năng sống của tế bào và ngăn chặn việc sản xuất PGE2 vàNO trong tế bào chondrocyte có nguồn gốc từ bệnh nhân viêm khớp Hơn nữa, vitexinlàm giảm mức độ cytokine tiền viêm của IL-6, TNF-α, MMP-1, MMP-3 và MMP-13trong tế bào chondrocyte được kích thích bởi IL-1β Sự ức chế biểu hiện của HIF-1αcó liên quan đến các tác dụng bảo vệ này Vì vậy, vitexin có thể được coi là một chấtchống thoái hóa khớp.20

Tác dụng chống khối u:

Trong nghiên cứu của Jong Hyun Lee và cộng sự (2020), vitexin cho tác dụng

ức chế hiệu quả sự hoạt hóa bền vững của JAK1, JAK2, Src và STAT3 trong tế bàoung thư biểu mô gan (HCC) Vitexin làm giảm khả năng liên kết DNA, làm giảmnhóm nhân của STAT3 và giảm sự biểu hiện gen STAT3 do yếu tố tăng trưởng biểubì (EGF) Nghiên cứu đã chứng minh vitexin có thể hoạt động như một chất ngănchặn tiềm năng của dòng tín hiệu STAT3 và giảm thiểu sự tồn tại cũng như sự xâmlấn của các tế bào HCC.21

Trong các nghiên cứu khác, isovitexin được phân lập từ Cucurbitaceae, Vignaradiate và Vitex trifolia L thể hiện tác động chống khối u qua quá trình chết tế bào

(apoptosis) ở tế bào HepG2, HeLa và HCT116.17

Tác dụng trên thần kinh:

G Smilin Bell Aseervatham và cộng sự (2016) đã thực hiện nghiên cứu đánh

giá tác dụng của apigenin 8-C-glucosid (vitexin) và acid chlorogenic trên chuột bịđộng kinh trên mô hình pilocarpin Sử dụng pilocarpin (85 mg/kg) trong sọ gây cogiật ở chuột được đánh giá qua quan sát hành vi, cho kết quả giảm đáng kể (p > 0,05)bởi apigenin 8-C-glucosid (AP8CG) (10 mg/kg) và acid chlorogenic (CA) (5 mg/kg),tương tự như diazepam Co giật đi kèm với sự mất cân bằng về nồng độ gamma-aminobutyric acid (GABA) và glutamate trong nhóm dùng pilocarpin Hơn nữa, cogiật cùng với giảm acetylcholinesterase, tăng monoamin oxidase và stress oxy hóa đãđược quan sát thấy ở chuột động kinh AP8CG và CA phục hồi đáng kể trở lại mứcbình thường ngay cả ở liều thấp hơn Sự gia tăng quá trình peroxy hóa lipid và hàmlượng nitrit cũng bị suy giảm đáng kể bởi AP8CG và CA Tuy nhiên, CA được cholà hiệu quả hơn khi so sánh với AP8CG Sự biểu hiện mRNA của thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDAR), mGluR1 và mGlu5 bị ức chế đáng kể (p  0,05) bởi AP8CGvà CA ở liều thấp hơn Sự biểu hiện mRNA của GRIK1 không khác biệt đáng kể ởbất kỳ nhóm nào và cho thấy một kiểu biểu hiện tương tự Kết quả cho thấy AP8CGvà CA ức chế chọn lọc biểu hiện NMDAR, mGluR1 và mGlu5 Sự thay đổi trongphản ứng canxi NMDAR được kích hoạt cùng với sự chết của tế bào thần kinh Dođó, những phát hiện này nhấn mạnh rằng polyphenol, AP8CG và CA đã có tác dụngchống động kinh và bảo vệ thần kinh bằng cách ức chế các thụ thể glutamat.22

Ngoài ra, vitexin và isovitexin đã được nghiên cứu có tác dụng bảo vệ chống lạitình trạng thiếu oxy và tổn thương do thiếu máu cục bộ, ngăn ngừa Alzheimer, tăngcường trí nhớ, ngăn ngừa trầm cảm,….

Tác dụng chống oxy hóa:

Năm 2016, Swati Khole và cộng sự đã phân lập vitexin và isovitexin từFenugreek (cỏ ca ri) và kiểm tra tác dụng chống oxy hóa bằng định tính khả năng khửgốc tự do in vitro và phân giải phóng xạ xung Sự bảo vệ ty thể chống lại tổn thương

oxy hóa được đánh giá bằng cách đo mức độ lipid peroxit và protein sulphydryl Sựbảo vệ khỏi độc tính tế bào gây ra bởi hydrogen peroxide trong tế bào HepG2 đã đượckiểm tra bằng xét nghiệm MTT và bằng cách đo ROS nội bào Khả năng điều chỉnh

tình trạng chống oxy hóa nội bào được kiểm tra cả ở mức độ hoạt động và RNA Kếtquả của nghiên cứu cho thấy vitexin và isovitexin thể hiện hoạt tính chống oxy hóakhác nhau chống lại các gốc khác nhau Vitexin là chất quét oxit nitric tốt hơn trongkhi isovitexin quét các gốc superoxid hiệu quả hơn Trong các ty thể bị tổn thươngdo oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid bị ức chế đáng kể bởi isovitexin trong khivitexin ngăn chặn việc giảm hàm lượng protein sulphydryl hiệu quả hơn Các hợpchất này bảo vệ tế bào HepG2 ở mức độ tương tự chống lại sự oxy hóa do hydrogenperoxid gây ra bằng cách giảm ROS nội bào và điều chỉnh mức độ của các enzymchống oxy hóa Nghiên cứu đã chứng minh vai trò của vitexin và isovitexin trongviệc giảm thiểu thiệt hại do stress oxy hóa gây ra và duy trì cân bằng nội môi oxy hóakhử tế bào.22

Một số tác dụng khác: bảo vệ tim mạch, phòng ngừa béo phì, bệnh tuyến giáp,

chống vi khuẩn, virus,…

e Định lượng

Trong các Dược điển hiện hành (Dược điển Việt Nam V, Dược điển Châu Âu10.4, Dược điển Mỹ 2020, Dược điển Nhật Bản 17, Dược điển Ấn Độ 2017, Dượcđiển Anh 2017), hiện chưa có chuyên luận riêng về định lượng vitexin và isovitexin.Một số nghiên cứu định lượng vitexin, isovitexin trong và ngoài nước đã công

bố được trình bày ở Bảng 1.1.1.2 Chiết xuất dược liệu

Chiết xuất là một kỹ thuật dùng dung môi để hòa tan và tách các chất mongmuốn ra khỏi dược liệu Dung môi chứa chất tan thu được gọi là dịch chiết Phầndược liệu sau khi chiết lấy dịch chiết gọi là bã Quá trình hòa tan chiết xuất là quátrình hòa tan không hoàn toàn Dịch chiết chủ yếu chứa các chất có tác dụng điều trịnhư alkaloid, glycosid, saponin,…, được gọi là hoạt chất, đồng thời còn có các chấthỗ trợ, làm tăng tác dụng của hoạt chất Ngoài ra, dịch chiết còn chứa một phần cácchất không mong muốn gọi là tạp chất Các chất này thường gây khó khăn trong quátrình bảo quản như đường, tinh bột, pectin, gôm, chất nhầy, nhựa,…19

Quá trình chiết xuất là giai đoạn quan trọng khi điều chế các chế phẩm từ dượcliệu, quyết định chất lượng của chế phẩm; cũng là giai đoạn đầu tiên của quá trìnhnghiên cứu tách, phân lập và xác định các hợp chất tinh khiết từ dược liệu Có ba quátrình đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:

+ Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.+ Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi.

+ Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.

Mục tiêu của quá trình chiết xuất là lấy được tối đa các hoạt chất và những chấthỗ trợ vào dịch chiết, giữ lại tối đa các tạp chất trong bã dược liệu, xác định được cácđiều kiện cần thiết để tiết kiệm dung môi, nhiên liệu, thời gian trong quá trình sảnxuất.23,24

Lựa chọn phương pháp chiết xuất phụ thuộc vào tính chất của chất cần chiết,dung môi chiết xuất, đặc điểm của dược liệu và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có Đốivới các dược liệu có cấu trúc mỏng manh như hoa, lá, dung môi dễ thấm vào dượcliệu, quá trình chiết xuất hoạt chất diễn ra nhanh Do đó, có thể sử dụng các phươngpháp chiết xuất là ngâm, với thời gian chiết xuất không quá dài mà vẫn có hiệu suấtchiết xuất cao Phương pháp ngâm có các ưu điểm như yêu cầu thiết bị đơn giản, íthao tốn năng lượng.25

Các bộ phận như rễ, thân có cấu trúc cứng rắn, màng tế bào thường được baobọc bởi các chất sáp, nhựa nên dung môi khó thấm vào dược liệu hơn và sự vậnchuyển hoạt chất từ tế bào ra dung môi cũng khó khăn hơn Vì vậy cần lựa chọnphương pháp chiết xuất như ngấm kiệt để luôn duy trì được sự chênh lệch nồng độhoạt chất bên trong và bên ngoài màng tế bào, giúp quá trình chiết xuất diễn ra thuậnlợi Phương pháp ngấm kiệt có ưu điểm hơn so với phương pháp ngâm là sử dụnglượng dung môi ít hơn khi cần chiết cùng một lượng hoạt chất từ dược liệu.25 Ngoàira, phương pháp chiết nóng thường được sử dụng để chiết dược liệu như đun hồi lưumang lại nhiều ưu điểm, giúp tiết kiệm dung môi, hiệu suất chiết cao, hạn chế đượcô nhiễm môi trường, thiết bị đơn giản, dễ thực hiện.

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng vitexin và isovitexin

liệuĐối tượng Phương pháp/Thiết bị Pha độngBước sóngphát hiện

[25] Định lượng đồngthời vitexin vàisovitexin trong vỏđậu xanh

HPLC Shimadzu 10Avp, cột PhenomenexC18 (150 x 4,6 mm,5µm)

Methanol, acid

orthophosphoric 0,1 %

335 nm

[19] Định lượng đồngthời vitexin vàisovitexin trong lábàng lá tim cẩmthạch

HPLC Water, Mỹ, cột250 x 4,6 mm ODS3,3µm (Inertsil, NhậtBản)

Methanol, nước khử ion 337 nm

[26] Định lượng đồngthời vitexin vàisovitexin trongmáu chuột sau khiuống dịch chiết láđàn hương trắng

Agilent 1200 LCMS/MS, cột DiamonsilC18 (150 x 4,6 mm,5µm)

Methanol (A) – 0,1 %acid formic (B)

[27] Định lượng đồngthời isoorientin,isovitexin, orientinvà vitexin trong látre

HPTLC, silica gel 60 Tetrahydrofuran –toluen - acid formic –nước (16:8:2:1)

350 nm

[28] Định lượng đồngthời 12 hợp chấtphenolic trong đậuxanh

HPLC-PDA Water, cộtHypersil ODS (150 ×4.6 mm, ThermoScientific)

Kênh A: acid

orthophosphoric 0,1 %Kênh B: acetonitril

270 nm

[29] Định lượngflavonoid C-glycosyl trong lá vàquả của chi lạc tiên

HPLC-DAD, cột LunaC18 (150 x 4,6 mm,5µm)

Kênh A:

tetrahydrofuran –isopropanol –acetonitril (10:2:3)Kênh B: acid

orthophosphoric 0,5 %

340 nm

HPLC-MS ShimadzuLC-10A, cột

Phenomenex LunaRP18 (150 x 2 mm,5µm)

Kênh A: nước-acid formic(3:87:10)

Kênh B: nước-acid formic(40:50:10)

acetonitril-340 nm

Trong sản xuất thực tế, các phương pháp chiết xuất truyền thống là chiết nóng,ngâm và ngấm kiệt vẫn chiếm ưu thế vì đơn giản, yêu cầu về cơ sở vật chất khôngcao như phương pháp chiết xuất hiện đại Các phương pháp chiết xuất hiện đại vớisự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng hay phương pháp chiết xuất lỏng siêu tới hạn đaphần mới dừng ở mức nghiên cứu với cỡ mẫu nhỏ.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tùy vào bản chất nguyên liệu vàmục đích chiết xuất Để tối ưu hóa quy trình chiết xuất, một số yếu tố thường đượckhảo sát theo từng phương pháp sử dụng Phương pháp ngâm lạnh thường được khảosát về thời gian chiết xuất, loại, tỷ lệ dung môi - dược liệu, số lần chiết xuất và kíchthước dược liệu Phương pháp chiết nóng khảo sát nhiệt độ chiết và các yếu tố tươngtự phương pháp ngâm lạnh Phương pháp ngấm kiệt thường khảo sát loại dung môichiết, thời gian ngâm, thể tích dung môi và tốc độ rút dịch chiết

Đề tài này được thực hiện theo hướng ứng dụng vào sản xuất thực tế, đặt mụctiêu xây dựng quy trình điều chế cao định chuẩn lá đàn hương trắng nhằm tìm ra mộtquy trình có hiệu suất chiết xuất cao, chất lượng cao đạt tiêu chuẩn cao thuốc, có khảnăng nâng cấp quy mô, phù hợp với điều kiện của cơ sở sản xuất Do vậy, đề tài lựachọn cácphương pháp chiết xuất ngâm, ngấm kiệt và đun hồi lưu, thực hiện nghiêncứu các thông số của quy trình chiết xuất để tìm ra các giá trị thông số cho hiệu quảtối ưu.

1.3 Phương pháp thử độc tính cấp trên động vật

Thử độc tính cấp trên động vật thử nghiệm được thực hiện theo - Hướng dẫnthử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu của Bộ Y tếban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015.26

1.3.1 Mục tiêu

Thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc củathuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mứcliều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốcnghiên cứu tiếp theo Do vậy, các phép thử độc tính cấp cần xác định: liều an toàn,liều dung nạp tối đa, liều gây ra độc tính có thể quan sát được, liều thấp nhất có thể

gây chết động vật thí nghiệm (nếu có), liều gây chết 50 % ĐVTN (LD50) gần đúng(nếu có thể xác định được), những triệu chứng ngộ độc điển hình có thể quan sát đượctrên động vật và khả năng hồi phục (nếu có).

1.3.2 Một số mô hình thử

Nguyên tắc lựa chọn: tùy theo mục đích của mỗi nghiên cứu và loại mẫu thử vànhững thông tin sẵn có để lựa chọn mô hình thử thích hợp Loài động vật gặm nhấmthường được sử dụng là chuột nhắt, chuột cống; loài không gặm nhấm có thể dùng làchó hoặc khỉ Số nhóm và số lượng cho mỗi nhóm tùy theo mô hình áp dụng.

Mô hình liều cố định: thực hiện với các mức liều xác định 5, 50, 300, 2000,5000 mg/kg hay 10 g/kg ĐVTN Chọn liều thử đầu tiên trên 5 ĐVTN Thử nghiệmtiếp tục đến khi xác định mức độ độc dựa trên đáp ứng ĐVTN chết hoặc không vàtriệu chứng ngộ độc, khả năng hồi phục Xác định giá trị LD50gần đúng (nếu có).

Mô hình Tăng - Giảm: tiến hành trên các mức liều được tính theo hệ số bướcnhảy, thực hiện lần lượt trên từng ĐVTN theo tiến trình tăng hoặc giảm liều đến khiđạt điều kiện dừng lại Quan sát các biểu hiện và triệu chứng ngộ độc theo quy địnhchung và tính giá trị LD50gần đúng (nếu có) theo quy định riêng của phương pháp.

Mô hình Behrens: đề xuất từ năm 1929 với lập luận “Những con vật đã sống ởmột mức liều thử nào đó thì sẽ sống với tất cả những mức liều thấp hơn và những convật đã chết ở một mức liều sẽ chết ở tất cả các mức liều cao hơn”.

Mô hình theo Litchfield – Wilcoxon: được đề xuất năm 1949 sau khi xem xét,cải tiến và cố gắng khắc phục những hạn chế của một số phương pháp trước đó Kếtquả được ghi đồ thị trên giấy log-probit và được tính theo phương pháp toán đồ cóhiệu chỉnh, do vậy cho kết quả chính xác hơn.

1.4 Nghiên cứu tác động hạ đường huyết

Một số phương pháp nghiên cứu tác động hạ đường huyết thường gặp được

trình bày trong Hình 1.3.

Trong nghiên cứu về đái tháo đường, mô hình động vật được sử dụng rộng rãi,tạo điều kiện cho các nhà khoa học nghiên cứu về bệnh học và các biến chứng củabệnh đái tháo đường, đồng thời thử nghiệm thuốc mới cho điều trị đái tháo đường

bao gồm cả cấy ghép tế bào đảo tuỵ và các phương pháp phòng ngừa các biến chứng.27Động vật được sử dụng trong mô hình thường là những động vật nhỏ như chuộtnhắt, chuột cống để dễ thao tác và chi phí rẻ Tuy nhiên, đôi khi cũng dùng một sốđộng vật lớn hơn như chó, mèo, heo hay linh trưởng để gây mô hình khi cần một kếtquả gần với các đặc điểm như người.

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác động hạ đường huyết thường gặp

1.4.1 Gây mô hình động vật đái tháo đường bằng chất hóa học

Hầu hết mô hình đái tháo đường típ-1 được gây bởi chất hóa học Cơ chế tácđộng bao gồm:

- Tác động chuyên biệt vào tế bào beta đảo tụy.- Ức chế tạm thời sản xuất hoặc bài tiết insulin.- Giảm độ nhạy của insulin ở mô đích.

Một số chất hóa học thường dùng gây mô hình đái tháo đường trên động vậtthực nghiệm: alloxan, streptozotocin, vacor, dithizon, 8-hydroxyquinolon.

a Mô hình đái tháo đường do alloxan

Alloxan là một hợp chất hữu cơ có công thức hoá học 5,5-dihydroxyl 2,4,6-trion, có khả năng gây ung thư và gây độc tế bào Alloxan làmột tác nhân hóahọc gây đái tháo đường phổ biến trên các mô hình động vật.Mô hình đái tháo đườngtrên chuột không phụ thuộc yếu tố di truyền.28

pyrimidin-Alloxan có cơ chế gây độc tế bào với ưu điểm tập trung nhiều ở tế bào beta củađảo tụy thông qua kênh đồng vận chuyển glucose transporter 2 (GLUT2).29

Mô hình có hai cơ chế gây tổn thương là ức chế chọn lọc sự tiết insulin và tạothành các gốc tự do (ROS) để gây hoại tử các tế bào beta đảo tụy.

Hạn chế: Tỷ lệ tử vong ở chuột cao; gây nhiễm ceton ở động vật, bệnh đái tháođường gây ra có thể hồi phục Một số loài như chuột lang có khả năng chống lại cơchế gây đái tháo đường của alloxan.30

b Mô hình đái tháo đường do streptozotocin

Streptozotocin (STZ) là một kháng sinh phổ rộng, được sản xuất từ

Streptomyces achromogens STZ được sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với chất hoá

học khác hoặc với chế độ ăn để gây đái tháo đường típ 1 hoặc típ 2 trên động vật.Thông thường, để gây đái tháo đường típ 1, STZ được dùng với 1 liều cao (140, 160,180, 200 mg/kg) và để gây đái tháo đường típ 2, STZ được dùng với nhiều liều nhỏSTZ hoặc STZ kết hợp nicotinamid hoặc STZ kết hợp chế độ ăn giàu chất béo.

STZ là tác nhân alkyl hóa DNA do sự kết hợp của nhóm N-methyl-N-nitrosourevà carbon số 2 của đường hexon Sự chuyển nhóm methyl từ STZ sẽ gây tổn thươngDNA của tế bào beta đảo tụy và sự phân mảnh DNA.31 So với alloxan, STZ có thờigian bán thải dài hơn dẫn đến sự ổn định và cơ chế ít gây độc tế bào hơn, hạn chế tỷlệ tử vong ở chuột thí nghiệm Vì ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố gây nhiễu nên môhình gây đái tháo đường do STZ được ưu tiên sử dụng hơn.29

c Gây mô hình động vật đái tháo đường bằng hormon

Dexamethason là một glucocorticoid tác dụng kéo dài được dùng để gây môhình đái tháo đường típ 2 Liều dexamethason thường dùng 2-5 mg/kg, IP x 2 lần mỗingày trong vài ngày.32

d Gây mô hình động vật đái tháo đường bằng kháng thể kháng insulin

Tiêm insulin bò vào cơ thể lợn Guinea để sản xuất kháng thể kháng insulin, thuhuyết thanh có chứa kháng thể sau 2 tuần của mũi tiêm thứ 2 Huyết thanh có chứakháng thể insulin được tiêm vào tĩnh mạch chuột lang đực, trọng lượng 300 - 400gam với liều 0,25 - 1,0 ml, i.v chậm hoặc i.p, tác dụng kéo dài vài giờ Glucose máutăng phụ thuộc liều lượng, có thể lên đến 300 mg Tình trạng tăng glucose máu hồiphục sau vài giờ.33

e Gây mô hình động vật đái tháo đường bằng vi-rút

Các loại vi-rút được sử dụng để gây ra bệnh đái tháo đường bao gồm: RNA

picornovirus, CoxsackieB4 (CB4), viêm não tủy (biến thể EMC-D và M), Mengo-2T,vi-rút reovirus và vi-rút viêm màng não mô tế bào lympho (LMCV, biến thể

1.4.2 Gây mô hình động vật đái tháo đường bằng phẫu thuật

Bệnh đái tháo đường được gây ra bằng cách cắt bỏ một phần (90 %) hay toànbộ tuyến tụy của động vật Khi cắt bỏ một phần, tùy thuộc vào số lượng tế bào tuyếntụy còn lại, bệnh đái tháo đường có thể kéo dài từ vài ngày đến vài tháng Khi cắt bỏtoàn bộ tuyến tụy dẫn đến bệnh đái tháo đường phụ thuộc insulin và lúc này liệu phápinsulin được bổ sung để duy trì đời sống động vật thí nghiệm Phương pháp nàythường được thực hiện trên chó Beagle đực có trọng lượng từ 12-16 kg.

1.4.3 Mô hình động vật đái tháo đường di truyền

Một số mô hình động vật đái tháo đường di truyền thường gặp được thể hiện

trong Bảng 1.2.

Bảng 1.2 Một số mô hình động vật đái tháo đường di truyền27

Mô hình trên chuột cống Mô hình trên chuột nhắt

Chuột cống đái tháo đường Cohen Chuột KK-Ay

Chuột Goto Kakizaki (GK) Chuột béo phì, tăng glucose máu(ob/ob)

Chuột béo phì Zucker Chuột đái tháo đường db/dbChuột béo phì, đái tháo đường Zucker

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dược liệu: Lá đàn hương trắng ba năm tuổi trở lên được thu hái tại tỉnh

Đắk Lắk vào tháng 7 năm 2022 Sau khi thu hoạch, làm sạch lá bằng nước để loại bỏbụi, phơi khô trong bóng râm Sấy ở 50 oC, xay nhỏ và rây qua rây kích thước 1 cm.Cân và bảo quản trong bao bì kín khí đến khi sử dụng.

Nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng

được trình bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu

7 Ethanol (thực phẩm) TCVN Hóa chất Đại Việt, Việt Nam

9 Ethyl acetat TCCS Xilong Scientific, Trung Quốc10 Acid acetic băng TCCS Xilong Scientific, Trung Quốc11 Alloxan monohydrat TCCS Sigma-Aldrich, Mỹ

13 Sodium carboxymethyl cellulose USP - NF DFE Pharma, Đức

Thiết bị: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong quá trình nghiên cứu, điều chế

và kiểm nghiệm được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

8 Hệ thống HPLC SHIMADZU LC 20AD Series Nhật Bản

10 Máy cô quay chân không HEIDOLPH HEI-VAP ULTIMATE Đức

Ngoài ra, trong nghiên cứu có sử dụng các phần mềm Design Expert v13.0,G*Power 3.1.9.4, MS Excel.

Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt chủng Swiss albino, có độ tuổi từ 5-6 tuần,

cân nặng khoảng 20 ± 4 g, được mua ở Viện Pasteur Tp.HCM Chuột sử dụng làchuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường và chưa được sử dụng trong nghiêncứu Chuột được nuôi ổn định trong môi trường thí nghiệm 5 ngày Điều kiện nuôinhốt và cho ăn được thực hiện theo tiêu chuẩn của Phòng thí nghiệm Bộ môn DượcLý – Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM.

2.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin và isovitexin

Trên các Dược điển hiện hành, chưa có chuyên luận định lượng vitexin,isovitexin và chuyên luận định lượng đồng thời vitexin và isovitexin trong lá đànhương trắng cũng như trong cao chiết từ lá đàn hương trắng Đề tài tiến hành thẩmđịnh quy trình định lượng với các điều kiện, thông số phân tích cụ thể như sau:

❖ Hệ thống HPLC Shimadzu:

− Cột sắc ký: SunFireTM C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).

− Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

− Detector PDA, bước sóng phát hiện 337 nm.− Nhiệt độ cột: 30 oC.

− Thể tích tiêm: 20 µl.

− Pha động: A: Methanol; B: dung dịch acid phosphoric 0,1 %

− Thời gian và tỷ lệ pha động được trình bày trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3 Thời gian và tỷ lệ pha động

− Hệ số đối xứng (𝐴𝑆) của từng pic chính phải trong khoảng 0,8 – 1,5.

− Độ phân giải (𝑅𝑆) giữa các pic phải lớn hơn 1,5.

2.2.2 Độ đặc hiệu

Dung dịch thử nguyên liệu: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu đã nghiền

mịn (rây qua rây số 335) cho vào cốc có mỏ, thêm 30 ml methanol 50 %, siêu âm

trong 5 phút, lọc vào bình định mức 100 ml, lặp lại với cắn thêm hai lần và bổ sungmethanol 50 % vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Dung dịch thử cao chiết: Cân chính xác khoảng 20 g dược liệu đã xay nhỏ cho

vào bình cầu, thêm 200 ml ethanol 70 %, đun hồi lưu trong 4 giờ Ép bả và lọc lấydịch vào bình định mức 200 ml, bổ sung ethanol 70 % đến vạch Cô thu hồi dungmôi Dịch chiết được cô đến khi thu được cao có độ ẩm 10 ± 2 % Cân khoảng 1 gcao cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung vừa đủ methanol 50 %, siêu âm đến tanhoàn toàn Hút 1 ml dung dịch vào bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi đến vạch.Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Dung dịch chuẩn đơn vitexin: hòa tan 1,5 mg vitexin trong 8 ml methanol 50

%, siêu âm trong 5 phút, bổ sung methanol 50 % vừa đủ 10 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.

Dung dịch chuẩn đơn isovitexin: hòa tan 1,0 mg isovitexin trong 8 ml methanol

50 %, siêu âm trong 5 phút, bổ sung methanol 50 % vừa đủ 10 ml, lọc qua màng lọc0,45 µm.

Dung dịch chuẩn hỗn hợp: hòa tan 1,5 mg vitexin và 1,0 mg isovitexin trong 8

ml methanol 50 %, siêu âm trong 5 phút, bổ sung methanol 50 % vừa đủ 10 ml, lọcqua màng lọc 0,45 µm.

Dung dịch mẫu trắng: methanol 50 %.

Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn vitexin, mẫu chuẩnđơn isovitexin, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử nguyên liệu và mẫu thử cao chiết Độđặc hiệu của phương pháp được xác định khi đạt các yêu cầu:

− SKĐ của mẫu trắng phải không xuất hiện pic ở khoảng thời gian lưu tương ứngcủa chất chuẩn.

− SKĐ mẫu thử phải cho thời gian lưu của các pic chính tương tự với thời gianlưu của các pic chính trên SKĐ mẫu chuẩn Các pic hoạt chất phải tách hoàn toànra khỏi các pic khác.

− Các pic của hoạt chất cần phân tích trong SKĐ của các mẫu phải đạt độ tinhkhiết > 99,99 %.

− Phổ UV – Vis tại thời gian lưu của pic chính trong SKĐ mẫu thử phải giốngphổ UV – Vis tại thời gian lưu của pic chính trong SKĐ mẫu chuẩn.

2.2.3 Độ tuyến tính

Dung dịch chuẩn isovitexin gốc: hòa tan 25 mg isovitexin trong 80 ml methanol

50 %, siêu âm trong 5 phút, bổ sung methanol 50 % vừa đủ 100 ml, lọc qua màng lọc0,45 µm Dung dịch chuẩn isovitexin gốc có nồng độ 250 µg/ml.

Dung dịch chuẩn vitexin gốc: hòa tan 37,5 mg vitexin trong 80 ml methanol 50

%, siêu âm trong 5 phút, bổ sung methanol 50 % vừa đủ 100 ml, lọc qua màng lọc0,45 µm Dung dịch chuẩn vitexin gốc có nồng độ 375 µg/ml.

Pha loãng dung dịch chuẩn vitexin gốc và dung dịch chuẩn isovitexin gốcthành dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp để khảo sát tính tuyến tính Tiến hành sắc ký cácmức nồng độ theo quy trình phân tích đã xác định Ghi lại SKĐ, xác định diện tíchpic của mỗi chất và áp dụng phương pháp bình phương cực tiểu để thiết lập cácphương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic (y) và nồngđộ chất phân tích (C).

Yêu cầu: hệ số tương quan r nằm trong khoảng 0,998 – 1,002; sử dụng phân tíchhồi quy để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy tuyến tính và ý nghĩa củacác hệ số trong phương trình hồi quy.

Tiến hành như độ lặp lại nhưng thực hiện trong 2 ngày khác nhau.

Yêu cầu: Giá trị RSD của hàm lượng mỗi chất phân tích từ 6 mẫu thử trong mộtngày và 12 mẫu thử trong 2 ngày ≤ 2,7 % Kết quả hàm lượng mỗi chất giữa 2 ngàyphân tích khác nhau không có ý nghĩa thống kê (sử dụng trắc nghiệm F và t để kiểmtra sự khác nhau giữa 2 ngày thử nghiệm).

2.2.5 Độ đúng

Độ đúng được tính toán trên tỷ lệ phần trăm phục hồi khi phân tích mẫu thử

được thêm chuẩn Tiến hành kiểm tra độ đúng của phương pháp ở 3 mức thêm chuẩnvào mẫu thử: 80 %, 100 %, 120 % Ở mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu Tiến hànhsắc ký, tính tỷ lệ thu hồi dựa trên lượng chất chuẩn thêm vào và lượng tìm được.

𝑇ỷ 𝑙ệ 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖 (%) = 𝐶 − 𝐴

Trong đó: A là lượng vitexin/isovitexin sẵn có

B là lượng vitexin/isovitexin chuẩn thêm vàoC là lượng vitexin/isovitexin tìm thấy

Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi từ 97,0 – 103,0 %, giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi ≤ 2,7 %.

2.2.6 Miền giá trị

Dựa vào kết quả thẩm định độ chính xác và độ đúng, xác định miền giá trị củaquy trình phân tích.

2.3 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào

Tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu đầu vào được kiểm tra dựa trên các chỉtiêu chất lượng chung trong các chuyên luận Dược liệu - DĐVN V.

2.3.1 Mô tả

Quan sát hình dạng cảm quan của lá đàn hương trắng và so sánh với các tài liệuthực vật học Nguyên liệu đầu vào có đặc điểm hình thái đúng với mô tả theo các tàiliệu tham khảo.

2.3.4 Độ ẩm

Xác định theo DĐVN V, Phụ lục 9.6 (trang PL-203).

Độ ẩm được xác định bằng cân phân tích độ ẩm MB45 (gia nhiệt bằng tia hồngngoại từ đèn halogen) Cân chính xác khoảng 2 g nguyên liệu, trải thành lớp mỏngkhông quá 5 mm Gia nhiệt ở 110 oC để bay hết hơi nước đến khối lượng không đổi,tức là sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ so với lần sấy trước đó khôngquá 5 mg Thử nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị độ ẩm trung bình.

Độ ẩm yêu cầu không quá 12,0 %.

2.3.5 Xác định tro toàn phần

Xác định tro toàn phần theo phương pháp 1, Phụ lục 9.8, DĐVN V (PL-204).Cân 2 g dược liệu vào chén sứ đã nung và cân bì Nung ở nhiệt độ không quá450 oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân Dùng một ít nước nóng cho vàokhối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro Rửađũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc Cho giấy lọc và cắn vàochén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng Tập trungdịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ khôngquá 450 oC đến khi khối lượng không đổi Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theodược liệu đã làm khô trong không khí.

Yêu cầu: Tro toàn phần không quá 10,0 %.

2.3.6 Tạp chất lẫn trong dược liệu

p là khối lượng mẫu thử tính bằng gam.Yêu cầu: Tạp chất không quá 1,0 %.

2.3.7 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật

Xác định theo Phụ lục 12.17, DĐVN V (trang PL-280).

Yêu cầu: Nguyên liệu đầu vào không có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật.

2.3.8 Định tính

Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng:

Pha tĩnh: bản mỏng silica gel F254.

Pha động: Ethyl acetate - acid formic - acid acetic băng - nước theo tỷ lệ

100:11:11:35 Hỗn hợp dung môi khai triển cho vào bình gạn, lắc đều, lấy lớp trên.

Mẫu thử: Thêm 10 ml methanol (TT) vào 1 g bột dược liệu Lắc đều, siêu âm

trong 10 phút, lọc qua giấy lọc Bổ sung methanol (TT) hoặc cô đặc để thu được 5 mldịch lọc.

Mẫu chuẩn đối chiếu: 0,1 mg hỗn hợp vitexin và isovitexin trong 1 ml methanol.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt (dạng vạch 6 mm) khoảng 6 l mẫu thử và 6l mẫu đối chiếu lên cùng bản mỏng Sau khi triển khai sắc ký, sấy khô bản mỏng ở80 oC trong khoảng 2 phút Phun lên bản mỏng dung dịch FeCl3 10 % Để khô ở nhiệtđộ phòng Quan sát dưới UV 254 nm.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có các vết tương đương màu sắc,kích thước và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

S𝑐 : Diện tích pic của dung dịch chuẩn

Cc : Nồng độ vitexin, isovitexin của dung dịch chuẩn (µg/ml)V : Thể tích pha mẫu thử (ml)