nghiên cứu điều chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng

Lê Minh QuânĐặt vấn đềTinh dầu hương nhu trắng là loại tinh dầu sẵn có ở nước ta và tính ứng dụng cao ởkhả năng kháng khuẩn, giảm đau, kháng nấm nhưng bị hạn chế do tính bay hơi, ít tant

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN TRẦN HƯNG YÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ NIOSOME CHỨA TINH DẦU

HƯƠNG NHU TRẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN TRẦN HƯNG YÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ NIOSOME CHỨA TINH DẦU

HƯƠNG NHU TRẮNG

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ MINH QUÂN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn đề tài “Nghiên cứu điều chế niosome chứa tinh dầu hươngnhu trắng” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứuđược trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan cũng như chưa từng đượccông bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Trần Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2020 – 2022

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc Mã số: 8720202

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ NIOSOME CHỨA TINH DẦU

HƯƠNG NHU TRẮNG Nguyễn Trần Hưng Yên Người hướng dẫn: TS Lê Minh Quân Đặt vấn đề

Tinh dầu hương nhu trắng là loại tinh dầu sẵn có ở nước ta và tính ứng dụng cao ởkhả năng kháng khuẩn, giảm đau, kháng nấm nhưng bị hạn chế do tính bay hơi, ít tantrong nước cũng như gây kích ứng khi bôi trực tiếp lên da do đó đề tài tiến hành tảitinh dầu hương nhu vào niosome để khắc phục các hạn chế trên

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng gồm niosome không chứa hoạt chất và niosome chứa tinh dầu hương nhu.Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình điều chế niosome bằng phươngpháp thiết kế thực nghiệm (Design of experiment – DOE) Điều chế niosome chứatinh dầu bằng phương pháp tiêm ethanol và sơ bộ đánh giá điều kiện bảo quản trong

01 tháng Định lượng eugenol trong tinh dầu hương nhu, niosome chứa tinh dầu bằngphương pháp HPLC được xây dựng và thẩm định

Kết quả

Bằng phương pháp DOE cho thấy tất cả 4 biến độc lập khảo sát bao gồm: tỉ lệ chấtdiện hoạt span 60:cholesterol, nhiệt độ phối hợp pha hữu cơ vào pha nước, thời gianphối hợp pha hữu cơ vào pha nước, loại CDH đều ảnh hưởng đến tính chất củaniosome không chứa hoạt chất Sử dụng cả 4 biến độc lập vào phần tối ưu hóa quytrình điều chế Sau quá trình tối ưu hóa, niosome không chứa hoạt chất thu được cóthành phần vỏ gồm span 60:cholesterol:kolliphor RH40, tỉ lệ span 60:cholesterol là10:1,43; nhiệt độ phối trộn 60 ± 2C; thời gian phối trộn 46,21 phút; dự đoán kích

hành thực nghiệm cho thấy kết quả thực nghiệm là hoàn toàn phù hợp với dự đoáncủa tối ưu hóa Điều chế niosome chứa tinh dầu thu được dạng lỏng, đục, màu vàngnhạt, lượng eugenol tải vào niosome là 2,15 ± 0,021 % tương ứng với EE 90,08 %;kích thước trung bình 188,3 ± 12,69 nm; PDI 0,083 ± 0,034 và thế zeta là – 40,9 ±2,01 mV Điều kiện bảo quản tối ưu là ở nhiệt độ 25 ± 2C.

Kết luận

Đề tài đã xác định được các yếu tố có ảnh hưởng đến tính chất của niosome, từ đóxây dựng được mô hình để tối ưu hóa công thức và quy trình bào chế niosome chứatinh dầu hương nhu Qua đây có thể là tiền đề cho việc phát triển dạng bào chế dùngngoài hỗ trợ trị nấm hoặc kháng viêm giảm đau

Từ khóa

Tinh dầu hương nhu trắng, niosome, tiêm ethanol, thiết kế thực nghiệm

Master thesis in Pharmacy – Academic course: 2020 - 2022

Speciality: Pharmaceutical technology and pharmaceutics Speciality code: 8720202

PREPARATION OF NIOSOMES LOADED WITH

BASIL - CLOVE ESSENTIAL OIL

Nguyen Tran HungYen Supervisor: Dr Le Minh Quan Introduction

Basil - clove essential oil is a well-known essential oil that possesses antibacterial,analgesic, and antifungal properties However, essential oil has some limitations,such as volatility, low solubility in water, and skin irritation when applied directly

To overcome these limitations, the study has proposed loading Tulsi essential oil intoniosomes

Materials and methods

The study material consisted of empty niosomes and niosomes containing basil –clove essential oil The Design of Experiment (DOE) method was used to evaluatethe influencing factors and optimize the niosome preparation process Thepreparation of niosomes containing essential oils was carried out using the ethanolinjection method, and the storage conditions were preliminarily assessed for onemonth A High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) method was developedand validated to quantify eugenol in basil – clove essential oil and niosomescontaining essential oils

Results and discussion

The Design of Experiment (DOE) result indicated that four independent variables:the ratio of surfactant span 60:cholesterol, temperature of mixing the organic phaseinto the water phase, time of combining the organic phase into the water phase, andtype of surfactant has a significant effect on the properties of empty niosomes All

60:cholesterol:kolliphor RH40, a span 60:cholesterol ratio of 10:1.43, a mixingtemperature of 60 ± 2C, and a mixing time of 46.21 minutes The predicted averageparticle size was about 113.2 nm experimental results about 112.3 ± 5.105 nm (p >0.05), and the thermodynamic stability was 5.92 cycles experimental results was 6cycles Experimental results were consistent with the predictions of optimization Thepreparation of niosomes containing basil – clove essential oils resulted in a liquid,cloudy, light yellow with an amount of eugenol loaded into the niosomes at 2.15

±0.021 %, corresponding to EE 90.08 ± 0.574 % The average size was 188.3 ± 12.69

nm, PDI was 0.083 ± 0.034, and potential zeta was – 40.9 ± 2.01 mV Optimal storageconditions are at a temperature of 25 ± 2C

Conclusions

The project identified factors that affect the properties of niosomes, and built a model

to optimize the formula and preparation process of niosomes containing basil – cloveessential oil This can be a premise for developing a dosage form for external use thathelps treat fungus or is anti-inflammatory and pain-relieving

Keywords

Basil - clove essential oil, niosome, ethanol enjection, DOE (Design of experiment)

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các chữ viết tắt i

Danh mục các bảng iii

Danh mục các sơ đồ, hình v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Cây hương nhu 2

1.2 Niosome 8

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp phân tích dữ liệu 36

Chương 3 KẾT QUẢ 37

3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất niosome 39

3.2 Tối ưu hóa quy trình điều chế 46

3.3 Bào chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng bằng phương pháp tiêm ethanol theo quy trình tối ưu hóa 48

3.4 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng eugenol trong tinh dầu hương nhu trắng và eugenol trong niosome bằng phương pháp sắc ký lỏng hiện năng cao 51

3.5 Sơ bộ đánh giá độ ổn định của niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng 56

Chương 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất niosome 61

4.3 Bào chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng bằng phương pháp tiêm

ethanol theo quy trình tối ưu hóa 624.4 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng eugenol trong tinh dầu hương nhutrắng và eugenol trong niosome bằng phương pháp sắc ký lỏng hiện năng cao 634.5 Sơ bộ đánh giá độ ổn định của niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DOE Design of experiment Thiết kế thực nghiệm

EE Entrapment efficiency Hiệu suất bắt giữ hoạt chất

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH The international conference on

Nồng độ tối thiểu diệt nấm

MIC Minimum Inhibitor Nồng độ tối thiểu ức chế

Từ viết tắt Từ nguyên gốc Nghĩa tiếng Việt

nhu trắngPDI Polydispersity Index Hệ số đa phân tán

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TEM Transmission electron

microscopy

Kính hiển vi điện tử truyền qua

UV – Vis Ultra violet - Visible Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả

kiến

Danh mục các bảng

Trang

Bảng 1.1 Thành phần các chất có trong tinh dầu hương nhu 3

Bảng 1.2 Một số chế phẩm chứa hương nhu trên thị trường 5

Bảng 1.3 Độ tan của eugenol trong các dung môi 6

Bảng 1.4 Một vài điều kiện định lượng eugenol bằng phương pháp HPLC 7

Bảng 1.5 Các chế phẩm chứa eugenol trên thị trường 8

Bảng 1.6 Nghiên cứu quốc tế về niosome 14

Bảng 1.7 Nghiên cứu trong nước về niosome 14

Bảng 1.8 Các thử nghiệm đánh giá độ ổn định của niosome 15

Bảng 1.9 Kích thước tiểu phân tương ứng với vị trí phân bố trong cơ thể 17

Bảng 1.10 Ảnh hưởng của PDI đến cách phân bố kích thước tiểu phân 18

Bảng 1.11 Ảnh hưởng của thế zeta đến độ ổn định của hệ phân tán 18

Bảng 2.1 Công thức bào chế của pha hữu cơ để sơ bộ đánh giá tỉ lệ 21

Bảng 2.2 Các hóa chất, dung môi và nguyên liệu 23

Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 24

Bảng 2.4 Các biến độc lập và cách ký hiệu khi khai báo biến trong thiết kế 25

Bảng 2.5 Các biến phụ thuộc trong thiết kế thực nghiệm (sàng lọc) 25

Bảng 2.6 Công thức bào chế pha hữu cơ của thí nghiệm bào chế N – T 26

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sơ bộ các tỉ lệ CDH 37

Bảng 3.2 Thể tích pha nước (ml) còn lại sau khi tiến hành tiêm pha hữu cơ vào pha nước ứng với từng điều kiện khảo sát nhiệt độ và thời gian tương ứng (n = 6) 38

Bảng 3.3 Hàm lượng (C %) dung môi hữu cơ tồn dư trong pha nước sau khi tiến hành tiêm pha hữu cơ vào pha nước ứng với từng điều kiện khảo sát nhiệt độ và thời gian tương ứng (n = 6) 39

Bảng 3.4 Thông số thiết kế thực nghiệm sàng lọc 40 Bảng 3.5 Phân tích ảnh hưởng của các biến độc lập đến kích thước trung bình bằng

Bảng 3.6 Mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập và tương tác giữa các biến độc

lập với nhau đến kích thước trung bình khi sử dụng hàm Inverse (nghịch đảo) 42

Bảng 3.7 Phân tích ảnh hưởng của các biến độc lập đến độ bền nhiệt động học bằng mô hình ANOVA 45

Bảng 3.8 Mức độ ảnh hưởng của các biến độc lập và tương tác giữa các biến độc lập với nhau đến độ bền nhiệt động học khi sử dụng hàm Power (lũy thừa) 45

Bảng 3.9 Các điều kiện tối ưu hóa, dự đoán của phần mềm và kết quả thực nghiệm kiểm chứng tạo N – T 47

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng (n = 3) 49

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng eugenol trong niosome 52

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát mối tương quan nồng độ với diện tích pic của eugenol 52

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng eugenol 54

Bảng 3.14 Số liệu khảo sát độ đúng quy trình định lượng eugenol 55

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng eugenol 55

Danh mục các sơ đồ, hình

Trang

Hình 1.1 Công thức phân tử eugenol 5

Hình 1.2 Cấu trúc niosome 8

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc các loại niosome (a) đơn lớp; (b), (c) đa lớp 9

Hình 2.1 Lưu đồ điều chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng; 29

Hình 3.1 Loại CDH S + C, biến thiên kích thước trung bình ở thời gian phối trộn (a) 40 phút, (b) 50 phút, (c) 60 phút 42

Hình 3.2 Loại CDH S + C + K, biến thiên kích thước trung bình ở thời gian phối trộn (a) 40 phút, (b) 50 phút, (c) 60 phút 43

Hình 3.3 Biến thiên kích thước trung bình ở nhiệt độ 40 ± 2 C, loại CDH (a) S + C, (b) S + C + K 43

Hình 3.4 Biến thiên kích thước trung bình ở tỉ lệ CDH 44

Hình 3.5 Biến thiên độ bền nhiệt động học với loại CDH 46

Hình 3.6 Hình ảnh N – T (a) vừa mới điều chế; (b) sau khi lưu 6 chu kỳ nóng – lạnh 48

Hình 3.7 Lưu đồ chi tiết điều chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng bằng phương pháp tiêm ethanol 48

Hình 3.8 Hình ảnh N – T và N – HNT sau 6 chu kỳ nóng – lạnh 50

Hình 3.9 Phân bố kích thước trung bình tiểu phân của các lô N - HNT (a) lô 1; (b) lô 2; (c) lô 3; (d) cả 3 lô 50

Hình 3.10 Hình chụp TEM của (a) N – T; (b) N - HNT 51

Hình 3.11 Đồ thị biểu thị tương quan nồng độ với diện tích pic của eugenol 53

Hình 3.12 Sắc ký đồ của (a) mẫu trắng; (b) N – T; (c) chuẩn eugenol; (d) N - HNT 56

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng eugenol tải trong niosome ở các điều kiện bảo quản 57

Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi kích thước trung bình của tiểu phân khi sơ

bộ đánh giá độ ổn định 59

Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi PDI khi sơ bộ đánh giá độ ổn định 59 Hình 3.17 Sự thay đổi thế zeta trong quá trình sơ bộ đánh giá độ ổn định 60

MỞ ĐẦU

Ngày nay việc sử dụng các hoạt chất thiên nhiên vào hỗ trợ và điều trị bệnh đã trởnên phổi biến.1 Do tình hình ô nhiễm môi trường, lối sống thiếu lành mạnh, thựcphẩm không đảm bảo và việc không tuân thủ điều trị đã dẫn đến nhiều tình trạng trầmtrọng hơn về sức khỏe Mặt khác, các thuốc từ dược liệu đã được chứng minh là antoàn và thân thiện hơn các thuốc hóa dược, do đó xu hướng dùng các thuốc có nguồngốc thiên nhiên ngày càng nhiều

Hương nhu là cây trồng hoặc mọc hoang phổ biến ở nước ta.2 Đã có nhiều vùng canhtác lớn nên nguồn dược liệu và tinh dầu luôn được đảm bảo.3-5 Thành phần, tác dụngcủa tinh dầu hương nhu đã được nghiên cứu rất nhiều cho thấy khả năng ứng dụngcao nhất là ở khả năng kháng khuẩn,6 giảm đau,7 kháng nấm,8 … nhưng tinh dầuhương nhu bị hạn chế do tính bay hơi, ít tan trong nước, gây kích ứng khi bôi trựctiếp lên da do đó một dạng mang thuốc giúp hạn chế sự bay hơi và giảm tác dụng phụ

là nhu cầu cần thiết.9

Niosome là một hệ thống phân phối thuốc nano với ưu điểm như có thể mang đồngthời hoạt chất thân nước và thân dầu, có khả năng phân hủy sinh học, không gây kíchứng.10 Tuy nhiên, hiện nay tại nước ta chưa có nghiên cứu về niosome chứa tinh dầuhương nhu trắng, do đó đề tài: “Nghiên cứu điều chế niosome chứa tinh dầu hươngnhu trắng” được tiến hành với các mục tiêu cụ thể sau:

- Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của niosome và tối ưu hóa quy trìnhđiều chế niosome bằng hướng tiếp cận dùng thiết kế thực nghiệm

- Xây dựng công thức và quy trình điều chế niosome chứa tinh dầu hương nhu trắngbằng phương pháp tiêm dung môi hữu cơ ethanol với hàm lượng tải eugenol tốithiểu 2,0 %

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng eugenol trong tinh dầu hương nhu vàeugenol trong niosome chứa tinh dầu hương nhu trắng bằng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây hương nhu

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Ở nước ta hiện nay có hai loài hương nhu là Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum

L hay É trắng, É lá lớn) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., O tenuiflorum L.

hay É tía), họ Bạc hà (Lamiaceae).2,11 Tên nước ngoài của hương nhu là holy basil,lemon basil, large basil, basil – clove, …

Mô tả thực vật

Cây hương nhu là loại cây nhỏ, sống hàng năm hoặc nhiều năm, thân có thể cao từ1,5 – 2 m (về chiều cao thì hương nhu trắng cao hơn hương nhu tía) Với hương nhutía thì thân và cành thường có màu tía Lá có cuống dài, thuôn hình mác hoặc hìnhtrứng, mép lá có răng cưa và lá có lông Lá và hoa khi vò ra có mùi thơm đinh hương.Hương nhu tía có hoa màu tím, mọc thành chùm xếp thành vòng từ 6 – 8 chiếc trênchùm, ít khi phân nhánh Hương nhu trắng có hoa nhỏ mọc thành xim đơn 6 hoa, xếpthành chùm, đôi khi ở phía dưới có phân nhánh, hạt không nở và không có chất nhầybao quanh khi cho vào nước.2

Phân bố, sinh học và sinh thái

Cây hương nhu phân bố khắp cả nước có thế được trồng hoặc mọc hoang Tại nước

ta hương nhu trắng mọc hoang nhiều tại các tỉnh Quảng Ninh, Hà Giang, TuyênQuang, Hải Dương, Phú Yên, Bình Định, … ngoài ra loài cây này còn phân bố nhiều

ở các nước khác như Ấn Độ, Lào, Thái Lan Phần thân trên mặt đất là nguyên liệuchưng cất tinh dầu.2

Thành phần hóa thực vật

Trong cây hương nhu trắng và tía đều có tinh dầu nhưng tỉ lệ tinh dầu trong hươngnhu trắng (60 – 80 %) cao hơn hương nhu tía (20 – 30 %).2 Tinh dầu hương nhu cóthành phần chính là eugenol ngoài ra còn chứa các chất như elemen, carophylen,linalool, …12,13 Tinh dầu hương nhu nếu để lâu ngoài không khí sẽ chuyển từ màu

vàng nhạt sang nâu đen do sự biến đổi màu của eugenol.2,14 Thành phần và tỉ lệ cácchất trong tinh dầu thay đổi tùy vào giống cây, khí hậu, thổ nhưỡng, điều kiện trồngtrọt, thu hái, …15,16 Các nghiên cứu về thành phần các chất và tỉ lệ của chất có trongtinh dầu hương nhu được trình bày tại Bảng 1.1 Dược điển Việt Nam V (DĐVN V)

có quy định về định lượng tinh dầu hương nhu trắng bằng bình cassia 100 ml yêu cầutinh dầu phải chứa ít nhất 60 % (tt/tt) eugenol (C10H12O2) toàn phần.11

Bảng 1.1 Thành phần các chất có trong tinh dầu hương nhu Loài Các thành phần chiếm tỉ lệ cao Nơi trồng

Ocimum gratissimum

γ-muurolene 91,6 (µg/mL tinh dầu) Thái Lan 17

Ocimum sanctum

Eugenol 71,21%; β-caryophyllen12,96%; cis-β-elemen 9,67%

Bình Định 3(Việt Nam)Eugenol 24,63%; 1,8-Cineole 20,45%;

Eugenol 22 %; β-elemene 19,2%;

13

Methyl eugenol 98,4; α-cubebene 9,94;

α-copaene 4,74 (µg/mL tinh dầu) Thái Lan 17Thông qua các nghiên cứu tại Bảng 1.1 và sự không cố định thành phần hay tỉ lệ cácchất trong tinh dầu, rất khó nếu chỉ dùng phương pháp định lượng để phân biệt tinhdầu hương nhu trắng và tinh dầu hương nhu tía Do đó khi lựa chọn nguyên liệu tinhdầu hương nhu cần có yêu cầu tối thiểu về hàm lượng eugenol chứa trong tinh dầu

Có thể tham khảo theo yêu cầu của DĐVN V hoặc tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của nhàcung cấp nguyên liệu tinh dầu hương nhu

1.1.2 Tác dụng dược lý

Theo Đông y, hương nhu có vị cay, hơi ôn, vào 2 kinh phế và vị Có tác dụng làm ramồi hôi, chữa cảm mạo, giảm sốt, lợi thấp hành thủy, dùng chữa cảm mạo, nhức đầu,đau bụng.2

Tinh dầu hương nhu có nhiều tác dụng dược lý có thể kể đến như hạ đường huyết,18kháng khuẩn,4,13 kháng nấm,8 chống oxy hóa,8,13 bảo vệ gan,19 giảm đau,7 trị loét dạdày,19 … Theo các nghiên cứu khoa học đã được công bố thì eugenol là hoạt chất chocác tác dụng dược lý kể trên.13 Đánh giá về khả năng kháng khuẩn hoặc kháng nấm,các nghiên cứu dựa vào chỉ số nồng độ tối thiểu ức chế (MIC), nồng độ tối thiểu diệtkhuẩn (MBC), nồng độ tối thiểu diệt nấm (MFC) Tiến hành so sánh các nghiên cứucủa các tác giả về việc để cùng ức chế/diệt 1 loại vi khuẩn thì MIC của eugenol sẽnhỏ hơn MIC của tinh dầu Nghiên cứu của tác giả Nawal Kishore Dubey và cộng sự,

để kháng nấm Malassezia pachydermatis thì MIC tinh dầu hương nhu trắng là 300

μg/g còn MIC eugenol là 150 μg/g; có thể giải thích điều này là vì trong thành phầncủa tinh dầu hương nhu có nhiều thành phần nên khi quy đổi từ tinh dầu hương nhu

ra eugenol thì hàm lượng eugenol trong tinh dầu có thể tướng ứng với eugenol nguyênchất đang dùng để khảo sát.20

1.1.3 Một số chế phẩm trên thị trường chứa hương nhu

Một số chế phẩm chứa hương nhu được sản xuất và sử dụng với mục đích bảo vệ sứckhỏe cả ở nước ngoài và trong nước được trình bày trong Bảng 1.2 Các chế phẩmđều là các thực phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc hóa mỹ phẩm dùng ngoài da hoặc dùngđường uống Tùy dạng bào chế thì công dụng và hàm lượng của hương nhu cũng sẽkhác nhau Như dạng nang cứng chứa bột lá hương nhu, hương nhu sẽ là thành phầnchính, còn dạng kem đánh răng hoặc dầu gió tỉ lệ của tinh dầu hương nhu sẽ nhỏ

Bảng 1.2 Một số chế phẩm chứa hương nhu trên thị trường Dạng bào

Ấn Độ

Bột lá hươngnhu tía

Ocimum tenuiflorum

Giảm căng thẳng, hỗ trợ giấc ngủcho trường hợp bị mất ngủ thườngxuyên, hỗ trợ tuyến thượng thận

Kem đánh

răng dạng

gel

Radius, Mỹ Bột lá Giúp bảo vệ sức khỏe răng nướu,

ngăn ngừa sâu răng

Dầu gội

dược liệu

Nguyên Xuân,Việt Nam

Tinh dầu Giúp tóc suôn mượt và kích thích

mọc tócDầu gió Dược phẩm Fito

Pharma, ViệtNam

Tinh dầu Giúp ức chế cơn đau trên cơ thể,

sát khuẩn, ngăn ngừa triệu chứnghọng – mũi bị kích thích

Nhiệt độ bay hơi 254 – 255 °C ở 1 átmốtphe (atm) và 93 – 130,5 °C ở 0,013 atm

Độ tan trong các dung môi được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Độ tan của eugenol trong các dung môi

thấp hơn 1 mg/ml ở 20 C 14 hoặc 1,154g/l ở 20 °C 21

Ethanol 70 % 1 ml eugenol trong 2 ml ethanol 70 %

hoặc thấp hơn 1 mg/ml ở 20 C 14

Gốc alcohol, cloroform, ete, dầu Hỗn hòa14

Dung dịch nước kiềm, acid acetic băng Hỗn hòa14

Các phương pháp định lượng

Để định lượng eugenol có thể kể đến các phương pháp như: phương pháp thể tíchdùng bình cassia,11 quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis), sắc ký lỏnghiệu năng cao (HPLC) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS).14 Do định hướng đềtài sẽ tiến hành định lượng đánh giá khả năng tải tinh dầu thông qua việc đánh giáhàm lượng eugenol (thành phần có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu hương nhutrắng) vì vậy các điều kiện định lượng eugenol bằng phương pháp HPLC được thamkhảo và liệt kê trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Một vài điều kiện định lượng eugenol bằng phương pháp HPLC Tên đề tài rút

mm, 5 μm)

MeOH:W60:40

mm, 5 μm

MeOH:ACN:W10:50:40

mm, 5 μm

ACN: acidtrifluoroacetic0,1 %62:38

0,43 40 C 380 nm

Tác dụng dược lý của eugenol

Vì eugenol là thành phần chính trong tinh dầu hương nhu nên các tác dụng dược lýcủa eugenol cũng tương tự như tinh dầu hương nhu, kể đến như: chống ung thư,25kháng khuẩn,26 kháng nấm,27 giảm đau,7 … Theo tác giả Anna Marchese và cộng sự,

26 tác giả Heba A Hassan và cộng sự,28 MIC của eugenol cho vi khuẩn gram âm,gram dương và vi nấm nằm trong khoảng từ 0,1 μl/ml đến 2 mg/ml; MBC trongkhoảng 0,1 μl/ml đến 1600 μg/ml; MFC trong khoảng 0,1 μl/ml đến 7,88 mg/ml

Một số chế phẩm trên thị trường chứa eugenol

Một vài chế phẩm trên thị trường được đề cập trong Bảng 1.5 Eugenol hiện nay được

sử dụng phổ biến nhất trong nha khoa và dùng dạng eugenol tinh khiết sẽ phối hợpoxyd kẽm để làm vật liệu trám tạm thời Các dạng bào chế dùng với mục tiêu trị liệutrên da không nhiều hoặc chỉ bổ sung eugenol làm thành phần phụ

Bảng 1.5 Các chế phẩm chứa eugenol trên thị trường Dạng bào chế Tên sản phẩm - Nhà sản xuất Công dụng

Gel bôi da After-sting – ALPA, Cộng Hòa

Séc

Giảm các triệu chứngviêm, sưng, ngứa, nóngrát do bị côn trùng đốtBột trám răng

Hình 1.2 Cấu trúc niosome

Nguồn: “Niosome as a novel pharmaceutical drug delivery: a brief review highlighting

formulation, types, composition and application”

Lõi thân nước

Vỏ thân dầu

Phân loại niosome dựa vào kích thước và số lớp vỏ Có thể phân loại thành:30

Niosome đơn lớp kích thước nhỏ (25 – 50 nm)

Niosome đơn lớp kích thước lớn (trên 100 nm)

Niosome đa lớp (500 - 1000 nm)

1.2.2 Ưu điểm và nhược điểm của niosome

Ưu điểm

Tăng sinh khả dụng đường uống của thuốc và khả năng thẩm thấu vào da.31

Cấu trúc màng kép giúp vận chuyển các thuốc thân dầu, có thể giúp giải phóng hoạtchất có kiểm soát Tăng tính ổn định đối với các thuốc thân dầu trong môi trườngnước Cải thiện hiệu quả điều trị của thuốc bằng cách bảo vệ thuốc khỏi môi trườngsinh học.32

Đa dạng đường dùng như uống, tiêm, bôi ngoài da.31

Cấu trúc vỏ là chất hoạt động bề mặt có tính tương thích sinh học cao và giảm cácphản ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể.32

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc các loại niosome (a) đơn lớp; (b), (c) đa lớp

Nguồn: “Advances of non-ionic surfactant vesicles (niosomes) and their application in

drug delivery”

Nhược điểm

Tính không ổn định về mặt vật lý như kết tụ, hợp nhất tiểu phân, rò rỉ thuốc Niosomeđược phân tán vào môi trường nước do đó thuốc đã được tải vào trong niosome dễ bịthủy phân làm hạn dùng/bảo quản thuốc thường ngắn, cần thêm các phương pháp hóarắn để cải thiện độ ổn định.31,32

1.2.3 Khả năng vận chuyển thuốc của niosome

Niosome giúp phân phối thuốc đến đích tác động, tăng hiệu quả điều trị và giảm cáctác dụng không mong muốn.10 Nhờ cấu trúc 2 lớp khép kín, tiểu phân niosome có thểmang được đa dạng loại hoạt chất: lớp vỏ kỵ nước chứa hoạt chất thân dầu, phần lõithân nước chứa hoạt chất thân nước.29 Tùy thuộc vào loại thuốc, chất hoạt động bềmặt, bệnh và vị trí hấp thu, có nhiều đường dùng khác nhau đối với thuốc niosomenhư tiêm tĩnh mạch, tiêm dưới da, tiêm bắp, uống, nhỏ mắt, dạng hít, qua da, phânphối thuốc qua hàng rào máu não.31,33,34

1.2.4 Thành phần của niosome

Niosome gồm hai thành phần chính là CDH không ion, cholesterol, trong đó CDH

là thành phần cơ bản của niosome.32

CDH không ion

CDH không ion có các ưu điểm như ít độc, dễ tránh khỏi các phản ứng miễn dịch của

cơ thể,35 ít bị ảnh hưởng bởi pH môi trường.36 Cấu trúc CDH không ion có hai phầnriêng biệt là đuôi kỵ nước và đầu thân nước hai phần này được kết nối với nhau bằngliên kết ester, ether hoặc amid.37

Chỉ số cân bằng dầu – nước (HLB) được quan tâm khi chọn CDH không ion do chỉ

số này quyết định sự hình thành của lớp vỏ (màng kép) Giá trị HLB đối với chất hoạtđộng bề mặt không ion là từ 0 đến 20 Giá trị HLB từ 14 đến 17 không tạo ra đượcniosome, khả năng tạo niosome cao nhất khi giá trị HBL là 8,6 Hiệu suất tạo niosomegiảm khi HLB giảm từ 8,6 xuống 1,7.35 Theo tác giả Karim Masud Kazi và cộng sự,CDH là sorbitan monostearate (span 60) có HLB là 4,7 có thể tạo niosome cho tác

dụng kéo dài.34 Ngoài ra khi chọn lựa CDH không ion cần lưu ý đến chiều dài củađuôi thân dầu, nhiệt độ chuyển pha/nhiệt độ nóng chảy nên chọn quy trình bào chếgia nhiệt cao hơn nhiệt độ chuyển pha Tỉ lệ CDH so với cholesterol hoặc bản chấtcủa hoạt chất cũng có thể ảnh hưởng đến kích thước, khả năng tải và khả năng giảiphóng hoạt chất.34 Các chất thường dùng làm CDH gồm: alkyl ether, alkyl ester, alkylamide, acid béo sorbitan ester, …

Alkyl ether là CDH tạo thành túi niosome tốt nhất, độ ổn định cao do đó hay dùng đểbao các peptid và protein, ít gây dị ứng da, dễ phối hợp với các CDH khác Một vàiCDH thuộc nhóm này như brij 30 (HLB 9,7); brij 58 (HLB 15,7); brij 72 và 92 đượcdùng để điều chế niosome đa lớp, …31

Acid béo sorbitan ester gồm có span Trong đó, span 60 cấu trúc đầu sorbitol thânnước và đuôi kỵ nước 15 carbon, nhiệt độ chuyển dạng trong khoảng 50 – 60 C.38Tan ít trong ethanol (50 mg/ml), tan trong iso – propanol, dầu khoáng, dầu thực vật,không tan trong nước

Cholesterol

Vai trò cholesterol được cung cấp vào vỏ để tăng độ cứng, thay đổi tính thấm vớinước, giảm rò rỉ hoạt chất và tăng hiệu quả bắt giữ hoạt chất thân nước Liên kết giữaspan 60 và cholesterol trong lớp vỏ niosome là liên kết hydro.33 Cần khảo sát tỉ lệspan 60:cholesterol vì khi tăng dần cholesterol khả năng tải hoạt chất tăng.39 Nhưngthực tế sau khi vượt qua một tỉ lệ chất định cholesterol thì khả năng tải hoạt chất sẽgiảm xuống.35 Cholesterol thực tế không tan trong nước (ít hơn 0,5 mg/100 ml nước);

ít tan trong ethanol (1,29 % khối lượng/khối lượng ở 20 °C); tan nhiều hơn trong cồnnóng (28 g cholesterol tan trong 100 g dung dịch ethanol 96 % bão hòa ở 80 °C).Ngoài ra, 1 g cholesterol tan trong 2,8 ml ether; 4,5 ml cloroform và 1,5 ml pyridin;hòa tan dễ dàng trong axeton, dioxan, etyl axetat, benzen, ete dầu mỏ, dầu, chất béo

và trong dung dịch nước của muối mật.40

Kolliphor RH40

Theo tác giả Li Key Yeo cùng cộng sự, vai trò của kolliphor RH40 được xem nhưmột chất đồng diện hoạt Các chất đồng đồng diện hoạt thân nước hơn CDH do đóđược dùng như chất nhũ hóa, hòa tan và làm ướt Giá trị HLB chất đồng diện hoạtcao hơn CDH thường là từ 12 đến 16 và trọng lượng phân tử cao hơn 1000 Da.41

1.2.5 Phương pháp bào chế

Để bào chế niosome có thể kể đến các phương pháp như hydrat màng phim mỏng,bay hơi pha đảo, tiêm ether, tiêm ethanol, phương pháp vi lỏng (tương tự tiêmether/ethanol nhưng tiên tiến hơn), phương pháp gia nhiệt,35 … Yêu cầu để có thể tạoliên kết giữa CDH và cholessterol là cần phải có năng lượng đầu vào là nhiệt hoặcsiêu âm, rung lắc

Phương pháp hydrat màng phim mỏng

Trong quá trình hydrat màng phim mỏng, CDH, chất hỗ trợ như cholesterol hoặcđồng diện hoạt được hòa tan bằng dung môi hữu cơ trong bình cầu đáy tròn Màngphim được hình thành khi khi tiến hành loại bỏ dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm(thu hồi dung môi) Sau đó màng mỏng được hydrat hóa bằng dung dịch nước Khithực hiện quá trình hydrat hóa màng phim cần tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độchuyển pha của CDH Phương pháp thường áp dụng cho dược chất thân dầu và thuđược niosome nhiều lớp, kích thước lớn và có thể loại bỏ gần như toàn bộ dung môihữu cơ Do đó cần có thêm các bước tinh chế hoặc đồng nhất hóa để giảm kích thướctiểu phân (ép đùn, siêu âm, …).31,42

Phương pháp bay hơi pha đảo

Tiến hành bằng cách hòa tan các chất thân dầu vào pha hữu cơ, các chất thân nướcvào pha nước Sau đó phối hợp pha nước vào pha hữu cơ, dùng siêu âm để trộn đều.Hỗn hợp sẽ được loại bỏ toàn bộ dung môi hữu cơ và thu được niosome Phươngpháp này thường áp dụng cho hoạt chất thân nước và thu được niosome đơn lớp kíchthước lớn Thường được kết hợp với phương pháp đùn ép.43

Phương pháp tiêm ether hay phương pháp tiêm ethanol

Nguyên tắc tiến hành của 2 phương pháp giống nhau chỉ khác dung môi hữu cơ lựachọn là ether hoặc ethanol Các chất thân dầu sẽ được hòa tan trong dung môi hữu

cơ, các chất thân nước được hòa tan trong nước Dùng kim tiêm để tiêm pha hữu cơvào pha nước, pha nước được gia nhiệt để tạo thành niosome đồng thời là để bay hơidung môi hữu cơ Phương pháp này thu được niosome dạng đơn lớp, nhưng có nhượcđiểm là khó loại toàn bộ dung môi hữu cơ ra khỏi niosome Ether có khả năng hòatan tốt các chất thân dầu hơn ethanol, tính bay hơi cao nên dễ loại ether ra khỏi hỗnhợp ether nước Do ethanol tạo với nước hỗn hợp đẳng phí (azeotrope), lúc này khó

có thể loại ethanol hoàn toàn khỏi sản phẩm bằng phương pháp chưng cất thôngthường.44 Nhược điểm của ether là dễ bay hơi, độc hại, dễ gây cháy nổ, ảnh hưởngđến môi trường và gây hiệu ứng nhà kính Trong khi đó ethanol được cho là một dungmôi “xanh”, có thể thu được từ phản ứng sinh học mặc dù dễ cháy và gây nổ nhưngdung môi này sẵn có, độ tinh khiết cao, giá thành phù hợp và có thể phân hủy sinhhọc.45 Phương pháp này có các yêu cầu kỹ thuật đơn giản, có thể nâng cơ lô bằng cácmáy móc thường quy trong phòng thí nghiệm Do đó đề tài tiến hành chọn phươngpháp tiêm ethanol để điều chế niosome

Phương pháp vi lỏng

Là phương pháp cải tiến của tiêm ether/ethanol, được tự động hóa bằng các kênh dẫnpha dung môi hữu cơ và pha nước nên có ưu điểm là tạo tiểu phân kích thước nhỏ,phân bố kích thước đồng nhất, độ lặp lại cao.42

Phương pháp gia nhiệt

Là phương pháp không sử dụng dung môi hữu cơ, CDH và cholesterol được trộn trựctiếp vào pha nước ở 140 C đồng thời khuấy trộn, lúc này sẽ tạo thành niosome nhưng

có phân bố kích thước rộng Sau đó tiến hành đùn ép để thu niosome kích thước đồngnhất hơn.35

1.2.6 Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn định của niosome trong nước và ngoài nước

Trên thế giới, số lượng các công trình nghiên cứu về niosome khá nhiều và đa dạng

về phương pháp bào chế, loại thuốc, đường dùng, … một vài nghiên cứu được trìnhbày trong Bảng 1.6 Trong nước, nghiên cứu về niosome hiện nay có nhưng vẫn cònhạn chế Các nghiên cứu trong nước đã công bố được trình bày trong Bảng 1.7 Hiệnnay trên thị trường, niosome đã có ứng dụng ở ngành mỹ phẩm nhưng trong ngànhDược vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu phát triển.46

Bảng 1.6 Nghiên cứu quốc tế về niosome

1

Hydrat hóa màng phim

Diclofenac Mục tiêu cải thiện sự ổn định, giảm liều dùng

và cho phép phân phối đến mô cụ thể 47

2 Gentamicin Điều trị tại chỗ trong nhãn khoa 48

3 Methotrexat Trị liệu tại chỗ qua da 49

4

Tinh dầu

Trachyspermum copticum

Chống oxy hóa hướng đến tác dụng điều trị ung thư 50

5

Tiêm ether

Aceclofenac Cải thiện sinh khả dụng 51

6 Etoricoxib Phân phối thuốc đến đích cụ thể 52

7 Naproxen Cải thiện các dạng đường uống hiện tại,

giảm tác dụng phụ 53

8

Bay hơi pha đảo

Acetazolamide Nhãn khoa, kéo dài tác dụng hạ nhãn áp 54

9 Paclitaxel Tăng sinh khả dụng, giảm độc tính trong

điều trị ung thư 55

10 Biến tính màng lipid Sulfadiazin Tăng tính thấm qua da 56

Bảng 1.7 Nghiên cứu trong nước về niosome

1

Hydrat hóa màng phim

Điều kiện bảo quản là một phần trong nghiên cứu độ ổn định với mục đích đánh giáchất lượng của dược chất hay sản phẩm thay đổi như thế nào theo thời gian dưới tácđộng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, pH, tiếp xúc không khí, ánh sáng, tiacực tím, …).64 Trên thế giới có nhiều hướng dẫn về thử nghiệm độ ổn định của thuốcnhư World Health Organization (WHO), International Conference of Harmonization(ICH), Food and Drug Administration (FDA), Association of South East AsianNations (ASEAN), … tùy vào vùng khí hậu, dạng bào chế, thời gian, điều kiện thửnghiệm để xây dụng quy trình phù hợp.64-67 Một vài nghiên cứu có đề cập đến đánhgiá độ ổn định của dạng bào chế niosome được trình bày trong Bảng 1.8.

Bảng 1.8 Các thử nghiệm đánh giá độ ổn định của niosome

STT Điều kiện bảo

quản (nhiệt độ/độ

ẩm)

Thời gian thử nghiệm

Thời gian lấy mẫu (ngày)

Thành phần công thức Vùng

khí hậu

1.2.7 Chỉ tiêu đánh giá niosome

Các tính chất cụ thể của niosome có thể dùng để đánh giá mức độ ổn định hóa lý vàkhả năng phân bố trong cơ thể Một số chỉ tiêu đánh giá đặc trưng của niosome như:hình thái cấu trúc, kích thước trung bình tiểu phân, hệ số đa phân tán, thế zeta, hiệusuất bắt giữ hoạt chất, …

Hình thái cấu trúc tiểu phân niosome

Niosome được cho là có cấu trúc hình cầu hoặc gần tròn Hình thái bên ngoài của tiểuphân được quan sát bằng hệ kính hiển vi điện tử như kính hiển vi điện tử quét (SEM),kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM); TEM và kính hiển vi điện tử đông lạnh Cryo– EM đồng thời có thể cung cấp cấu trúc lõi/vỏ của tiểu phân Đối với tiểu phân cókích thước lớn (tầm μm) có thể dùng kính hiển vi quang học để quan sát hình thái tiểuphân.42

Cấu trúc lớp vỏ kép do các CDH không ion tập trung tạo thành do đó dưới kính hiển

vi phân cực ánh sáng có xuất hiện chữ X Số lượng lớp vỏ kép của tiểu phân đượcxác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ tia X góc nhỏ và kính hiển vi điện

tử Độ cứng của lớp vỏ kép được đánh giá bằng đầu dò huỳnh quang dựa vào sự biếnthiên nhiệt độ.34

Đáng giá kích thước trung bình tiểu phân

Kích thước trung bình tiểu phân cho biết khả năng phân bố trong tuần hoàn và hệ sốthanh thải của tiểu phân Tùy mục tiêu sử dụng mà kích thước tiểu phân sẽ được điềuchỉnh cho phù hợp, kích thước tiểu phân tương ứng với vị trí phân bố trong cơ thểđược trình bày trong Bảng 1.9.73

Bảng 1.9 Kích thước tiểu phân tương ứng với vị trí phân bố trong cơ thể

Đường vận chuyển thuốc

tiểu phân

Toàn thân

Mao mạch mạch máu vào xoang xương, lá

Hô hấp

Hệ số đa phân tán (PDI)

Hệ số đa phân tán cho biết sự phân bố kích thước tiểu phân Trị số này phân bố trongkhoảng từ 0,0 (mẫu hoàn toàn đồng nhất về kích thước) đến 1,0 (mẫu có độ phân tánkích thước cao hay kích thước các tiểu phân không đồng nhất) từ đây có thể dùng đểđánh giá độ ổn định của mẫu.73 Có thể đánh giá sự ảnh hưởng của PDI đến cách phân

bố kích thước tiểu phân dựa vào Bảng 1.10.73

Bảng 1.10 Ảnh hưởng của PDI đến cách phân bố kích thước tiểu phân

Giá trị PDI Phân bố kích thước tiểu phân

Thế zeta

Thế zeta dùng để chỉ điện thế trong hệ phân tán keo, đây là một chỉ số phản ánh mức

độ ổn định của hệ phân tán, giá trị tuyệt đối của zeta càng lớn thì lực đẩy tĩnh điệnlớn nên hệ phân tán càng ổn định Mức độ ảnh hưởng của thế zeta đến độ ổn định của

hệ phân tán được trình bày trong Bảng 1.11.74

Bảng 1.11 Ảnh hưởng của thế zeta đến độ ổn định của hệ phân tán Giá trị tuyệt đối của thế zeta (mV) Múc độ ổn định của hệ phân tán

Đánh giá hiệu suất bắt giữ hoạt chất (Entrapment efficiency – EE % )

Hiệu suất bắt giữ hoạt chất là một tiêu chí để đánh giá chất lượng của niosome hoặcphương pháp/quy trình bào chế Hiệu suất bắt giữ càng cao thì hiệu quả điều trị cũngcao Đánh giá dựa vào tỉ số giữa lượng dược chất được nạp vào niosome với tổng

lượng dược chất ban đầu được sử dụng, biểu thị bằng % và được tính theo công thứcsau: EE % = (Dược chất nạp/Dược chất ban đầu) * 100.42

Các kỹ thuật đánh giá hiệu suất nạp hay được sử dụng gồm: sắc ký cột gel, thẩm tích,siêu lọc kết hợp với ly tâm Do cấu trúc niosome và liposome tương đồng nên các kỹthật đánh giá được tham khảo từ tài liệu liposome.75

Sắc ký cột gel dùng cột sắc ký để tách dược chất tự do ra khỏi mẫu bằng cột Sephadexhoặc cột Sepharose dựa trên nguyên tắc khác nhau về thời gian lưu giữa dược chất tự

do với cấu trúc niosome Ưu điểm của phương pháp này là điều kiện tách tương đối

ổn định, tái sử dụng cột Nhược điểm là không áp dụng được với dược chất thân dầu,thời gian tiến hành rửa giải lâu và tốn dung môi

Phương pháp thẩm tích, những phân tử nhỏ sẽ bị loại bỏ khỏi mẫu bằng cách sử dụngmàng bán thấm có các lỗ nhỏ cho phép những phân tử nhỏ được tự do chui qua lỗ.Khi tiến hành cần lựa chọn môi trường thẩm tích là môi trường hòa tan tốt dược chấtnhưng không làm phá vỡ cấu trúc Thường áp dụng cho các dược chất thân nước, vẫn

có thể áp dụng cho dược chất thân dầu nhưng phải tìm được môi trường thẩm tíchthích hợp Ưu điểm của phương pháp này là tiến hành thực hiện đơn giản, kết quả có

độ lặp lại cao Nhược điểm là thời gian tiến hành dài

Phương pháp siêu lọc kết hợp với ly tâm là phương pháp nhanh và đơn giản để táchdược chất tự do ra khỏi dạng niosome Nguyên tắc dựa trên sự khác nhau về kíchthước dược chất tự do với niosome Sử dụng màng bán thấm để giữ lại các phân tử

có phân tử lượng cao (niosome), các chất phân tử lượng thấp, dược chất tự do, nước

sẽ đi qua Khi tiến hành phương pháp này cần lưu ý lựa chọn kích thước màng bánthấm phù hợp với kích thước niosome Ưu điểm của phương pháp là không làm phaloãng mẫu (cả 2 phương pháp trước đều làm mẫu bị pha loãng do đó không phù hợpvới mẫu có tỉ lệ dược chất tự do quá thấp vì sẽ không phát hiện được), thao tác tiếnhành nhanh, độ lặp lại cao Nhược điểm là cần phải lựa chọn điều kiện ly tâm thíchhợp do dưới tác động của lực ly tâm có thể gây ra sự rò rỉ hoạt chất hoặc vỡ niosome

Đề tài nghiên cứu chọn phương pháp siêu lọc kết hợp với ly tâm để đánh giá hiệu suấtbắt giữ hoạt chất do eugenol bản chất không tan trong nước (thấp hơn 1 mg/ml ở 20

C 14 hoặc 1,154 g/l ở 20 °C 21) do đó hàm lượng eugneol tự do trong pha nước rất ít,cần chọn một phương pháp không pha loãng mẫu Đồng thời, phương pháp này cóthao tác tiến hành nhanh

Giải phóng hoạt chất in vitro

Việc đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro bằng phương pháp thẩm tách

với túi thẩm tách Độ phóng thích hoạt chất qua màng thẩm tách được tiến hành bằngcách hút chính xác một lượng chế phẩm cho vào túi thẩm tách đã được hoạt hóa, tiếnhành trên máy khuấy từ và giữ mức nhiệt duy trì Đánh giá lượng hoạt chất giải phóng

ra môi trường ngoài túi bằng phương pháp định lượng thích hợp Mỗi lần rút dịch đểđịnh lượng phải bổ sung một lượng tương đương dung dịch đệm mới trở lại hệ.34

Giải phóng hoạt chất in vivo

Thí nghiệm đánh giá giải phóng hoạt chất in vivo được đánh giá trên động vật thửnghiệm là chuột bạch Tùy vào đường dùng mà chuột thử nghiệm sẽ được tiêm dạngniosome vào tĩnh mạch đuôi, cho uống, thử nghiệm trên da, …sau đó tiến hành đánhgiá với nhóm không sử dụng niosome và nhóm sử dụng thuốc điều trị.34

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU

Nghiên cứu tiền cứu nhằm mục đích đánh giá và sàng lọc ra các mức trong biến độclập tỉ lệ CDH span 60:cholesterol trước khi tiến hành bằng thiết kế thực nghiệm vàlượng dung môi ethanol tồn dư, phương pháp loại ethanol do ethanol tồn dư có thểảnh hưởng đến độ tan của các chất Do đó các nghiên cứu sau gồm: sơ bộ đánh giá tỉ

lệ của CDH nhằm mục đích giảm số mức của biến độc lập X1 là tỉ lệ giữa CDH span60:cholesterol, sơ bộ đánh giá lượng dung môi hữu cơ tồn dư

Sơ bộ đánh giá X 1 tỉ lệ của CDH span 60:cholesterol

Tiến hành khảo sát các tỉ lệ CDH span 60:cholesterol từ 10:10,00 đến 10:1,10(mol/mol) ở điều kiện cố định như sau: thể tích pha hữu cơ ethanol 99,7 % là 25 ml;thể tích pha nước 50 ml (tương ứng tỉ lệ pha hữu cơ:pha nước là 1:2); pha nước vàpha hữu cơ được gia nhiệt đến 40 ± 2 C trước khi tiến hành tiêm pha hữu cơ; tốc độkhuấy 500 vòng/phút; tốc độ tiêm pha hữu cơ vào pha nước 5 ml/phút; nhiệt độ phốitrộn 2 pha 40 ± 2 C; thời gian phối trộn 40 phút (chưa tiến hành loại bỏ dung môihữu cơ tồn dư) Mẫu sau đó được đánh giá qua 01 chu kỳ nhiệt động học Ghi nhậncó/không có mảng tinh thể tái kết tinh span 60 hoặc cholesterol bằng cách soi kínhhiển vi quang học Công thức bào chế pha hữu cơ theo từng tỉ lệ span 60:cholesterolrút gọn được thể hiện trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức bào chế của pha hữu cơ để sơ bộ đánh giá tỉ lệ

Sơ bộ đánh giá lượng dung môi hữu cơ tồn dư

Khảo sát trên các công thức có tỉ lệ CDH span 60:cholesterol rút gọn là 10:10,00;10:3,33; 10:1,67; 10:1,43; 10:1,25; 10:1,12 (công thức bào chế được trình bày trongBảng 2.1) Tiến hành điều chế ở điều kiện: thể tích pha hữu cơ ethanol 99,7 % là 25ml; thể tích pha nước 50 ml (tương ứng tỉ lệ pha hữu cơ:pha nước là 1:2); pha nước

và pha hữu cơ được gia nhiệt đến nhiệt độ tương ứng với nhiệt độ phối trộn; tốc độkhuấy 500 vòng/phút; tốc độ tiêm pha hữu cơ vào pha nước 5 ml/phút; nhiệt độ phốitrộn 40, 50, 60 ± 2 C và thời gian phối trộn 40, 50, 60 phút Ghi nhận lại thể tíchmẫu bằng ống đong, đồng thời dùng phương pháp UV – Vis tạo màu với thuốc thửkali dicromat (Phụ lục 1) đánh giá lượng dung môi hữu cơ tồn dư (C %) ứng với từngđiều kiện nhiệt độ phối hợp và thời gian phối trộn Sau khi đánh giá được tồn dưethanol, tiến hành cô quay áp suất giảm để loại ethanol ở điều kiện: nhiệt độ bể côquay 50 ± 3 C; nhiệt độ của hệ thống sinh hàn 0 ± 2 C; tốc độ quay bình cầu 50vòng/phút; bình cầu được quay một chiều, không đảo chiều; thời gian 10 phút (Phụlục 2) Sau mỗi chu kỳ cô quay đánh giá lại tồn dư ethanol bằng phương pháp UV –Vis, nếu tồn dư ethanol trên 0,5 % tiến hành thêm nước cất vào mẫu đến thể tích 50

ml, lặp lại chu kỳ cô quay áp suất giảm và tái định lượng tồn dư; nếu tồn dư ethanolnhỏ hơn hoặc bằng 0,5 % tiến hành bổ sung thêm nước cất để dịch thu được cuốicùng là 50 ml

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm niosome không chứa hoạt chất (N – T) và niosomechứa tinh dầu hương nhu trắng (N – HNT) bào chế bằng phương pháp tiêm ethanol

2.1.1 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

Chất chuẩn eugenol được cung cấp bởi Sigma – aldrich, Đức với các thông số sau:đóng gói 250 mg/lọ; hàm lượng chuẩn 99,797 % bằng phương pháp sắc ký khí; tỉtrọng 1,067 g/cm3 ở 25 °C/lít; hạn dùng 12/2024; bảo quản trong lọ kín, môi trườngkhí trơ, chất chuẩn nhạy cảm với không khí (Phụ lục 3)

Yêu cầu tinh dầu hương nhu trắng phải chứa ít nhất 60 % (tt/tt) eugenol (C10H12O2)toàn phần theo DĐVN V.11 Định lượng eugenol trong nguyên liệu tinh dầu hươngnhu trắng bằng phương pháp HPLC và sắc ký khí ghép khối phổ cho kết quả lần lượt

là 68,06 % và 68,85 % (Quy trình chi tiết định lượng và kết quả hình phổ được trìnhbày trong Phụ lục 4)

Các hóa chất, dung môi và nguyên liệu sử dụng được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các hóa chất, dung môi và nguyên liệu STT Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nhà sản xuất

1 Tinh dầu hương nhu trắng TCCS Việt Nam

2.1.2 Trang thiết bị

Trang thiết bị nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.3

Thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là thiết bị tại Viện Khoa học Vật liệuỨng dụng

Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu

1 Cân phân tích 4 số lẻ PA214 Ohau, Mỹ

4 Máy khuấy từ gia nhiệt UC152 Stuart, Anh

5 Máy đo kích thước tiểu phân nano – thếzeta ZS ZEN 3600

Malvern panalytical,Anh

6 Kính hiển vi quang học CX21 Olympus, Nhật Bản

7 Máy cô quay áp suất giảm ModelN1300 V-WB

Eyela, Nhật Bản

8 Nhiệt kế điện tử HI98501 Hanna, Romania

11 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) LC-2030HSX

Shimadzu, Nhật Bản

12 Máy quang phổ UV – Vis 1800 Shimadzu, Nhật Bản

13 Máy sắc ký khí ISQ TM 7000 Thermo Scientific, Mỹ

14 Phần mềm thiết kế và tối ưu hóaDesign – Expert 13.0

Mỹ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của niosome bằng hướng tiếp cận dùng phần mềm Design Expert 13.0

Để đánh giá các yếu tố nào trong quy trình điều chế có thể ảnh hưởng đến độ ổn định,kích thước trung bình của niosome bằng thiết kế của phần mềm Design Expert 13.0.Thực nghiệm đánh giá trên đối tượng là N – T điều chế bằng phương pháp tiêmethanol các thông số điều chế do phần mềm đề xuất

a Thiết kế thực nghiệm bằng phần mềm

Thí nghiệm được thiết kế nhằm mục đích điều chế N – T bằng phương pháp tiêmethanol Quá trình khảo sát sơ bộ đã xác định mức độ ảnh hưởng của mỗi biến độclập Tiến hành thiết kế mô hình thí nghiệm bằng phần mềm Design Expert 13.0 Biến

độc lập gồm 4 biến, mỗi biến sẽ có các mức đáp ứng tương tự được trình bày ở Bảng2.4 Trong đó biến X1 là tỉ lệ CDH span 60 so với cholesterol (mol/mol) ở dạng rútgọn nhất và sẽ cố định tỉ lệ span 60, giảm dần tỉ lệ của cholesterol Mức 1 của biến

X1 tương ứng với tỉ lệ CDH span 60 so với cholesterol (mol/mol) là 10:5,00; tương

tự Mức 2 đến 5 lần lượt là các tỉ lệ 10:3,33; 10:2,50; 10:1,67; 10:1,43 Khi khai báocác mức độ của biến X1 vào phần mềm sẽ khai báo ký hiệu là 1, 2, 3, 4, 5 tương ứngvới Mức 1, …, Mức 5 Biến X4 là loại CDH trong công thức bào chế gồm Mức 1 chỉbao gồm chất diện hoạt là span 60 được ký hiệu S + C; Mức 2 bao gồm chất diện hoạtspan 60 và chất đồng diện hoạt kolliphor RH40, trong đó lượng kolliphor RH40 được

cố định theo tỉ lệ khối lượng/khối lượng giữa span 60:kolliphor RH40 là 5:1, ký hiệu

X 2 Nhiệt độ phối hợp pha

-X 3

Thời gian phối hợppha hữu cơ vào phanước

Bảng 2.5 Các biến phụ thuộc trong thiết kế thực nghiệm (sàng lọc)

Y 1 Kích thước trung bình của tiểu phân nm