nghiên cứu điều chế viên nén chứa cao định chuẩn hoa sao nhái hoa vàng cosmos sulphureus cav hỗ trợ điều trị bệnh gout

Trên các thử nghiệm in vitro,in vivo, dịch chiết hoa Sao nhái hoa vàng có hiệu quả kháng oxi hóa, kháng viêm dạnhái hoa vàng đã thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase của một

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐINH TRƯỜNG SƠN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VIÊN NÉN CHỨA CAO

ĐỊNH CHUẨN HOA SAO NHÁI HOA VÀNG

(Cosmos sulphureus Cav.) HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐINH TRƯỜNG SƠN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VIÊN NÉN CHỨA CAO ĐỊNH CHUẨN HOA SAO NHÁI HOA VÀNG

(Cosmos sulphureus Cav.) HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS NGÔ KIẾN ĐỨC

2 TS LÊ MINH QUÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu nêu trong luận văn là khách quan, trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đinh Trường Sơn

Luận văn thạc sĩ - khóa: 2021 - 2023 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc

Mã số: 8720202 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VIÊN NÉN CHỨA CAO ĐỊNH CHUẨN

HOA SAO NHÁI HOA VÀNG (Cosmos sulphureus Cav.) HỖ TRỢ

ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT Đinh Trường Sơn Người hướng dẫn: TS Ngô Kiến Đức và TS Lê Minh Quân

Đặt vấn đề: Sao nhái hoa vàng (Cosmos sulphureus Cav.), họ Cúc (Asteraceae) được

trồng làm cảnh ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam Trong y học cổ truyền,

hoa Sao nhái hoa vàng được dùng để trị sốt rét, béo phì Trên các thử nghiệm in vitro,

in vivo, dịch chiết hoa Sao nhái hoa vàng có hiệu quả kháng oxi hóa, kháng viêm dạ

nhái hoa vàng đã thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase của một sốhợp chất phân lập từ hoa Sao nhái hoa vàng, cho thấy đây là dược liệu tiềm năng đểsản xuất các chế phẩm có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gout

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hoa Sao nhái hoa vàng được đánh giá chất

lượng theo yêu cầu chung của DĐVN V Sau khi nguyên liệu được kiểm nghiệm tiếnhành chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt với hỗn hợp ethanol - nước

và chiết nóng với nước Chọn lựa cao chiết tiềm năng dựa trên hàm lượng flavonoid

toàn phần và các hoạt tính sinh học in vitro của cao chiết thu được Áp dụng điều kiện

chiết xuất đã tối ưu, nâng cấp cỡ lô điều chế cao định chuẩn và kiểm nghiệm chấtlượng cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng Đánh giá tác dụng dược lý của cao địnhchuẩn hoa Sao nhái hoa vàng trên các mô hình chống oxy hóa (mô hình DPPH),kháng viêm (mô hình gây viêm bằng carrageenan), tăng acid uric cấp và mạn tính(mô hình tiêm kali oxonat, i.p.) Xác định liều uống có tác dụng dược lý tốt nhất dùng

cho điều chế chế phẩm viên nén Nghiên cứu công thức tá dược tối ưu và xây dựngcác chỉ tiêu kiểm nghiệm cho dạng bào chế viên nén chứa cao hoa Sao nhái hoa vàng.

Kết quả: Nguyên liệu đầu vào hoa Sao nhái hoa vàng đạt các yêu cầu kiểm nghiệm

phục vụ nghiên cứu Chọn lựa được điều kiện tối ưu phù hợp để chiết xuất cao chiếthoa Sao nhái hoa vàng có hàm lượng flavonoid cũng như có hoạt tính tốt nhất là chiếtngấm kiệt với ethanol 70%, tỉ lệ dược liệu - dung môi 1:20, thời gian ngâm 12 h, tốc

độ rút dịch 0,5 ml/phút Nâng cấp cỡ lô 1 kg nguyên liệu/mẻ, quy trình chiết xuất đạttính ổn định và áp dụng cho nghiên cứu tác dụng dược lý hỗ trợ điều trị gout Kết quảthử nghiệm dược lý cho thấy liều cấp uống 250 mg/kg thể hiện tác dụng kháng viêmcấp và mạn tương đương với celecoxib liều 25 mg/kg Tương tự trên mô hình gâytăng acid uric máu cấp và mạn tính bằng kalioxonat (i.p), cao hoa Sao nhái hoa vàngliều 250 mg/kg cũng thể hiện tác dụng hạ acid uric tương tự thuốc đối chiếuallopurinol 10 mg/kg Chế phẩm viên nén hoa Sao nhái hoa vàng được điều chế vàđảm bảo đạt yêu cầu về độ cứng, độ rã, độ hòa tan Cao định chuẩn và chế phẩm viênnén hoa Sao nhái hoa vàng cũng đã được kiểm nghiệm các chỉ tiêu cơ bản theo quyđịnh của Dược Điển Việt Nam V

Kết luận: Nghiên cứu đã điều chế thành công viên nén chứa cao định chuẩn hoa Sao

nhái hoa vàng có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gout

Từ khóa: Sao nhái hoa vàng, tối ưu hóa quy trình, điều chế viên nén, hạ acid uric

máu, Gout.

Master’s thesis - Academic course: 2021 – 2023 Speciality: Pharmaceutical technology and Pharmaceutics

Speciality code: 8720202 FORMULATION AND EVALUATION OF TABLETS CONTAINING THE

QUANTIFIED EXTRACT OF COSMIC YELLOW FLOWER (COSMOS

SULPHUREUS CAV.) FOR GOUT’S TREATMENT

Dinh Truong Son Supervisor: PhD Kien Duc Ngo and PhD Minh Quan Le

Introduction: Cosmic yellow flower (Cosmos sulphureus Cav.), Asteraceae family,

is grown as an ornamental plant in many places around the world, including Vietnam

In traditional medicine, C sulphureus flower are used to treat malaria and obesity In

in vitro and in vivo bio-activity tests, the cosmic yellow flower extracts also shows

anti-oxidant, anti-gastritis, hepatitis, and arthritis effects Recently, a number of

studies on the chemical composition of C sulphureus flower have tested the xanthine oxidase inhibitory activity of some compounds isolated from C sulphureus flower Thats are showing C sulphureus flower are the potential materials to develop the

medicinal products for supporting the treatment of gout

Material and methods: C sulphureus flowers was evaluated for quality according

to the general requirements of the Vietnam Pharmacopoeia V After the raw materialsare tested, medicinal herbs are extracted using the percolation method with a mixturesolvent of ethanol - water, and hot extraction with water The potential extract wasselected based on the total flavonoid content and the xanthine oxidase inhibitoryactivities of the obtained extracts Applying optimized extraction conditions forupgrading the standard batch size and testing the quality of the quantified extract of

C sulphureus flower The pharmacological effects of the extract was evaluated the

anti-oxidant activity on DPPH tests; the anti-inflammatory activity on modelsinduced by carrageenan; and the acute and chronic hyperuricemia effects on models

induced by oxonate potassium (i.p.) After determination the administered dose with

the strongest pharmacological effect, the tablets was studied on the stablity and

optimized excipient formula The optimal C sulphureus flower tablets was tested the

quanlity levels following the requests of the Vietnam Pharmacopoeia V

Results: The C sulphureus flower materials is eligible for requirements of the

extraction study The optimal conditions suitable for extracting flowers with the highflavonoid content as well as the strongest activity is used the percolation method with70% ethanol as solvent, the ratio of medicinal herbs - solvent of 1:20 (w/w), thesoaking time of 12 hrs, the fluid withdrawal speed of 0.5 ml/min Upgrading the batchsize to 1 kg of raw material per batch, the extraction process is stable The quantified

C.sulphureus flower extract was applied to research on the pharmacological effects

to treat gout The pharmacological study results showed that C sulphureus extract

dose at 250 mg/kg demonstrated the acute and chronic anti-inflammatory effectsequivalent to celecoxib at 25 mg/kg Similar to the model acute and chronic

hyperuricemia induced by oxonate potassium 300 mg/kg (i.p), the dose 250 mg/kg of the C sulphureus flower extract also showed the same uric acid lowering effect as the reference drug allopurinol at 10 mg/kg The C sulphureus flower tablets are

prepared and ensured the stability of the product in terms of hardness, disintegration,

solubility The quantified extract and the optimal formula tablet of C sulphureus

flower has also been tested for basic criteria according to the provisions of theVietnam Pharmacopoeia V

Conlusion: The study has developed sucessfully the process for preparing tablets

from the quantified of C sulphureus flower to treat gout.

Key word: C sulphureus flower, optimization, tablet preparation, xanthine oxidase,

hyperuricemia, gout

MỤC LỤC

Trang

Danh mục chữ viết tắt i

Danh mục các hình ii

Danh mục các bảng iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan bệnh gout và phương pháp nghiên cứu trong hỗ trợ điều trị gout 3

1.2 Tổng quan về sao nhái hoa vàng và các công trình nghiên cứu có liên quan 7

1.3 Chiết xuất và phân biệt các cao chiết dược liệu 14

1.4 Tổng quan về viên nén và các tá dược dùng trong đều chế viên nén chứa cao dược liệu 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 51

3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất cao định chuẩn 51

3.2 Đánh giá tác dụng sinh học của cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng 58

3.5 Nghiên cứu điều chế viên nén từ cao chiết định chuẩn 64

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 77

4.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng 77

4.2 Đánh giá tác dụng sinh học của cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng 78

4.3 Nghiên cứu điều chế viên nén chứa cao định chuẩn Sao nhái hoa vàng 84

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88

5.1 Kết luận 885.2 Kiến nghị 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ nguyên gốc Nghĩa tiếng Việt

inflammatory drug

Kháng viêm không steroid

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh và tiếp cận điều trị gout 4

Hình 1.2 Hình ảnh Sao nhái hoa vàng (Cosmos sulphureus Cav.) 8

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của coreopsin 13

Hình 2.1 Vùng trồng dược liệu Sao nhái hoa vàng (A), hình ảnh dược liệu (B) và tiêu bản dược liệu (C) 23

Hình 2.2 Trình tự các nội dung nghiên cứu 26

Hình 2.3 Lưu đồ điều chế viên ở giai đoạn sàng lọc tá dược rã 43

Hình 3.1 Kết quả định tính mẫu nguyên liệu SNHV bằng phản ứng hóa học 51

Hình 3.2 Kết quả định tính coreopsin trong nguyên liệu bằng sắc ký lớp mỏng 51

Hình 3.3 Kết quả định tính mẫu cao SNHV bằng phản ứng hóa học 56

Hình 3.4 Kết quả định tính coreopsin trong cao định chuẩn bằng sắc ký lớp mỏng 57

Hình 3.5 Viên nén nhân A) và viên nén bao phim B) chứa cao SNHV 74

Hình 3.6 Kết quả định tính flavonoid trong chế phẩm SNHV 74

Hình 3.7 Sắc ký đồ định tính coreopsin trong chế phẩm viên nén 75

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân biệt cao chuẩn hóa, cao định chuẩn và cao nguyên liệu 17

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng 24

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất dự kiến sử dụng 25

Bảng 2.3 Bố trí thử nghiệm khảo sát tác dụng hạ acid uric cấp – điều trị 37

Bảng 2.4 Bố trí thử nghiệm khảo sát tác dụng hạ acid uric cấp – dự phòng 38

Bảng 2.5 Bố trí thử nghiệm khảo sát tác dụng hạ acid uric mạn 38

Bảng 2.6 Quy trình định lượng acid uric 39

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm trong khảo sát kháng viêm cấp 40

Bảng 2.8 Bố bố trí thí nghiệm trong khảo sát kháng viêm mạn 41

Bảng 3.1 Kết quả kiểm nghiệm dược liệu SNHV 54

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát loại dung môi và phương pháp chiết xuất 53

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ dược liệu/ dung môi khi sử dụng ethanol 70% 54

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian ngâm chiết dược liệu 55

Bảng 3.5 Kết quả chiết xuất cao định chuẩn ở quy mô 1kg/mẻ 56

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng của cao định chuẩn SNHV 58

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá tác dụng sinh học in vitro của cao định chuẩn 58

Bảng 3.8 Hàm lượng acid uric của các lô thử nghiệm trong khảo sát tác dụng hạ acid uric cấp - Phác đồ điều trị 59

Bảng 3.9 Hàm lượng acid uric của các lô thử nghiệm trong khảo sát tác dụng hạ acid uric cấp - Phác đồ dự phòng 60

Bảng 3.10 Hàm lượng acid uric của các lô thử nghiệm trong khảo sát tác dụng hạ acid uric mạn 61

Bảng 3.11 Mức độ viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm trong thực nghiệm

carrageenan 62

Bảng 3.12 Mức độ giảm viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm so với lô chứng sinh lý 62

Bảng 3.13 Mức độ viêm phù chân chuột ở các lô thử nghiệm 63

Bảng 3.14 Mức độ giảm viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm 64

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát tá dược hút 65

Bảng 3.16 Công thức khảo sát tá dược rã trong xây dựng công thức viên hoa Sao nhái hoa vàng 66

Bảng 3.17 Công thức khảo sát tá dược độn trong xây dựng công thức viên hoa Sao nhái hoa vàng 68

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát tỷ lệ MCC trong hỗn hợp tá dược độn 71

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát tỷ lệ phối hợp tá dược rã 72

Bảng 3.20 Thành phần công thức cho một viên nén SNHV 73

Bảng 3.21 Kết quả kiểm nghiệm viên nén chứa cao định chuẩn hoa SNHV 76

MỞ ĐẦU

Bệnh gout là một bệnh rối loạn chuyển hóa base nhân purin ngày càng phổbiến và có xu hướng gia tăng Cơ chế bệnh sinh của gout là do sự gia tăng nồng độacid uric trong cơ thể, đồng thời cũng gia tăng nồng độ các gốc oxy hóa gây tổnthương tế bào Bệnh gout nếu không được điều trị kịp thời không chỉ làm giảm chấtlượng cuộc sống mà còn gây nên các biến chứng nặng nề trên các cơ quan khác chẳnghạn như tim và thận

Hiện nay, trong điều trị bệnh gout vẫn chủ yếu sử dụng các thuốc hóa dược đểlàm giảm acid uric máu, kháng viêm giảm đau Một trong các thuốc được chỉ địnhđầu tay hiện nay là allopurinol, tuy nhiên allopurinol lại có nhiều tác dụng phụ nhưtăng enzym gan, suy thận và đặc biệt là dị ứng nên theo khuyến cáo của ACR, trướckhi chỉ định allopurinol, cân nhắc làm thử nghiệm HLA-B*5801, trên một số đốitượng có nguy cơ cao mẫn cảm với allopurinol Tại Việt Nam tỷ lệ nhóm người nàykhoảng 18,6%.1

Trước những tác dụng phụ có hại allopurinol, xu hướng sử dụng các thuốc cónguồn gốc từ dược liệu có hoạt tính ức chế enzym xanthin oxidase (XO) và có tácđộng kháng viêm nhằm hỗ trợ điều trị gout, giảm tác dụng phụ có nhu cầu rất lớn.Một số hợp chất được tìm thấy trong dược liệu như flavonoid (quercetin, luteolin,

…), carotenoid đã được biết tới có khả năng ức chế enzym xanthin oxidase giúp làmgiảm acid uric Việc ức chế enzym xanthin oxidase cũng là một cơ chế chống oxyhóa hiệu quả do enzym xanthin oxidase sinh ra các gốc tự do superoxid, khi nồng độcác gốc tự do này quá cao sẽ gia tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, gây lão hóa

vật cũng cho thấy hiệu quả với mô hình loét dạ dày, gan, viêm, hoặc sưng kiểu viêm

tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym XO vượt trội, rất tiềm năng sử dụng trong

hỗ trợ điều trị gout Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng điềutrị gout trên các mô hình động vật thử nghiệm Các nghiên cứu về hoạt tính sinh họccủa Sao nhái hoa vàng cũng hạn chế tại Việt Nam và Quốc tế Trên thị trường cũngchưa có chế phẩm nào bào chế từ Sao nhái hoa vàng Đứng trước việc phát triển thuốc

từ dược liệu đang được đẩy mạnh, Sao nhái hoa vàng lại được trồng ở khắp nơi nhưngchưa được khai thác tiềm năng làm thuốc chữa bệnh Do vậy, đề tài được xây dựng

để nghiên cứu tác dụng điều trị gout từ hoa Sao nhái hoa vàng, từ các kết quả thử tácdụng dược lý được thực hiện tiếp tục phát triển quy trình để đưa đưa ra sản phẩm làviên nén Đề tài được tiến hành với mục tiêu sau:

Mục tiêu tổng quát:

Nghiên cứu điều chế viên nén chứa cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng (Cosmos

sulphureus Cav.) hỗ trợ điều trị bệnh gout

Mục tiêu cụ thể:

1 Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao định chuẩn Sao nhái hoa vàng

2 Đánh giá tác dụng sinh học của cao chiết định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng

3 Xây dựng công thức bào chế viên nén từ cao định chuẩn hoa Sao nhái hoa vàng

và sỏi tiết niệu Bệnh thường gặp ở các nước phát triển, chiếm khoảng 0,02 - 0,2%dân số, với 95% nam giới trong độ tuổi trung niên từ 30 - 40 tuổi Nữ giới thườnggặp ở độ tuổi 60 - 70 tuổi Ở Việt Nam, gout chiếm 1,5% các bệnh về khớp được điềutrị nội trú tại khoa Xương khớp Bệnh viện Bạch Mai, đứng hàng thứ tư trong cácbệnh khớp nội trú thường gặp.7

1.1.2 Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh

Cơ chế bệnh sinh chính của bệnh gout là sự tích lũy acid uric ở mô, tạo nêncác micro tophi Khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi phát cơn gout cấp đượcđặc trưng bởi sự khởi đầu nhanh chóng của cơn đau, sưng và viêm Các cơn thườngbắt đầu ở khớp xương đơn lẻ, thường nhất là khớp ngón chân cái và sau đó theo thứtự: mu bàn chân, mắt cá chân, gót chân, đầu gối, cổ tay, ngón tay và khuỷu tay Sựlắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong mô sụn và tại mô mềm, bao gân tạo nên hạttophi và cuối cùng dẫn đến viêm thận kẽ (bệnh thận do gout) do tinh thể urat lắngđọng tại tổ chức kẽ của thận Khi bị gout, ngoài acid uric máu tăng thì acid uric niệucũng tăng và sự toan hóa nước tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu trong bệnh gout.7

Tăng acid uric máu là yếu tố nguy cơ chính cho sự phát triển của bệnh gout,rối loạn chức năng thận, tăng huyết áp, tăng lipid máu, tiểu đường và béo phì, tuynhiên chỉ có 25% các trường hợp tăng acid uric máu sẽ dẫn đến bệnh gout Con người

là một trong số ít loài có men uricase không hoạt động, kết quả dẫn đến tăng nồng độacid uric máu Acid uric bảo vệ cơ thể chống lại quá trình thoái hóa bằng cách hoạtđộng tương tự chất chống oxy hóa Nồng độ urat cao và trong các điều kiện nhất định

sẽ kết tủa thành các tinh thể monosodium urat và khi những tinh thể này lắng đọngtrong bao hoạt dịch, dịch khớp hoặc các mô khác có thể dẫn đến bệnh gout Do vậy,

có thể nói nguyên nhân chính gây ra bệnh gout là hậu quả của tình trạng acid uricmáu cao và vi tinh thể urat có vai trò chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh gout.8

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh và tiếp cận điều trị gout 9

Quá trình chuyển hóa acid uric là quá trình chuyển hóa base purin làm tăngacid uric nồng độ cao dẫn tới hệ quả tăng tích tụ tinh thể urat và gây nên các đợt viêmcấp Trong quá trình chuyển hóa acid uric cũng đồng thời hình thành gốc tự do, từ đógây các tác động bất lợi cho cơ thể như peroxy hóa màng tế bào, làm nặng nề tìnhtrạng viêm Do đó hướng tiếp cận điều trị bệnh gout bao gồm ba mục tiêu: mục tiêuchính trong điều trị gout là hạ acid uric máu, đồng thời khi xảy ra các cơn gout cấpcần sử dụng thêm các thuốc kháng viêm để điều trị Bên cạnh đó việc sử dụng thêmcác hoạt chất chống oxy hóa cũng đóng góp vào hỗ trợ điều trị bệnh gout

1.1.3 Các mô hình nghiên cứu hạ acid uric máu in vivo trong điều trị gout

Mô hình gây tăng acid uric máu bằng kali oxonat

Nguyên tắc: Kali oxonat đã được chứng minh và sử dụng trên nhiều mô hình

tương tự, có tác dụng ức chế uricase, một enzyme tham gia chuyển hóa purin, gâytăng sự tích tụ và nồng độ acid uric máu ở chuột.10 Allopurinol là một trong những

loại thuốc đã được sử dụng điều trị cho bệnh nhân gout được lựa chọn làm thuốc đốichứng, hoạt động dựa trên cơ chế ức chế xanthine oxidase, ngăn cản quá trình tổnghợp acid uric diễn ra trong cơ thể.

Đánh giá: Đo nồng độ acid uric máu ở các lô chuột sinh lý, bệnh lý, thuốc đối

chứng và mẫu thử để đánh giá tác dụng hạ acid uric của mẫu thử

Phạm vi áp dụng: Mô hình sử dụng tác nhân kali oxonat để gây tăng acid uric

máu là mô hình sử dụng phổ biến nhất hiện nay Sử dụng tác nhân này để bố trí cácthí nghiệm tác dụng hạ acid uric cấp tính và mãn tính nhằm đánh giá tác dụng của cácmẫu thử cao chiết hoặc thuốc mới

Mô hình gây tăng acid uric máu bằng chế độ ăn

Gout có thể do tăng acid uric nội sinh, do tổng hợp denovo (quá trình tổng hợpcác nucleotid purin từ các phân tử nhỏ như phosphoribose, acid amin, CO2, ), thoáihóa acid nucleic hoặc ngoại sinh, do chế độ ăn uống Purin trong chế độ ăn uống đónggóp gần một phần ba lượng purin hàng ngày Trong mô hình, chuột sẽ được gây tăngacid uric máu bằng chế độ ăn có hàm lượng purin cao trong 8 tuần Chuột được uống

200 μl dung dịch purin hàm lượng cao có thành phần gồm hypoxanthin 200mg/kg/ngày, chiết xuất nấm men 30 mg/kg/ngày, và kali oxonat 200 mg/kg/ngày.Trong thời gian thử nghiệm, trọng lượng chuột sẽ được theo dõi mỗi ngày Mẫu phânđược lấy từ mỗi con chuột khi kết thúc thử nghiệm và được lắng ở 80oC Sau đó chuột

ở các lô thử nghiệm khác nhau (sinh lý, đối chiếu và nhóm dùng chất thử) sẽ đượcgây tê và lấy máu mí mắt để đo nồng độ acid uric.11

1.1.4 Một số phương pháp nghiên cứu kháng viêm in vivo

Mô hình gây phù bàn chân chuột:

Nguyên tắc: Sau khi tiêm vào bàn chân chuột các tác nhân gây viêm như

formaldehyd, dextrin, albumin trứng, kaolin, sulfat polysaccharid (carrageenan,naphthoheparamin), các chất này kích hoạt phản ứng viêm, gây giãn mạch và tăngtính thấm thành mạch Kết quả của quá trình viêm này là hiện tượng phù bàn chân

chuột Các thuốc có tác dụng chống viêm sẽ có khả năng ức chế hiện tượng phù Khigây viêm bằng carrageenan, mức độ viêm tối đa trong thời gian 3 - 4 giờ; với aerosil

và kaolin thời gian gây viêm có thể kéo dài đến 24 giờ hay 2 ngày Do đó cần lựachọn tác nhân gây viêm phù hợp với mục đích nghiên cứu, theo tác dụng chống viêmmạnh hay yếu, thời gian thuốc có tác dụng.12,13

Các chỉ tiêu đánh giá: So sánh mức độ phù chân chuột ở cùng thời điểm sau

khi gây viêm giữa lô động vật được dùng mẫu thử và lô chứng để đánh giá tác dụngchống viêm của mẫu thử

Phạm vi áp dụng: Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan được sử

dụng bởi nhiều nhà nghiên cứu và được chứng minh phù hợp với mục đích sàng lọcđánh giá tác dụng chống viêm của thuốc chống viêm không steroid, steroid, thuốckháng histamin, kháng serotonin

Mô hình gây phù bàn chân chuột là mô hình đơn giản, dễ tiến hành, viêm cấp đápứng trong vài giờ, thời gian tiến hành ngắn

Mô hình gây ban đỏ bằng tia tử ngoại chuột lang:

Nguyên tắc: Mô hình gây ban đỏ bằng tia tử ngoại được Wilhelmi mô tả lần

đầu tiên (1949), ông đã nhận thấy khả năng làm chậm sự phát triển của ban đỏ do tia

tử ngoại cả phenylbutazon và các thuốc chống viêm không steroid Nồng độprostaglandin E tăng trong 24 giờ sau khi da chuột tiếp xúc với tia cực tím bức xạ280-320 nm Ban đỏ là dấu hiệu đầu tiên của viêm, khi đáp ứng viêm chưa đi kèmvới phù nề và tăng tiết dịch.14

Chỉ tiêu đánh giá: Đánh giá mức độ viêm bằng cách đo diện tích ban đỏ Phạm vi áp dụng: Phương pháp này có thể áp dụng để nghiên cứu tác dụng

của thuốc chống viêm steroid

Mô hình đo độ thẩm thấu mạch máu:

Nguyên tắc: Sau khi tế bào mast bị kích thích, các chất trung gian hóa học gây

viêm như là histamin, prostaglandin và leucotrien được giải phóng gây dãn các tiểu

động mạch, làm tăng tính thấm thành mạch Kết quả là dịch và protein huyết tươngthoát ra gây phù Những tác động này bị ức chế bởi thuốc kháng histamin, thuốc ứcchế chuyển hóa của acid arachidonic và thuốc ức chế thụ thể của leucotrien.

Chỉ tiêu đánh giá: Đánh giá tác dụng chống tăng tính thấm của thuốc thông

qua nồng độ chất nhuộm xanh Evans khi tiêm dưới da

Phạm vi áp dụng: Thử nghiệm này được dùng để đánh giá tác dụng của các

1.2 Tổng quan về sao nhái hoa vàng và các công trình nghiên cứu có liên quan 1.2.1 Đặc điểm thực vật

Chi Cúc chuồn hay còn gọi chi Sao nhái, Chuồn chuồn, hoa cánh bướm (danh

pháp khoa học: Cosmos) là một chi của khoảng 20 - 42 loài thực vật sống một năm

hay lâu năm trong họ Cúc (Asteraceae), có nguồn gốc tại các vùng đất nhiều bụi rậm

và bãi cỏ của Mehico, miền nam Hoa Kỳ (Arizona, Florida), Trung Mỹ và miềnbắc Nam Mỹ kéo dài về phía nam tới Paraguay.15 Trong chi Cosmos, có 2 loài là Sao

nhái hồng và Sao nhái hoa vàng được sử dụng làm thuốc trong nền y học bản địa vàlàm thức ăn ở nhiều nơi trên thế giới

1.2.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Cosmos sulphureus Cav.

Họ: Asteraceae, Chi: Cosmos

1.2.1.2 Mô tả thực vật học

Cỏ nhất niên, có lông, cao 1 - 1,5 m Lá mọc đối, 2 - 3 lần chẻ thành đoạn thon,

có lông, bìa có ít răng hay không Hoa đầu vàng tươi, trên cọng rất dài; hoa hình môi;hoa giữa hình ống, bao phấn đen Bế quả có mỏ dài, chót có 2 răng có móc nhỏ.15

1.2.1.3 Bộ phận dùng và thu hái

Cành non và lá được ăn như rau sống hoặc nấu chín có tên là “lalab” hoặc

trong món salad ở Thái Lan.17

1.2.1.4 Phân bố

Sao nhái hoa vàng có nguồn gốc từ Mehico ở miền Trung Mỹ

Sau đó, loài này đã được trồng ở khắp thế giới ví dụ như ở Ấn Độ, Campuchia

và Indonesia Ở Việt Nam, cây Sao nhái hoa vàng có thể mọc hoang dại hoặc trồng ởnhiều nơi trong nước với mục đích chính là làm cảnh và phục vụ du lịch

1.2.1.5 Công dụng

Lá non và hoa dùng làm thức ăn Hoa của cây Sao nhái hoa vàng là hoa duy

nhất trong chi Cosmos ăn được, hay được dùng trong các món ăn ở Thái Lan.

Hình 1.2 Sao nhái hoa vàng (Cosmos sulphureus Cav.)

Lá được sử dụng trong y học bản địa ở Indonesia 18 và ở Brazil dùng để chữabệnh sốt rét.19 Nước sắc từ lá trị tim đập nhanh.15

Các cánh hoa của Sao nhái hoa vàng và các loài khác từ các chi Cosmos,

Bidens và Coreopsis đã cung cấp các nguồn thuốc nhuộm màu vàng đến cam quan

Âu sử dụng làm thuốc nhuộm màu vàng phổ biến để sản xuất hàng dệt trong nước.Các thợ nhuộm ở đây dùng các sắc tố chiết từ cánh hoa như một thuốc nhuộm tựnhiên cho hàng dệt thủ công, để nhuộm len có màu vàng hoặc cam sáng Len đượcnhuộm bằng thuốc nhuộm từ hoa Sao nhái hoa vàng thường bền và có màu rực rỡdưới ánh nắng so với các loại thuốc nhuộm khác.21

1.2.2 Một số nghiên cứu về tác dụng và thành phần hóa học của hoa cây Sao nhái hoa vàng

Một số nghiên cứu được thực hiện trước đây cho thấy thành phần hóa học chủyếu gồm flavonoid, các hợp chất polyphenol, ngoài có còn có các hợp chất carotenoid,tinh dầu,… Những hợp chất trên được chứng minh có tác dụng sinh học mạnh nhưchống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, hỗ trợ điều trị đái tháo đường, ức chếlipase hỗ trợ điều trị béo phì,… (Kaisoon và các cộng sự, 2011 - 2012).6,17

Đối với nhóm hợp chất flavonoid:

Kaisoon và các cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu các hợp chất flavonoidtan có trong hoa Sao nhái hoa vàng theo khối lượng g/g chất khô Kết quả cho thấySao nhái hoa vàng bao gồm rutin 7 g, myricetin 4,9 g, quercetin 485,9 g, apigenin0,72 g và kaempferol 3,54 g, tổng cộng 502,1 g.6 Các hợp chất flavonoid trên đều

là những hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh ở nồng độ thấp (giá trịIC50 dao động từ 0,40 đến 5,02 μM).22

Đồng thời, từ sắc tố hoa đã phân lập được flavonoid có tên coreopsin, là mộtglycosid của butein với cấu trúc 4′-O-glucosid butein.23 Butein là một flavonoid cóhoạt tính sinh học mạnh như kháng viêm và gây độc tế bào trên các dòng ung thư như

ung thư vú, ung thư gan và ung thư phổi.24 Theo nghiên cứu của Hou và cộng sự thựchiện 2019, butein cũng có khả năng ức chế xanthin oxidase tốt với IC50 là 2,93.10-6mol/l so với chứng dương allopurinol là 1,1.10-6 mol/l.25

Năm 2017, Vankar và cộng sự tiến hành phân lập các hợp chất flavonoid cótrong hoa của cây Sao nhái hoa vàng Kết quả cho thấy hoa cây Sao nhái hoa vàng

Cosmos sulphureus có chứa các nhóm flavonoid sau: quercetin, luteolin, sulphuretin

và fustin.26 Trong đó luteolin là hợp chất ức chế xanthin oxidase mạnh với IC50 1,3

Sao nhái hoa vàng là fustin và sulphurein cho kết quả thử nghiệm in vivo có tác động

kháng viêm mạnh, không chỉ có tác động chống oxy hóa riêng lẻ mà còn có tác độngtăng khả năng hoạt động của các enzym chống oxy hóa nội sinh của cơ thể, ức chếenzym xanthin oxidase và một số enzym liên quan đến các bệnh chuyển hóa cho cơthể.28

Năm 2019, Iwashina cùng cộng sự đã phân lập được hợp chất flavonoid mới

của hoa Sao nhái hoa vàng có cấu trúc

5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavylium-4′-O-β-D-glucopyranosid Hợp chất này được đặt tên là cosmonidin-4′-O-glucosid.29

Đối với các hợp chất polyphenol khác:

Kaisoon và các cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu các hợp chấtpolyphenol có trong dịch chiết cồn của hoa Sao nhái hoa vàng Kết quả cho thấy cókhoảng 210,27 mg polyphenol trên 100 g chất khô bao gồm acid gallic 9,25 mg, acid

protocatechuic 3,26 mg, acid p-hydroxybenzoic 2,74 mg, acid chlorogenic 6,90 mg, acid caffeic 13,88 mg, acid syringic 2,91 mg, acid p-coumaric 137 mg, acid ferulic

có khả năng ức chế kép đối với xanthine oxidase và cyclooxygenase-2 theo các giátrị IC50 tương ứng 68; 70,2 và 65 μg/ml (xanthin oxidase) và 68,5; 65,2 và 62,5 μg/ml(cyclooxygenase-2).30

Một số thành phần hóa học khác:

Carotenoid là một trong những sắc tố quan trọng nhất để tạo màu cho cánh

hoa Sao nhái hoa vàng Carotenoid của hoa sao nhái hao vàng bao gồm β-carotene, lutein, β–caroxanthin,… (Edia R và cộng sự 2016)31 Các hợp chất thuộc nhómcarotenoid đều là các hợp chất chống oxy hóa mạnh, đồng thời với khả năng khángviêm nên đóng vai trò quan trọng trong ngăn ngừa các biến cố tim mạch.32

Một số nghiên cứu hoạt tính sinh học của hoa Sao nhái hoa vàng:

Sao nhái vàng đã được sử dụng từ lâu trong y học bản địa Brazil để điều trị

bệnh sốt rét và có khả năng chống lại ký sinh trùng đơn bào Plasmodium Ở Thái Lan,

hoa Sao nhái hoa vàng được sử dụng kết hợp với các dược liệu làm trà thảo mộc vớitác dụng ức chế lipase tuyến tụy.6,17

Kaisoon cùng các cộng sự đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên hoa Sao nháihoa vàng liên tục trong hai năm 2011 và 2012 và thu được một số kết quả khả quan

về các hoạt tính sinh học của hoa Sao nhái hoa vàng như sau:

Đối với khả năng điều trị bệnh đái tháo đường, nhóm nghiên cứu đã thực hiện

trên nhiều loài và có kết quả ức chế enzym α-glucosidase như sau: Tagetes erecta

(IC50 = 0,06 mg/ml) > Antigonon leptopus (IC50 = 3,26 mg/ml) > Bougainvillea

glabra (IC50 = 5,21 mg/ml) > Cosmos sulphureus (IC50 = 5,62 mg/ml) 6

Riêng đối với khả năng ức chế enzym lipase ứng dụng trong điều trị béo phì

thì hoa Sao nhái hoa vàng có kết quả ức chế mạnh nhất Kết quả như sau: Cosmos

sulphureus (IC50 = 4,60 mg/ml) > Tagetes erecta (IC50 = 4,82 mg/ml)> Bougainvillea

glabra ( IC50 = 5,14 mg/ml) > Leptopus Antigonon (IC50 = 7,87 mg/ml) 17

Năm 2017, Saleem cùng cộng sự đã thực hiện công trình nghiên cứu khả năngbảo vệ gan của cây hoa Sao nhái hoa vàng và cây Sao nhái hồng Kết quả cho thấy

dịch chiết từ loài cây này làm giảm đáng kể alanin aminotransaminase và bilirubin

toàn phần (p < 0,05), phụ thuộc vào liều lượng và bảo vệ gan trên mô hình thực

Malakal và cộng sự (2015) đã chứng minh được chế phẩm nano bạc kết hợpcao chiết nước Sao nhái vàng thể hiện khả năng ức chế gốc tự do mạnh hơn so vớicao đơn lẻ với giá trị IC50 là 92,38 g/mL và 135,53 μg/mL, kết quả được so sánh vớichứng dương acid ascorbic có giá trị là 60,78 µg/mL.34

Jadav và cộng sự đã tiến hành chiết xuất hoa Sao nhái hoa vàng trong các dungmôi thử nghiệm (ether dầu hỏa, chloroform, methanol, nước), cao chiết methanol hoaSao nhái vàng có tiềm năng cao trong việc ức chế gốc tự do DPPH (89,87%) tươngđương đối chứng acid ascorbic (94,05%) ở cùng nồng độ, tác giả nhận định khả năngnày là do có sự hiện diện của các hợp chất polyphenol.35

Năm 2020 tác giả Đặng Gia Lệ, Lê Thị Gấm trường đại học Tây Đô đã tiến

hành đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Sao nhái vàng (Cosmos

sulphureus Cav.) và Sao nhái hồng (Cosmos caudatus Kunth) kết quả cho thấy cao

chiết ethanol 50% từ hoa Sao nhái vàng cho kết quả tốt nhất trong các mẫu thử nghiệm

1.2.3 Tổng quan về flavonoid coreopsin

Flavonoid là nhóm của các hợp chất phenol thực vật có cấu trúc cơ bản làdiphenylpropan (C6 – C3 – C6), là cấu trúc phổ biến, có mặt trong nhiều nhóm hợpchất của thực vật Đa số là các hợp chất có mạch 3 C đóng vòng với vòng A qua dị

tố oxy để tạo nên vòng C19 Đối dược liệu hoa Sao nhái hoa vàng, có nhiều hợp chất

có tác dụng ức chế XO và kháng viêm hỗ trợ điều trị gout Trong đó các flavonoid cóhoạt tính sinh học mạnh đối với hỗ trợ bệnh trên, đặc trưng cho cây nên sẽ lựa chọnlàm chất chuẩn cho chế phẩm Đề tài lựa chọn coreopsin là một flavonoid đặc trưng

có trong hoa Sao nhái, hàm lượng cao để làm chất chỉ dấu định tính và định lượngtrong đề tài

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của coreopsin

- Coreopsin là glycosid của butein ở vị trí 4’ (flavonoid thuộc nhóm chalcon)

- Tên gọi: butein 4’--D-glucoside

(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-[2-hydroxy-4-yl]oxyphenyl]prop-2-en-1-on

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2 Công thức phân tử: C21H22O10

- Khối lượng phân tử: 434,4 g/mol

- Hình thức: màu vàng đến vàng cam.37

- Dễ tan trong các dung môi phân cực: ethanol, methanol, hỗn hợp ethanol-nước.37

- Phổ UV: hấp thụ mạnh ở khoảng 300 – 400 nm.37

Coreopsin là dạng glycoside của flavonoid butein Butein thuộc nhóm flavonoid

chalcone và được phân lập từ một số loại thực vật bao gồm Toxicodendron

vernicifluum, Semecarpus anacardium, Dalbergiaodorifera và Butea monosperma.

Butein được phân lập từ những loài thực vật trên đã được nghiên cứu cho thấy nhiềutác dụng sinh học trong hỗ trợ các bệnh khác nhau nhờ có cóđặc tính chống oxy hóa,kháng viêm, ức chế gây độc tế bào ung thư, hỗ trợ điều tri bênh gout, hỗ trợ điều trịđái tháo đường và có hoạt tính kháng khuẩn Tương tư như các polyphenol khác,butein cũng được chứng minh là có tiềm năng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm,bệnh lao, béo phì, đái tháo đường, xơ gan và stress oxy hóa Butein đã được tìm thấy

có tác dụng ức chế hoạt động của xanthine oxidase (XO).Cơ chế ức chế của buteinđối với XO đã được tìm hiểu Phân tích động học ức chế cho thấy butein có khả năng

ức chế XO mạnh hơn theo cơ chế ức chế cạnh tranh không nghịch đảo với giá trị IC50

là 2,93 × 10−6 mol/L−1 Kết quả phân tích quang phổ huỳnh quang chỉ ra rằng butein

có thể tương tác với XO thông một vị trí liên kết trên XO Sau đó, kết quả của sự gắnkết phân tử giữa butein và protein XO cho thấy butein hình thành liên kết hydro vớicác gốc axit amin nằm trong khoang kỵ nước của XO Thông qua các nghiên cứu chothấy cơ chế ức chế của butein trên XO được dự đoán do butein gắn vào vị trí hoạtđộng trung tâm xúc tác của XO để ngăn cản sự tiếp hợp giữa xanthine và XO, đồngthời gây ra những thay đổi về hình dạng không gian ba chiều của XO.37

1.3 Chiết xuất và phân loại các cao chiết dược liệu

Chiết xuất dược liệu là quá trình dùng dung môi để hòa tan và tách các chấttan ra khỏi dược liệu Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịchcủa các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Dịch chiếtchủ yếu chứa các chất có hoạt tính sinh học mang tác dụng trị liệu, các chất hỗ trợ,ngoài ra còn chứa các chất không mong muốn gọi là tạp chất Đây là giai đoạn quantrọng khi bào chế các chế phẩm từ dược liệu, quyết định chất lượng của chế phẩm.38

Mục tiêu của hòa tan chiết xuất là lấy được tối đa các hoạt chất và những chất

hỗ trợ vào dịch chiết, giữ lại tối đa các tạp chất trong bã dược liệu, xác định được cácđiều kiện cần thiết nhằm tiết kiệm dung môi, nhiên liệu, thời gian, … trong quá trìnhchiết xuất Chiết xuất dược liệu là một quá trình phức tạp, trong đó: Sự thấm dungmôi vào dược liệu, sự hòa tan các chất trong tế bào dược liệu, sự khuếch tán các chấtqua màng tế bào và sự khuếch tán chất tan trong dung môi là các hiệu tượng quantrọng Các yếu tố ảnh hưởng lên những quá trình này (bản chất chất tan, dung môi, tỷ

lệ dung môi/dược liệu, cấu tạo vách tế bào, độ mịn của dược liệu, nhiệt độ chiết xuất,thời gian chiết xuất, sự khuấy trộn…) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quátrình chiết xuất.38

Methanol, ethanol, nước, hỗn hợp cồn - nước thường được sử dụng làm dung môichiết xuất Chiết xuất dược liệu với mục đích thu được cao dược liệu để làm nguyênliệu bào chế các thành phẩm thì có yêu cầu về tính an toàn của dung môi Methanol

có độc tính cao nên ít sử dụng Điều chế cao chiết làm nguyên liệu cho quá trình bàochế các dạng chế phẩm nên sử dụng nước và ethanol vì có tính an toàn cao hơn.

Hiện nay Dược điển Việt Nam và các Dược điển tham chiếu hiện hành (dượcđiển Mỹ - USP; dược điển Anh – BP; dược điển Châu Âu – EP; dược điển Nhật – JP)

và dược điển Trung Quốc – CP đều có chuyên luận chung về cao thảo dược, trong đó

có phân loại cao, phương pháp điều chế (chiết xuất) cao và yêu cầu chất lượng chungcủa cao, nhưng chỉ có EP và BP có phân biệt cao chuẩn hóa và cao định chuẩn Theocác dược điển, cao thảo dược là chế phẩm thu được bằng cách cô hoặc sấy đến thểchất quy định các dịch chiết thu được từ thảo dược với các dung môi thích hợp Cóthể chia cao thảo dược thành 3 loại là cao lỏng (liquid extraction preparations), caođặc (soft extracts and oleoresins) và cao khô (dry extracts)

Về cơ bản chất lượng của cao thảo dược phụ thuộc vào chất lượng của thảodược, quy trình sản xuất (dung môi chiết xuất, phương pháp chế biến…) và tiêu chuẩnchất lượng của cao

Theo EP 10.0 39 và BP 2020 40 có thể phân biệt các loại cao như sau

Cao chuẩn hóa (Standardized extracts): Là cao được điều chỉnh theo hàm

lượng xác định của một hoặc nhiều thành phần có hoạt tính điều trị đã biết Có thể sửdụng các tá dược trơ để điều chỉnh nồng độ dược chất mong muốn hoặc trộn các lôcao chiết với nhau.52

Trong mỗi chuyên luận riêng của cao chuẩn hóa, phần định nghĩa sẽ chỉ ra hàm lượngcủa thành phần cần định lượng là một giá trị xác định hoặc khoảng giá trị xác định.Khoảng phần trăm cho phép của chỉ tiêu định lượng thường từ 5 - 10%, tùy thuộc vàobản chất của cao chiết và phương pháp định lượng

Ví dụ 1: Yêu cầu chất lượng của Cao lỏng chuẩn hóa Ipecacuanha là tổng hàm lượng

alkaloid tính theo emetin (C29H40N2O4) từ 1,90 - 2,10% (2,0%  0,1%).40

Ví dụ 2: Yêu cầu chất lượng của Cao khô chuẩn hóa vỏ Frangula là hàm lượng

glucofrangulins tính theo glucofrangulin A (C27H30O14) từ 15,0 - 30,0%, khoảng phầntrăm cho phép của chỉ tiêu định lượng là 10%.40

Cao định chuẩn (Quantified extracts): Là cao được điều chỉnh theo một hoặc

nhiều chất đánh dấu có hoạt tính (active markers) Hàm lượng của chất này đượckiểm soát trong một phạm vi giới hạn xác định Sự điều chỉnh được thực hiện bằngcách trộn các lô cao chiết với nhau

Không được phép sử dụng tá dược trơ để điều chỉnh hàm lượng của các thành phầnđược kiểm soát

Hàm lượng của thành phần cần kiểm soát trong cao định chuẩn phải nằm trong giớihạn đã cho trong phần định nghĩa của từng chuyên luận riêng.40

Các loại cao khác: Cao không được điều chỉnh theo hàm lượng cụ thể của các

thành phần Để kiểm soát chất lượng cao, có thể sử dụng một hay nhiều thành phầnnhư chất đánh dấu phân tích (analytical markers) Các chuyên luận riêng cho các loạicao này thường đưa ra mức hàm lượng tối thiểu cho các chất đánh dấu

Không được phép sử dụng tá dược trơ để điều chỉnh hàm lượng của các thành phầnđược kiểm soát

Hàm lượng của thành phần cần kiểm soát trong các loại cao này phải không đượcthấp hơn giá trị tối thiểu được đưa ra trong phần định nghĩa từng chuyên luận riêng.40

Cao nguyên liệu (nằm trong mục các loại cao khác): cao được chiết xuất từ

các thảo dược với các dung môi khác nhau (cao toàn phần và cao giàu hoạt chất).Dung môi sử dụng thường là ethanol, nước, hỗn hợp ethanol – nước với các tỷ lệ khácnhau, hoặc glycerol hay propylen glycol

Bảng 1.1 Phân biệt cao chuẩn hóa, cao định chuẩn và cao nguyên liệu.

Cao chuẩn hóa Cao định chuẩn Cao nguyên liệu

Cao được quy ra một hay

nhiều thành phần xác

định có hoạt tính điều trị

đã biết

Cao chứa các thành phầnđược cho là có hoạt tính(active markers) và hàmlượng các thành phần nàynằm trong một phạm vigiới hạn xác định

Cao chưa biết rõ hàm lượng cácthành phần trong cao, có thể sửdụng một hay nhiều thành phầnnhư chất đánh dấu phân tích(analytical markers) để kiểmsoát chất lượng và đưa ra mứchàm lượng tối thiểu cho mỗithành phần

Có thể sử dụng các tá

dược trơ để điều chỉnh

nồng độ các thành phần

đã biết hoặc trộn các lô

cao chiết với nhau

Không được phép sửdụng tá dược trơ để điềuchỉnh hàm lượng của cácthành phần có hoạt tính

Không được điều chỉnh theohàm lượng cụ thể của chất đánhdấu phân tích

Yêu cầu của chỉ tiêu định

công bố trên nhãn, tùy

vào bản chất cao chiết và

phương pháp định lượng

Yêu cầu của chỉ tiêu định lượng: Hàm lượng của

các thành phần có hoạttính phải nằm trongkhoảng giới hạn đã công

bố của các thành phầntrên nhãn

Yêu cầu của chỉ tiêu định lượng:

Hàm lượng của các thành phầnkiểm soát không được thấp hơnmức hàm lượng tối thiểu đã đưa

ra Mức tối thiểu này được xácđịnh dựa vào quá trình địnhlượng các thành phần của ít nhất

là 6 cao được bào chế trong cùngđiều kiện

Chỉ tiêu kiểm nghiệm chung: Tính chất, định tính, mất khối lượng do làm khô, kim loại

nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật…

1.4 Tổng quan về viên nén và các tá dược dùng trong điều chế viên nén chứa cao dược liệu

1.4.1 Tổng quan sơ lược về viên nén

Về hình dạng và màu sắc: Viên nén có nhiều kiểu dáng rất phong phú do thayđổi về chày và cối của máy dập viên Viên nén có thể bao, hoặc được nhuộm màu đểphân biệt hoặc nhằm tạo cảm quan hấp dẫn hoặc mục đích khác

+ Tá dược dính: tạo môi trường trung gian giúp cho bột, hạt thuốc dễ liên kếtthành khối khi nén và viên đạt độ cứng cần thiết chịu được lực tác động khi bảo quản,vận chuyển Một số tá dược dính hay dùng: ethanol và hỗn hợp ethanol – nước; hồtinh bột; dẫn chất tinh bột; nhóm đường glucose, saccharose và nhóm đường sorbitol,

manitol; gelatin; gôm arabic; poly vinyl pyrrolidon (PVP) và dẫn chất, dẫn chấtcellulose; dẫn xuất của acid alginic.38

+ Tá dược rã: giúp viên thuốc khi tiếp xúc với nước hoặc dịch thể sẽ chuyển

từ cấu trúc rắn chắc sang dạng phân tán thành nhiều hạt nhỏ Rã là quá trình khởi đầu

để thuốc được phóng thích hòa tan do đó có ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc.Viên nén thường rã theo 2 cơ chế: theo cơ chế lý học bằng cách trương nở, hòa tan

và theo cơ chế hóa học bằng phản ứng tạo khí carbonic hoặc oxy.38

+ Tá dược trơn hay trơn - bóng: đặc điểm nổi bật nhóm tá dược này làm trơn

bề mặt của bột hoặc hạt cốm, giúp quá trình phân liều, dập viên được dễ dàng và làmnhẵn bóng bề mặt viên Tá dược trơn bóng hay gặp thuộc 2 nhóm tan trong nước (acidboric, natri lauryl sulfat, natri benzoate, PEG 4000, 6000…) và nhóm không tan trongnước (talc, acid stearic, magnesi stearate, tinh bột, dầu paraffin…).38

+ Nhóm tá dược phụ: Tuy không phải luôn được dùng nhưng trong nhiềutrường hợp, nhóm chất này có ảnh hưởng rất tốt đối với chất lượng chế phẩm Cácnhóm tá dược phụ có thể tham gia vào công thức: tá dược hút, tá dược làm ẩm, tádược điều chỉnh pH hay tá dược đệm, tá dược màu, chất làm thơm, chất điều vị, chấtsát trùng bảo quản, chất ổn định, tá dược điều chỉnh sự phóng thích hoạt chất.38

1.4.2 Tổng quan các phương pháp sản xuất viên nén

Kỹ thuật sản xuất thuốc viên nén có hai phương pháp cơ bản: dập trực tiếp vàxát hạt

Phương pháp dập trực tiếp: thuốc được trộn đều tất cả các thành phần của côngthức thành khối bột thuốc đồng nhất và dập trên máy Ưu điểm của phương pháp này

là nhanh, đơn giản, ít gây hư hỏng thuốc, nhưng phạm vi ứng dụng hạn chế ngay cảkhi sử dụng tá dược đa năng, vì chỉ thích hợp với viên liều nhỏ, tỷ lệ hoạt chất ít hơn30%, khó áp dụng cho viên liều cao Tá dược dập thẳng thường đắt, khó thu hồi, sửachữa khi dập viên không đạt.38

Phương pháp xát hạt: thuốc phải trải qua công đoạn tạo hạt để thu được hạtthuốc đủ tiêu chuẩn dập thành viên Có thể xát hạt ướt (là cách tạo hạt với tá dược

dính ở thể lỏng, thường là nước) và xát hạt khô (là tạo hạt với tá dược dính ở thể khô).Phương pháp dập trực tiếp ít được sử dụng vì hỗn hợp bột thuốc thường không đápứng đủ các tiêu chí kỹ thuật cần thiết nên phương pháp tạo hạt thường được áp dụngtrong bào chế viên nén.

Phương pháp xát hạt khô thích hợp cho các hoạt chất kém bền với nhiệt, ẩmnhư vitamin, natri hidrocarbonat, kháng sinh, enzym,…Phương pháp xát hạt khô ítthông dụng vì hiệu suất thấp, giá thành cao do hao mòn máy móc lớn, đầu tư cho thiết

bị chuyên dùng, lượng tá dược dính cần nhiều hơn, là lựa chọn cuối cùng so vớiphương pháp xát hạt ướt và phương pháp nén trực tiếp

Phương pháp xát hạt ướt cho chi phí thấp, áp dụng được cả quy mô phòng thínghiệm và quy mô công nghiệp, sử dụng thiết bị máy móc linh động cho năng suấtcao, chất lượng tốt Phương pháp này không áp dụng được cho hoạt chất kém bềnnhiệt và ẩm.38

1.4.3 Các tá dược trong viên nén chứa cao dược liệu

Cao dược liệu là một hỗn hợp chứa nhiều thành phần, do vậy dễ biến đổi tínhchất khi bảo quản không đúng hoặc trong thời gian dài Một vấn đề thường xảy ra ởviên nén chứa cao dược liệu là rất dễ hút ẩm, rã kém, thời gian rã có thể tăng lên khi

để lâu ngày Vì vậy cần lựa chọn các tá dược thích hợp cho công thức viên nén chứacao dược liệu để cải thiện các nhược điểm này Các nhóm tá dược cơ bản được sửdụng trong viên nén chứa cao chiết dược liệu gồm tá dược hút, độn, rã, dính và trơnbóng Ngoài ra, viên nén dược liệu nên được bao phim với mục đích chống ẩm viên

Viên nén dược liệu có thể được điều chế bằng phương pháp dập thẳng hoặcxát hạt Phương pháp xát hạt ướt cho viên nén có chất lượng tốt hơn các phương phápkhác Cao dược liệu ở dạng lỏng/mềm có thể trộn với tá dược có khả năng hút chấtlỏng ở tỷ lệ thích hợp để tạo cốm dập viên Các muối vô cơ: calci carbonat, calcisulfat, calci hydrophosphat, magnesi carbonat có tính hút tốt nhưng nhược điểm làkhiến viên khó rã và có tác dụng dược lý riêng Kaolin hút ẩm tốt nhưng có tính hấp

silica khác như calci silicat, colloidal silicon dioxid có khả năng hút chất lỏng mạnh,

chuyển cao lỏng thành dạng bột có tính trơn chảy, chịu nén Các tá dược hút thường

có tỷ trọng thấp, nên cần thêm tá dược độn để tăng tỷ trọng của bột/cốm tới mức thíchhợp, cải thiện tính chịu nén, trơn chảy của bột/cốm

Tá dược độn cũng có khả năng hỗ trợ tải cao, giúp rã viên Các tá dược độnthường được sử dụng trong viên chứa cao dược liệu là tinh bột, lactose, MCC Mỗiloại tá dược đều có ưu nhược điểm riêng: Tinh bột có tính hút, không tan nhưngtrương nở khá tốt trong nước, tỷ trọng lớn, có tính trơn nhưng chịu nén kém Lactosetan trong nước, giúp làm rã viên và giải phóng hoạt chất tốt, gần như không hút ẩm,

dễ chịu nén, tỷ trọng lớn MCC, silicified MCC (một dạng kết hợp giữa colloidalsilicon dioxid và MCC) là tá dược độn đa năng vì có tính dính, rã, trơn, hút, chịu néntốt nhưng tỷ trọng thấp.38 Do đó, trong công thức viên nén chứa cao chiết dược liệuthường kết hợp nhiều loại tá dược độn và hút, tạo bột/cốm có tính chất cơ lý phù hợp

để dập viên, và viên có khả năng rã tốt

Tuy các tá dược hút, độn thường có tính đa năng, giúp rã viên nhưng đối vớiviên nén chứa cao dược liệu vẫn cần có tá dược rã để cải thiện độ rã của viên Tádược rã giúp viên sau khi tiếp xúc với nước hoặc dịch thể sẽ chuyển từ cấu trúc rắnchắc sang dạng phân tán thành nhiều hạt nhỏ, giải phóng tối đa bề mặt tiếp xúc banđầu của tiểu phân với môi trường hòa tan Các tá dược rã thường được sử dụng trongviên nén chứa cao dược liệu là natri starch glycolat, natri croscarmelose, crospovidon.Đây là các tá dược có khả năng hút nước và trương nở rất mạnh, giúp viên rã theokiểu trương phồng Kiểu rã viên này giải phóng hoạt chất nhanh hơn kiểu bào mòn.Thông thường, nên kết hợp các tá dược rã theo cả cơ chế trương nở và cơ chế hòatan, và phối hợp tá dược vào viên theo kiểu vừa rã nội, vừa rã ngoại để cải thiện độ

rã của viên.38

Tá dược dính tạo môi trường trung gian giúp bột, hạt thuốc dễ liên kết thànhkhối khi nén viên và viên đạt độ cứng cần thiết chịu được lực tác động khi bảo quản,vận chuyển Viên nén chứa cao dược liệu thường sử dụng PVP, gôm arabic, hồ tinhbột làm tá dược dính Trong phương pháp xát hạt ướt, các chất lỏng được phối hợp

với tá dược dính tạo khối ẩm để xát hạt Cũng có thể phối hợp cao dược liệu vào dịch

tá dược dính hoặc chuyển cao chiết sang dạng cao lỏng bằng cách pha loãng vớinước/ethanol có nồng độ thích hợp và sử dụng cao lỏng này tạo khối ẩm để xát hạt

38 Talc, magnesi stearat, colloidal silicon dioxid là các tá dược trơn bóng thường sửdụng trong viên nén chứa cao dược liệu với tỷ lệ từ 1 - 2% Sử dụng các tá dược này

để cải thiện tính trơn chảy của bột/cốm trước khi dập viên, làm bóng viên và chốngdính chày cối trong quá trình dập.38 Dính chày là sự cố thường gặp trong quá trìnhdập viên chứa cao chiết dược liệu Bên cạnh việc sử dụng tá dược trơn bóng để chốngdính, kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ của môi trường dập viên rất quan trọng

Các viên nén chứa cao dược liệu thường được bao đường hoặc bao phim Xuhướng hiện nay là bao phim vì lớp bao phim ổn định hơn lớp bao đường, quá trìnhbao phim liên tục với thời gian ngắn hơn bao đường và khả năng tự động hóa cao.Mục đích của bao phim viên nén chứa cao dược liệu là chống ẩm cho viên và cảithiện cảm quan màu sắc của viên Tá dược tạo màng bao phim thường dùng là HPMC,chất hóa dẻo là PEG, tá dược trơn, làm bóng như titan dioxid, talc, magnesi stearat,

các tá dược bao phim đã phối hợp sẵn các thành phần này, khi sử dụng chỉ cần hòatan/phân tán tá dược vào dung môi

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

Hoa Sao nhái Sao vàng được thu hái ở khu du lịch Vườn hoa Bốn Mùa, huyệnXuân Lộc, tỉnh Đồng Nai vào tháng 8/2022 Mẫu thực vật Sao Nhái hoa vàng đượcđịnh danh bằng quan sát hình thái so sánh với các tài liệu tham khảo và định danhbằng ADN

Hình 2.1 Vùng trồng dược liệu Sao nhái hoa vàng A), dược

liệu B) và tiêu bản dược liệu C)

Dược liệu sau khi thu hái được phơi trong bóng râm đến khi khô Dược liệukhô sẽ được đánh giá tiêu chuẩn, xử lý và chiết xuất khảo sát các điều kiện chiết xuất

để thu được cao định chuẩn dùng cho nghiên cứu

C

2.1.2 Trang thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu

Các thiết bị sử dụng trong các nội dung nghiên cứu của đề tài được liệt kê dưới đây:

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị sử dụng

Co, Đức

Các dung môi, hóa chất sử dụng trong đề tài được liệt kê dưới đây:

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất sử dụng

Quốc

Nhật Bản

22 Trypsin EP Sigma Aldrich, USA

SantaCruzBiotechnology

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 2.2 Trình tự các nội dung nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp kiểm nghiệm một số chỉ tiêu nguyên liệu đầu vào, cao định chuẩn và chế phẩm hoa SNHV

2.2.1.1 Kiểm nghiệm độ tinh khiết

a) Độ ẩm

đổi (sai số không quá 0,05 g), để nguội trong bình hút ẩm 15 phút trước khi đem cân.Cân chính xác khoảng 1 g mẫu thử, trải đều dưới đáy chén, rồi đem sấy trong máysấy ở nhiệt độ 105 °C, áp suất thường trong 4 giờ Để nguội trong bình hút ẩm 15

phút, cân và ghi kết quả Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu như trên chođến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5 mg Mỗi mẫu thựchiện 3 lần, lấy giá trị trung bình từng mẫu.

b) Độ tro toàn phần

Nung chén sứ đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút

và cân khối lượng của chén không Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu hoặc caochiết cho vào chén nung Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điệncho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói Đưa chén vào lònung ở 550 °C trong 4 giờ cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen)

Để nguội trong bình hút ẩm 30 phút Cân và ghi lại kết quả Tiếp tục sấy trong 1 giờ,

để nguội và cân mẫu như trên Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cânliên tiếp chênh nhau không quá 0,5 mg

2.2.1.2 Định tính hợp chất flavonoid

a) Định tính bằng phản ứng hóa học

Chuẩn bị mẫu thử: cân 1 g mẫu thử, thêm vào 100 ml ethanol 70% đem đi siêu

âm 30 phút rồi lọc thu dịch và tiến hành thực hiện các phản ứng định tính

Phản ứng với thuốc thử FeCl3 5%: lấy 2 ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt FeCl3 5%,

sẽ xuất hiện kết tủa xanh đen

Phản ứng với thuốc thử Pb(CH3COO)2 10%: lấy 2 ml dịch chiết cồn, thêm vàovài giọt thuốc thử dưới đáy ống nghiệm sẽ xuất hiện kết tủa

b) Định tính bằng sắc ký lớp mỏng