Soạn bài Thực Hành Hóa Sinh giúp các bạn ôn thi và kiểm tra tốt hơn. Chúc các bạn làm bài tốt! Soạn bài Thực Hành Hóa Sinh giúp các bạn ôn thi và kiểm tra tốt hơn. Chúc các bạn làm bài tốt!
Trang 1HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 1
Bài 1: GLUCID
Xác định tính khử của đường disaccarid:
o Đường còn nhóm –OH bán acetal thì còn tính khử
o Đường maltose, lactose có tính khử
o Đường saccarose không có tính khử
o Thuốc thử: Fehling (Fehling A + Fehling B đồng thể tích), đây là Cu2+ trong mt kiềm
o Không nên đun quá lâu vì sinh ra sản phẩm đường có tính khử (glucose, fructose)
o Đường tác dụng với Fehling làm cường độ màu xanh thuốc thử giảm do: đường khử Cu2+ thành Cu+
Sélivanop:
o Fructose và những cetone khác tạo thành oxymetyl furfural khi đun nóng với acid
o Chất này oxymetyl furfural tác dụng resorcin (có trong thuốc thử sélivanop) cho màu đỏ
o Phản ứng này dùng để phân biệt aldose với cetose, giữa glucose với fructose
o Phản ứng rất chậm với aldose, nên có đặc hiệu cho cetone
Thủy phân saccharose:
o Succrose không có tính khử
o Sản phẩm sau khi thủy phân bằng acid: glucose + fructose (2 đường này đều có tính khử)
o Trung hòa với lượng NaOH vừa đủ, vì nếu dư nhiều sẽ không cho màu đỏ khi dùng sélivanop
Sự tạo thành osazon:
o Xảy ra ở các đường đơn (ose) và một số đường đôi (lactose, maltose) có tính chất khử Các đường này không thể phân biệt bằng Fehling
o Gồm: glucose, lactose, phenylhydrazin, nhiệt độ
o Chức carbonyl (aldehyde, ketone) của monosaccarid tác dụng với phenylhydrazin để cho ra các oxazon (nếu dư phenylhydrazin) có hình dạng đặc biệt coi dưới kính hiển vi
o Hình dạng glucose: hình chổi, bó mạ
o Hình dạng lactose: hình cầu gai
o Phản ứng này dùng để định tính các chất đường, phân biệt glucose với lactose
o Glucose, fructose, manose, cho cùng 1 dạng oxazon Vì chung 1 đồng phân vị trí cacbon (1) và (2) mang nhóm định chức (-CO-CHOH-)
Thủy phân tinh bột:
o Thủy phân trong mt acid loãng, đun nóng
o Tinh bột → dextrin (oligosaccarid) → maltose (disaccarose) → glucose
o Maltose, glucose: không bắt màu với iod
Định lượng glucose bằng pp so màu dưới tác động của enzyme oxydase:
Trang 2HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 2
Glucose oxydase
Peroxidas
e
o Glucose + O2 + H2O Gluconic acid + H2O2
o H2O2 + phenol + 4-aminoantipyrine Quinoneimine + H2O
o 2 enzyme ở trên
o PP đo quang điểm cuối
o Bước sóng đo: 505 nm
o Dung dịch glucose chuẩn: 100 mg/dL
o Giá trị tham khảo: 74 – 106 mg/dL
o Khoảng tuyến tính: ≤ 400 mg/ dL
Bài 2: PROTEIN
Phản ứng biure:
o Phản ứng nhận biết liên kết peptide
o Tạo phức màu tím khi tác dụng với CuSO4 trong mt kiềm
o Thuốc thử: đồng sulfat, NaOH
o Không nên cho thừa đồng sulfat vì màu xanh sẽ che lấp màu tím của phức màu biure protein
Phản ứng ninhydrin:
o Phản ứng để xác định acid α-amine
o Khi đun nóng với ninhydrin sẽ cho màu xanh hoặc tím để lâu bị biến thành màu xanh, bị acid hóa thành ammoniac, khí CO2, aldehyde và ninhydrin bị khử
o Trong mt ammoniac, ninhydrin bị khử kết hợp với ninhydrin không bị khử tạo nên sản phẩm có màu
xanh tím
o Các acid amine không phải acid α-amine cũng phản ứng ninhydrin cho màu xanh nhưng không phóng thích CO2
o Proline thì cho màu vàng, hình ảnh CTCT proline:
Phản ứng xanthoprotein:
o Phản ứng xác định những acid amine vòng: tryptophan, phenylalanine, tyrosine
o Nitro hóa nhân thơm thành dẫn xuất nitro có màu vàng
o Khi kiềm hóa chất màu vàng sẽ thành màu da cam, màu của muối dinitrotyrosin
o Phản ứng phân biệt protein với gelatin
o Phản ứng dương tính với một số hợp chất thơm, như phenol
Trang 3HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 3
Phản ứng adam-kievics:
o Phản ứng tìm tryptophan
o Xuất hiện vòng đỏ tím giữa 2 chất lỏng phân cách
o Tryptophan phản ứng với acid glyocylic (có lẫn trong acetic acid đậm đặc) hoặc oxymtyl furfural (hình thành từ fructose)
o Acid sulfuric đặc có tác dụng hút nước
o Acetic acid phải đậm đặc mới có acid glyocylic
Phản ứng tạo chì sulfat:
o Phản ứng tìm acid amine chưa S: methionine, cysteine
o Methionine mặc dù có S nhưng không có phản ứng vì ở dạng liên kết bền vững
o Cysteine có liên kết yếu với S
o Cys (-CH2-SH) sau khi phản ứng kiềm, muối chì cho ra aa Serine (-CH2-OH) và có tạo kết tủa đen
o Thuốc thử: NaOH, chì acetate
Phản ứng kết tủa protein: giúp chúng ta đánh giá trọng lượng phân tử và kích thước phân tử protein:
o Tác nhân gây tủa protein: protein bị biến tính do bị khử nước, làm giảm sự hòa tan protein gây tủa và
bị trung hòa điện tích
o Phản ứng kết tủa không thuận nghịch:
HNO3: được sử dụng rộng rãi để định tính và định lượng protein trong nước tiểu
Sulfosalicylic acid: được dùng để tìm và định lượng albumin trong nước tiểu (tủa to)
Trichloroacetic acid: được dùng để kết tủa protein trong máu (tủa nhỏ)
Kim loại nặng: chì acetate, đồng sulfate
o Phản ứng kết tủa thuận nghịch
H2SO4:
Acetone:
NaCl: ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn
Điều kiện để làm phản ứng tủa dd protein phải trung tính hoặc hơi acid và tốt hơn hết là nên có chất điện giải (NaCl)
o Tủa protein bằng kim loại nặng (chì acetate, đồng,…) protein biến tính do sự hấp phụ kim loại nặng trên bề mặt phân tử
o Protein không tạo tủa với acid ortophosphoric (acid photphoric, H3PO4)
o Globulin có trọng lượng lớn hơn, dễ bị tủa hơn albumin
o Thu albumim dùng: dd amoni sulfate bão hòa (thuận nghịch)
o Thu globulin dùng: amoni bán bão hóa, nacl bão hòa
o NaCl tủa yếu hơn amoni sulfate, vì tác dụng khử yếu hơn
o Sự kết tủa bằng muối kết là một quá trình thuận nghịch!
Trang 4HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 4
2 – 8 độ C
Casein: là phosphoprotein:
o Nhóm ngoại có H3PO4
o Trong sữa ở dạng calcium hòa tan
o Khi acid hóa (CH3COOH), calcium bị phân ly, casein bị tủa (tủa bông)
o Điểm đẳng điện casein: pI = 4.7
o Trong tách chiết casein, NaOH có vai trò tạo mt pH = pI casein
Cromoprotein: hemoglobin:
o Có phần protein với nhóm ngoại gọi là Hem
o Của người và động vật khác ở phần globin, giống ở phần Hem
o Cấu tạp Hem: protoporphyrin kết hợp với ion Fe2+
o Khi oxy hóa: kết hợp với hydroxyd trong máu tạo Hematin, kết hợp với clor tạo Hemin
Định lượng protein toàn phần bằng phương pháp biure:
o PP đo quang điểm cuối
o Bước sóng đo: 546 nm
o Dung dịch albumin của bò chuẩn: 6 g/dL
o Giá trị tham khảo: 6 – 7.8 g/dL
o Khoảng tuyến tính: ≤ 12g/dL
Định lượng bilirubin tổng cộng và trực tiếp:
o PP đo quang: đo quang điểm cuối
o Bước sóng đo: 550 nm
o Bilirubin là sp thoái hóa của hemoglobin, cụ thể là phần porphyrin ở hem
o Bilirubin trực tiếp là bilirubin liên hợp
o Bilirubin gián tiếp = bilirubin tổng cộng – bilirubin liên hợp
o Bilirubin tổng cộng chuẩn: 1 mg/dL
o Bilirubin trực tiếp chuẩn: 0.2 mg/dL
Hợp chất diazo của
acid sulfanilic
+ bilirubin tổng cộng azobilirubin + bilirubin trực tiếp azobilirubin
Acid sulfanilic + natri nitrit
(HNO2)
Trang 5HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 5
o Khoảng tham khảo:
Bilirubin tổng cộng: 0.3 – 1.2 mg/dL
Bilirubin trực tiếp: < 0.2 mg/dL
o Khoảng tuyến tính: ≤ 20 mg/dL
Bài 3: LIPIP
Lecithin:
o Tên gọi khác: phosphatidyl cholin
o Là ester của acid phosphatidic với cholin
o Tan trong alcol, không tan trong acetone
o Tạo nhũ tương bền trong nước
o Thủy phân trong kiềm hoàn toàn cho ra: cholin, glycerol, acid béo, acid phosphoric
Cholin: thủy phân tiếp cho ra trimetylamin
Glycerol: bị oxy hóa bởi K2SO4 cho ra acrolein, acrolein là aldehyde có nối đôi (hình bên dưới), nhận biết acrolein bằng thuốc thử Schiff, xuất hiện màu tím bền
Thuốc thử Schiff: là đặc trưng nhận biết gốc aldehyde
Acid béo:
Tạo từ muối acid béo khi cho tác dụng với HCl đậm đặc
Tạo tủa trắng với muối Ca2+
o Từ glycerol ra acrolein, nhờ tác nhân oxy hóa là K2SO4, nó tách nước hình thành nối đôi
Thủy phân lipip bằng lipase:
o Lipase: là enzym có ở dịch tụy, tiết bởi tụy, đổ vào tá tràng để thủy phân lipip, enzyme này hoạt động tốt ở pH hơi kiềm (đầu ruột non)
o Lipip thủy phân bới dịch tụy cho ra: acid béo, glycerol
o Thuốc thử: Na2CO3, phenolphtalein
Trang 6HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 6
Lipoprotein lipase
G3P oxidase
Peroxidase
Cholesterol esterase
Cholesterol oxidase
Peroxidase
Định lượng triglycerid:
o Triglycerid + H2O Glycerol + acid béo
o Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphat (G3P) + ADP
o G3P + O2 H2O2 + dehydro acetone phosphat
o H2O2 + amino-4-antipyrine (4-AAP) + p-Chlorophenol Quinoneimine
Coi hết các enzyme ở trên
Dung dịch triglycerid chuẩn: 200 mg/dL
Phương pháp đo quang điểm cuối
Bước sóng đo: 500 nm
Giá trị tham khảo: ≤ 150 mg/dL
Khoảng tuyến tính: ≤ 1000 mg/dL
Khi nồng độ triglycerid vượt quá cao thì nguyên nhân do đái đường
Định lượng cholesterol:
o Cholesterol ester + H2O Cholesterol + acid béo
o Cholesterol + O2 Choles-4-en-3-on + H2O2
o H2O2 + phenol + 4-aminoantipyrine (4-AAP) Quinoneimine + H2O
o Coi hết enzyme ở trên
o PP đo quang điểm cuối
o Dung dịch cholesterol chuẩn 200 mg/dL
o Bước sóng đo 500 nm
o Giá trị tham khảo: < 200 mg/dL
o Khoảng tuyến tính: ≤ 600 mg/dL
o Mẫu huyết thanh phải pha loãng nếu nồng độ cholesterol vượt quá 500 mg/dL
Định lượng HDL cholesterol (HDL – C):
o HDL là cholesterol tốt
o Chylomyron, VLDL, LDL bị tủa khi cho acid phosphotungstic và ion Mg 2+
o PP đo quang điểm cuối
o Định lượng HDL – C bằng thuốc thử định lượng cholesterol toàn phần (TC)
Trang 7HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 7
o Dung dịch cholesterol chuẩn: 50 mg/dL, 100 mg/dL
o Giá trị tham khảo:
Nam: > 35 mg/dL
Nữ: > 45 mg/dL
o Tính toán LDL cholesterol (LDL – C): công thức Friedewald:
LDL = TC – (HDL + TG/5 ) mg/dL
Trang 8HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 8
GOT
Malate dehydrogenase (MDH)
GPT Lactate dehydrogenase (LDH)
Urease Peroxidase
Bài 4: ENZYME
Định lượng GOT (ASAT):
o ASAT: aspartate aminotransferase
o GOT: Glutamate – oxaloacetate transaminase
o L-Aspartate + α-ketoglutarate oxalo acetate + L-glutamate
o Oxalo acetate + NADH + H+ L-malate + NAD +
o Học các enzyme
o PP đo quang: động học KHÔNG so chuẩn
o Bước sóng đo: 340 nm
o Giá trị tham khảo: < 37 U/L
o Khoảng tuyến tính: ≤ 250 U/L
o Tính toán: ở 340 nm, hoạt độ GOT (U/L) = ∆OD/1 phút 1746
Định lượng GPT (ALAT):
o ALAT: alanin aminotransferase
o GPT: glutamate – pyruvate transaminase
o L-alnin + α-ketoglutarate Pyruvate + L-glutamate
o Pyruvate + NADH + H+ L-Lactate + NAD+
o Học các enzyme trên
o Bước sóng đo: 340 nm
o Giá trị tham khảo: < 37 U/L
o Khoảng tuyến tính: ≤ 250 U/L
o Tính toán: ở 340 nm, hoạt độ GPT (U/L) = ∆OD/1 phút 1746
GOT > GPT có nguy cơ bị nhồi máu cơ tim
Định lượng uric acid:
o Acid uric + H2O + O2 Allantoin + CO2 + H2O2
o H2O2 + 4-AAP + EHSPT Quinoneimine + H2O
EHSPT: N-etyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin
o Học 2 enzyme trên
o PP đo quang: pp đo quang điểm cuối
o Acid uric là sản phẩm thoái hóa của base purin
Trang 9HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 9
Catalase
o Dung dịch acid uric chuẩn: 6 mg/L
o Giá trị tham khảo, khoảng tuyến tính: coi thêm ở sách nha mấy bạn!
o Bước sóng đo: 546 nm
Phần pH tối ưu, nhiệt độ của enzyme các bạn tự xem ở sách nha! Học đó!
Enzyme catalase:
o H2O2 O2 + H2O
o Cấu tạo của enzyme này giống cytocrom ở phần hem, khác ở phần protein
o Cơ chất của enzyme này là H2O2
Bài 5: Các thành phần trong nước tiểu
Tìm Glucose:
o Dựa vào tính khử của glucose với thuốc thử fehling
o Chất khử bã:
Thuốc thử courton: dd trung hòa chì acetate 30% dùng để loại acid uric và urat
Thuốc thử Potion Dufau: dd nitrat thủy ngân trong mt acid dùng để loại acid uric, creatin và protein
o Không sử dụng chất khử bã trên ở mt kiềm, bởi sẽ tạo kết tủa và hấp phụ mất lượng đường (gây sai số)
o Thuốc thử: Fehling và Courton
Tìm cetone: cho màu tím ở trên mặt
o Thuốc thử: natri nitroprussiat (Fe(CN)5NO)2Na trong mt amoniac
o Trong kĩ thuật Rothera, nước tiểu bão hòa bởi amoni sulfat Cho phép ta tìm đc lượng nhỏ
acetylacetic acid
o K2SO4 có tác dụng đưa hết cetone trong nước tiểu lên mặt trên!
o Những cetone trong cơ thể: acetone, acetylacetic acid, hydroxybutiric acid
Tìm sắc tố mật:
o Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của hemoglobin Bình thường nước tiểu sẽ không có, nếu có do bệnh
lí vàng da, tắc mật, viêm gan
o Thuốc thử Fouchet và BaCl2 Fouchet: FeCl3 trong dd acid trichloacetic)
o Bilirubin bị oxy hóa bời FeCl3 thành biliverdin (màu xanh lơ)
Trang 10HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 10
+ BaCl2
Urease
Glutamate dehydrogenase
o Nguyên tắc:
Tìm muối mật:
o Thuốc thử: bột lưu huỳnh
o Các muối mật làm giảm sức căng bề mặt ngoài của nước tiểu
o Phản ứng không đặc hiệu, dương tính ngay khi nước tiểu có thymol (chất bảo quản nước tiểu)
o Bình thường nước tiểu sẽ ko có muối mật, xuất hiện trong bệnh lí xơ gan, vàng da, tắc mật
o Vàng da do tiêu huyết không có muối mật trong nước tiểu
Tìm protein:
o Tạo tủa trắng với acid trichlroacetic
o Thuốc thử: trichlroacetic 1/3 trong nước
Định lượng glucose trong nước tiểu bằng pp Causse Bonnas:
o PP Causse Bonnas:
o Thành phần:
Thuốc thử courton
Dung dịch kali ferrocyanua (K4[Fe(CN)6]) được dùng để hòa tan oxyd đồng tạo thành, giúp cho
sự quan sát màu dễ dàng
Chính xác dd Fehling A, B
o Coi công thức tính nồng độ Glusose trong sách trang 40
o Định phân kết thúc khi chuyển từ xanh dương sang xanh lá rồi vàng, kết thúc khi qua màu nâu đen
Định lượng ure:
o Ure + H2O NH3 + CO2
o NH4+ + 2-α-ketoglutarate + NADH 2-L-Glutamate + 2NAD+ + H2O
o Học các enzyme trên
o Ure được tạo ra ở gan
o Định lượng ure trong máu và nước tiểu là xét nghiệm cơ bản thăm dò chức năng thận
Bilirubin trong nước tiểu
(có nhiều gốc SO42-)
Bilirubin bị oxh thành biliverdin
(làm tủa có màu xanh lơ)
Tạo tủa BaSO4, tủa này hấp phụ các sắc tố mật lọc lấy tủa
Thuốc thử Fouchet (có màu vàng của
Fe3+)
Trang 11HÓA SINH/ CM 69 - VA.LIM 11
o PP đo quang: đo quang động học 2 điểm so chuẩn
o Bước sóng đo: 340 nm Đo sự mất đi của NADH hay sự hình thành NAD+
o Dung dịch ure chuẩn: 50 mg/dL
o Coi giá trị tham khảo, khoảng tuyến tính trang sách trang 41, 42
Định lượng Creatinin:
o Đo tốc độ sự hình thành phức màu giữa creatinin với picrat kiềm
o Creatinin là sản phẩm thoái hóa của creatin phosphat của cơ và cơ quan khác
o PP đo quang: đo quang động học 2 điểm so chuẩn
o Dung dịch creatinin chuẩn: 2 mg/dL (20 mg/L)
o Bước sóng đo: 505 nm
o Giá trị tham khảo: coi ở sách thêm
o Khoảng tuyến tính: 0.5 – 15 mg/dL
o Độ thanh thải creatinin:
Là số ml huyết tương dược lọc hết creatinin qua nước tiểu trong 1 phút
Creatinin được dùng phổ biến nhất bởi lẻ ít bị tái hấp thu và bài tiết thêm
Bình thường độ thanh thải creatinin khoảng 75 – 120 ml/phút
Độ thanh thải nhỏ hơn 75 ml/phút chứng tỏ chức năng lọc cầu thận kém
o Công thức tính độ thanh thải Cr:
𝑃
o Chất chỉ duy nhất được thải bỏ ra khỏi cơ thể bằng phương pháp lọc cầu thận
Định lượng nồng đồ ure và creatinin để đánh giá chức năng cầu thận, Phương pháp động học này sẽ làm giảm ảnh hưởng của những chất có tác động đến phản ứng
CÁC KHOẢNG ÁNH SÁNG:
o Hồng ngoại: 700nm – 1mm
o Tử ngoại: 10 – 380 nm
o Nhìn thấy: 380 – 700 nm
Ccr: độ thanh thải creatinin (ml/phút) U: nồng độ Cr trong nước tiểu (mg/ml) P: nồng độ Cr trung bình trong huyết thanh (mg/ml) V: số ml nước tiểu đào thải trong 1 phút (trung bình 1200ml/24 giờ