nghiên cứu giữ ổn định chất màu chlorophyll trích ly từ rau ngót sauropus androgynus

Mẫu nguyên liệu sau xử lý được trích ly với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 25 phút, sử dụng dung môi ethanol 40% và bổ sung các muối NaCl, Na2CO3, ZnSO4 với nồng độ 1% để so

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

CAO HỒ KIM NGÂN

NGHIÊN CỨU GIỮ ỔN ĐỊNH CHẤT MÀU CHLOROPHYLL

TRÍCH LY TỪ RAU NGÓT (SAUROPUS ANDROGYNUS)

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Đống Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Kha Chấn Tuyền

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 05 tháng 01 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS.TS Trần Thị Thu Trà – Chủ tịch

2 PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi – Thư ký 3 PGS.TS Kha Chấn Tuyền – Phản biện 1 4 PGS.TS Mai Huỳnh Cang – Phản biện 2 5 GS.TS Đống Thị Anh Đào - Ủy viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 31/12/1996 Nơi sinh: Bình Dương

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Phân tích một số thành phần hóa học của rau ngót

- Khảo sát điều kiện tiền xử lý chần (thời gian, nhiệt độ chần) và hàm lượng muối NaCl bổ sung trong quá trình chần đến hiệu suất thu nhận chlorophyll

- Khảo sát ảnh hưởng của các muối kim loại NaCl, ZnSO4, Na2CO3 bổ sung vào dịch trích đến hiệu suất thu nhận chlorophyll và sự thay đổi màu chlorophyll theo thời

gian

- Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng và dung dịch trích ly bổ sung Na2CO3 đến hiệu suất trích ly chlorophyll và sự thay đổi màu của chlorophyll theo thời bảo quản

- Xác định một số đặc tính của bột chlorophyll sau sấy phun

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/09/2023

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS.TS Đống Thị Anh Đào

Tp HCM, ngày tháng… năm 2023

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

GS TS Đống Thị Anh Đào GS TS Lê Văn Việt Mẫn TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Bách Khoa TP HCM đã mang lại cho tôi nhiều kiến thức bổ ích Để có được điều đó, tôi xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy Cô tại Trường Đại học Bách Khoa TP HCM và đặc biệt quý Thầy Cô ở bộ môn Công nghệ Thực phẩm – khoa Kỹ thuật Hóa học

Để hoàn thành được luận văn nghiên cứu này tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, quý Thầy Cô tại khu thí nghiệm - thực hành Viện Phát Triển Ứng Dụng – Trường Đại học Thủ Dầu Một, đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian qua Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Đống Thị Anh Đào, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này Cảm ơn Cô đã hết lòng quan tâm, tận tình chỉ bảo, động viên giúp đỡ để em hoàn thành được luận văn và chương trình học tập tại trường

Qua đây tôi cũng gửi lời trân trọng biết ơn đến bố mẹ, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn quan tâm, động viên hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm – khoa Kỹ thuật Hóa học trường Đại học Bách Khoa; quý Thầy Cô Viện Phát triển Ứng dụng trường Đại học Đại học Thủ Dầu Một nhiều sức khỏe, hạnh phúc, gặt hái được nhiều thành quả tốt đẹp trong giảng dạy và nghiên cứu

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2023

Học viên

Cao Hồ Kim Ngân

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Rau ngót (Sauropus androgynus) là một loại rau quý có chứa nhiều chlorophyll, được

sử dụng để tạo màu xanh lá đặc trưng cho các sản phẩm thực phẩm Trong nghiên cứu này, chlorophyll được chiết xuất từ lá rau ngót bằng cách sử dụng lá tươi đã được tiền xử lý bằng phương pháp chần ở điều kiện nhiệt độ là 90oC, thời gian là 180 giây, bằng dung môi NaCl 1% hoặc nước cất Mẫu nguyên liệu sau xử lý được trích ly với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 25 phút, sử dụng dung môi ethanol 40% và bổ sung các muối NaCl, Na2CO3, ZnSO4 với nồng độ 1% để so sánh độ ổn định của màu chlorophyll theo thời gian nhằm xác định ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý chần bằng dung dịch muối kim loại đến hàm lượng và độ ổn định của sắc tố chlorophyll Bên cạnh yếu tố chần thích hợp là nhiệt độ 90oC trong 180 giây, điều kiện trích ly bổ sung trong dung dịch từng loại muối NaCl, Na2CO3, ZnSO4 được khảo sát Với điều kiện thời gian 150 giây trích ly bằng vi sóng công suất 500W (500w/khối lượng lá) và với dung môi ethanol 40% và bổ sung muối kim loại cũng được thực hiện Kết quả cho thấy ở điều kiện trích ly thông thường ở nhiệt độ phòng trong vòng 25 phút có bổ sung 1% muối Na2CO3, hàm lượng chlorophyll đạt hiệu suất thu nhận cao nhất là 1.351 ± 0.032 mg/g chất khô Mẫu dịch trích ly chlorophyll đóng bao bì kín, che chắn hoàn toàn ánh sáng, có thể bảo quản ổn định màu sắc và hàm lượng chlorophyll trong 34 ngày ở nhiệt độ phòng và 104 ngày ở 4oC Mẫu bột

chlorophyll sau sấy phun thích hợp sử dụng làm chất màu thực phẩm

ABSTRACT

Sauropus androgynus (S androgynus) is a precious vegetable rich in chlorophyll,

which is used to give a characteristic green color to food products In this study,

chlorophyll was extracted from the leaves of S androgynus by using fresh leaves that

were pretreated by blanching at the temperature of 90oC, time for 180 seconds, with 1% NaCl solvent or distilled water The raw material sample after treatment was extracted at 500 rpm at room temperature for 25 minutes, using 40% ethanol solvent and adding NaCl, Na2CO3, ZnSO4 salts with a concentration of 1% to compare chlorophyll color stability over time in order to determine the influence of metal salt solution blanching method on the content and stability of chlorophyll pigment Besides the suitable blanching factor, which is the temperature of 90oC for 180 seconds, extraction conditions adding in each solution of NaCl, Na2CO3, ZnSO4 salts were investigated With the condition of 150 seconds, extraction by microwave power 500W (500w/weight of leaves) with 40% ethanol solvent and the addition of metal salts was also performed The results showed that under normal extraction conditions at room temperature within 25 minutes with the addition of 1% Na2CO3 salt, the highest chlorophyll content was obtained at 1.351 ± 0.032 mg/g dry matter Samples of chlorophyll extracts are sealed in sealed containers, completely shielded from light, and stored stably on chlorophyll color and content for 29 days at temperature and 99 days at temperature 4oC Samples of chlorophyll powder after spray drying are suitable for use as food colorants

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài này được hướng dẫn bởi GS TS Đống Thị Anh Đào, bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Kỹ thuật Hóa học Trường Đại học Bách khoa TP HCM Đề tài do chính tôi thực hiện nghiên cứu tại Viện Phát triển Ứng dụng – Trường Đại học Thủ Dầu Một Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực chưa được công bố trong bất kỳ công trình khác Mọi trích dẫn trong luận văn được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên

Cao Hồ Kim Ngân

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

LỜI CAM ĐOAN v

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH x

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về cây rau ngót 3

2.1.1 Phân loại khoa học 3

2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu đề tài trong và ngoài nước 16

2.3.1 Tình hình nghiên cứu đề tài ngoài nước 16

2.3.2 Tình hình nghiên cứu đề tài trong nước 17

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.2 Hóa chất và trang thiết bị 19

3.2.1 Hóa chất 19

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 21

3.3.2 Quy trình trích ly dịch rau ngót 22

3.3.3 Thiết kế thí nghiệm 24

3.3.4 Phương pháp phân tích 26

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả xác định một số thành phần trong nguyên liệu 30

4.2 Kết quả ảnh hưởng của điều kiện chần đến hàm lượng chlorophyll tổng 30

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chần 31

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ chần 30

4.3 Kết quả ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly đến hàm lượng chlorophyll tổng số 31

4.4 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của dịch trích ly chlorophyll trích ly không có hỗ trợ vi sóng và xử lý chần nguyên liệu bằng nước cất 34

4.5 Kết quả ảnh hưởng tiền xử lý chần bằng dung dịch NaCl 1% và bổ sung muối kim loại trong quá trình trích ly đến hàm lượng chlorophyll tổng khi trích ly có sự hỗ trợ vi sóng và chần nước cất 37

4.6 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của dịch trích ly chlorophyll trích ly có sự hỗ trợ vi sóng 39

4.7 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Na2CO3 bổ sung trong quá trình trích ly đến giá trị pH và hàm lượng chlorophyll trích ly được từ lá rau ngót 41

4.8 Sấy phun dịch trích ly chlorophyll từ rau ngót tạo bột màu xanh lá cây 42

4.9 Kết quả phân tích FT-IR mẫu bột màu chlorophyll 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng của rau ngót ở Ấn Độ [] 4

Bảng 2.2: Các nhóm chức tạo nên các loại chlorophyll a, b, d, f 8

Bảng 2.3: Các nhóm chức tạo nên chlorophyll c 9

Bảng 3.1: Giá trị dinh dưỡng của whey protein Hilmar 19

Bảng 4.1: Một số thành phần trong nguyên liệu lá rau ngót (*) 30

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hàm lượng chlorophyll trích ly 31

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của quá trình chần bằng các dung dịch nước cất và NaCl 1% đến hàm lượng chlorophyll tổng trong dịch trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE) 38

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hàm lượng Na2CO3 bổ sung đến hàm lượng chlorophyll và giá trị pH của dịch trích ly 41

Bảng 4.5: Thành phần dinh dưỡng của sắc tố xanh hòa tan dạng bột sấy phun 43

Phụ lục 1: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc của các mẫu dịch trích ly chlorophyll dưới ảnh hưởng thời gian chần 60

Phụ lục 2: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc của các mẫu dịch trích ly chlorophyll dưới ảnh hưởng nhiệt độ chần 60

Phụ lục 3: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc của các mẫu dịch trích ly chlorophyll dưới ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly không có hỗ trợ vi sóng 61

Phụ lục 4: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc của các mẫu dịch trích ly chlorophyll dưới ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng 61

Phụ lục 5: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc của các mẫu dịch trích ly chlorophyll dưới ảnh hưởng của hàm lượng Na2CO3 bổ sung vào quá trình trích ly không có hỗ trợ vi sóng 62

Phụ lục 6: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng chlorophyll trích ly 62

Phụ lục 7: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hàm lượng chlorophyll trích ly 63

Phụ lục 8: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào trích ly đến hàm lượng chlorophyll 63

Phụ lục 9: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly không có vi sóng và tiền xử lý chần nước cất 63

Phụ lục 10: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly không có vi sóng, có bổ sung NaCl và tiền xử lý chần nước cất 64

Phụ lục 11: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly không có vi sóng, có bổ sung Na2CO3 và tiền xử lý chần nước cất 64 Phụ lục 12: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào trích ly có hỗ trợ của vi sóng đến hàm lượng chlorophyll 66 Phụ lục 13: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly có hỗ trợ vi sóng và tiền xử lý chần nước cất 66 Phụ lục 14: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly có hỗ trợ vi sóng, có bổ sung NaCl và tiền xử lý chần nước cất 67 Phụ lục 15: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản mẫu dịch trích ly có hỗ trợ vi sóng, có bổ sung Na2CO3 và tiền xử lý chần nước cất 67 Phụ lục 16: Số liệu thô của thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng Na2CO3 đến giá trị pH và hàm lượng chlorophyll trích ly 69

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây rau ngót 4

Hình 2.2 Cấu tạo porphyrin 7

Hình 2.3 Cấu trúc phorbin 7

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của các loại chlorophyll a, b, d, f 8

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chlorophyll c 9

Hình 2.6 Phản ứng của chlorophyll a với acid 10

Hình 2.7 Phản ứng của chlorophyll a với bazo 11

Hình 2.8 Phản ứng tổng hợp chlorophyllin 11

Hình 2.9 Phản ứng biến đổi chlorophyll của enzyme chlorophyllase 12

Hình 2.10 Viên uống Puritan's Pride Chlorophyll 15

Hình 2.11 Nước Diệp Lục Swisse Chlorophyll 15

Hình 2.12 Bột diệp lục Unicity Super Chlorophyll 16

Hình 3.1 Quy trình trích ly mẫu lá rau ngót 22

Hình 3.2 Mẫu phiếu đánh giá cảm quan 29

Hình 4.1 Nhận biết bằng cảm quan màu của dịch trích ly chlorophyll theo sự thay đổi của nhiệt độ chần 31

Hình 4.2 Ảnh hưởng của thời gian chần đến hàm lượng chlorophyll được trích ly 32 Hình 4.3 Ảnh hưởng của muối NaCl 1% bổ sung trong quá trình chần đến hàm lượng chlorophyll tổng thu nhận bằng phương pháp trích ly có bổ sung muối kim loại NaCl, Na2CO3, ZnSO4 33

Hình 4.4 Nhận biến bằng cảm quan màu của dịch trích ly chlorophyll khi chần bằng nước cất (A) và dung dịch NaCl 1% (B) 34

Hình 4.5 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll theo thời gian khi bảo quản ở 4oC 35

Hình 4.6 Thay đổi hàm lượng chlorophyll khi bảo quản ở nhiệt độ phòng theo thời gian 36

Hình 4.7 Nhận biết cảm quan sự thay đổi màu sắc của dịch trích ly chlorophyll bổ sung Na2CO3 1% không có hỗ trợ vi sóng khi bảo quản ở 4oC ở ngày thứ 104 và nhiệt độ phòng ở ngày thứ 39 so với ban đầu 37

Hình 4.8 Nhận biết cảm quan màu của dịch trích ly chlorophyll có sự hỗ trợ vi sóng với phương pháp tiền xử lý chần bằng nước cất (A) và dung dịch NaCl 1% (B) 38

Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll theo thời gian khi bảo quản ở 4oC khi quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng 39

Hình 4.10 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll theo thời gian khi bảo quản ở nhiệt độ phòng khi quá trình trích ly có hỗ trợ vi sóng 40

Hình 4.11 Nhận biết cảm quan sự thay đổi màu sắc của dịch trích ly chlorophyll bổ sung Na2CO3 1% có hỗ trợ vi sóng khi bảo quản ở 4oC ở ngày thứ 59 và nhiệt độ phòng ở ngày thứ 24 so với ban đầu 41 Hình 4.12 Nhận biết cảm quan màu sắc dịch trích ly chlorophyll khi tăng hàm lượng Na2CO3 bổ sung 42 Hình 4.13 Bột chlorophyll sau khi sấy phun (A) và bảo quản trong 60 ngày (B) 43 Hình 4.14 Phổ FT-IR của dịch trích ly mẫu đối chứng 44 Hình 4.15 Phổ FT-IR của dịch trích ly mẫu có bổ sung Na2CO3 44

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, con người đang có xu hướng lựa chọn và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên để bảo vệ sức khỏe Các hợp chất màu chiết xuất từ tự nhiên cũng được ưu tiên sử dụng hơn chất màu tổng hợp vì độ an toàn cao, không có tác dụng phụ Một trong số các nhóm chất màu tự nhiên thường thấy hiện nay là nhóm chất màu chlorophyll với màu xanh lá cây đặc trưng Chlorophyll đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở cây Bên cạnh đó, chlorophyll tự nhiên được trích ly từ lá của thực vật giàu sắc tố xanh lá cây có khả năng chống oxy hóa, lợi ích cho sức khỏe và quá trình trích ly chlorophyll còn thu nhận đồng thời một số vitamin, acid amin và khoáng chất Hai loại chlorophyll thường thấy trong thực vật là chlorophyll a và chlorophyll b Chúng đều là những hợp chất tan trong chất béo có đặc tính chống oxy hóa Chlorophyll được sử dụng để bổ sung vào một số sản phẩm nước giải khát và bánh kẹo để tăng giá trị cảm quan Ngoài công dụng là chất màu trong thực phẩm, chlorophyll cũng có một số lợi ích cho sức khỏe của con người Chlorophyll chỉ khác với hemoglobin trong máu người ở nhân Mg2+ trong vòng porphyrin (thay vì Fe2+) Một số nghiên cứu cho thấy chlorophyll có tác dụng làm lành da, thanh lọc cơ thể, giải độc tố, chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa huyết áp, hỗ trợ điều trị thiếu máu, [1]

Rau ngót (Sauropus androgynus) là một loại rau có giá trị dinh dưỡng cao

Ngoài ra, nó còn là nguồn chlorophyll tự nhiên dồi dào Chất màu chiết từ rau này khá bền với nhiệt, dễ tan trong nước, thường được sử dụng rộng rãi trong dân gian Ngoài ra, rau ngót là một loại rau phổ biến, dễ trồng, dễ sống và được trồng bằng thân và có thể trồng ở mọi nơi

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu khảo sát và đánh giá trích ly chlorophyll từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau trong tự nhiên, đặc biệt là từ tảo xanh và các loại rau xanh Tuy nhiên, chlorophyll là chất rất dễ bị biến đổi màu trong thời gian bảo quản do đó gặp khó khăn cho việc sử dụng và bảo quản các sản phẩm thực phẩm có chlorophyll

Do đó cần thiết nghiên cứu giữ ổn định chlorophyll từ nguồn tự nhiên, đặc biệt là rau ngót bởi vì chlorophyll có khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vực thực phẩm đặc biệt là các sản phẩm bảo vệ sức khỏe

Trong tình hình hiện nay, Việt Nam và các nước trên thế giới đang ưu tiên sử dụng các hợp chất trích ly từ tự nhiên Từ thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài:

Nghiên cứu giữ ổn định chất màu chlorophyll trích ly từ rau ngót (Sauropus

androgynus)

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của muối kim loại đến hiệu suất trích ly và độ ổn định

màu của chlorophyll từ rau ngót (Sauropus androgynus)

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chlorophyll từ nguyên liệu rau ngót (Sauropus androgynus)

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu trích ly và giữ ổn định màu chlorophyll từ rau ngót (Sauropus

androgynus) bằng thực nghiệm trong phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm

trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm trường Đại học Thủ Dầu Một từ tháng 02/2023 đến tháng 12/2023

1.4 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích một số thành phần hóa học của rau ngót

- Khảo sát điều kiện tiền xử lý chần (thời gian, nhiệt độ chần) và hàm lượng muối NaCl bổ sung trong quá trình chần đến hiệu suất thu nhận chlorophyll

- Khảo sát ảnh hưởng của các muối kim loại NaCl, ZnSO4, Na2CO3 bổ sung vào dịch trích đến hiệu suất thu nhận chlorophyll và sự thay đổi màu chlorophyll theo thời gian

- Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng và dung dịch trích ly bổ sung Na2CO3 đến hiệu suất trích ly chlorophyll và sự thay đổi màu của chlorophyll theo thời bảo quản

- Xác định một số đặc tính của bột chlorophyll sau sấy phun

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây rau ngót

2.1.1 Phân loại khoa học [2]

Rau ngót còn được gọi với tên bù ngót, bồ ngót, hay rau tuốt là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới Á châu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, như ở Việt Nam

Tên khoa học của rau ngót là Sauropus androgynus

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Malpighiales Họ: Phyllanthaceae Chi: Sauropus

Loài: S androgynus

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Rau ngót hay Sauropus androgynus (Họ: Phyllanthaceae) là một loại cây bụi

lâu năm thường phân bố rộng rãi ở Đông Nam Á và Nam Á Cây mọc tự nhiên trong môi trường nóng ẩm, được trồng và sử dụng rộng rãi ở Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ và Trung Quốc Ở Malaysia, nó được biết đến như một loại rau xanh và nhiều vitamin được dùng làm salad hoặc chế biến thành món rau xào [3]

Cây rau ngót thích nơi ấm áp và ẩm ướt với nhiệt độ cân bằng và lượng mưa cao, cho thấy khả năng chịu bóng râm tương đối Rễ của loại cây này phát triển trong đất có độ pH dao động từ 5.5 đến 8.0, nếu không chúng sẽ có chất lượng kém và phát triển chậm khi ở trên đất khô và cằn cỗi [4]

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Rau ngót là giống cây bụi mọc thẳng với chiều cao từ 1–3 m và thường nở hoa từ tháng 4 đến tháng 7 Lá có hình mũi mác, dài 3–10 cm và rộng 1.5–3.5 cm, với các phiến lá mỏng như giấy hoặc có màng dưới bề mặt [5] Hoa của cây là hoa đơn tính cùng gốc hoặc dị tính, có 1 hoặc 2 hoa, hoặc nhiều hoa đực và hoa cái trên một cụm Hoa đực có hình đĩa hoàn toàn hoặc gần như hình đĩa [6], với các cuống mảnh mai

dày 5.0–7.5 mm và đường kính 5–12 mm Quả có đài hoa màu đỏ bền và hình cầu lõm hoặc hình cầu có đường kính lên tới 1.5 cm, giống như một quả nang hình cầu màu vàng nhạt khi trưởng thành Hạt có màu đen, có gân và không hoạt động sau khi mất nước [7]

Hình 2.1 Cây rau ngót

2.1.4 Thành phần hóa học

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chất dinh dưỡng trong rau ngót bao gồm hàm lượng đồng, acid ascorbic (vitamin C) và chlorophyll được phát hiện là cao nhất trong số 10 loại cây truyền thống từ đảo Andamana và Nicobar ở Ấn Độ [8] Hơn nữa, hàm lượng vitamin C, vitamin E và tiền vitamin A trong rau ngót cao hơn hầu hết các loại rau thông thường, điều này chứng tỏ rau ngót là một loại thực vật đa vitamin [7]

Bảng 2.1: Thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng của rau ngót ở Ấn Độ [3]

Phospho mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 61.20 ± 3.46 Coban mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 1.62 ± 0.10 Mangan mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 25.60 ± 5.80

Đồng mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 768.70 ± 11.40 Natri mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 306.31 ± 52.8 Kẽm mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 15.93 ± 6.61 Canxi mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 84.44 ± 8.14 Sắt mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 212.50 ± 2.82 Magie mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 64.90 ± 38.14 Ngoài ra, rau ngót còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như sterols, resins, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, terpenoids, glycosides, phenols, catechol, cardiac glycosides [9] Tùy thuộc vào đặc điểm đất đai, khí hậu,… mà thành phần hóa học trong rau ngót có sự khác nhau

2.1.5 Công dụng của rau ngót

Công dụng dân gian:

- Rau ngót là một trong những loại thực phẩm phổ biến trong bữa cơm của người Việt và một số nước ở Nam Á và Đông Nam Á [7] Lá rau ngót được sử dụng làm chất tạo màu cho một số loại bánh truyền thống của Việt Nam như bánh chưng, bánh tét,

- Trong dân gian, người ta sử dụng rau ngót để chữa các bệnh: bệnh tiết niệu – sinh dục, bệnh tim mạch và chống béo phì Ngoài ra, lá rau ngót còn được dùng cho phụ nữ sau khi sinh để phục hồi sau sinh và tăng tiết sữa ở các bà mẹ đang cho con bú Việc tăng cường sản xuất sữa mẹ có thể bắt nguồn từ tác động nội tiết tố của các hợp chất hóa học là sterol estrogen [2]

Công dụng dược lý [2]:

- Chống oxy hóa: Lá rau ngót chứa hoạt tính chống oxy hóa khá cao trong các loại rau ăn lá khác có nguồn gốc từ Indonesia [10] Các chất chống oxy hóa trong lá rau ngót có thể ngăn ngừa một số bệnh mãn tính, chẳng hạn như bệnh ung thư và bệnh tim mạch

- Tác dụng giảm cân: Lá rau ngót được chứng minh là có tác dụng giảm béo nhưng không được khuyến khích sử dụng để giảm cân vì một số hợp chất có thể ảnh hưởng đến sức khỏe khi sử dụng nhiều

- Kháng khuẩn: Dịch chiết từ rau ngót có khả năng kháng vi khuẩn gram âm và gram dương nhưng vùng ức chế còn nhỏ hơn so với kháng sinh streptomycin

- Chống viêm

- Hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường: cây này có tiềm năng cao trong việc hạ thấp lượng đường trong máu người, điều này có khả năng hỗ trợ trong cuộc chiến toàn cầu nhằm giảm bệnh tiểu đường

- Tăng tiết sữa mẹ: Một nghiên cứu ở Indonesia đã báo cáo rằng chiết xuất lá rau ngót đã làm tăng sản lượng sữa mẹ của các bà mẹ đang cho con bú lên đến 50.7% so với giả dược [11]

2.2 Tổng quan về chlorophyll

2.2.1 Giới thiệu về chlorophyll

Chlorophyll hay diệp lục là sắc tố màu xanh lục có nguồn gốc chủ yếu từ lá cây, có chức năng chuyển đổi năng lượng ánh sáng mặt trời [12] và là sắc tố quang hợp được mô tả đầu tiên bởi Pelletier và Caventou năm 1915 [13] Các nghiên cứu cho thấy cấu trúc của chlorophyll ở các loại thực vật khác nhau đều giống nhau, sự khác biệt màu sắc là do sự hiện diện và phân bố của các chất màu thực vật khác nhau có trong lá cây [14] Sắc tố này được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, tảo vào vi khuẩn cyanobacterial

Tên của nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp chloros (xanh lá cây) và phyllon (lá) [1] Chlorophyll được phân lập đầu tiên bởi Joseph Bienaimé Caventou và Pierre Joseph Pelletier vào năm 1817, năm 1851 Verdeil đã đưa ra mối quan hệ giữa cấu trúc Chlorophyll và sắc tố hemoglobin trong máu [14] Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời, cây xanh đã có một cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt trời là chlorophyll Thông qua quá trình quang hợp, nó có khả năng chuyển năng lượng của bức xạ mặt trời thành năng lượng hóa học của các hợp chất hữu cơ trong tế bào Năm 1940, Hans Fischer

tìm ra cấu trúc tổng quát của chlorophyll Và năm 1960, cấu trúc lập thể của chlorophyll a được làm sáng tỏ hoàn toàn

2.2.2 Cấu trúc hóa học

Cấu trúc cơ bản của chlorophyll gồm phần “thân” là một porphyrin và phần “đuôi” là một phytol Porphyrin là một nhóm hợp chất có bốn vòng pyrole được liên kết bởi ion magie trung tâm và chuỗi phytol (C20H39) [15] Nhân porphyrin do 4 vòng pyrrole nối với nhau tạo thành vòng khép kín Trên vòng porphirin có tổng cộng 8 nguyên tử cacbon, ở giữa là nhân Mg2+ tạo nên cấu trúc quyết định sự khác biệt của Chlorophyll đối với các tetrapyrroles khác như hemoglobin hay vitamin B12 [13]

Hình 2.2 Cấu tạo porphyrin

Các pyrrol riêng lẻ được đánh nhãn A; B; C; D và một vòng isocyclic năm cạnh (E) gắn vào vòng pyrrole C hình thành nên phorbin Cấu trúc của chlorophyll được tạo nên nhờ việc bổ sung các nhóm khác vào bên ngoài cấu trúc phorbin, cùng với sự kết hợp của ion magie kim loại ở trung tâm [16] Năm 1940, cấu trúc của chlorophyll a và b đã được thiết lập bởi Hans Fischer [1]

Hình 2.3 Cấu trúc phorbin

2.2.3 Phân loại

Có nhiều loại phân tử chlorophyll, mỗi loại được đặc trưng riêng bởi các nhóm bên khác nhau tạo nên một số tính chất khác nhau Chlorophyll a, b, c, d là 4 dạng của chlorophyll Thực vật chứa nhiều chlorophyll a và b, ngược lại các loại tảo chứa nhiều chlorophyll c, d và f hơn [17]

- Chlorophyll a: C55H72O5N4Mg là chất diệp lục chính trong tất cả các loài thực vật và là dạng phân bố rộng rãi nhất Chlorophyll a thường đi cùng lượng nhỏ chlorophyll d trong tảo đỏ, chlorophyll c trong tảo cát (Bacillariophyceae), chlorophyll b trong tảo xanh (Chlorophyceae) [18]

- Chlorophyll b: C55H70O6N4Mg là chất diệp lục có trong hầu hết các loại thực vật và một ít trong Euglena tảo xanh [18] Trong nhiều loại thực vật như trái cây và rau xanh, chlorophyll a thường có tỷ lệ cao hơn chlorophyll b với tỷ lệ là 3:1 [17]

- Chlorophyll c: là loại chất diệp lục đi kèm với chlorophyll a trong tảo cát, tảo lục, tảo nâu và một số loài tảo cộng sinh của hải quỳ Chlorophyll c gồm c1, c2, c3, có phổ hấp phụ độ hòa tan, phản ứng kiềm khác biệt rất nhiều so với tất cả các loại diệp lục khác, được hòa tan trong ete, không tan trong nước [18]

- Chlorophyll d: C54H70O6N4Mg thường đi kèm với chlorophyll a trong một số tảo đỏ [18]

- Chlorpphyll f: C55H70O6N4Mg là một dạng chất diệp lục hấp thụ ánh sáng đỏ (ánh sáng hồng ngoại) [19]

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của các loại chlorophyll a, b, d, f

Bảng 2.2: Các nhóm chức tạo nên các loại chlorophyll a, b, d, f

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chlorophyll c Bảng 2.3: Các nhóm chức tạo nên chlorophyll c

2.2.4.2 Tính chất quang hóa

Quang phổ hấp thu cực đại của chlorophyll trong vùng ánh sáng xanh là 430 – 460 nm và vùng ánh sáng đỏ là 620 - 700 nm Nếu năng lượng ánh sáng hấp phụ bởi chlorophyll không sử dụng trong quá trình quang hợp thì năng lượng ánh sáng cung cấp tiếp theo không được hấp thụ Sự tiêu tan năng lượng ánh sáng thừa này có thể xảy ra bởi một số cơ chế, bao gồm huỳnh quang và phản ứng với các hợp chất khác Chlorophyll ở trạng thái kích thích phản ứng với oxy để tạo thành oxy nguyên tử là một trong những phản ứng gây hại nhất đối với cây trồng Việc tạo ra oxy nguyên tử có thể dẫn đến một loạt các phản ứng gốc tự do của oxy tạo thành ROS làm hỏng các protein và các acid nucleic và gây chết tế bào Để ngăn ngừa các tác động gây hại

này, cây trồng đã phát triển các cơ chế để hạn chế sự hình thành oxy nguyên tử và các gốc tự do [19]

2.2.4.3 Tính chất hóa học

Thời gian bán hủy của chlorophyl là từ 6 đến 50 tiếng Quá trình thay đổi màu sắc dễ nhìn thấy nhất là vào mùa thu, khi đó cây có dấu hiệu rụng lá và các quá trình lão hóa khác Nguyên nhân thoái hóa chlorophyll là do sự lão hóa để cây trồng có thể phục hồi các chất dinh dưỡng, cụ thể của quá trình lão hóa đó là quá trình đưa ion Mg2+ ra khỏi lá già [12]

Về bản chất hóa học, chlorophyll là một ester nên nó có khả năng phản ứng với kiềm và acid

Phản ứng với acid

Phản ứng của chlorophyll a với acid loại bỏ ion magie rồi thay thế nó bằng hai nguyên tử hydro tạo ra một chất rắn màu nâu olive gọi là pheophytin-a Quá trình thủy phân chất này (ngược lại với quá trình ester hóa) tách ra phytol và tạo ra pheophorbide-a Phản ứng này sẽ thu được các hợp chất tương tự nếu sử dụng chlorophyll b

Hình 2.6 Phản ứng của chlorophyll a với acid

Phản ứng với kiềm

Nhân magie đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên màu xanh của chlorophyll Do đó khi phản ứng với kiềm, nhân magie không bị thay thế và màu sắc của chlorophyll sẽ không thay đổi nhiều nhưng do sự xuất hiện của muối kim loại kiềm, dịch sắc tố sẽ trở nên đục hơn

Khi chlorophyll phản ứng với bazo, nó tạo thành một loạt các hợp chất phyllin, magie porphyrin Xử lý phyllin bằng acid tạo ra porphyrin

Hình 2.7 Phản ứng của chlorophyll a với bazo

Ngoài ra, phản ứng này còn được ứng dụng để tạo ra một sản phẩm khác là chlorophyllin - một chất bán tổng hợp của muối đồng Natri Chlorophyllin là một muối tan trong nước được tổng hợp bằng cách thủy phân chlorophyll trong dung dịch kiềm, phản ứng này xảy ra theo cơ chế đồng sẽ thay thế magie trong phân tử và và Natri sẽ thay thế các nhóm metyl và phytyl ester (Hình 2.6) [12]

Hình 2.8 Phản ứng tổng hợp chlorophyllin Ảnh hưởng của enzyme:

Rau và trái cây tươi chứa một số loại enzyme như peroxidase, lipoxygene và chlorophyllase Enzyme peroxidase hoạt động trong quá trình làm chín rau quả, gây thoái hóa chlorophyll Enzyme lipoxygene oxy hóa chất béo, hình thành cơ chế gốc tự do, phân hủy chlorophyll Sự thủy phân của chuỗi phytol do xúc tác của enzyme chlorophyllase, thay đổi chorophyll thành chlorophyllide (Hình 2.7) Chlorophyllide sau đó được chuyển đổi thành pheophorbide do mất ion Mg2+ [21]

Hình 2.9 Phản ứng biến đổi chlorophyll của enzyme chlorophyllase Ảnh hưởng của ánh sáng:

Sự nhạy cảm của một số thực phẩm với ánh sáng là do hàm lượng sắc tố của chúng được kích thích bởi các photon của vùng quang phổ khả kiến Năng lượng được truyền trực tiếp từ các photon ánh sáng đến các cấu tử trong thực phẩm hoặc oxy Sau đó năng lượng chuyển thành dạng hoạt động, thúc đẩy quá trình oxy hóa khử Kết quả của quá trình oxy hóa dẫn đến sự phân hủy của chlorophyll

2.2.4.4 Độ bền màu của chlorophyll và phương pháp giữ ổn định màu

Chlorophyll là hợp chất có độ bền màu kém do chlorophyll dễ bị phân hủy thành các dẫn xuất khi tiếp xúc nhiệt độ, ánh sáng, oxy, pH và enzyme Các dẫn xuất của Chlorophyl được hình thành do sự mất ion Mg2+ trong phân tử chlorophyll, do đó màu xanh sẽ bị mất đi và tạo thành màu nâu oliu Chlorophyll b bền nhiệt hơn chlorophyll a [20]

Để bảo vệ màu xanh của chlorophyll, người ta thường khử hoạt tính của enzyme chlorophyllase (enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân loại phytol khỏi chlorophyll và pheophytin, tạo thành chlorophyllide) hoặc bổ sung các ion kim loại Na+, Mg2+,

Cu2+ hoặc Zn2+ Các ion kim loại này được đưa vào vòng porphyrin để tạo ra sự tương tác giữa các ion kim loại với Mg, làm cho Mg ổn định hơn trong nhân porphyrin vì chúng có khả năng chịu acid và nhiệt độ tốt hơn, do đó có thể ngăn ngừa sự mất màu xanh của cây [12,22,51] Ngoài ra còn kiểm soát độ pH, nhiệt độ và bổ sung các chất chống oxy hóa để ngăn ngừa quá trình oxy hóa của chlorophyll

2.2.5 Xác định chlorophyll

Các chất diệp lục phải được chiết từ thực vật trước khi được định lượng Với chiết xuất từ thực vật, các sắc tố xanh thường định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thu Đối với việc sử dụng phương pháp quang phổ, cần phải biết các yếu tố hấp thụ cụ thể của các sắc tố tinh khiết Với chiết xuất có chứa hỗn hợp các chất màu khác thì chlorophyll được tách ra bằng dung môi thích hợp hoặc sử dụng các phương pháp sắc ký

Phương pháp thường dùng để ước lượng chlorophyll phụ thuộc vào việc đo lường các tính chất hấp phụ quang phổ của chúng trong các dung môi acetone hoặc ethanol Hiện nay có nhiều phương trình thực nghiệm được ứng dụng trong việc định lượng chlorophyll

Harold H Strain và Walter A Svec đã đưa ra một phương trình được dùng để xác định chlorophyll a và b chiết trong acetone 80% [23]:

Chlorophyll a (μg/mL) = 11.63𝐴665 – 2.39𝐴649Chlorophyll b (μg/mL) = −5.18𝐴665 + 20.11𝐴649 Chlorophyll tổng (μg/mL) = 6.64𝐴665 + 17.72𝐴649

J F G M Wintermans và A D Moits đã chứng minh được phương trình thực nghiệm sử dụng để đánh giá độ hấp thu A trong hai vùng bước sóng của chlorophyll a và b trong ethanol 96%, trong đó A là độ hấp phụ ở bước sóng 665 nm; 649 nm:

Chlorophyll a (μg/mL) = 13.7𝐴665 – 5.76𝐴649Chlorophyll b (μg/mL) = −7.6𝐴665 + 25.8𝐴649 Chlorophyll tổng (μg/mL) = 6.1𝐴665 + 20.04𝐴649

Trong ethanol 96%, bước sóng hấp thụ đỉnh của chlorophyll a là 665 nm; đỉnh cho chlorophyll b là 649 nm [24]

Phương trình khác được sử dụng để xác định hàm lượng chlorophyll a và b trong ethanol 40% với độ hấp thụ quang ở hai bước sóng 664 và 648 nm [25]:

Chlorophyll a (μg/mL) = 12,35𝐴664 – 2,25𝐴648Chlorophyll b (μg/mL) = −4,91𝐴664 + 20,31𝐴648 Chlorophyll tổng (μg/mL) = 7,34𝐴664 + 17,76𝐴648

Ngoài những phương trình nêu trên thì vẫn còn nhiều phương trình khác để xác định lượng chlorophyll Nhìn chung những phương trình thực nghiệm đưa ra để định lượng chlorophyll đều dựa trên độ hấp thu đo được trong hai vùng bước sóng chính của chlorophyll Sự khác nhau giữa các phương trình này là do dung môi và điều kiện khảo sát khác nhau

2.2.6 Ứng dụng của chlorophyll

2.2.6.1 Ứng dụng trong y học

Chlorophyll tự nhiên không gây ra những tác dụng phụ cho cơ thể người, trong khi các chất màu tổng hợp luôn để lại tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài Dẫn xuất của chlorophyll - Chlorophyllin là màu xanh lá cây và ký hiệu thường sử dụng trong thực phẩm là E141

Chlorophyll và chlorophyllin có thể tạo thành cấu trúc phức hợp với một số hóa chất gây ung thư như aflatoxin-B1 có trong bột và chiết xuất của nhiều loại gia vị, thảo mộc và thực vật hoặc một số amin dị vòng có trong thịt nấu chín hoặc các hydrocacbon thơm đa vòng có trong khói thuốc lá [26] Sự hình thành cấu trúc phức hợp này có thể giảm thiểu khả năng gây ung thư, tăng quá trình đào thải chất độc ở đường tiêu hóa và làm giảm lượng chất gây ung thư trong các mô nhạy cảm [27]

Bên cạnh đó, chlorophyll còn là một chất chống oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa dầu Khả năng này của chlorophyll và các dẫn xuất của nó phụ thuộc vào sự hiện diện của ánh sáng Khi ở trong môi trường tối, chlorophyll và các dẫn xuất của nó hoạt động như chất chống oxy hóa ngược lại thì khi ở điều kiện có ánh sáng nó lại là tiền chất oxy hóa [28] Chlorophyll có thể ức chế sự phát triển của canxi oxalat dihydrate - giai đoạn chính trong quá trình hình thành sỏi thận [29]

trong cấu trúc, có màu xanh ôliu đến xanh đậm Và E140ii là dẫn xuất chlorophyll hydroxit (hay còn gọi là chlorophyllin natri/kali) thu được bằng cách xà phòng hóa sản phẩm chiết từ thực vật, chất có màu xanh lá cây đậm Đối với cả hai loại E140 thì lượng sử dụng tối đa là 50 mg/kg thức ăn

E141 bao gồm các phức hợp đồng với chlorophyll E141i là tan trong pha dầu gọi là “đồng chlorophyll”, chất có màu xanh lá cây đến xanh đậm E141ii gọi là “đồng chlorophyllins” là dạng bột màu xanh đậm hoặc đen Đồng được sử dụng không quá 100mg/kg và tổng số đồng không quá 8% tổng lượng Cu-chlorophyllins [30]

2.2.6.3 Một số sản phẩm từ chlorophyll

Hình 2.10 Viên uống Puritan's Pride Chlorophyll

Hình 2.11 Nước Diệp Lục Swisse Chlorophyll

Hình 2.12 Bột diệp lục Unicity Super Chlorophyll

2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu đề tài trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu đề tài ngoài nước

Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chiết xuất chất màu chlorophyll cũng như giữ ổn định chất màu này bằng nhiều phương pháp và nguyên liệu khác nhau:

- Fangwei Li và cộng sự đã trích ly chlorophyll từ rau mồng tơi (Spinacia

oleracea L.) bằng ethanol 95% và nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl đến sự ổn định

của nó Nghiên cứu này bảo vệ màu xanh của chlorophyll bằng NaCl và áp suất cao, kết quả cho thấy rằng so với đối chứng, khả năng lưu giữ chlorophyll tăng 80.14% và năng lượng hoạt hóa cao hơn 62.7% trong dung dịch NaCl 7,8% Khi áp suất là 600 MPa với 7.8% NaCl, độ ổn định của chlorophyll đã đạt cao nhất [31]

- Edia Rahayuningsih và cộng sự cũng đã chiết xuất thành công chlorophyll từ

lá cây bồng bồng (Pleomele angustifolia Roxb.) với chất ổn định ZnCl2 bằng cách sử dụng kẽm thay thế magie trong porphyrin vòng của nó để tăng sự ổn định của chlorophyll và giảm sự mất màu Phương pháp này thu được 47.2975 mg/100 g lá tươi khi chiết xuất chlorophyll ở pH = 7, nồng độ ZnCl2 là 700 ppm và nhiệt độ 85oC Các thử nghiệm cũng cho thấy được độ ổn định của chlorophyll sau chiết xuất [32] - Hojnik và cộng sự đã nghiên cứu về điều kiện trích ly chlorophyll từ cây tầm ma Ba phần nguyên liệu gồm cuống, lá và toàn cây được bảo quản ở các kỹ thuật khác nhau (chần trong nước ở nhiệt độ 90-95oC và sấy khô ở 30- 40oC); nhiệt độ bảo quản khác nhau (-20oC đối với mẫu chần và 4oC đối với mẫu sấy khô) Nghiên cứu sử dụng chiết soxhlet kết hợp với siêu âm để khảo sát các loại dung môi ethanol,

acetone, methanol, ethyl acetate và isopropyl alcohol và thời gian chiết (0,5; 1; 2 và 5 giờ) chlorophyll tối ưu Kết quả cho thấy điều kiện trích ly lá tầm ma tốt nhất là sấy khô ở 40oC và bảo quản trong hộp nhựa tối màu ở 4oC, trích ly bằng dung môi ethanol 90% trong 2 giờ với nhiệt độ 40oC Hàm lượng chlorophyll đạt được khoảng 7mg/1g lá tầm ma khô, độ ẩm 11.87% [33]

- Nhóm tác giả Porrarud Senklang và Pranee Anprung đã nghiên cứu quá trình chiết với tác nhân chiết là enzyme pectinase để ổn định chlorophyll từ lá dứa để tạo màu xanh hơn và tạo ra hàm lượng phức kẽm chlorophyll cao nhất Các điều kiện bền hóa và trích ly được khảo sát là pH (3 – 8), nồng độ ZnCl2 (300 – 600ppm), nhiệt độ (80 –120oC); nồng độ enzyme pectinase (1 – 3%), thời gian trích (90 – 270 phút), số lần trích (1 – 2) Kết quả thu được điều kiện tối ưu cho Zn-chlorophyll hình thành là phản ứng của chlorophyll với 300ppm ZnCl2 ở pH=5, nhiệt độ 110oC, thời gian 15 phút; điều kiện trích ly chlorophyll tối ưu là nồng độ enzyme 2.3 – 2.5% pectinase, thời gian ủ 240 – 260 phút và chiết lặp lại 2 lần ở 35oC Bên cạnh đó, hàm lượng chiết xuất của các dẫn xuất chlorophyll có màu xanh và các giá trị biểu thị khả năng kháng oxy hóa tăng lần lượt là 17.31 và 1.92 lần so với các mẫu chưa xử lý [34]

- Ngamwonglumlert và cộng sự đã nghiên cứu về độ bền của chất màu tự nhiên được trích từ rau má trong các điều kiện gia nhiệt và bổ sung ion kim loại Dịch trích Cu – chlorophyll có màu tương tự như màu khi không gia nhiệt, Zn – chlorophyll lại có màu vàng – xanh Đồng thời, độ bền của Zn – chlorophyll và Cu – chlorophyll đều cao hơn chlorophyll trong môi trường nhiệt độ cao và acid [35]

Như các nghiên cứu đã nêu trên, có thể thấy việc thêm muối kim loại vào hỗn hợp trong quá trình trích ly là một phương pháp hữu hiệu cho khả năng bền hóa màu xanh của chlorophyll Ngoài ra, các phương pháp có thể trích ly chlorophyll như sử dụng enzyme, trích ly bằng dung môi, soxlet, hỗ trợ siêu âm

2.3.2 Tình hình nghiên cứu đề tài trong nước

Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành nghiên cứu và trích ly chlorophyll từ nguyên liệu tự nhiên như sau:

Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu và các điều kiện chiết đến hàm lượng chlorophyll được chiết xuất từ rau ngót

(Sauropus androgynus (L.) Merr) Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết

ngâm với dung môi ethanol và xúc tác MgCO3 Kết quả cho thấy khi nguyên liệu được nghiền mịn thì điều kiện chiết xuất tối ưu là ethanol 92%, MgCO3 0.08g trong thời gian 40 giờ Hàm lượng chlorophyll thu được là 3.23567 mg/g do đó có thể xây dựng quy trình chiết tách chlorophyll quy mô lớn từ quy trình này [36]

Bùi Thị Kim Lý và cộng sự đã chiết xuất chlorophyll từ rau má (Centella

asiatica L.) bằng các dung môi khác nhau (ethanol, acetone, diethyl ether và

methanol) có bổ sung thêm Mg2+ và Zn2+ Kết quả cho thấy ethanol 96 %, bổ sung 100mg MgO là điều kiện chiết xuất chlorophyll tốt nhất Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu còn sử dụng enzyme pectinase để hỗ trợ quá trình chiết [37]

L.T.H Ánh và cộng sự có nghiên cứu thu nhận bột màu chlorophyll từ rong nước

lợ Cheatomorpha sp ở đồng bằng Sông Cửu Long Rong tươi được trích ly với dung

môi ethanol 80 %, tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1/15 (w/v), thời gian trích ly 24h trong điều kiện tối, sử dụng MgCO3 0.5 % so với nguyên liệu để giúp tăng hiệu suất trích ly Kết quả thu được dịch trích có hàm lượng chlorophyll 34.03 g/l Tiến hành cô đặc mẫu bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 48°C, thu được dịch trích ly có nồng độ chất khô 12%, bổ sung maltodextrin đến 13.5 % Sấy phun thu được chế phẩm bột màu xanh mịn, độ ẩm 5.4%, tan tốt trong nước có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, hiệu suất thu hồi chlorophyll 62.96 % [38]

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Rau ngót được thu hoạch tại vườn tại thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Cây rau ngót được lựa chọn thu hái có chiều cao khoảng 1 m và hái những lá cách gốc cây 20 – 30 cm cho đến ngọn cây, kích thước lá đạt chuẩn là dài 4-6 cm, rộng 15-30 mm Rau ngót sau khi đem về được bảo quản trong bao PE (20x40cm) có đục lỗ (kích thước 1 cm/lỗ, 10 lỗ/túi) đựng trong thùng xốp, đặt trong phòng mát (nhiệt độ 15oC) và được sử dụng trong 3 ngày

3.2 Hóa chất và trang thiết bị

3.2.1 Hóa chất

- Ethanol 99,5% (Trung Quốc)

- Natri carbonate – Na2CO3 (Trung Quốc) - Natri chlorua – NaCl (Trung Quốc) - Kẽm sulfate – ZnSO4 (Trung Quốc)

- Whey Protein (HilmarTM 8010 Instantized)

Bảng 3.1: Giá trị dinh dưỡng của whey protein Hilmar

- Máy đo pH EZDO MP-103 (Đài Loan)

- Lò vi sóng Panasonic NN Microwave - GS597M model, dung tích 25L

- Một số dụng cụ: cuvette thạch anh; micropipette, erlen, becher, ống ly tâm, ống đong, rây lọc,…tất cả các dụng cụ trước khi làm thí nghiệm được rửa sạch, tráng bằng nước cất và được sấy khô trong tủ sấy

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Rau ngót

Chần nước cất Trích ly

Khảo sát hàm lượng Na2CO3 bổ sung (0.5-3%)

Khảo sát chần và

trích ly bổ sung

muối

Chlorophyll tổng Thời gian bảo quản Cảm quan màu sắc

Sấy phun

Bổ sung 1% của từng loại muối: NaCl, Na2CO3,

ZnSO4Chần

NaCl 1%

pH

Chlorophyll tổng Cảm quan màu sắc

Cảm quan màu sắc FT/IR

Bột sấy phun

Khảo sát chần, trích ly có

hỗ trợ vi sóng và bổ sung muối Khảo sát điều

kiện chần

Thời gian chần

Chlorophyll tổng Cảm quan màu sắc Nhiệt độ chần

3.3.2 Quy trình trích ly dịch rau ngót

Hình 3.1 Quy trình trích ly mẫu lá rau ngót

Lạnh đông Xử lý sơ bộ

Chần Rau ngót tươi

Cành, lá hư, tạp chất,

Nghiền nhuyễn

Trích ly Ethanol/Nước

NaCl 1%

Thuyết minh quy trình:

- Rau ngót được thu mua và vận chuyển về phòng thí nghiệm Lá rau ngót được lặt và làm sạch để loại bỏ tạp chất, lá hỏng, cành…sau đó được rửa sạch và để ráo tự nhiên

- Chần: Lá rau ngót sau khi được làm ráo tự nhiên tiến hành chần ở 90oC trong vòng 180 giây Mục đích của quá trình này nhằm đình chỉ hoạt động của các enzyme, ngăn ngừa sự biến đổi màu của lá rau ngót, đồng thời tiêu diệt một số vi sinh vật trên bề mặt Quá trình này làm tăng độ thẩm thấu của nguyên sinh chất, làm cho dịch bào thoát ra dễ dàng khi tiến hành nghiền xay nguyên liệu ở các bước sau đó

- Làm nguội nhanh: Lá rau ngót sau khi chần được làm nguội nhanh trong 5 phút ở nhiệt độ 5oC rồi lấy ra ngoài để ráo Mục đích của quá trình này nhằm làm giảm mức độ biến đổi về hóa học, hóa sinh và sinh học

- Lạnh đông: Lá rau ngót sau khi đã làm nguội được lạnh đông ở nhiệt độ -18oC Mục đích của quá trình này nhằm làm hỗ trợ quá trình nghiền được dễ dàng hơn, kích thước lá sau nghiền nhỏ hơn, tăng hiệu suất trích ly

- Nghiền nhuyễn: Lá rau ngót được nghiền nhuyễn đến kích thước 0.2 mm nhằm mục đích phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu để nâng cao hiệu suất của quá trình trích ly Kích thước của nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Lá sau khi chần được nghiền nhuyễn với kích thước 0,5 – 1 mm bằng thiết bị xay gián đoạn (Philips Blender, HR2096/00) Mỗi lần xay khoảng 10g lá rau ngót trong vòng 5 phút

- Trích ly: Đây là quá trình trích ly rắn – lỏng, dung môi được sử dụng trong nghiên cứu này là nước - cồn Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát và tìm ra điều kiện tối ưu của các thông số cần khảo sát như: tỷ lệ tối ưu của các muối kim loại bổ sung vào dịch chiết để ổn định màu chlorophyll, loại muối giúp ổn định tốt nhất

- Lọc thô: Mẫu sau quá trình trích ly được tiến hành lọc qua rây lọc có kích thước lỗ 0,5 mm Mục đích của quá trình này nhằm tạo ra một hỗn hợp huyền phù đồng nhất

- Ly tâm: Mẫu sau khi lọc được ly tâm để thu phần dịch chiết trong Mục đích của quá trình này là để dễ quan sát sự thay đổi màu của dịch chiết theo thời gian và để đo quang

+ Tốc độ khuấy: 500 vòng/phút

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng chlorophyll (mg/g chất khô)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần

- Thông số khảo sát:

Nhiệt độ chần: 70, 80, 90, 95oC - Thông số cố định:

+ Thời gian chần: Giá trị tốt nhất thu được ở thí nghiệm 1 + Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5

+ Thời gian trích ly: 25 phút + Nhiệt độ trích ly: 20oC

+ Tốc độ khuấy: 500 vòng/phút

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng chlorophyll (mg/g chất khô)

3.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly đến hàm lượng chlorophyll tổng

- Thông số khảo sát:

+ Thành phần dung dịch chần: nước cất, NaCl 1% + Các loại muối kim loại: NaCl, Na2CO3, ZnSO4 - Thông số cố định:

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5

+ Thời gian chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 1

+ Nhiệt độ chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 2 + Thời gian trích ly: 25 phút

- Thông số khảo sát:

+ Thành phần dung dịch chần: nước cất, NaCl 1% + Các loại muối kim loại: NaCl, Na2CO3, ZnSO4 - Thông số cố định:

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5

+ Thời gian chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 1 + Nhiệt độ chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 2 + Thời gian vi sóng: 3 phút

+ Công suất vi sóng: 550W + Thời gian khuấy: 7 phút + Nhiệt độ khuấy: 20oC

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5

+ Thời gian chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 1 + Nhiệt độ chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 2 + Thời gian trích ly: 25 phút

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng chlorophyll (mg/g chất khô), giá trị pH

3.3.3.4 Sấy phun dịch chiết chlorophyll

Bột whey protein được trộn dịch trích ly chlorophyll từ lá rau ngót đã được trích ly bằng quy trình tốt nhất trong các thí nghiệm trước đó với tỉ lệ là 0.7: 1 chất khô của dịch trích ly và vi nang thành bột bằng phương pháp sấy phun sử dụng máy sấy phun SD06 của Labplant Các thông số kỹ thuật của quá trình sấy phun: tốc độ dòng nhập liệu 6,3 vòng/phút, công suất làm nóng 3 kW, công suất bay hơi 1000 - 1500 mL/h, luồng không khí 15–30 m3/h và nhiệt độ đầu vào là 160°C

3.3.4 Phương pháp phân tích

Các phép phân tích, đo lường được tiến hành tại Khu thí nghiệm – thực hành Viện Phát triển Ứng dụng, trường Đại học Thủ Dầu Một

3.3.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu

Phương pháp AOAC được sử dụng để tính độ ẩm [39] Lá rau ngót tươi (2 g) được cân và sấy khô trong tủ sấy ở 105°C cho đến khi trọng lượng của chúng không đổi

Độ ẩm của nguyên liệu được tính theo công thức: D (%) = 𝑚0−𝑚

𝑚0 × 100

Trong đó: D (%) là độ ẩm của nguyên liệu

m0 (g) là khối lượng của nguyên liệu trước khi sấy

m (g) là khối lượng của nguyên liệu sau khi sấy đến khối lượng không đổi

3.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll tổng

- Nguyên tắc: Dịch chiết được đo độ hấp thu ở bước sóng 648 nm và 664 nm, hàm lượng chlorophyll tổng được xác định theo công thức thực nghiệm của Lichtenthaler và cộng sự [40]:

Chlorophyll a (μg∕ml) = 12.25 A664 − 2.55 A648Chlorophyll b (μg∕ml) = 20.31 A648 − 4.91 A664C = Chlorophyll tổng = 7.34 A664 + 17.76 A648

- Cách tiến hành: Dịch chiết được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 5500 vòng/phút, sau đó lọc bằng giấy lọc để thu được dung dịch trong suốt Sau đó đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 648 nm và 664 nm

- Tính toán kết quả:

TC = Chlorophyll tổng (mg/g chất khô nguyên liệu) = 𝐶×𝑉

1000×𝑚×(1−𝐷) Trong đó: C (μg/ml): chlorophyll tổng

V (ml): thể tích dịch chiết từ m(g) mẫu m (g): khối lượng lá rau ngót tươi D (%): độ ẩm của lá rau ngót tươi Hiệu suất thu nhận chlorophyll:

CRY = Chlorophyll recovery yeild (%) = 𝑇𝐶

3.3.4.3 Phương pháp quang phổ hồng ngoại Fourier (FT/IR)

Phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT/IR) được sử dụng để phân tích các nhóm chức có trong bột sấy phun từ đó xác định sự có mặt của chlorophyll trong mẫu

3.3.4.4 Phương pháp xác định các thành phần trong mẫu

Xác định hàm lượng:

- Protein bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC 960.52)