nghiên cứu giữ ổn định chất màu chlorophyll trích ly từ rau ngót sauropus androgynus

Mẫu nguyên liệu sau xử lý được trích ly với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 25 phút, sử dụng dung môi ethanol 40% và bổ sung các muối NaCl, Na2CO3, ZnSO4 với nồng độ 1% để so

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây rau ngót

Rau ngót còn được gọi với tên bù ngót, bồ ngót, hay rau tuốt là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới Á châu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, như ở Việt Nam

Tên khoa học của rau ngót là Sauropus androgynus

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Rau ngót hay Sauropus androgynus (Họ: Phyllanthaceae) là một loại cây bụi lâu năm thường phân bố rộng rãi ở Đông Nam Á và Nam Á Cây mọc tự nhiên trong môi trường nóng ẩm, được trồng và sử dụng rộng rãi ở Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ và Trung Quốc Ở Malaysia, nó được biết đến như một loại rau xanh và nhiều vitamin được dùng làm salad hoặc chế biến thành món rau xào [3]

Cây rau ngót thích nơi ấm áp và ẩm ướt với nhiệt độ cân bằng và lượng mưa cao, cho thấy khả năng chịu bóng râm tương đối Rễ của loại cây này phát triển trong đất có độ pH dao động từ 5.5 đến 8.0, nếu không chúng sẽ có chất lượng kém và phát triển chậm khi ở trên đất khô và cằn cỗi [4]

Rau ngót là giống cây bụi mọc thẳng với chiều cao từ 1–3 m và thường nở hoa từ tháng 4 đến tháng 7 Lá có hình mũi mác, dài 3–10 cm và rộng 1.5–3.5 cm, với các phiến lá mỏng như giấy hoặc có màng dưới bề mặt [5] Hoa của cây là hoa đơn tính cùng gốc hoặc dị tính, có 1 hoặc 2 hoa, hoặc nhiều hoa đực và hoa cái trên một cụm Hoa đực có hình đĩa hoàn toàn hoặc gần như hình đĩa [6], với các cuống mảnh mai

Quả của loài cây này có kích thước trung bình, với đường kính 5–12 mm, dày 5,0–7,5 mm và có đài hoa màu đỏ tươi, hình cầu lồi hoặc hình cầu lõm có đường kính lên đến 1,5 cm Khi quả chín, chúng trông giống như một quả nang hình cầu màu vàng nhạt Bên trong quả chứa các hạt màu đen có gân, nhưng chúng sẽ mất khả năng hoạt động sau khi mất nước.

Hình 2.1 Cây rau ngót 2.1.4 Thành phần hóa học

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chất dinh dưỡng trong rau ngót bao gồm hàm lượng đồng, acid ascorbic (vitamin C) và chlorophyll được phát hiện là cao nhất trong số 10 loại cây truyền thống từ đảo Andamana và Nicobar ở Ấn Độ [8] Hơn nữa, hàm lượng vitamin C, vitamin E và tiền vitamin A trong rau ngót cao hơn hầu hết các loại rau thông thường, điều này chứng tỏ rau ngót là một loại thực vật đa vitamin [7]

Bảng 2.1: Thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng của rau ngót ở Ấn Độ [3]

Thành phần Đơn vị Hàm lượng Độ ẩm % 85.42 ± 1.90

Vitamin C mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 314.30 ± 1.84 Kali mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 45.70 ± 1.45

Phospho mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 61.20 ± 3.46 Coban mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 1.62 ± 0.10 Mangan mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 25.60 ± 5.80 Đồng mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 768.70 ± 11.40 Natri mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 306.31 ± 52.8 Kẽm mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 15.93 ± 6.61 Canxi mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 84.44 ± 8.14 Sắt mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 212.50 ± 2.82 Magie mg/100g (theo chất khô nguyên liệu) 64.90 ± 38.14 Ngoài ra, rau ngót còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như sterols, resins, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, terpenoids, glycosides, phenols, catechol, cardiac glycosides [9] Tùy thuộc vào đặc điểm đất đai, khí hậu,… mà thành phần hóa học trong rau ngót có sự khác nhau

2.1.5 Công dụng của rau ngót

- Rau ngót là một trong những loại thực phẩm phổ biến trong bữa cơm của người Việt và một số nước ở Nam Á và Đông Nam Á [7] Lá rau ngót được sử dụng làm chất tạo màu cho một số loại bánh truyền thống của Việt Nam như bánh chưng, bánh tét,

- Trong dân gian, người ta sử dụng rau ngót để chữa các bệnh: bệnh tiết niệu – sinh dục, bệnh tim mạch và chống béo phì Ngoài ra, lá rau ngót còn được dùng cho phụ nữ sau khi sinh để phục hồi sau sinh và tăng tiết sữa ở các bà mẹ đang cho con bú Việc tăng cường sản xuất sữa mẹ có thể bắt nguồn từ tác động nội tiết tố của các hợp chất hóa học là sterol estrogen [2]

Lá rau ngót có hàm lượng hoạt chất chống oxy hóa cao, giúp ngăn ngừa các bệnh mãn tính như ung thư và tim mạch Các chất chống oxy hóa này có thể trung hòa các gốc tự do, giúp bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương và ngăn chặn quá trình lão hóa.

Theo nghiên cứu, lá rau ngót có tác dụng hỗ trợ giảm cân Tuy nhiên, việc sử dụng lá rau ngót với mục đích giảm cân không được khuyến khích vì một số hợp chất trong lá có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe khi sử dụng quá nhiều.

- Kháng khuẩn: Dịch chiết từ rau ngót có khả năng kháng vi khuẩn gram âm và gram dương nhưng vùng ức chế còn nhỏ hơn so với kháng sinh streptomycin

- Hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường: cây này có tiềm năng cao trong việc hạ thấp lượng đường trong máu người, điều này có khả năng hỗ trợ trong cuộc chiến toàn cầu nhằm giảm bệnh tiểu đường

- Tăng tiết sữa mẹ: Một nghiên cứu ở Indonesia đã báo cáo rằng chiết xuất lá rau ngót đã làm tăng sản lượng sữa mẹ của các bà mẹ đang cho con bú lên đến 50.7% so với giả dược [11].

Tổng quan về chlorophyll

Chlorophyll hay diệp lục là sắc tố màu xanh lục có nguồn gốc chủ yếu từ lá cây, có chức năng chuyển đổi năng lượng ánh sáng mặt trời [12] và là sắc tố quang hợp được mô tả đầu tiên bởi Pelletier và Caventou năm 1915 [13] Các nghiên cứu cho thấy cấu trúc của chlorophyll ở các loại thực vật khác nhau đều giống nhau, sự khác biệt màu sắc là do sự hiện diện và phân bố của các chất màu thực vật khác nhau có trong lá cây [14] Sắc tố này được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, tảo vào vi khuẩn cyanobacterial

Tên của nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp chloros (xanh lá cây) và phyllon (lá) [1] Chlorophyll được phân lập đầu tiên bởi Joseph Bienaimé Caventou và Pierre Joseph Pelletier vào năm 1817, năm 1851 Verdeil đã đưa ra mối quan hệ giữa cấu trúc Chlorophyll và sắc tố hemoglobin trong máu [14] Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời, cây xanh đã có một cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt trời là chlorophyll Thông qua quá trình quang hợp, nó có khả năng chuyển năng lượng của bức xạ mặt trời thành năng lượng hóa học của các hợp chất hữu cơ trong tế bào Năm 1940, Hans Fischer

7 tìm ra cấu trúc tổng quát của chlorophyll Và năm 1960, cấu trúc lập thể của chlorophyll a được làm sáng tỏ hoàn toàn

Cấu trúc cơ bản của chlorophyll gồm phần “thân” là một porphyrin và phần

“đuôi” là một phytol Porphyrin là một nhóm hợp chất có bốn vòng pyrole được liên kết bởi ion magie trung tâm và chuỗi phytol (C20H39) [15] Nhân porphyrin do 4 vòng pyrrole nối với nhau tạo thành vòng khép kín Trên vòng porphirin có tổng cộng 8 nguyên tử cacbon, ở giữa là nhân Mg 2+ tạo nên cấu trúc quyết định sự khác biệt của Chlorophyll đối với các tetrapyrroles khác như hemoglobin hay vitamin B12 [13]

Các pyrrol riêng lẻ được đánh nhãn A; B; C; D và một vòng isocyclic năm cạnh (E) gắn vào vòng pyrrole C hình thành nên phorbin Cấu trúc của chlorophyll được tạo nên nhờ việc bổ sung các nhóm khác vào bên ngoài cấu trúc phorbin, cùng với sự kết hợp của ion magie kim loại ở trung tâm [16] Năm 1940, cấu trúc của chlorophyll a và b đã được thiết lập bởi Hans Fischer [1]

Hình 2.3 Cấu trúc phorbin 2.2.3 Phân loại

Chlorophyll có nhiều loại, mỗi loại có đặc điểm riêng biệt do các nhóm bên tạo nên Có bốn dạng chính của chlorophyll gồm a, b, c, d Trong thực vật, chlorophyll a và b chiếm hàm lượng cao, trong khi tảo có nhiều chlorophyll c, d và f hơn.

- Chlorophyll a: C55H72O5N4Mg là chất diệp lục chính trong tất cả các loài thực vật và là dạng phân bố rộng rãi nhất Chlorophyll a thường đi cùng lượng nhỏ chlorophyll d trong tảo đỏ, chlorophyll c trong tảo cát (Bacillariophyceae), chlorophyll b trong tảo xanh (Chlorophyceae) [18]

- Chlorophyll b: C55H70O6N4Mg là chất diệp lục có trong hầu hết các loại thực vật và một ít trong Euglena tảo xanh [18] Trong nhiều loại thực vật như trái cây và rau xanh, chlorophyll a thường có tỷ lệ cao hơn chlorophyll b với tỷ lệ là 3:1 [17]

- Chlorophyll c: là loại chất diệp lục đi kèm với chlorophyll a trong tảo cát, tảo lục, tảo nâu và một số loài tảo cộng sinh của hải quỳ Chlorophyll c gồm c1, c2, c3, có phổ hấp phụ độ hòa tan, phản ứng kiềm khác biệt rất nhiều so với tất cả các loại diệp lục khác, được hòa tan trong ete, không tan trong nước [18]

- Chlorophyll d: C54H70O6N4Mg thường đi kèm với chlorophyll a trong một số tảo đỏ [18]

- Chlorpphyll f: C55H70O6N4Mg là một dạng chất diệp lục hấp thụ ánh sáng đỏ (ánh sáng hồng ngoại) [19]

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của các loại chlorophyll a, b, d, f

Bảng 2.2: Các nhóm chức tạo nên các loại chlorophyll a, b, d, f

Chlorophyll a CH3 CH = CH2 CH3

Chlorophyll b CH3 CH = CH2 CHO

Chlorophyll f CHO CH = CH2 CH3

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chlorophyll c Bảng 2.3: Các nhóm chức tạo nên chlorophyll c

Chlorophyll c1 CH3 CH2 – CH 3 Chlorophyll c2 CH3 CH = CH2

- Chlorophyll là chất không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ

- Chlorophyll vừa có tính axit, vừa có tính kiềm

- Chlorophyll có cấu tạo với phần “thân” là một porphyrin và phần “đuôi” là một phytol Do có nhóm phytol nên chlorophyll hòa tan trong dung môi như benzene, CCl4 nhiều hơn chlorophyllide và ít hòa tan trong các dung môi phân cực

Quang phổ hấp thu cực đại của chlorophyll trong vùng ánh sáng xanh là 430 –

460 nm và vùng ánh sáng đỏ là 620 - 700 nm Nếu năng lượng ánh sáng hấp phụ bởi chlorophyll không sử dụng trong quá trình quang hợp thì năng lượng ánh sáng cung cấp tiếp theo không được hấp thụ Sự tiêu tan năng lượng ánh sáng thừa này có thể xảy ra bởi một số cơ chế, bao gồm huỳnh quang và phản ứng với các hợp chất khác Chlorophyll ở trạng thái kích thích phản ứng với oxy để tạo thành oxy nguyên tử là một trong những phản ứng gây hại nhất đối với cây trồng Việc tạo ra oxy nguyên tử có thể dẫn đến một loạt các phản ứng gốc tự do của oxy tạo thành ROS làm hỏng các protein và các acid nucleic và gây chết tế bào Để ngăn ngừa các tác động gây hại

10 này, cây trồng đã phát triển các cơ chế để hạn chế sự hình thành oxy nguyên tử và các gốc tự do [19]

Thời gian bán hủy của chlorophyll là từ 6 đến 50 giờ Hiện tượng thoái hóa chlorophyll diễn ra để thực vật phục hồi các chất dinh dưỡng cần thiết Quá trình thoái hóa này dễ thấy nhất vào mùa thu, khi cây rụng lá và biểu hiện các dấu hiệu lão hóa khác.

Mg 2+ ra khỏi lá già [12]

Về bản chất hóa học, chlorophyll là một ester nên nó có khả năng phản ứng với kiềm và acid

Phản ứng giữa chlorophyll a và axit loại bỏ ion magie, thay thế bằng hai nguyên tử hydro tạo nên pheophytin-a màu nâu ô liu Tiến hành thủy phân pheophytin-a sẽ giải phóng phytol, tạo thành pheophorbide-a Các hợp chất tương tự cũng được tạo thành nếu sử dụng chlorophyll b trong phản ứng này.

Hình 2.6 Phản ứng của chlorophyll a với acid Phản ứng với kiềm

Nhân magie đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên màu xanh của chlorophyll Do đó khi phản ứng với kiềm, nhân magie không bị thay thế và màu sắc của chlorophyll sẽ không thay đổi nhiều nhưng do sự xuất hiện của muối kim loại kiềm, dịch sắc tố sẽ trở nên đục hơn

Khi chlorophyll phản ứng với bazo, nó tạo thành một loạt các hợp chất phyllin, magie porphyrin Xử lý phyllin bằng acid tạo ra porphyrin

Hình 2.7 Phản ứng của chlorophyll a với bazo

Ngoài ra, phản ứng này còn được ứng dụng để tạo ra một sản phẩm khác là chlorophyllin - một chất bán tổng hợp của muối đồng Natri Chlorophyllin là một muối tan trong nước được tổng hợp bằng cách thủy phân chlorophyll trong dung dịch kiềm, phản ứng này xảy ra theo cơ chế đồng sẽ thay thế magie trong phân tử và và Natri sẽ thay thế các nhóm metyl và phytyl ester (Hình 2.6) [12]

Hình 2.8 Phản ứng tổng hợp chlorophyllin Ảnh hưởng của enzyme:

Rau và trái cây tươi chứa một số loại enzyme như peroxidase, lipoxygene và chlorophyllase Enzyme peroxidase hoạt động trong quá trình làm chín rau quả, gây thoái hóa chlorophyll Enzyme lipoxygene oxy hóa chất béo, hình thành cơ chế gốc tự do, phân hủy chlorophyll Sự thủy phân của chuỗi phytol do xúc tác của enzyme chlorophyllase, thay đổi chorophyll thành chlorophyllide (Hình 2.7) Chlorophyllide sau đó được chuyển đổi thành pheophorbide do mất ion Mg 2+ [21]

Hình 2.9 Phản ứng biến đổi chlorophyll của enzyme chlorophyllase Ảnh hưởng của ánh sáng:

Tổng quan tình hình nghiên cứu đề tài trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu đề tài ngoài nước

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về chiết xuất và ổn định chất màu chlorophyll được chú trọng trên toàn cầu, với đa dạng phương pháp và nguyên liệu sử dụng.

- Fangwei Li và cộng sự đã trích ly chlorophyll từ rau mồng tơi (Spinacia oleracea L.) bằng ethanol 95% và nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl đến sự ổn định của nó Nghiên cứu này bảo vệ màu xanh của chlorophyll bằng NaCl và áp suất cao, kết quả cho thấy rằng so với đối chứng, khả năng lưu giữ chlorophyll tăng 80.14% và năng lượng hoạt hóa cao hơn 62.7% trong dung dịch NaCl 7,8% Khi áp suất là 600 MPa với 7.8% NaCl, độ ổn định của chlorophyll đã đạt cao nhất [31]

Để tăng độ ổn định của chlorophyll, nhóm nghiên cứu của Edia Rahayuningsih đã sử dụng kẽm thay thế magiê trong vòng porphyrin của chlorophyll Phương pháp chiết xuất sử dụng chất ổn định ZnCl2, thay thế magiê trong cấu trúc của chlorophyll, đã thu được 47,2975 mg/100 g lá tươi tại điều kiện pH = 7, nồng độ ZnCl2 700 ppm và nhiệt độ 85 độ C Các thử nghiệm đã chứng minh hiệu quả của phương pháp này trong việc duy trì độ ổn định của chlorophyll sau khi chiết xuất [32].

Hojnik và cộng sự đã nghiên cứu điều kiện tối ưu để trích ly chlorophyll từ cây tầm ma, sử dụng ba phần nguyên liệu gồm cuống, lá và toàn cây, bảo quản bằng các phương pháp khác nhau (chần trong nước ở 90-95 độ C và sấy khô ở 30-40 độ C) và nhiệt độ bảo quản khác nhau (-20 độ C đối với mẫu chần và 4 độ C đối với mẫu sấy khô) Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết Soxhlet kết hợp với siêu âm, đồng thời khảo sát các loại dung môi etanol.

17 acetone, methanol, ethyl acetate và isopropyl alcohol và thời gian chiết (0,5; 1; 2 và

5 giờ) chlorophyll tối ưu Kết quả cho thấy điều kiện trích ly lá tầm ma tốt nhất là sấy khô ở 40 o C và bảo quản trong hộp nhựa tối màu ở 4 o C, trích ly bằng dung môi ethanol 90% trong 2 giờ với nhiệt độ 40 o C Hàm lượng chlorophyll đạt được khoảng 7mg/1g lá tầm ma khô, độ ẩm 11.87% [33]

- Nhóm tác giả Porrarud Senklang và Pranee Anprung đã nghiên cứu quá trình chiết với tác nhân chiết là enzyme pectinase để ổn định chlorophyll từ lá dứa để tạo màu xanh hơn và tạo ra hàm lượng phức kẽm chlorophyll cao nhất Các điều kiện bền hóa và trích ly được khảo sát là pH (3 – 8), nồng độ ZnCl2 (300 – 600ppm), nhiệt độ (80 –120 o C); nồng độ enzyme pectinase (1 – 3%), thời gian trích (90 – 270 phút), số lần trích (1 – 2) Kết quả thu được điều kiện tối ưu cho Zn-chlorophyll hình thành là phản ứng của chlorophyll với 300ppm ZnCl2 ở pH=5, nhiệt độ 110 o C, thời gian 15 phút; điều kiện trích ly chlorophyll tối ưu là nồng độ enzyme 2.3 – 2.5% pectinase, thời gian ủ 240 – 260 phút và chiết lặp lại 2 lần ở 35 o C Bên cạnh đó, hàm lượng chiết xuất của các dẫn xuất chlorophyll có màu xanh và các giá trị biểu thị khả năng kháng oxy hóa tăng lần lượt là 17.31 và 1.92 lần so với các mẫu chưa xử lý [34]

- Ngamwonglumlert và cộng sự đã nghiên cứu về độ bền của chất màu tự nhiên được trích từ rau má trong các điều kiện gia nhiệt và bổ sung ion kim loại Dịch trích

Cu – chlorophyll có màu tương tự như màu khi không gia nhiệt, Zn – chlorophyll lại có màu vàng – xanh Đồng thời, độ bền của Zn – chlorophyll và Cu – chlorophyll đều cao hơn chlorophyll trong môi trường nhiệt độ cao và acid [35]

Như các nghiên cứu đã nêu trên, có thể thấy việc thêm muối kim loại vào hỗn hợp trong quá trình trích ly là một phương pháp hữu hiệu cho khả năng bền hóa màu xanh của chlorophyll Ngoài ra, các phương pháp có thể trích ly chlorophyll như sử dụng enzyme, trích ly bằng dung môi, soxlet, hỗ trợ siêu âm

2.3.2 Tình hình nghiên cứu đề tài trong nước Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành nghiên cứu và trích ly chlorophyll từ nguyên liệu tự nhiên như sau:

Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu và các điều kiện chiết đến hàm lượng chlorophyll được chiết xuất từ rau ngót (Sauropus androgynus (L.) Merr) Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết

18 ngâm với dung môi ethanol và xúc tác MgCO3 Kết quả cho thấy khi nguyên liệu được nghiền mịn thì điều kiện chiết xuất tối ưu là ethanol 92%, MgCO3 0.08g trong thời gian 40 giờ Hàm lượng chlorophyll thu được là 3.23567 mg/g do đó có thể xây dựng quy trình chiết tách chlorophyll quy mô lớn từ quy trình này [36]

Bùi Thị Kim Lý và cộng sự đã chiết xuất chlorophyll từ rau má (Centella asiatica L.) bằng các dung môi khác nhau (ethanol, acetone, diethyl ether và methanol) có bổ sung thêm Mg 2+ và Zn 2+ Kết quả cho thấy ethanol 96 %, bổ sung 100mg MgO là điều kiện chiết xuất chlorophyll tốt nhất Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu còn sử dụng enzyme pectinase để hỗ trợ quá trình chiết [37]

L.T.H Ánh và cộng sự có nghiên cứu thu nhận bột màu chlorophyll từ rong nước lợ Cheatomorpha sp ở đồng bằng Sông Cửu Long Rong tươi được trích ly với dung môi ethanol 80 %, tỉ lệ nguyên liệu/ethanol là 1/15 (w/v), thời gian trích ly 24h trong điều kiện tối, sử dụng MgCO3 0.5 % so với nguyên liệu để giúp tăng hiệu suất trích ly Kết quả thu được dịch trích có hàm lượng chlorophyll 34.03 g/l Tiến hành cô đặc mẫu bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 48°C, thu được dịch trích ly có nồng độ chất khô 12%, bổ sung maltodextrin đến 13.5 % Sấy phun thu được chế phẩm bột màu xanh mịn, độ ẩm 5.4%, tan tốt trong nước có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, hiệu suất thu hồi chlorophyll 62.96 % [38]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Rau ngót được thu hoạch tại vườn tại thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Cây rau ngót được lựa chọn thu hái có chiều cao khoảng 1 m và hái những lá cách gốc cây 20 – 30 cm cho đến ngọn cây, kích thước lá đạt chuẩn là dài 4-6 cm, rộng 15-

30 mm Rau ngót sau khi đem về được bảo quản trong bao PE (20x40cm) có đục lỗ (kích thước 1 cm/lỗ, 10 lỗ/túi) đựng trong thùng xốp, đặt trong phòng mát (nhiệt độ

15 o C) và được sử dụng trong 3 ngày.

Hóa chất và trang thiết bị

- Natri carbonate – Na2CO3 (Trung Quốc)

- Natri chlorua – NaCl (Trung Quốc)

- Kẽm sulfate – ZnSO4 (Trung Quốc)

- Whey Protein (Hilmar TM 8010 Instantized)

Bảng 3.1: Giá trị dinh dưỡng của whey protein Hilmar

Thành phần Hàm lượng (%) Độ ẩm 4.7 Độ tro 2.7

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

- Máy đo quang phổ UV-VIS/NIR JASCO V770 (Nhật Bản)

- Cân phân tích 4 chữ số OneLab (Trung Quốc)

- Máy khuấy từ có gia nhiệt digital Phoenix Instrument RSM-05H (Đức)

- Máy ly tâm Hettich EBA20 (Đức)

- Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)

- Máy đo pH EZDO MP-103 (Đài Loan)

- Lò vi sóng Panasonic NN Microwave - GS597M model, dung tích 25L

- Một số dụng cụ: cuvette thạch anh; micropipette, erlen, becher, ống ly tâm, ống đong, rây lọc,…tất cả các dụng cụ trước khi làm thí nghiệm được rửa sạch, tráng bằng nước cất và được sấy khô trong tủ sấy.

Phương pháp nghiên cứu

Rau ngót Độ ẩm Pectin Lipid

Protein Đường tổng/khử Độ tro

Chần nước cất Trích ly

Khảo sát chần và trích ly bổ sung muối

Chlorophyll tổng Thời gian bảo quản Cảm quan màu sắc

Bổ sung 1% của từng loại muối:

Chần NaCl 1% pH Chlorophyll tổng Cảm quan màu sắc

Cảm quan màu sắc FT/IR

Khảo sát chần, trích ly có hỗ trợ vi sóng và bổ sung muối

Khảo sát điều kiện chần

Chlorophyll tổng Cảm quan màu sắc Nhiệt độ chần

3.3.2 Quy trình trích ly dịch rau ngót

Hình 3.1 Quy trình trích ly mẫu lá rau ngót

Cành, lá hư, tạp chất,

Làm lạnh nhanh Nước cất hoặc

Lá rau ngót sau khi thu mua sẽ được vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành lặt bỏ tạp chất, lá hỏng, cành Sau đó, lá được rửa sạch và để ráo tự nhiên nhằm loại bỏ hoàn toàn bụi bẩn bám trên bề mặt, đảm bảo an toàn vệ sinh trước khi tiến hành các công đoạn tiếp theo.

- Chần: Lá rau ngót sau khi được làm ráo tự nhiên tiến hành chần ở 90 o C trong vòng 180 giây Mục đích của quá trình này nhằm đình chỉ hoạt động của các enzyme, ngăn ngừa sự biến đổi màu của lá rau ngót, đồng thời tiêu diệt một số vi sinh vật trên bề mặt Quá trình này làm tăng độ thẩm thấu của nguyên sinh chất, làm cho dịch bào thoát ra dễ dàng khi tiến hành nghiền xay nguyên liệu ở các bước sau đó

- Làm nguội nhanh: Lá rau ngót sau khi chần được làm nguội nhanh trong 5 phút ở nhiệt độ 5 o C rồi lấy ra ngoài để ráo Mục đích của quá trình này nhằm làm giảm mức độ biến đổi về hóa học, hóa sinh và sinh học

Để tăng hiệu suất trích ly và dễ dàng nghiền lá rau ngót hơn, sau khi làm nguội, lá sẽ được lạnh đông ở nhiệt độ -18 o C Quá trình này hỗ trợ nghiền lá nhỏ hơn, từ đó tăng cường hiệu quả trích ly.

- Nghiền nhuyễn: Lá rau ngót được nghiền nhuyễn đến kích thước 0.2 mm nhằm mục đích phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu để nâng cao hiệu suất của quá trình trích ly Kích thước của nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Lá sau khi chần được nghiền nhuyễn với kích thước 0,5 – 1 mm bằng thiết bị xay gián đoạn (Philips Blender, HR2096/00) Mỗi lần xay khoảng 10g lá rau ngót trong vòng 5 phút

- Trích ly: Đây là quá trình trích ly rắn – lỏng, dung môi được sử dụng trong nghiên cứu này là nước - cồn Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát và tìm ra điều kiện tối ưu của các thông số cần khảo sát như: tỷ lệ tối ưu của các muối kim loại bổ sung vào dịch chiết để ổn định màu chlorophyll, loại muối giúp ổn định tốt nhất

- Lọc thô: Mẫu sau quá trình trích ly được tiến hành lọc qua rây lọc có kích thước lỗ 0,5 mm Mục đích của quá trình này nhằm tạo ra một hỗn hợp huyền phù đồng nhất

- Ly tâm: Mẫu sau khi lọc được ly tâm để thu phần dịch chiết trong Mục đích của quá trình này là để dễ quan sát sự thay đổi màu của dịch chiết theo thời gian và để đo quang

3.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tiền xử lý chần đến hàm lượng chlorophyll tổng

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5

+ Thời gian trích ly: 25 phút

+ Tốc độ khuấy: 500 vòng/phút

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng chlorophyll (mg/g chất khô)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần

+ Thời gian chần: Giá trị tốt nhất thu được ở thí nghiệm 1

3.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly đến hàm lượng chlorophyll tổng

+ Thành phần dung dịch chần: nước cất, NaCl 1%

+ Các loại muối kim loại: NaCl, Na2CO3, ZnSO4

+ Thời gian chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 1

+ Nhiệt độ chần: giá trị tốt nhất thu nhận được ở thí nghiệm 2

+ Hàm lượng mỗi muối kim loại: 1% so với chất khô nguyên liệu

3.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của NaCl 1% bổ sung vào chần và muối kim loại bổ sung vào quá trình trích ly đến hàm lượng chlorophyll tổng khi trích ly có sự hỗ trợ vi sóng

+ Thành phần dung dịch chần: nước cất, NaCl 1%

+ Các loại muối kim loại: NaCl, Na2CO3, ZnSO4

+ Thời gian vi sóng: 3 phút

+ Hàm lượng mỗi muối kim loại: 1% so với chất khô nguyên liệu

3.3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng muối kim loại giữ ổn định tốt nhất đến giá trị pH và hàm lượng chlorophyll trích ly từ lá rau ngót

- Thông số khảo sát: Hàm lượng muối bổ sung: 0.5, 1, 2, 3 %

+ Thành phần dung dịch chần: thành phần tốt nhất thu được ở các thí nghiệm trước

+ Muối kim loại: Sử dụng muối có giá trị ổn định chlorophyll tốt nhất ở các thí nghiệm trước

- Hàm mục tiêu: Hàm lượng chlorophyll (mg/g chất khô), giá trị pH

3.3.3.4 Sấy phun dịch chiết chlorophyll

Bột whey protein được trộn dịch trích ly chlorophyll từ lá rau ngót đã được trích ly bằng quy trình tốt nhất trong các thí nghiệm trước đó với tỉ lệ là 0.7: 1 chất khô của dịch trích ly và vi nang thành bột bằng phương pháp sấy phun sử dụng máy sấy phun SD06 của Labplant Các thông số kỹ thuật của quá trình sấy phun: tốc độ dòng nhập liệu 6,3 vòng/phút, công suất làm nóng 3 kW, công suất bay hơi 1000 - 1500 mL/h, luồng không khí 15–30 m 3 /h và nhiệt độ đầu vào là 160°C

Các phép phân tích, đo lường được tiến hành tại Khu thí nghiệm – thực hành Viện Phát triển Ứng dụng, trường Đại học Thủ Dầu Một

3.3.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu

Phương pháp AOAC được sử dụng để tính độ ẩm [39] Lá rau ngót tươi (2 g) được cân và sấy khô trong tủ sấy ở 105°C cho đến khi trọng lượng của chúng không đổi Độ ẩm của nguyên liệu được tính theo công thức:

Độ ẩm của nguyên liệu là thành phần nước có trong nguyên liệu Để xác định độ ẩm của nguyên liệu, ta sử dụng công thức: D (%) = (m0 - m)/m0 * 100% Trong đó, m0 là khối lượng nguyên liệu trước khi sấy, m là khối lượng nguyên liệu sau khi sấy đến khối lượng không đổi Khi sấy nguyên liệu đến khối lượng không đổi tức là khi toàn bộ nước trong nguyên liệu đã thoát ra hết, giúp chúng ta có thể xác định được độ ẩm chính xác của nguyên liệu.

3.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll tổng

- Nguyên tắc: Dịch chiết được đo độ hấp thu ở bước sóng 648 nm và 664 nm, hàm lượng chlorophyll tổng được xác định theo công thức thực nghiệm của Lichtenthaler và cộng sự [40]:

- Cách tiến hành: Dịch chiết được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 5500 vòng/phút, sau đó lọc bằng giấy lọc để thu được dung dịch trong suốt Sau đó đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 648 nm và 664 nm

TC = Chlorophyll tổng (mg/g chất khô nguyên liệu) = 𝐶×𝑉

1000×𝑚×(1−𝐷) Trong đó: C (μg/ml): chlorophyll tổng

V (ml): thể tích dịch chiết từ m(g) mẫu m (g): khối lượng lá rau ngót tươi

D (%): độ ẩm của lá rau ngót tươi

Hiệu suất thu nhận chlorophyll:

TC (mg/g chất khô nguyên liệu): Hàm lượng chlorophyll tổng thu được sau trích ly

TC0 (mg/g chất khô nguyên liệu): Hàm lượng chlorophyll tổng trong lá rau ngót tươi

3.3.4.3 Phương pháp quang phổ hồng ngoại Fourier (FT/IR)

Phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT/IR) được sử dụng để phân tích các nhóm chức có trong bột sấy phun từ đó xác định sự có mặt của chlorophyll trong mẫu

3.3.4.4 Phương pháp xác định các thành phần trong mẫu

- Protein bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC 960.52)

- Tro bằng phương pháp nung ở 500 - 800 o C đến khối lượng không đổi (AOAC 942.05)

- Đường tổng bằng phương pháp DNS (AOAC 968.28)

- Đường khử bằng phương pháp DNS (AOAC 930.36)

- Hàm lượng xơ tổng (FAO FNP 14/7, (p.230)-1986)

- Carbohydrate tổng bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao (HPAE) (AOAC 995.13)

- Lipid tổng bằng phương pháp thủy phân bằng acid chlorhydride (AOAC 922.06)

3.3.4.4 Phương pháp phân tích cảm quan màu sắc

Cường độ màu sắc được đánh giá bằng phép thử so hàng:

- Hội đồng đánh giá bao gồm 7 chuyên gia làm thành viên

Định dạng
Số trang	83
Dung lượng	2,64 MB