Kết quả thu được: khi trích ly không có hỗ trợ vi sóng với thời gian chần 180 giây, thời gian chiết 20 phút hiệu quả trích ly chlorophyll CRY là 25,784%; khi trích ly có hỗ trợ vi sóng v
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Rau ngót
Danh pháp hai phần: Sauropus androgynus [6]
Cây Rau ngót còn có tên là bồ ngót, bù ngót, hắc diện thần (Trung Quốc) Tên khoa học Sauropus androgynus (L.) Merr Thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae
Cây nhãn có thể phát triển tới 1,50 – 2m, có nhiều cành mọc thẳng cùng vỏ cây màu xanh lục chuyển nâu nhạt khi về già Lá cây mọc so le, có cuống ngắn chỉ dài 1 – 2 mm, hình dạng lá nguyên hình trứng hoặc bầu dục, mép nguyên Hoa đực mọc theo hình xim đơn ở kẽ lá phía dưới, trong khi hoa cái mọc ở trên Quả nhãn hình cầu, hạt có vân nhỏ Đây là loài cây được trồng phổ biến tại Việt Nam.
Trong nghiên cứu này nguyên liệu sử dụng được thu hoạch tại vườn trồng ở tỉnh Bình Dương
2.1.2 Sự phân bố của Rau ngót
Rau ngót (Sauropus androgynus) là một loại cây bụi mọc thẳng đứng có nguồn gốc từ Đông Nam Á [8], có thể được tìm thấy trên khắp các vùng cao nguyên của Đông Nam Á, bao gồm Malaysia, Indonesia, tây nam Trung Quốc và Việt Nam [9] Ngoài hàm lượng vitamin, khoáng chất, chất xơ, lipid và carbohydrate cao, S androgynus còn có hàm lượng cao các hoạt chất sinh học như phenolic, tannin, flavonoid, anthocyanin, phytosterol và các chất khác S androgynus là một trong những loại rau xanh có tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chức năng [10] Tại Việt Nam, S androgynus được sử dụng như một loại thực phẩm bổ dưỡng hoặc một chất tạo màu phổ biến trong một số loại bánh truyền thống của Việt Nam do màu xanh bắt mắt S androgynus dễ trồng, ít đòi hỏi về kỹ thuật chăm sóc, phân bón và có thể thu hoạch với năng suất lớn khoảng 22,86 tấn/ha/ngày.
Tổng quan về Chlorophyll
Diệp lục (chlorophyll) là hợp chất tạo nên màu xanh lục cho cây xanh, tồn tại trong hầu hết thực vật, tảo, dương xỉ, rêu và một số vi khuẩn Đây là sắc tố quang hợp được các nhà khoa học Pelletier và Caventou phát hiện đầu tiên vào năm 1817 và đặt tên theo tiếng Hy Lạp chlor´os (xanh lá) và phyllon (lá) Diệp lục đóng vai trò hấp thụ năng lượng ánh sáng mặt trời trong quá trình quang hợp để tổng hợp các hợp chất hữu cơ như glucose và giải phóng oxy từ CO2 và nước.
Cấu trúc hóa học của chlorophyll bắt đầu với cấu trúc vòng cơ bản của porphin là sự sắp xếp đối xứng của 4 nhóm pyrrole Để dễ nhận biết, các vòng được dán nhãn từ A đến E với vòng đồng vị (E) được gắn vào vòng pyrole C Việc thêm một vòng ở ngoài hình thành cấu trúc phorbin cùng với sự kết hợp của ion Mg 2+ ở trung tâm và đuôi phytol (C20H39) tạo thành cấu trúc chính của chlorophyll [12], [13]
Hình 2.2 Porphin (trái) và Phorbin (phải)
Chlorophyll có các loại là a, b, c, d và f; trong đó, chlorophyll a và b có nhiều trong thực vật, trong khi chlorophyll c và d phổ biến hơn ở tảo quang hợp và tảo cát Tỷ lệ chlorophyll a: chlorophyll b thường được báo cáo là 3:1 [14]
Chlorophyll a: loại chlorophyll này được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật quang hợp, như thực vật, tảo, vi khuẩn lam và các loài thủy sinh Trước đây nó được gọi là chlorophyll α Chlorophyll a hấp thụ chủ yếu ánh sáng đỏ từ quang phổ mặt trời; đỉnh hấp thụ thu được ở 420 nm và 660 nm trong dung môi hữu cơ và ở 453 nm và 670 – 480 nm trong tế bào quang hợp (in vivo)
Diệp lục b: trước đây được gọi là diệp lục β, là một loại sắc tố có mặt trong tảo lục và thực vật bậc cao Nó đóng vai trò hỗ trợ diệp lục a trong quá trình quang hợp Sắc tố này có màu vàng tự nhiên nhưng hấp thụ ánh sáng xanh lam trong toàn bộ quang phổ của mặt trời Đối với diệp lục b, các đỉnh hấp thụ đặc trưng được quan sát thấy ở 453 nm và 625 nm (trong ống nghiệm) và ở 480 nm và 650 nm (trong cơ thể sống).
Chlorophyll c: là một sắc tố màu vàng nâu đi kèm với chlorophyll a trong quá trình quang hợp với tư cách là một sắc tố phụ Nó có ba phân lớp, được đặt tên là chlorophyll c 1 , c 2 và c 3 , được tìm thấy ở nhiều loại tảo khác nhau Sắc tố này được tìm thấy rộng rãi trong các sinh vật biển khác nhau như tảo cát, tảo nâu và các loại tảo biển khác Đỉnh hấp thụ của chlorophyll c cho phổ quang hợp thu được ở 445 nm và 625 nm trong dung môi hữu cơ và 645 nm trong điều kiện in vivo [15]
Chlorophyll d: là chlorophyll phụ được xác định trong tảo đỏ (Rhodophyta) Nó hấp thu phần cực đỏ của quang phổ ánh sáng mặt trời Phổ hấp thụ thu được đối với
6 chlorophyll d ở điều kiện in vitro 450 nm và 690 nm và lên đến 740 nm trên dải màu đỏ in vivo Nó có thể được điều chế trong phòng thí nghiệm với sự trợ giúp của permanganate bằng cách oxy hóa chlorophyll a [15]
Chlorophyll f là loại chlorophyll phụ được phát hiện muộn nhất Nó được phát hiện trong vi khuẩn lam từ stromatolit cổ ở Tây Úc bởi Min Chen và cộng sự Trong số các loại chlorophyll đã biết, chlorophyll f có khả năng hấp thụ ánh sáng mặt trời thấp nhất, từ đầu cực đỏ của quang phổ hồng ngoại để quang hợp Sự hấp thụ và huỳnh quang (trong ống nghiệm) của chlorophyll f lần lượt ở bước sóng 706 nm và 720 nm.
Hình 2.3 Cấu trúc của các chlorophyll khác nhau
Các chlorophyll phytyl hóa (a, b, d và f) kỵ nước và có thể được chiết xuất từ nguyên liệu thực vật bằng các dung môi hữu cơ, chẳng hạn như acetone, ethanol, benzen và các dung môi khác, tạo ra dung dịch có màu xanh lục Trong khi đó, chlorophyll c thiếu chuỗi phytol có thể hòa tan trong nước và dung môi phân cực [17]
Các đặc tính quang hóa của chlorophyll, quan trọng cho quá trình quang hợp, cũng tiềm ẩn rủi ro cho thực vật Ánh sáng thừa không được chlorophyll hấp thụ có thể tiêu tán qua các cơ chế như huỳnh quang và phản ứng với các hợp chất khác Nguy hại nhất là phản ứng tạo oxy nguyên tử từ phản ứng của chlorophyll kích thích với oxy Oxy nguyên tử phản ứng với các phân tử khác tạo ra các gốc tự do gây stress oxy hóa, phá hủy tế bào Do đó, thực vật đã phát triển các cơ chế hạn chế hình thành oxy nguyên tử và gốc tự do để bảo vệ tế bào khỏi những tác động này.
Chlorophyll bị phân hủy bởi nhiệt và tạo ra màu xanh ô liu Thời gian gia nhiệt và nhiệt độ ảnh hưởng đến mức độ phân hủy do nhiệt độ cao và trong môi trường axit Việc sử dụng các dung dịch có tính kiềm giúp giảm độ axit của môi trường Tuy nhiên, nếu nó được sử dụng với lượng dư thừa, chlorophyll sẽ phản ứng với base tạo thành chlorophyllin và rượu phytol Phản ứng của chlorophyll a với axit loại bỏ ion magiê thay thế nó bằng hai nguyên tử hydro tạo ra chất rắn màu nâu ô liu, pheophytin a Quá trình thủy phân này (đảo ngược quá trình este hóa) tách phytol và tạo ra pheophorbide a Các hợp chất tương tự thu được nếu kiềm tác dụng với chlorophyll b [19] [20]
Hình 2.4 Phản ứng của chlorophyll với axit
Hình 2.5 Phản ứng của chlorophyll với base 2.2.3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng
Quang phân hủy chlorophyll có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc mất sắc tố Mặc dù chlorophyll bị phai màu nhanh chóng dưới ánh sáng trong môi trường in vitro, nhưng môi trường lục lạp thường bảo vệ chlorophyll khỏi tình trạng này (in vivo)
Quá trình oxy hóa được xác định bằng sự suy giảm tất cả các sắc tố quang hợp, protein tổng số và RNA Hàm lượng axit amin tự do tăng lên cũng như hàm lượng của các enzyme như peroxidase và lipoxygenase Các gốc tự do hữu cơ cũng có thể phát sinh trong quá trình oxy hóa và có thể đóng vai trò phá hủy chlorophyll [21]
Enzyme chlorophylase trong tế bào lá tươi chỉ hoạt động ở nhiệt độ từ 65 - 75 độ C dưới điều kiện có nước Enzym này thủy phân nhóm phytyl este của chlorophyll và pheophytin, tạo ra chlorophyllides và pheophorbide Ion hydro có thể biến đổi chlorophyll thành pheophytin tương ứng bằng cách thay thế ion Mg2+ trong vòng porphyrin.
Trích ly bằng phương pháp vật lý
Các phương pháp vật lý sử dụng trong chiết xuất sắc tố bao gồm áp dụng lực ép (vít), ly tâm (lưỡi kim loại quay nhanh hoặc lưỡi cắt nhỏ) hoặc cắt (máy xay, đồng nhất tốc độ cao, cắt tốc độ cao), gây ra sự phá vỡ tế bào của vật liệu và giải phóng các hợp chất Những phương pháp này đã được sử dụng để thu được betalain, anthocyanin, carotenoid và chlorophyll Ngoài sự đơn giản, các phương pháp vật lý còn có ưu điểm là được thực hiện trong thời gian ngắn, tránh được sự phân hủy hoặc đồng phân hóa của các sắc tố Tuy nhiên, các lực nói trên (áp suất, ly tâm hoặc cắt) có thể làm tăng nhiệt độ, ảnh hưởng tiêu cực đến dịch chiết; vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách thực hiện trong nhiệt độ lạnh [25]
Tiền xử lý cũng có tác động đến các sắc tố trong chiết xuất thực vật Chần là một trong những phương pháp tiền xử lý được sử dụng nhiều nhất đối với nguyên liệu thực
Trong quá trình trích ly, sử dụng 11 vật có chức năng giúp tối thiểu hóa tổn thất về chất lượng dinh dưỡng và cảm quan trong quá trình bảo quản đông lạnh Để nâng cao hiệu quả trích ly, các điều kiện chần thích hợp có thể được áp dụng nhằm tác động đến thành tế bào thực vật và ức chế hoạt động của enzyme, giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất.
Trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), một trong những kỹ thuật mới thu hút sự chú ý của nhiều học giả gần đây, mang lại nhiều lợi ích Dẫn truyền ion và quay lưỡng cực là hai cơ chế cơ bản ảnh hưởng trực tiếp đến các phân tử khi sử dụng phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng Các ion di chuyển dưới tác dụng của điện trường thay đổi, gọi là sự dẫn truyền ion Khả năng chống dẫn truyền ion của dung dịch gây ra ma sát, làm nóng dung dịch Quay lưỡng cực là quá trình trong đó các lưỡng cực của phân tử tự sắp xếp lại với điện trường thay đổi nhanh chóng Các phân tử dung môi cố gắng tự sắp xếp lại theo điện trường để giữ chúng luôn ở cùng một pha Tuy nhiên, do thành phần điện của sóng thay đổi quá nhanh nên chúng không thể thay đổi được nữa và bắt đầu dao động và sinh nhiệt [28] Sự nóng lên là do ma sát giữa các phân tử ở tốc độ cực cao trong môi trường điện trường xoay chiều tần số cao [29] Do đó, việc trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng chỉ có thể được thực hiện trong thời gian rất ngắn với tần số thấp [30] [31] Việc làm nóng cưỡng bức nước trong lõi vật liệu có thể thúc đẩy quá trình bay hơi chất lỏng bên trong tế bào, dẫn đến vỡ thành tế bào và/hoặc màng sinh chất
Tất cả các phương pháp tiền xử lý nêu trên đều làm tăng hiệu quả trích ly chlorophyll Do đó, vấn đề nảy sinh là liệu việc kết hợp các quy trình tiền xử lý như chần, lạnh đông và trích ly chlorophyll từ lá Sauropus androgynus bằng ethanol nồng độ thấp có cải thiện hiệu quả trích ly nhờ sự hỗ trợ của lò vi sóng hay không.
Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Năm 2010, Shengqi Su và các cộng sự đã so sánh các phương pháp trích ly chlorophyll phổ biến ở Lemna minor (bèo tấm), Potamogeton crispus và Egeria densa nhằm xác định một phương pháp tối ưu để chiết xuất nhanh chlorophyll trong thực vật thủy sinh Phương pháp nghiền – rửa giải được chọn để phá vỡ mô tế bào và hiệu quả của ba dung môi (acetone 80%, acetone 90% và ethanol 95%) trong quá trình trích ly chlorophyll đã được thử nghiệm trên Lemna minor, Potamogeton crispus và Egeria densa Tổng lượng chlorophyll trích ly bằng acetone 90% (0,860 ± 0,008 mg/g) cao hơn so với acetone 80% (0,648 ± 0,012 mg/g) hoặc ethanol 95% (0,745 ± 0,018 mg/g) đối với bèo tấm [32]
Năm 2012, nhóm nghiên cứu Yang Tong, Lijing Gao, Guomin Xiao, Xiaomei Pan đã báo cáo về một phương pháp trích ly chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina platensis có hỗ trợ vi sóng Kết quả cho thấy các thông số quy trình tối ưu cho phương pháp trích ly ethanol có hỗ trợ tiền xử lý bằng vi sóng là: acetone/nước (1:1,v/v) là đồng dung môi phá vỡ thành tế bào với thể tích là 10 mL, thời gian xử ký vi sóng là 60 giây , công suất vi sóng 560 W, thời gian trích ly 52,8 phút, nhiệt độ trích ly 55,1 o C và tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10,8 mL/g Hiệu suất chiết xuất chlorophyll được tối ưu hóa là 1,27%, phù hợp với hiệu suất chiết xuất lý thuyết [33]
Nhóm nghiên cứu Meilana Dharma Putra, Agus Darmawan Ilham Wahdini và Ahmed E Abasaeed đã thực hiện nghiên cứu chiết xuất chlorophyll từ lá dứa dại trong dung môi ethanol 70% vào năm 2017 Họ xác định được điều kiện chiết xuất tối ưu là thời gian 30 phút và không đề cập đến nhiệt độ trong báo cáo nghiên cứu.
60 o C và tốc độ khuấy là 300 vòng/phút, với hàm lượng chlorophyll thu được là 107,1 mg/L [34]
Năm 2019, Nguyễn Duy Tân đã báo cáo về nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng các hợp chất sinh học, chất màu và khả năng chống oxy hóa của dịch trích ly từ hỗn hợp ngải bún/nghệ/sả Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện trích ly tối ưu là nồng độ ethanol 80% và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 25/1 mL/g Tại điều kiện trích ly này, hàm lượng chlorophyll tổng thu được là 18,78 mg/100 g lá tươi [35]
Năm 2020, N H K Nguyen và cộng sự đã tiến hành khảo sát hàm lượng chlorophyll từ rau ngót (Sauropus androgynus (L.) Merr) bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng Khi trích bằng acetone 90%, công suất vi sóng 300 W, tỷ lệ chất rắn trên dung môi là 1:30, thời gian trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng là 120 giây; hàm lượng chlorophyll (14,43± 0,16 μg/mL) thu được cao nhất [36]
Năm 2022, Adriana K Molina cùng các cộng sự đã nghiên cứu thiết kế một phương pháp khai thác chlorophyll từ các phụ phẩm công nghiệp của cà rốt (Daucus carota L.) và cà chua (Solanum lycopersicum) Điều kiện trích ly tối ưu là 60 phút trong dung môi ethanol 95%, công suất siêu âm 400 W trong vòng 5 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Trong quá trình ngâm chiết và hỗ trợ siêu âm được thực hiện trong nghiên cứu này, dung môi ethanol 90% cho thấy khả năng chiết xuất cao gấp 100 lần so với hexan 95%, có thể là do tính phân cực cao hơn Hiệu quả trích ly chlorophyll từ các bộ phận
13 trờn mặt đất của cà chua (211,6 ± 0,3 àg/g) cao hơn so với cỏc bộ phận trờn mặt đất của cà rốt (110,4 ± 0,4 àg/g) [37]
Kết quả nghiên cứu trong nước và quốc tế cho thấy việc sử dụng dung môi hữu cơ hoặc phương pháp trích ly vật lý (siêu âm, vi sóng) trong quá trình chiết xuất chlorophyll đang thu hút sự quan tâm lớn do ứng dụng tiềm năng của chlorophyll trong y học và thực phẩm Tuy nhiên, thực tế lại cho thấy việc sử dụng dung môi nồng độ cao có thể gây ô nhiễm môi trường, trong khi các phương pháp vật lý thông thường lại cho hiệu suất trích ly thấp Do đó, nghiên cứu này đề xuất phương pháp chiết xuất chlorophyll xanh kết hợp giữa phương pháp trích ly dung môi truyền thống và các phương pháp tiền xử lý vật lý, với mục tiêu cải thiện hiệu suất thu nhận chlorophyll Ưu điểm của phương pháp này bao gồm thời gian chiết xuất ngắn, nồng độ dung môi thấp, thân thiện với môi trường, dễ thực hiện và chi phí thấp.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Lá Rau ngót (S androgynus) tươi được thu thập từ thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương, Việt Nam (Vĩ độ: 10°58'49,44"B và Kinh độ: 106°39'6,84"E) Cây Rau ngót trồng bằng cành sau 2 tháng; khi cây cao tầm 0,5 – 1 m; lá có kích thước dài 4 – 6 cm, rộng 15 – 30 cm là có thể tiến hành thu hoạch bằng cách cắt thân cây khoảng 20 –
30 cm cách từ gốc Sau khi tách lá khỏi thân, chúng được rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn Lá sau đó được chần trong bể nước nóng với tỷ lệ lá-nước là 1:10 (w/v), sau đó làm lạnh nhanh bằng cách ngâm trong nước đá lạnh 5°C trong 2 phút Lá sau khi chần được đóng gói trong túi PE (20x40cm) và bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh (-18°C), sử dụng trong vòng 3 ngày.
Hóa chất và thiết bị
Whey protein (WPI) Hilmar™ 9410 được cung cấp bởi Công ty Hilmar Ingredients (Mỹ)
Ethanol 99,5% (AR, Xilong, Cas 64-17-5) được sử dụng để trích ly S androgynus được mua từ Công ty Xilong Scientific Co., Ltd, (Trung Quốc)
- Máy xay sinh tố Philips (Philips, HR2096/00, Trung Quốc)
- Lò vi sóng Panasonic (Panasonic NN Microwave - GS597M model, capacity 25L, Nhật Bản)
- Máy khuấy từ RSM-04H (Phoenix Instrument, Đức)
- Thiết bị sấy phun SD06 Labplant (SD06, Labplant, Anh)
- Máy đo quang phổ (UV-Vis-V770, JASCO, Nhật Bản)
- Máy vortex (IKA Vortex 2, Đức)
- Máy li tâm lạnh (HERMLE, Z 216 MK, Đức)
Phương pháp nghiên cứu
Thành phẩm dạng bột qua quá trình sấy phun
Thời gian, nhiệt độ trích ly Độ ẩm Tổng chất khô
Chlorophyll Thành phần hóa học
Thời gian, nhiệt độ chần
- Hiệu quả trích ly chlorophyll
- Cảm quan màu xanh lá cây
- Cảm quan màu sắc xanh lá cây bởi hội đồng chuyên gia
- Hiệu quả trích ly chất khô tổng
- Chỉ tiêu kim loại nặng, vi sinh
Thời gian, công suất vi sóng Thời gian lạnh đông
3.3.2 Quy trình công nghệ tạo sản phẩm bột chlorophyll từ dịch chiết rau Rau ngót
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình trích ly dịch chiết Rau ngót
Thu hoạch rau ngót bằng cách cắt thân cây khoảng 20 – 30 cm tính từ gốc, nhặt lấy phần lá loại bỏ những phần hỏng và phần thân cây
Lá hỏng, sâu, tạp chất, …
Xử lý vi sóng Nước
Lá rau ngót sau khi rửa sạch, để ráo được chần với nước nóng với tỷ lệ nguyên liệu: nước chần 1: 10 ở nhiệt độ 70 – 95 o C trong vòng 10 – 210 giây Sau đó, mẫu lá (200 g lá tươi trên 1 đơn vị bao bì) được làm lạnh đông trong vòng 24 – 48 giờ
Lấy 10 g mẫu lạnh đông nghiền với dung môi nước, hỗn hợp này được xử lý với vi sóng trong 1 – 4 phút ở công suất 300 – 700 W Sau đó, mẫu được ngâm chiết trong dung dịch ethanol 40% với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1: 5, có khuấy đảo Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman Dịch sau lọc được dùng để tiến hành cho quá trình sấy phun tiếp theo.
Phương pháp sấy phun tạo dạng bột rau ngót
Hiện nay, phương pháp sấy phun rất phổ biến trong ngành công nghiệp thực do khả năng sấy một bậc nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khá đơn giản, dễ dàng kiểm soát nhiệt độ và định dạng hạt sản phẩm Dựa vào nguyên tắc sấy phun, quy trình sấy bột rau ngót gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Dịch chiết rau ngót sau trích ly và phối trộn với chất mang whey protein được chuyển dạng sương mù (các hạt lỏng phân tán trong môi trường không khí) nhờ cơ cấu phun sương trong thiết bị sấy phun
- Giai đoạn 2: Hòa trộn sương mù với dòng tác nhân sấy (khí nóng) trong buồng sấy Do nguyên liệu được phun sương nên diện tích tiếp xúc lớn, ẩm được bay hơi nhanh chóng Sản phẩm được tạo thành dạng bột mịn trong thời gian vài giây
- Giai đoạn 3: Bột sản phẩm được tách khỏi dòng không khí theo sự rơi do trọng lực vào bình chứa
Trong báo cáo này, dịch chiết chlorophyll trích ly lá Rau ngót được sấy phun dưới các điều kiện: công suất gia nhiệt 3 kW, công suất bay hơi 1000 – 1500 mL/h, lưu lượng khí 15 – 30 m 3 /h, nhiệt độ không khí đầu vào 150°C, áp suất không khí 3 bar và tốc độ nhập liệu 6,3 vòng/phút [38].
Phương pháp xác định các thành phần trong mẫu
- Protein bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC 960.52)
- Tro bằng phương pháp nung ở 500 – 800 o C đến khối lượng không đổi (AOAC 942.05)
- Đường tổng và đường khử bằng phương pháp Bertrand (AOAC 968.28, AOAC 930.36)
- Hàm lượng xơ tổng (FAO FNP 14/7, (p.230)-1986)
- Carbohydrate bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao (HPAE) (AOAC 995.13)
- Lipid bằng phương pháp thủy phân bằng axit hydrochloric (AOAC 922.06).
Xác định hàm lượng chlorophyll tổng số (TCC) trong S androgynus bằng phương pháp quang phổ
Các dung dịch trích ly được phân tích bằng phương pháp quang phổ UV-Vis Kết quả phân tích giúp xác định sự hiện diện của hợp chất chlorophyll Ngoài ra, giá trị bước sóng hấp thụ cực đại được so sánh theo thời gian, phản ánh độ ổn định của màu sắc.
Kỹ thuật đo quang phổ do Lichtenthaler và Buschmann thiết lập đã được sử dụng để xác định hàm lượng chlorophyll [39] Dung dịch đầu tiên được pha loãng đến nồng độ mong muốn Độ hấp thụ quang của dung dịch sau đó được đo ở bước sóng 664 nm và 648 nm bằng máy đo quang phổ (UV-Vis-V770, JASCO, Nhật Bản) Mẫu trắng được tạo ra theo cách tương tự, nhưng mẫu được thay thế bằng nước cất
Công thức sau đây được sử dụng để tính hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và chlorophyll tổng số:
[Chl b] (àg∕mL) = 20.31 A648 − 4.91 A664 x = Chorophyll tổng (àg∕mL) = 7.34 A664 + 17.76 A648 (1)
Trong đó: TCC là tổng hàm lượng chlorophyll (mg/g d.w chất khô); x là hàm lượng chlorophyll thu được từ phương trình (1); V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu; f là hệ số pha loãng; m là khối lượng lá S androgynus tươi (g); và W là độ ẩm của lá S androgynus tươi (%)
Hiệu quả trích ly chlorophyll (CRY) được tính theo công thức sau:
Trong đó TCC là tổng hàm lượng chlorophyll thu được từ dịch chiết lá S androgynus tươi bằng phương pháp kết hợp tiền xử lý vật lý và TCC0 là tổng hàm lượng chlorophyll trong lá S androgynus tươi.
Xác định độ ẩm
Phương pháp AOAC (2000) được sử dụng để tính toán độ ẩm Các mẫu lá S androgynus hoặc bột S androgynus được cân (khoảng 2g) và sấy khô trong tủ sấy ở
105°C cho đến khi khối lượng không đổi.
Phương pháp xác định độ hòa tan (WSI)
Hòa tan 2,5 gam bột trong 30 ml dung dịch cất ở 40 độ C trong ống ly tâm đã trừ bì Khuấy hỗn hợp bằng máy khuấy vortex (IKA Vortex 2, Đức) trong 1 phút Sau đó, ly tâm hỗn hợp.
3500 vòng/phút ở 4°C trong 20 phút bằng máy ly tâm (HERMLE, Z 216 MK, Đức) Rót phần dịch hòa tan ra khỏi ống, đưa ống đang chứa phần lắng sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi Độ hòa tan được tính bằng công thức [40]:
Phương pháp phân tích cảm quan màu sắc
Cường độ màu sắc được đánh giá bằng phép thử so hàng:
- Hội đồng đánh giá bao gồm 7 chuyên gia là những người đang nghiên cứu về màu chlorophyll
- Người đánh giá được mời quan sát các mẫu dịch trích ly và bột sấy phun (được mã hóa) theo cường độ tăng dần màu sắc và chấm điểm vào phiếu đánh giá gửi kèm theo mẫu dưới đây
- Sau khi hội đồng thử xong thu lại phiếu đánh giá và xử lý kết quả
- Mẫu được 5/7 chuyên gia chấm thang điểm 4 – 5 là mẫu được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
Hình 3.2 Phiếu đánh giá cảm quan
Phân tích dữ liệu
Những thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần Dữ liệu được phân tích bởi ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Centurion XIX.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần và nhiệt độ chần đến hiệu quả trích
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.1:
Biến khảo sát là thời gian chần từ 0, 10, 20, 30, 60, 90, 150, 180, 210 giây
PHIẾU ĐÁNH GIÁ Người đánh giá: Ngày đánh giá:
Anh/chị sẽ nhận được các mẫu đã được đánh mã số và sắp xếp theo thứ tự màu xanh từ nhạt đến đậm Hãy quan sát màu sắc từng mẫu và đánh giá mức độ ưa thích của anh/chị đối với mỗi mẫu bằng cách cho điểm theo thang điểm từ 1-5 dưới đây Ghi nhận câu trả lời của anh/chị vào bảng đánh giá bên dưới
1 – Hoàn toàn không thích 4 – Thích
2 – Không thích 5 – Hoàn toàn ưa thích
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần đến hiệu quả trích ly chlorophyll Thông số khảo sát Đơn vị Không hỗ trợ vi sóng Có hỗ trợ vi sóng
Thời gian lạnh đông giờ 24 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5 1:5
Thời gian trích ly phút 30 30
Thời gian vi sóng phút 0 2 Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.2:
Biến khảo sát là nhiệt độ chần từ 70, 80, 90, 95 o C
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hiệu quả trích ly chlorophyll Thông số khảo sát Đơn vị Không hỗ trợ vi sóng Có hỗ trợ vi sóng
Thời gian lạnh đông giờ 24 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5 1:5
Thời gian trích ly phút 30 30
Thời gian vi sóng phút 0 2
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lạnh đông đến hiệu quả trích ly
chlorophyll Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lạnh đông, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.3:
Biến khảo sát là thời gian lạnh đông từ 12, 24, 36, 48 giờ
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lạnh đông đến hiệu quả trích ly chlorophyll Thông số khảo sát Đơn vị Không hỗ trợ vi sóng Có hỗ trợ vi sóng
Thời gian lạnh đông giờ 12, 24, 36, 48 12, 24, 36, 48
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5 1:5
Thời gian trích ly phút 30 30
Thời gian vi sóng phút 0 2
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly và nhiệt độ trích ly đến hiệu quả trích ly chlorophyll
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.4:
Biến khảo sát là thời gian trích ly từ 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 phút
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly chlorophyll Thông số khảo sát Đơn vị Không hỗ trợ vi sóng Có hỗ trợ vi sóng
Thời gian lạnh đông giờ 24 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5 1:5
Thời gian trích ly phút 3 – 25 3 – 25
Thời gian vi sóng phút 0 2
23 Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.5:
Biến khảo sát là nhiệt độ trích ly từ 30, 40, 50 o C
Bảng 3.5 trình bày bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu quả trích ly chlorophyll từ mẫu thực vật Thí nghiệm được thực hiện với hai điều kiện: có và không hỗ trợ vi sóng.
Thời gian lạnh đông giờ 24 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5 1:5
Thời gian trích ly phút 20 7
Thời gian vi sóng phút 0 2
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến hiệu quả trích ly
chlorophyll Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.6:
Biến khảo sát là thời gian xử lý vi sóng từ 1, 2, 3, 4 phút
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến hiệu quả trích ly chlorophyll
Thông số khảo sát Đơn vị Mẫu thí nghiệm
Thời gian lạnh đông giờ 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5
Thời gian trích ly phút 7
Thời gian vi sóng phút 1, 2, 3, 4
Khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu quả trích ly chlorophyll
chlorophyll Để khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng, điều kiện thí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bảng 3.7:
Biến khảo sát là công suất vi sóng từ 300, 400, 550, 700 W
Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu quả trích ly chlorophyll
Thông số khảo sát Đơn vị Mẫu thí nghiệm
Thời gian lạnh đông giờ 24
Tỷ lệ chất rắn: dung môi g/mL 1:5
Thời gian trích ly phút 7
Thời gian vi sóng phút 3
