sản xuất sinh khối nấm men khảo sát quá trình phát triển của nấm men trong môi trường nuôi cấy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒNKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMBÀI BÁO CÁOMôn: Thực hành công nghệ sinh họcSẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN - KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁTTRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MÔI TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



BÀI BÁO CÁO

Môn: Thực hành công nghệ sinh học

SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN - KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT

TRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Minh Hải

Th.S Nguyễn Tấn Anh Nguyên

Th.S Nguyễn Quỳnh Dao

Sinh viên thực hiện:

3 Trương Huỳnh Thanh Phước An D20_TP02 DH62007220

Tháng 3/2023

BÀI 1: SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN - KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

I NẤM MEN SACCAROMYCES CEREVISIAE

- Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh

vật thuộc chi Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay [1]

- Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài sinh vật nhân chuẩn được khoa học dùng nhiều nhất, cùng với E.coli là hai loài sinh vật mô hình phổ biến nhất

- Là một sinh vật đơn bào, Saccharomyces cerevisiae là một phần của giới nấm Mặc dù tên gọi chung của nó là nấm men bánh mì (Vì có tác dụng làm bột mì trương nở) hoặc nấm men bia thì tên chi của nó lại bắt nguồn từ cụm từ

saccharose (đường) và mycelium (nấm) Tên loài là ‘cerevisiae’ nghĩa là bia lúa mạch hoặc lúa mì lên men truyền thống của Gauls [2]

- Cấu tạo chủ yếu là protein, lipit và ít polisaccarit

- Ứng dụng của saccharomyces cerevisiae:

+ Trong sản xuất bánh mì

+ Trong sản xuất bia

+ Trong sản xuất rượu

II NGUYÊN VẬT LIỆU

- Giống nấm men: Saccharomyces cerevisiae

Hình 1: Saccharomyces cerevisiae

- Thiết bị lắc ổn nhiệt

- Kính hiển vi

Hình 2: Kính hiển vi

- Buồng đếm hồng cầu

Hình 3: Buồng đếm hồng cầu

- Lame kính

Hình 4: Lame kính

- Ống cuvet

Hình 5: Ống cuvet

- Máy đo quang phổ OD (optical density)

- Micropipette

Hình 6: Micropipette được dùng trong phòng thí nghiệm

- Môi trường lên men M4 gồm

+Dịch chiếc cà chua: 250 ml + glucose: 5%

+ ampicilline: 0.5ml (phòng thí nghiệm đã chuẩn bị)

 Cách pha chế dịch chiết cà chua: 75g cà chua được lột vỏ, cắt nhỏ và

đun sôi với 300 ml nước trong 30 phút Lọc qua vải mỏng (hoặc rây) lấy phần dịch trong Bổ sung nước cho đủ 250ml

Hình 7,8: pha chế dịch chiết cà chua

- Metyl blue: hoá chất nhuộm được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm y sinh học Nó được ứng dụng nhiều trong đánh giá tỷ lệ sống chết của

tế bào, tế bào nấm men

- Tại sao phải dùng Methyl blue?

Bởi vì nguyên lý của phương pháp này là dựa vào đặc tính thấm khác nhau giữa tế bào sống và tế bào chết Những tế bào còn sống, màng có tính thấm chọn lọc, do đó thuốc nhuộm như methylene blue không thể đi qua Ngược lại, đối với tế bào chết, màng mất đi tính thấm chọn lọc, nên khi nhuộm với hoá chất này nó sẽ bắt màu xanh đậm Ngoài ra, methylene blue còn được sử dụng

để nhuộm trực khuẩn, đặc biệt trực khuẩn bạch hầu Đối với phương pháp này

tế bào trực khuẩn sẽ được nhuộm với methylen blue trong môi trường kiềm hoá

III Cách tiến hành

1 Sản xuất sinh khối:

B1: Hút 5ml nấm men từ bình nấm men đã được chuẩn bị từ phòng thí nghiệm

chuyển vào môi trường sử dụng (Saccharomyces cerevisiae được nuôi trong môi trường Hansen trong 48h ở điều kiện nhiệt đồ phòng)

B2: Lắc đều

B3: Đem bình môi trường vào thiết bị lắc ổn nhiệt, lắc với tốc độ 220rpm, nhiệt

độ 28-35oC

Hình 9: Những bình môi trường được đặt vào thiết bị lắc ổn nhiệt

2 Chuẫn bị mẫu đo OD

Chuẩn bị 9 ống nghiệm đánh số từ t0 → t8

Lấy 1ml dung dịch mẫu + 4 ml nước cất vào 8 ống còn ống blank (t0) là 5ml

nước cất

Lắc đều

Đo OD λ = 600nm

Ghi kết quả

 Cách đo độ hấp thụ A600nm

B1: Mở máy đo

B2: Chỉnh λ= 600nm

B3: Cho nước cất làm mẫu blank và cho vào cuvet

B4: Bấm mesure sau đó bấm B

B5: Lấy cuvet khác tráng nước

B6: Sau khi đổ nước cất, tiếp tục tráng bằng dung dịch mẫu

B7: Cho 1 ít dung dịch mẫu cần đo vào cuvet

B8: Để vị trí rồi đậy nắp máy đo

B9: Bấm số 1

B10: Ghi kết qủa

3 Xác định tổng số tế bào/ml bằng buồng đếm hồng cầu

B1: Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm

B2: Cho 1 giọt methylene blue

B3: Lắc đều

B4: Lấy lame kính để lên buồng đếm

B5: Lấy 1 ít mẫu trong ống nghiệm bỏ vào buồng đếm

B7: Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi

B8: Ghi kết quả

IV KẾT QUẢ TÍNH TOÁN VÀ BIỆN LUẬN

Ghi kết quả

gian

( giờ)

Ta có:

N = {a/b x

400/0.1} x 103 x

n

N1 = {a1/b x

400/0.1} x 103 x

n

N2 = {a2/b x

400/0.1} x 103 x

n

Trong đó:

- N: tổng số tế

bào trong 1ml

mẫu nghiên cứu

Thời gian

T0

Độ pha loãng n=1

156

T1

Độ pha loãng n=1

107

T2

Độ pha loãng n=1

T3

Độ pha loãng n=1

292

T4

Độ pha loãng n=2

169

T5

Độ pha loãng n=2

232

T6

Độ pha loãng n=2

T7

Độ pha loãng n=2

178

- N1: tổng số tế bào chết trong 1ml mẫu nghiên cứu

- N2: tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu

- a: tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn

- a1: tổng số tế bào chết trong 5 ô vuông lớn

- a2: tổng số tế bào nảy chồi trong 5 ô vuông lớn

- b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn ( 16*5 = 80)

- 400: tổng số ô vuông nhỏ

- 0.1 : thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3 ) chứa trên ô trung tâm

- 103 : số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml)

- n: độ pha loãng của mẫu dung dịch nuôi cấy trên nấm men

Thời

gian

( giờ) A600nm

lgN (tb/m) (tb/m)lg N1 (tb/m)lg N2

Tỉ lệ chết (%)

Tỉ lệ nảy chồi

c ( giờ) 

-1 0.324 15.493 12.206 9.798 3.74 0.34 -1.998 -0.501 -0.345

2 0.283 15.664 13.955 7.313 18.11 0.02 4.596 0.218 0.150

3 0.398 17.190 15.068 11.871 11.99 0.49 -0.884 -1.131 -0.781

4 0.389 16.643 14.557 8.517 12.43 0.03 3.501 0.286 0.197

5 0.194 16.960 14.880 8.006 12.50 0.01 4.196 0.238 0.164

6 0.481 16.537 14.581 6.908 14.14 0.01 -1.908 -0.524 -0.362

7 0.460 16.695 15.274 7.601 24.16 0.01 -2.202 -0.454 -0.313

Ta có:

Thời gian thế hệ g: g = n t =(ln 2(t 2−t 1) lnN −lnN 0)

Tốc độ tăng trưởng riêng: lnN −lnN 0

(t−t 0)

Hằng số tốc độ phân chia: c = 1g = n t

Mối liên hệ giữa hằng số tốc độ sinh trưởng (µ), hằng số tốc độ phân chia (c )

và thời gian thế hê (g) là c = 0,69 * c/g

Tỉ lệ chết (%) = N1/N x 100

Tỉ lệ nảy chồi (%) = N2/N x 100

*Biểu đồ

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.42

0.32

0.28

0.4 0.39

0.19

0.48 0.46

f(x) = 0.01 x + 0.34 R² = 0.05

Biểu đồ biểu diễn A600nm theo thời gian t

t (Giờ)

Nhận xét, biện luận:

- Độ hấp thu của mẫu có xu hướng tăng dần nhưng giảm mạnh ở thời gian t5

- Cao nhất ở t6 là 0.481A còn thấp nhất là 0.194A ở t5

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

20000000

7800000

5350000 6350000

14600000

8450000

11600000

15200000

17800000

f(x) = 1533928.57 x + 5525000 R² = 0.67

Đồ thị biểu tổng số tế bào (N) theo thời gian t

t (giờ)

v

Nhận xét, biện luận:

- Dựa vào biểu đồ ta thấy tổng số tế bào ở giai đoạn t1 thấp nhất và tăng nhanh cho đến t5 đạt tổng số lượng tế bào cao nhất, sau đó do pha loãng

mà tế bào giảm ở giai đoạn t6, t7 cho tổng số tế bào xấp xỉ nhau

Tỉ lệ chết 23.72 3.74 18.11 11.99 12.43 12.50 14.14 24.16

Tỉ lệ nảy chồi 0.04 0.34 0.02 0.49 0.03 0.01 0.01 0.01

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

30.00

23.72

3.74

18.11

22.29

12.43 12.50

14.14

24.16

0.04 0.34 0.02 0.05 0.03 0.01 0.01 0.01

Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ chết, tỉ lệ nảy chồi (%) theo thời gian t

Tỉ lệ chết Tỉ lệ nảy chồi

t ( giờ )

Nhận xét, biện luận:

- Qua biểu đồ trên ta thấy tỉ lệ tế bào chết tăng giảm liên tục theo thời gian, ở thời gian t0 tế bào chết khá nhiều vì tế bào nấm men vừa được thêm vào môi trường chưa kịp thích ứng với môi trường nuôi cấy nên tỉ

lệ chết cao

- Tỉ lệ này chồi của tế bào nấm men chiếm rất ít so với tỉ lệ chết

- Tỉ lệ chết của nấm men qua các t tiếp theo giảm dần vì khi đó các tế bào nấm men sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để sinh trưởng và phát triển nhưng lại tăng cao ở t6 và t7

[1] Feldmann, H (2011) Yeast: molecular and cell biology John Wiley &

Sons

[2] https://chatluongthucpham.com/moi-truong-nuoi-cay-saccharomyces-

cerevisiae/?fbclid=IwAR3GSgtnnikzxWeR-zinBRYUFQ-yXo_tGEhrnj5lvOQ_8_18id0vmPfZVQA