Luận án phó tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu di truyền học một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế của nấm men SACCHAROMYCES SPP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG DẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Bs i

LÊ THÀNH LAM

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC MOT SỐ TINH TRANG

CÓ Ý NGHIA KINH TẾ CUA NAM MEN SACCHAROMYCES spp.

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã sò :1.05, 06

LUẬN ÁN PHO THEN SI KHOA HOC SINE HỌC

Người hướng dan Khoa học: GS.PTS, Lê Đỉnh Lương

Hà nội 1996

MOT SỐ TINH TRANG CÓ Y NGHIA KINH TẾ 3

I ĐẶC DIEM SINH HOC VÀ GIÁ TRI KINH TẾ CA NAM MEN

Saccharontyces spp `I 1 Đặc điểm sinh hoc của nam men 3

1 2 Giá trị kinh tẾ của nam men 8

HE DỊ PRUYN HỌC MỘT SỐ TÍNH TRẠNG KINH TÚ Ở NAM MEN 9

H.L Tinh trạng hình thái 1@ bào 9

I] 2 Tinh trạng chịu ethanol IIIH 3 Tính trạng chịu nhiệt 13IL 4 Tinh trạng chịu mặn L4[I 5 Tĩnh trạng đường hoá tinh bội 1SHH 6 Tinh trạng chuyển hoá các loại đường 20

Hl CÁC PHƯƠNG PHAP TẠO RA NOL NAM MEN MỚI, 21

IH.1.L.ai 21

HHI.1.I Nguyên tie chung 21

HHI.1.2 Các phương pháp lai 22

11.2 Dung hợp tế bào trần 23

HII.3 Biến nạp và ADN tái tổ hợp - 24

IV MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ VIEC TẠO GIỐNG NAM MEN ie

B VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

| VAT LIÊU |

Tf Cae noi nam men 1

IL.1 4 Xác định sinh khối,

[I.1 5 Xác định kha năng lên men.

1.1 6 Xác định lượng rượu có trong dịch lên men.

HI.1 7 Xác định kha năng đường hoá tỉnh hội.

II.1.8 Xác định khả năng chịu nhiệt.

II.1 9 Xác định khả năng chịu pl thấp.

JJ.1 J0 Xác định kha năng chịu con.

ILL 11 Xác định khả năng chịu muối.

1].2 Cae phương pháp di truyền học.

11.2.1 Tach bào tử hàng loạt.

I.2.2 Vi thao tác.11.2.3 Lat bão hoà.

[L.2 Dung hợp té bào trần.

G KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN.

I DIỀU TRA SINH HỌC VÀ PHÁN TICH DETRUYEN MỘT SỐ

TINH TRANG CÓ Ý NGHỊA KINH TÊCỦA NAM MEN

Sacchareniyces spp.

I.1 Kha năng sinh bào tửcủa các nòi nam men.

J 2 Kha năng song sót của các bào tứ tách ra từ các nòi nam men.3 Khả năng chịu con của các noi nam men.

L 3 Kha nắng chịu côn của các not nam i

[ 4 Khả năng chịu mudi của các noi nam men.

I 5.Khả năng chịu nhiệt độ cao (42 "C) của nòi nấm men TH,- 30.

I 6 Khả năng chịu pH thấp ( pH 2) của nồi nam men TH „T30,

I.7 Kha năng tích luỹ sinh khối của ndi nấm men TU, -30.

HH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NAM MEN MỚI,

Ht Tạo giống nấm men bánh mỉ có vỏ tế bao mồng.

II.1.1.Sở đồ lại.

H.1.2 Tho nhận noi lai mang gen 7727 lai bằng may vi thao tác.

11.1.3 So sánh kha năng lên men đường, tích lũy sinh khối giữa

noi lai và cha me.

HI.!.1 So gánh kha năng tạo sinh khối giữa noi nam men lai mang gen

rpm? với noi cha mẹ trong điều kiện sân XUẤT.

11.2 Nghiên cứu tạo giống nấm men chịu cồn.

[I.2.1 Cai tạo đi truyền noi nấm men dùng trong sẵn xuất rượu vang.

(1.2.1.1 So đồ tách dong tế bào.

II.2.1.2 Kiểm tra kha năng chin còn của các thể phân ly ban dan.

ii,ho1.3 Kha năng chịu con của các thé phân ly được chọn lần |.

[I.2.1.4 Kha năng chịu côn của các thê phân ly được chọn ở lần 2.

1.2.1.5 So đồ lai.

[I.2.1.6 So gánh kha năng chịu côn, lên men và khả năng tích Itty

sinh khối giữa nòi lai với nòi nấm men ban đầu ( VIL ).

11.2.2 Tạo giống nấm men cho san xuất côn và nước giải khát có ga.II.2.2.1 Kết qua thu nhận các nòi nấm men lai bằng máy vi thao tác.11.2.2.2 So gánh kha năng lên men kha năng tịch lũy sinh khối

giữa các nòi nấm men lai với cha me.

HH.3 Nghiên cuu tạo giống nấm men ®% cerevisiae

có khả năng đường hoá tỉnh bột.

Ps bx Chuyen gen đường hoa tinh bột từ Š diastaticus vào hệ ven

của 8 cerevisiae bằng phép lai hao hoà.[E3 1.1 Sơ đồ lat bão hoà.

hà

[I3.1.2 So sánh khả năng đường hoa tinh hột, kha năng lên men

và khả năng tích lũy sinh khối giữa ndi lai với nồi cha mẹ.11.3.2 Tạo giống nấm men có khả năng đường hoá tỉnh bột bằng

kỹ thuật dung hợp tế bào trần.

II.3.2.1 Sơ đồ dung hợp.

11.3.2.2 Khả năng hình thành tẾ bào trần.

II.3.2.3 Kết quả của các phép dung hợp 86

II.3.2.4 So sánh kha năng chịu nhiệt, chịu muối, khả năng đường hoa

tinh bột, kha năng lên men và kha năng ích ly sinh khối

piữa các the dung hop vacha me.

MỘT SỐ THUẬT NGỮ CHUYEN MÔN ANH -VIỆT

Tetrad analysis : Phân ch bộ bốn

Segregant : The phan ly

Protoplast fusion : Dung hợp tế bào trần

Fusant : The dung hợp

Saturated hybridization : Lai bão hoà

Thermaltolerant character : Tinh tran g chiu nhiét

Halotolerant chracter : Tinh trang chiu man

Ethanol tolerant character : Tinh trang chin còn

Acid tolerant character : Tinh trạng chịu axit ( pH thấp )

Biomass accumulation character: Tĩnh trạng tích lũy sinh khối

Mating-ty pe : Giới tinh

MỞ DAU

Không có nhóm vi sinh vật nào lại gắn liền với tiến bộ và sự phồn

vinh của loài người hơn là nam men Đây chính là nhóm vi sinh vật quan

trọng nhất đã được con người sử dụng trong sản xuất và trong nghiên cứu

khoa học Theo tài liệu quốc tế (1984), các sản phẩm từ nấm men chiếm gần

70 % tong gố các gân phẩm công nghệ sinh học trên toàn thế giới Về phương

diện nghiên cứu khoa học, nắm men chính là đối tượng thuận tiện đề nghiêncứu nhiều vấn đề cơ bản liên quan đến sinh vật nhân chuẩn như sự biểu hiện

của gen, sự sao chép của ADN , sự chuyển chỗ, cấu trúc của nhiễm sắc thể,

cơ chế nguyên phân và giảm phan Có thể nói nấm men là đối tượng quan

trọng bậc nhất của công nghệ sinh học hiện đại [16, 115, 116, 117 ].

Người ta thấy rằng, nam men nói riêng và vi sinh vật nói chung thậm

chí còn biến đổi thường xuyên hơn ca các san phẩm do chúng tạo ra Chính

vi thế mà từ xưa đến nay, con người không ngừng lựa chọn, tạo ra những nồi

khác nhau, tùy theo từng mục đích sử dụng Ngày nay, phương pháp lựa

chọn có định hướng - nghĩa là tạo ra các điều kiện nuôi cấy và môi trường

đặc biệt ( như nhiệt độ cao, độ mặn cao, ap suất thấm thấu cao ) để chọn

lọc những nồi thích hợp - đã được sử dung ở nước ta và trên thế giới [ 20, 22,

31, 33, 45, 51, 56, 85, 93, 108, 113 J.

Tuy nhién, néu chi tién hanh phân lập va giữ giếng thi không thể thoả

mãn nhu cầu ngày càng tăng của sản xuất và nghiên cứu khoa học [ 13 ] Mặt

khác, cho đến nay trên thế giới chưa có nhiều công trình nghiên cứu về ditruyền học các tinh trang chống chịu ở nấm men Còn ở Việt nam, các công

trình nghiên cứu theo hướng phan tích di truyền các tính trạng chống chịu vàtạo giống nam men ban g các phương phap di truyền học cũng chỉ đang ở gia

đoạn bước đầu [ó, 8, 10, 11, 12, 17, 79 | Việt nam lại là nước nhiệt đới, có

thời tiết nóng âm kéo dài nhiều thang trong năm; cố khu hệ vi sinh vật vô

cùng phong phú; cho nên việc duy tri được những điều kiện mong muốn

trong suốt quá trình sản xuất ( chẳng han, bao dam đề nhiệt độ lên men liôn

luôn ở 28° - 30°C; hay bảo dam vô trùng cho quá trinh lên men ) là khátốn kém Cho nên, việc nghiên cứu đề tao ra noi nam men mang những

pham chat qui giá, chang hạn vừa có khả năng tích lũy sinh khối cao, vừa có

kha năng chịu nhiệt cao chính là cách để giam bớt tốn kém do phải dùng

nước dé giải toa nhiệt độ sinh ra trong quá trình lên men; hay nếu có được

noi nam men chiu cồn cao, chịu pH thấp thi sẽ hạn chế được sự nhiễm của vi

khuẩn lạ từ bên ngoài vào môi trường lên men Nhằm góp phần nghiên cứu

về sự kiểm soát di truyền đối với một 86 tính trạng có ý nghĩa kinh t 6 nấmmen như chịu nhiệt độ cao, chiu cồn cao, chịu mặn cao, chịu pH thấp tichlay sinh khối, lên men các loại đường dé tạo cơ sở cho nghiên cứu tạo giống

nấm men hữu ich cho san xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu di

truyền hoc một số lĩnh tạng có § nghĩa kinh té của nam men

Saccharomyces spp Dé tài nghiên cứu gôm hai nội dung cu thé như sau:

1 Phân tích di truyền một số tinh trạng chống chiu ( nhiệt độ cao : 42” C, độ

còn cao :14 -16 % v/v , độ mặn cao : 3 % NaCl w#, pH thấp : pH 2 ) và một

sô tinh trạng có ý nghĩa kinh tê trực tiếp ( kha năng tích lãy sinh khối, lên

men đường, ) ở một gõ nòi nam men nhập nội và phân lập ở Việt nam.

2 Nghiên cứu cai tạo di truyền những noi nam men dùng trong sản xuấtmen bánh mi, sản xuât con và san xuât rượu vang ; đồng thời nghiên cứu việc

chuyên gen đường hoa tinh bột vào nam men Saccharomyces cerevisiae.

i)

A TONG QUAN TÀI LIỆU.

< ` £ ` 5 2 by

NAM MEN Saccharomyces VÀ VAN DE ĐIÊU KHIỂN DI TRUYEN

MỘT SỐ TINH TRẠNG CO Ý NGHIA KINH TE.

Saccharomyces là những vi sinh vật nhan chuan don gian nhất có quá

trình hữu tinh điển hình Nhờ vậy, chúng là đối Lượng rat thuận tiện để

nghiên cưú những vấn đề của di truyền học đại cương và nhất là di truyền học

phân tử của các sinh vật bậc cao Saccharomyces chính là đối tượng sinh vậtđược nghiên cứu rat day đủ về mặt di truyền học Hàng tram gen có những

chức năng khác nhau đã được định vị trên ban đồ di truyền gồm 17 nhiễm sắc

the Thêm vào đó, Saccharomyces cũng chính là đối tượng quan trọng cha

nhiều ngành san xuất trong công nghiệp vi sinh vật : sản xuất men bánh mi,

làm cồn, làm rượu, làm bia, sản xuất các chế phẩm enzym, sản xuất protein

đơn bào, chế biến các phụ phẩm dầu hoa Ngày nay, di truyền học nấm men

bao gồm ca di truyén hoc kinh điển và di truyền học hiện đại đã trỏ thành mộtlinh vực rộng lớn của Di truyền học, Vi sinh vật học và Sinh học phân tử Cứ

hai năm một lần lại có những hội nghị quốc tế về Di truyền học và Sinh học

nấm men được triệu tập [ 4, 16, 116, 117 ] Trong khuôn khô của luận an này

chúng tôi xin đề cập đến các thông tin liên quan đến một số đặc điểm sinh

học, giá trị kinh lế và việc điều khiển di truyền của một số tính lrạng có ynghia kinh tế của nam men Saccharontyces spp.

1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ GIA TRI KINH TE CUA NAM MEN

Saccharomyces spp.

I.1.Đặc điểm sinh học.

Nấm men là sinh vật đơn bào , nhân chuẩn ( eukaryotic ) Té bao cha

chúng có dang hình tròn hay ovan và thường có kích thước 5- 10 p Nam

men có những đặc điểm hấp dẫn khiến cho có thể tiến hành các thí nphiệm

với chúng nhanh chong và dé dàng như đối với các sinh vật nhân sơ

( prokaryotic ) Trước hết, chúng sinh trưởng rất nhanh có thời gian nhân đôi

ngắn ( khoảng 2 giờ ) Có nghĩa là, hàng nghìn khuẩn lạc của nấm ¡nen có thé

được nuôi cấy trên các đĩa petri trong khoảng hai ngày Thứ hai, nấm men

có bộ may di truyền nhỏ (chi to hơn hệ gen của E.coli khoảng 4 lần, và nhỏ

hon hệ gen của tê bao động vật có vú khoảng 200 lần ) ( hình 1 )

Thu ba, nam men là đồi tượng đặc biệt thuận tiện de phân tích đi truyền vi

các pha đơn bội và lưỡng bội trong chu trinh sông là rõ rang và có thé điều

khiển được Như vậy, nhà nghiên cum co thể dé dang thu được các đột biến

lặn khi sử dung các tế bao đơn bội Còn phép tai tố hợp di truyền, công cụ

căn bản của nhà di truyền học , có thể được thực hiện một cách dé đàng nhờlai hai thể đột biến đơn bội khác nhau đề tạo ra mot thé lưỡng bội [ 16, 115,

117, 129 Ị.

Nấm mien Saccharomyces có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng27°C' đến 33°C và pH tối ưu là 4,5 đến 5,5 TẾ bào phân chia theo cách

nay choi; giai đoạn sinh dudng thường là lưỡng bội Trong những điều kiện

moi trường nhất định thi tẾ bào lưỡng bội phan chia giam phân đề tạo thành

nang bào tử chứa bốn bào tử đơn bội Tuy nhiên cũng có thể quan sat thay cácnang chứa it hơn ( 1 - 3 bào tử ) hay nhiều hơn (5 -8 bào tử ) Trường hợp it

hơn 4 bào tử có thể là do vài nhân không tham gia vào quá trinh hình thành

bào tử, hoặc hai nhân tạo thành một bào tử Còn nang có chứa nhiều hơn 4

bào tử có thể xuất hiện do có thêm một lần phân chia nguyên phân sau khíphân chia giảm phân hoặc chúng có the được hinh thành từ các tế bào mang

hai nhân lưỡng boi[ 4, 27, 114, 115 } Trong môi trường định dưỡng thông

thường, các bào tử đơn bội sinh trưởng và thường giao kết với nhau từng đôi

một để tạo thành các hợp tử lưỡng hội Sau đó, các hợp tử này tiếp tục sinhsản vô tinh theo cách nay chồi để tạo thành các dòng lưỡng bội Thôngthường, tế bào đơn bội nhỏ hơn, có dạng hình cầu, có khả năng giao phối vàkhông sinh bào tử; còn tế bào lưỡng bội thi to hơn, có hình ovan, không cókhả năng giao phối và có khả năng sinh bào tử Người ta đã biết có it nhất 5

gen kiêm soát quá trình giảm phân ở nấm men ; còn các giai đoạn riêng biệt

của quá trình hình thành bào tử do 19 gen kiểm soát [ 58, 61, 114,121] Khi

nuôi cấy lâu dai trong phòng thí nghiệm, kha năng giao phối của ndi đơn bộigiảm nhiều và cuối cùng có thể dẫn đến bat thụ Cae đột biến ở gen giới tinh

hoặc các biến đối ở các gen sửa đổi kiểm soát sự giao phối chính là nguyên

nhân của hiện tượng đó Tuy nhiên, cũng có những noi đơn bội có thé duy trì

5

được khả năng giao phối trong một thời gian dài Khả năng giao phối của các

noi nấm men liên quan chặt chẽ đến khả năng tiếtra pheromon giới tinh đề

làm ngừng quá trình phân bào Chúng có bản chất là oligopeptit [ 27, 48, 55,

64 |.

Dựa vào cách hình thành thể lưỡng bội trong chu trinh sống mà nấm

men được chia làm hai loại : nam men đồng tan va nam men di tan ( hình 2 ).

Hình 2: Chu trình sống của Saccharomyces

Nấm men dị tan là loại nấm men mà thể lưỡng hội được tạo thành do sự

giao phối của các bào tứ hoặc tế bào đơn bội có giới tính khác nhau , a hay ot

Nấm men đồng tân là nam men mà sự giao phối có thể xây ra giữa hai bào tử

hay hai tế bào đơn bội bất ki Chỉnh vi thế mà không thê duy trì được trạng

thái đơn bội ở loại nấm men này Giới tính của tế bào đơn bội do một locut

MAT kiểm soát Locut MAT có thé mang một trong hai alen MATa hay

Ấ x Z_ xế 1® ys 2s eae 4

MAT œ Trong các noi nam men dong tán các tê bào chuyển đổi giới tinh a

sang giới tinh œ và ngược lại một cách thường xuyên ở các thế hệ liên tiếp.

MAT nằm cách tâm động 60 kb trên nhánh phải của nhiễm sắc thé số TIL, còn

các ban sao không hoạt động của MATa hay MAT o nam tại các locut

HMR và HML ở hai phía của MAT Sự chuyển đổi giới tính được bắt đầu

bằng su cắt bổ ADN tại MAT bởi HO endonucleaza Trinh tự ADN tại

MAT bị phân hủy và được thay thế bằng một ban sao của một trong hai locut

không hoạt động [ 21 59, 60, 62, 65, 94,99, 120 ].

/ MATa được

/ -2 ^

` a / biêu hiện ˆ

-Không hoạt động Locut MAT / ‘ Khong hoat động

HMLce HO endonucleaza HiMRe

cat dut ADN tai

Chuyên doi sang a ở thể hệ sau

Hình 3: Sự chuyên đối giới tinh 6 nam men

1.2 Giá trị kinh t€ của nam men Saccharomyces

Hon 6000 năm trước đây, người Ai cập đã biết lam nổ bột mi bằng nấm

men có trong không khí Thậm chí trước đó nữa, người Summarian đã khắc

lên bia đã phương phấp lên men dé làm cồn Ngày nay, nấm men đã được sử

dụng & qui mô công nghiệp hiện đại San lượng nấm men hàng năm của

thế giới đạt gần hai triệu tấn; cồn cùng với các sẵn phẩm thu được từ qua

trình lên men có sử dụng nấm men đạt hơn hai triệu tấn và lợi ích do nó

mang lại lên đến hàng nghìn triệu đô la[ 116, 125 | Trong qui mô công

nghiệp, nấm men được sử dụng trong 3 lính vực chính chính đây ( bang 1 )

Bang 1 Các ứng dụng công nghiệp của nam men [ 116 ].

Thành phần tế bào Các sản Tướng tac

wae cen nnn nnn nen n nn nnn nnn nnn en nn nnn nnn nn ene ne nen nen ene pham enzym -cd chat

Nam men Hợpchất Hopchat San pham tiết

khõ cao phan th chiết CƠ SỞ

-Thứcăn -Lipit -Coenzym -Axitamin -Bia - Sử dụng sữa

gia súc -protein - Vitamin -Purin - Rượu vang (X.ƒfagiilis)

- Thức an - Pyrimidin - Rượu mạnh - Sử dụng tinh

hột (qui trình

-Protein -ethanol để Symba )

dan bao lam nhién - San xuất

liệu Maltotrioza

- Glycerol ( Sutvarum )

=~ 0,

Phạm vi ứng dụng của nấm men bao gồm các ngành sản xuất chính như sau:

- Công nghiệp san xuất men bánh mi.

- Công nghiệp san xuất cồn, rượu vang và nước uống có cồn.

- Sản xuất các san phẩm dinh dưỡng cho người và thức ăn gia súc.

- Sản xuất vitamin, axit amin, axit nucleic

Can đây, nấm men còn được sử dụng để chế biến dau hoa [ 3 4, 19 ]

Sở di nấm men có được những ung dụng rộng rai như vậy là do chúng

có khả năng chuyền hoá vừa nhanh chóng vừa có hiệu quả các loại đườngthành cồn và CO, ( vi dụ như các loại đường có trong dịch chiết ngũ cốc, dịchnho, sữa ) Có thể nói, nắm men là “thực vat” được nuôi trong lâu đời

nhất [ 4, 116 ].

I DITRUYBN HỌC CUA MỘT SỐ TINH TRANGCÓ Ý NGHIA KINH TẾ Ở NAM MEN.

H.1 Tinh trạng hình thái tê bao.

Ở nam men, quan hệ giữa hình thái tế bao và sự biến đổi trong vô tế

bao đặc biệt rõ ràng trong sự chuyển đổi từ dạng ““tế bào nấm men” sang

dang “ gia khuẩn ty” và ngược lại Hình dạng tế bào rõ ràng là được xác

định bởi tác động qua lại của các hoạt động điêù hoà và cấu trúc của tế bào.

Nghĩa là sự xuất hiện của một dạng tế bào cụ thê chắc chắn phái là do sự

tương tác của các cơ chế biêu hiện của gen, cơ chế kiêm soát chu trình phân

bào, các quá trình sinh tong hợp các thành phần vỏ tế bào Khi nghiên cứu

chu trinh phân bao ở nam men Saccharomyces , Hartwell và cộng sự đã thấy

9

có 35 gen khác nhau kiểm tra qua trinh này Tuy rang, đột biến ở các gen

khác nhau gây ra các dang tẾ bào khác nhau , nhưng tất cả đột biến đó đều

anh hướng đến cấu trúc của vỏ tế bào Đột biến gây ra dạng “giả khuẩn ty”

chính là loại đột biến ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của vỏ tế bào Nó

gây ra các thay đổi về hình thai và thành phần hoá sinh của vỏ té bào ở các

noi mang chúng Nhìn chung các thể đột biến “giả khuẩn ty” đều có vỏ tế

bào mỏng hơn , mẫn cảm hơn đối với nồi killer, chứa nhiều lipit và đường

sưabinoza hơn Cho đến nay, ở phòng thí nghiệm của bộ môn Di truyền học,trường Đại Học Tổng Hợp Petersburg ( Nga ) người ta xac định được 6 genlặn không liên kết gây ra dạng “giả khuẩn ty”, trong đó các gen rpm J - rpm3

do Lê Đình Lương và cộng sự [ 138.139, 140 ] xác định còn các gen rpm 4

- rpm ® do tác gia JLa.xA.€Ät.|[ 137 ] xác định Thêm vào đó, người ta cũng

đà xác định được là gen rpm2 và gen zmm+ nằm trên nhánh phải của nhiễm

sắc thể số TV [ 133, 134 ] Con các nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Hoá

-Sinh và Lý Sinh, trường Đại Học Tổng Hợp Iowa ( Mỹ) thi đã xác địnhrằng có đột biến ở 14 locut gen không liên kết khác nhau gây ra dang “giả

khuân ty” ở nam men Saccharomyces cerevisiae | 25, 35, 46, 49, 114 ].

Rõ rang nam men Saccharomyces là nô hình di truyền học rat hap dân

dé nghiên cứu các cơ chê kiêm soat hinh thai tê bào [ 26 ] Mặt khác, nam

š 3 + A & 3 z 3 z Poa š $ % š

men sinh san nhanh chong , té bad của chúng lại chứa nhiêu vitamin và axit

amin không thay thê, ham lượng protein chiêm tới 50% trọng lượng khô Cho

r ta A Ps € we ~ A ` tA “ be Z

nên, các phòng thi nghiệm trên thê giới van không ngừng nghiên cứu đê có

thê chu động tao ra được các nồi nam men có kha năng tạo ra nhiều san

2 ` 4% 1` ER os , 9 2 4 ,_ ft `

phầm hơn và dé dang hơn trong việc thu nhận các san phâm của các linh vực

ế z ° sử, sẻ Ấ P

san xuat khác nhau Ở Việt nam, nòi nam men lai mang gen rpm J ( rough

pseudo mycellium ) gây ra vO mong đã được ứng dụng vào san xuất men

bánh mì và đã thu được kết quả tốt [ 3, 5 ].

10

II.2 Tính trạng chịu ethanol.

Saccharomyces thuộc loại sinh vật nhan chuẩn có khả năng chịu con

cao nhat Chung co the mọc được trên môi trường chứa 8 - 14 % ( v/v ) con.

Khả năng chịu cồn ở những nòi khác nhau là khác nhau và do nhiều gen

kiểm soát Tuy nhiên , người ta đã thấy có nhiều gen ảnh hưởng đến gự phân

bào khi có mặt của cồn trong môi trường Số lượng của những gen này Ở

những nòi khác nhau không như nhau Cho nên việc lai các nòi đơn bội

khác nhau, lai noi đơn hội với noi lưỡng bôi có thé tao ra được nòi lai

lưỡng bội , đa bội có khả năng chịu cồn cao hơn so với nòi cha ine Ngoài

ra, phương pháp gây đột biến ( dùng tác nhân đột biến UV, diethysulphat ) và

dung hợp tế bào trần cũng đã được sử dụng đề tạo ra các nòi có khả năng chịu

con cao hơn [ 31, 38, 39, 57, 66, 81, 112, 126 ] Với phương pháp chọn lọc

bằng cách thay đồi pH khi nuôi cấy liên tục, thay đổi điều kiện lí hoá của môi

trường người ta cũng thu được noi nấm men bền vũng hơn với cồn [7L].Thêm vào đó, người ta còn ấp dụng một số phương pháp khác để nâng khả

năng chịu cồn của nam men trong quá trình lên men, như cho thêm một số

phức chất chứa N vào môi trường , hoặc bồ sung cơ chất dần dần vào môi

trường trong suốt quá trinh lên men Panchal va Stewart [ 100, 101 ] đã

chứng minh rằng việc tăng ap suất thâm thấu do nồn g độ cơ chất cao sẽ n gan

can việc tiết ethanol từ tế bào ra môi trường, do dé làm cho tế bao bi độc vàgiảm tốc độ lên men Một giải pháp khác đã được ứng dụng thành công đểlàm giâm tác dung độc hại của cồn trong quá trình lên men là: ở giai đoạn banđầu, người ta sử dụng nấm men có khả năng chống chịu áp suất thâm thấu để

lên men đến 5 - 7% ( v/v) cồn, sau đó mới hồ sung nấm men chống chịu cồnđể lên men tiếp tục [ 72, 100, 101 ] Một nhân tố khác là nhiệt độ cũng ảnh

11

hưởng đến tính chịu cồn của nấm men Người ta thấy rằng, nhiệt độ lên men

cao sẽ làm tăng tác dụng có hại của cồn đối với khả năng sống của tế bào.

Đó là vi khi nhiệt độ lên men tăng lên thì sẽ làm tăng sự tich lũy cồn nội bào.

Hơn nữa, nhiệt độ lên men tắng cao sẽ làm dừng sớm quá trình lên men.

Nghĩa là gây ra sự lên men không triệt đề (còn nhiều cơ chất chưa lên men sót

lại trong môi trường ), vỉ thế mà tạo ra nồng độ cồn thấp hơn dự kiến [30, 70,

#3 |

Điều dang chú ý là ban thân cồn cũng có tác dụng ức chế, thậm chí gầy

chết đối với tế bào nấm men N gười ta cho rằng cồn tác động lên tế bào nấmmen thông qua việc phá hỏng ADN tỉ the Người ta da chuyền ti thể từ nòi

nấm men rượu vang chịu cồn sang nòi nấm men ở trong phòng thí nghiệm

không chịu cồn làm cho các nồi nhận có kha năng chống chịu với cồn cao

hơn [ 32, 70, 107, 127 ] Khi so sánh khả năng chống chịu cồn của nòi nấm

men S cerevisae kiểu dại với thể đột biến hư hỏng cả 3 gen kiểm soát

proteaza không bào ( đột biến pep 4.3 ) Sugden va Oliver [ 118 ] đã thấy

rằng : ở 25° C, cả hai nòi đều mọc như nhau trên môi trường có chứa 0 - 8%

( v/v ) cồn Nhưng trong khoảng 30° - 38° C thi cùng một độ cồn đã gây ức

chế mạnh hơn đối với sinh trưởng của thể đột hiến pep 4.3 Có thé, đội biến

pep 4.3 đã gây ra những thay đổi căn bản trong mang của các the đột hiến và

làm cho chúng man cam hon đối với cồn so với nòi kiểu dại Một biéu hiện

khác của tinh chịu cồn ở nấm men lại liên quan đến protein sốc nhiệt Người

ta đã chứng minh được rằng những nòi nam men có protein sốc nhiệt có ti lệ

sống sót đến 40% sau khi xử lí 36 giờ ở 24 % ( v/v ) độ cồn ; trong khi cũng

chính nồi này nhưng không có protein sốc nhiệt thi ti lệ sống sót là 0 %.

Đồng thời, các nồi có protein sốc nhiệt cũng có khả năng phục hồi sinh

trưởng nhanh hơn sau khi đã loại bỏ cồn Từ đó người ta cho rằng việc tách

dòng các gen kiêm soát việc sinh ra protein sốc nhiệt và đưa nó vào nam men

lz

có thé là một trong những cách làm tăng khả năng chống chịu cồn cho nấm

men [ 118, 131 ].

II.3 Tính trạng chịu nhiệt.

Nói chung, nấm men có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 27

-33° C.Tuy nhiên, người ta cũng đã phân lập được hàng loạt nòi nấm men có

khả năng mọc ở 45° C và có khả năng lên men ở 42 °C [ 50, 80, 85 ] Tinh

chịu nhiệt là khả năng của tế bào sinh trưởng được ở nhiệt độ cao ( 37° C hay

cao hơn ) Tất nhiên, nhân tố cơ bản xác định giới hạn nhiệt độ cho sự phat

triển của sinh vật chính là cấu trúc di truyền của nó; nhưng cho đến nay,

người ta van chưa biết đầy đủ về bản chất di truyền của tính chống chịu với

nhiệt độ cao Ghaughran da thống kê được hơn 25 giả thuyết đã được nêu radé giải thích về sự bền nhiệt hoặc khả năng moc ở nhiệt độ cao Nhưng theo

thời gian, chỉ còn bốn giã thuyết được chú ý hơn cả [ 36, 37,52]:

(i) Tại nhiệt độ cao, các lipit chứa axit béo no sẽ có điểm nóng chay cao

hơn axit béo không no Cho nên, tê bào mang nhiêu axit béo no sẽ có kha

năng bảo toàn được tỉnh nguyên vẹn của nó.

(ii) Sinh tông hợp nhanh những chất trao đổi thiết yếu dé thay thé các chất

trao đổi kém bền nhiệt.

( iii ) Sinh vật chịu nhiệt có chứa các đại phân tử (enzym, protein ) bền nhiệt.

(iv ) Sinh vật chịu nhiệt co chứa các cau trúc và các cơ quan tử có khả năng

duy tri được các hoạt động chức năng ở nhiệt độ cao.

việc phục hồi tông hợp protein thông thường ở thời ki phục hôi [91, 92, 112,

Gan đây, cũng đã có một gỗ dẫn liệu di truyền học cho thấy rằng khả

năng sông của nan men ở nhiệt độ cao ( 45 ” C ) là phụ thuộc hệ gen ti thé |

70, 85, 86 ]; đông thời cũng đã có những dân liệu chứng tỏ răng 6 nam men,

tính chịu nhiệt (42° C ) là do gen nhân kiểm soát [8, 79 ].

II.4 Tỉnh trang chịu mặn.

Cũng như các vi sinh vật khác, tế bào nấm men cũng có hệ thống bảo

vệ để thích nghỉ với tác động của môi trường có muối hằng nhiều nghiên

cứu khác nhau, người ta đã hiểu được rằng quá trình tích tụ của plycerol và

sự biến đổi của acetoin thành 2,3-butanediol trong tế bào nấm men chính là

do sự có mặt của muối đã ức chế việc sinh ra cồn trong suốt quá trinh lên

men [ 22,78 119 ] Một số tác giả khác thi thấy rằng , dé thích nghị với môitrường có muối thi các tế bào nam men đã tăng tong hợp các nhân tố bennhiệt Đồng thời, khi sống trong môi trường muối thì các tế bào già hơn bịmất các nhân tố bền nhiệt nhanh hơn so với các tế hao non, và việc bổ sung

glucoza sé làm tang nhanh quá trình tong hợp nhân tố bền nhiệt (75, 76,

111 ] Thêm nữa, người ta cũng đã biết được là khi song trong điều kiện có

nồng độ muối cao, tế bào nấm men đã tăng cường tong hợp va tích lũy

trehaloza để điều hoà áp suất thấm thấu bên trong tẾ baò; đồng thời tăngcường tổng hợp polysaccarit của vỏ tế bào dé cho vỏ tế bào trở nên bền chắc

hơn [ 109, 110 ].

Gan day, đã bat đầu có các dan liệu di truyên học về moi liên quan giữa

cau trúc ADN và sự biêu hiện của tính trạng chồng chịu mặn Masutani và

14

cộng sự [ 90 ] đã dùng tác nhân ethylmethanesulfonat (EMS) để gây đột

biến với các tế bào đơn bội và các tế bào lưỡng hội của nam men Ho đã thu

được những noi nam men đơn bội có kha năng phát triển trên môi trường có

chứa đến 10 % NaCl; và những noi nấm men lưỡng bội có khả năng mọc

trên môi trường có chữa đến 18 % NaCl Bên cạnh đó họ cũng thấy rằng khảnăng chịu muối tăng lên luôn luôn Eun cho kích thước của tẾ bào giám đi.

Phương pháp dung hợp !Ế bào trần cũng đã được sir dụng để tạo ra noi

nam men có khả năng chịu man đến 5 % NaCl | §7, 90 | Một SỐ nghiên cửu

khác thì cho thấy rằng gen HAL-{ kiểm soát tính chịu mặn của nấm men,

HAL-1 mã hoá cho một protein khoảng 32 KD liên quan trực tiếp đến tính

chịu man Gen HAL-! đã được tach dong dé giải trình tự, và gây dot hiến

nham tìm hiệu quan hệ giữa cau trúc của gen, câu trúc của protein do nó ma

hoa và tính chịu mặn của nam men [ 51———

.5.Tinh trạng đường hoá tỉnh bội.

Cho đến nay người ta đã biết có khoảng 90 loài nấm men ít nhiều có

kha năng đường hoá tinh bột Chúng thuộc 14 chỉ khác nhau Nhung chỉ có

một số loài thuộc các giống Endomycopsis, Lipomyces, Pichia va

Schwanniomyces là có hoạt tinh cao hơn ca Đã có hai loài là

saccharomvces diastaticus và Endomycopsis fibuligera được nghiền cứu kỹ

hơn cả [43, 84, 106 ].

Nam men có kha năng đường hoá tỉnh bột tiết ra ít nhất hai enzym

amylaza khác nhau: ơ-amylaza và glucoamylaza œ-amyla?za phần giải

không triệt đề tỉnh bột thành đường, còn glueoamylaza thì có thé phan giải

hoàn toàn tính bột thành glucoza Người tacũng đã tiên hành nghiên cứu

9 it} 2 a ` a ^ ta

anh hưởng cua nguồn cac hon va nguồn nito lên việc tạo ra enzym

amylaza và thay răng su tông hợp enzym này bị ức chê khi nam men sinh

LS

trưởng trên môi trường có chứa ethanol hoặc sulphatamon và cao nắm men

L43 45, 53 ].

Kế từ khi & diastaticus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1952,

người ta đã dành nhiều có gắng để xác định số lượng gen tham gia vào quá

trình phân giải tỉnh hội Gilliand đã phát hiện ra hai gen trội cần thiết cho

quá tinh đó: S1 mã hoá cho maltaza và S2 mã hoá cho amylaza Về sau,

Lindegren mô tả thêm hai gen nữa: DX kiểm soát VIỆC tông hợp enzymdextrinaza để thuy phân dextrin và glycogen, nhưng không thuy phân được

tinh bột và amylopectin; còn gen ST mã hoã cho amylaza đề thuỷ phan tinh

hột va amylopectin, nhưng không thuỷ phan dextrin hoặc glycogen Trong

hai gen nói trên (DX, ST ) thi chi một gen DX có kha năng kiểm soát việc

thuy phần đường maltoza một cách chậm chap Người ta đã xác định được là

hai gen DX va ST nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhan và phan ly độc lập

với nhau [ 44, 131 J.

Hon 20 năm sau, các nghiên cứu di truyền về hệ enzym glucoamylaza

lại được tiễn hành trổ lại một cách độc lập bởi hai nhóm khác nhau Nhómthứ nhất, Tamaki [ 122 ] đã chung minh được sự ton tại của 3 gen cần thiết để

lên men tỉnh bot: ST1, STA2 và STA3 Mỗi gen nằm trên một nhiễm sắc thể

khác nhau Nhóm thứ hai, Iirratt và Stewart [42 ] đã đặt tên cho các gen mã

hoá cho dextrinaza là: DEX1, DEX? và DEX3 Các nghiên cứu cho thấy

rang DEX3 alen với STA3, DBXI alen với STA2 còn DEX3 alen với STAT.

Cả ba gen STA đã được tách dòng và toàn bộ STAL đã được giải trình tự

nucleotit STAT đài 2753 nucleotit và chỉ có một khung đọc mở từ nueleotit

-9 đến nucleotit 2334 [ 44, 122, 131 |.

S diastaticus rat gần với S.cerevisiae về mat di truyền học Vì các tế

bào đơn hội của chúng có thê lai được với nhau Sự khác biệt căn ban lì S.

4 2 sk ` bi ` Be z

diastaticus có kha năng tiết ra glucoamylaza, còn Š cerevisiae thì không có

16

mm": 05 |brain

kha năng đó Do la vi S cerevisiae có mang gen INHI có vai trò ức chế

việc lạo ra glucoamylaza Như vậy có thể kí hiệu kiểu gen có kha năng tao

ra glucoamylaza ở S cerevisiae là sta INH, cồn kiểu gen đó của 8.

diastaticus là STA inh Cáo nghiên cứu về phân tích lai Southern cho thấy

rằng hệ gen của hai loài này chứa các đoạn ADN có độ tương đồng rất cao.

Còn phép phân tích bằng cách lập ban đồ điểm cắt của enzym giới hạn ở các

đoạn ADN tương đồng đó cho thấy là các gen glucoamylaza của s.

diastaticus có thé xuất hiện do tái tổ hợp giữa các đoạn ADN có san ở trong

hệ gen của S cerevisiae [ 131, 132 ].

Do khả năng tiết ra được glucoamylaza - loại enzym ma về mặt lý

thuyết có thé phân huy hoàn toàn tinh bột thành đường glucoza - cho nên

Š diastaticus đã được chú ý thích dang Người ta đã chon lọc được những

nòi tốt nhất về khả năng này, phối hợp chung voi nhau khi lên men, tối ưu

hoá điều kiện lên men và cũng đã tạo ra các nòi lai có mang các gen STA

khác nhau dùng để lên men con từ tình bột Tuy nhiên người ta cũng thấy

rằng, S diastaticus kém chịu cồn, lên men chậm và trên thực tế, ngay Ở

trong điều kiện lên men tối ưu cũng vẫn dé sót lạt hơn 20 % tinh bot không

lên men được Nhưng nếu tỉnh bot đã được xử lý bằng ơ-arnylaza thương

phẩm trước khi dùng để lên men thì S diastaticus có thể biến đổi 97% tỉnh

bột thành cồn Chính vì thế mà các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới

đã tiễn hành ghép gen o-amylaza từ các sinh vật khác nhau vào với gen STA

roi đưa vào Š cerevisiae Năm 1988, người ta đã thu được các thê biến nạp

của nam men S.eerevisiae có kha năng tiết ra cả glucoamylaza của nấm menvà a-amylaza của chuột Mét trong các thể biến nạp đó đã có khả năngchuyển hoá gần hết (93% ) gố tinh bột có trong môi trường thành đường chỉ

trong khoảng hai ngày [45, 74, 124 ].

17 IT F224

Người ta biết răng thành phần chủ yếu của vỏ tế bào nội nhũ của hạt

lúa mạch - nguyên liệu chủ yếu để làm bia - chứa đến 75 % ( 1-3,1-4

)-J-glucan Trong quá trình nay mầm cũng như trong quá trình ủ malt, enzym

B- glucanaza của hạt sẽ phân hủy - glucan của vo té bào nội nhũ dé sau

đó , các enzym phân hủy tinh bột, vaenzym phân hủy protein có thể thủy

phân tinh bột và các protein dự trữ của nội nhũ Nhưng, ƒ— glueanaza của

hạt hầu như bị bất hoạt trong qua trình ủ và nghiền malt Cho nên để lạt mot

lượng lớn B- glucan có trọng lượng phân tử cao trong dịch bia ; gây ra nhiều

khó khăn trong việc lọc dich bia trước khi lên men và lọc bia sau khi đã lên

men Để khắc phục khó khăn đó, trước đây người ta bo sung ché pham enzym

(1-3,1-4 )-B-glucanaza bền nhiệt tách ra từ các vi sinh vật khác ( vi dụ :

Bacillus subtilis, Aspergillus niger Trichoderma reesei ) vào trong qua trinh

nghién malt hay hổ sung vào giai đoạn cuối cùng của quá trinh lên men.

Nhưng gần đây, dé đạt mục đích đó, người ta đã tạo ra các phân tử ADN

tái tổ hợp từ các gen (1-3,1-4)-B-glucanaza của Bacillus aniyloliquefaciens va

Bacillus macerans rồi đưa vào nam men S.cerevisiae Các thé biến nạp của

nam men đã tiết ra (1-3,1-4)-(-glucanaza bền nhiệt: Sau khi 60 phút ở70° C, pH 6 thi enzym từ các vi khuan cha inechicdn ít hơn 5 % hoạt tinh

trong khí đó enzym lai tiết ra từ nấm men vẫn giữ được 90 2% hoạt tính

[96, 97, 98 ].

Một khía cạnh khác cũng can phải giải quyết là nghiên cứu ảnhhưởng của các gen khác đên sự biêu hiện của gen glucoamylaza Cho dénnay, chỉ mới thu được một số thông tin về van đề đó như sau [45].

- Gen CDX 1: Khi ở trạng thai đơn bội, gen này ức chế việc tiết enzym

glucoamylaza từ trong té bào ra môi trường nêu việc ức chê trao đôi cac bon

chưa được loại trừ Nêu gen CDX | bị hư hồng thi enzym glucoamylaza sẽ

được tong hợp một cách liên tục và được tiêt ra môi trường.

18

- Gen STA 10: Người ta biết răng gen này chỉ có mặt trong một số nòi chứ

không phải có mặt ở trong tat cả các nồi nấm men S cerevisiae Nó ức chế sur

biểu hiện của cả ba gen STA 1, STA 2, STA 3 Người ta đã chứng minh

được rằng khi có mat STA 10, thi enzym glueoamylaza không được tích lũy

ở bên trong tế bào Như vậy gen này không liên quan đến việc vận chuyền

glucoamylaza từ trong tế bào ra bên ngoài mà liên quan đến một vài giai đoạn

trước khi tiêt enzym.

- Gen MAT: Người ta đã biết được rằng hoạt tính glucoamylaza và kha năng

lên men tỉnh bột của cấc nòi nấm men đồng hợp tử về gen STAI hoặc STA 3

nhưng di hợp tử về locut MAT bi giảm đi rất nhiều Tuy nhiên, khả năng

tạo ra enzym glucoamylaza của những noi nấm men đồng hợp tử về cả hai

gen STA và MAT thi lại ngang bằng với ndi di hợp tử Điều đó chứng tổlính dị hợp tử về gen MAT đã ức chế việc tạo ra enzym glucoamylaza.

- Gen INH |: Người tacũng biết rang gen INH | ức chê sự biêu hiện của

các gen STA 1, STA 3 Gnam men Š cerevisiae Kiêu tác động của INI 1 có

⁄ ".ẻ - ⁄: a nã s

vẻ giong với kiêu tác động của STA 10, nhưng môi quan hệ giữa hai gen này

van chưa được xác định.

Những thong tin đó được tom tắt ở hang sau day [ 45 ]:

Rang 2 Các gen có anh hưởng đến sự biểu hiện của glucoamylaza.Œen Kiểu hình

CDXI Khi có mặtcủa CDXI glucoamylaza chí được tiết ra khi sự ức chế

(rao đổi cac bon bị loại trừ.

STAIO0_ Khi có matSTA10, glucoamylaza không biêu hiện được Van

chưa biết cơ chế tác động của nó.

MAT Tạng thai dị hợp tử của MAT ức chế việc tạo ra glueoamylaza.

chưa biết về cơ chế tác động của nó.

INHI Khicó mặt của INHI, hoạt tính của glucoamylaza bị ức chế Chua

bit về cơ chê tác động của nó.

19

H.6 Tĩnh trang chuyên hoá các loại đường,

a) Saccaroza

Phan ứng đầu tiên trong quá trình sử dụng đường saccaroza ở nấm

men là việc dùng enzym invettaza đề phân cất nó thành đường đơn.

Enzym invertaza được ma hoá bởi các gen trong hệ gen SUC Người ta đã

biết là có 6 gen không liên kết thuộc hệ nay; gen SUC 2 đã được giải trình tự:

Tế bào nam men chỉ cần một trong sáu gen là đã có khả năng lên men

đường sucroza Số gen SUC ở các nòi nấm men công nghiệp thì chưa được

biết rõ Nhưng các nòi khác nhau thì chứa số gen SUC khác nhan và gố bản

sao của mỗi gen có ở môi nồi cũng khác nhau Người ta đã xác định được vi

trí bản đồ của 4 gen và biết răng gen SUC6 alen với SUC 4 Đồng thời ,người ta cũng đã biết rằng hầu hết các nòi nấm men đều không mang đủ cả 6gen SUC Các nghiên cứu dùng gen SUC2 làm vật dò cho thấy rằng gen nàytương đồng với các alen SUC hoạt động chức năng khác Như vậy, cónghĩa là sự hiện diện của các alen SUC ở các vị trí khác nhau trong hệ gencủa nam men là do sự dời chỗ của gen này trong quá trình tiến hoá của các

noi và các loài khác nhau [ 34 35 54 111, 125 ].

b) Galactoza.

Galactoza cũng là một loại cơ chat của nam men S cerevisiae Nhung

việc sử dung nó lại bi cơ chê sử dụng glucoza ức chê, Người ta đã biết là có7 gen liên quan dén quá trình lên men galatoza Đó là GAL 1, 2,3, 4,7 10 và

GAL 80 Các gen GAL 3, 4, 80 là các gen điều hoà [ 40, 41 J.

©) Maltoza.

b2S©

Cho đến nay người ta đã biết có 5 gen liên quan đến việc sử dụng

maltoza: MAL1, 2, 3, 4 và MAL6 [ 47, 125 ] Cũng như đối với các gen

SUC, không có nồi nấm men nào lại mang đủ cd năm alen trong tế bào của

mình Mỗi tế bào chỉ can có một trong 5 gen nói trên là đã có khả năng lên

men maltoza Trong quá trình lên men dịch bia, người ta thấy rằng những

noi có mang nhiều bản sao của MAL2 hơn thì có tốc độ lên men nhanh

hơn Nghĩa là nó có hiệu qua liều lượng Dịch dùng để lên men bia chứa

nhieu loại đường: saccaroza, glucoza, fructoza, maltoza, maltottioza va

dextrin, Cac ndi nấm men bia điển hình thì có kha năng lên men lần lượt các

loại đường đó, nhưng không lên men được dextrin Do đó, những noi nam

men lưỡng bội dị hợp tử về các gen dextrinaza đã được tao ra bằng cách lai.Hiệu quả liều lượng của gen đã biển hiện 6 nòi nấm men mang gen DBXIhoặc DEX2, nhưng không biểu hiện ở noi mang gen dextrinaza BỊ 40,

116, 123 ].

Ill CÁC PHƯƠNG PHAP TẠO NÒI NẤM MEN MỚI.

IH.1 Lai.

[H.1.1 Nguyên lý chung.

Cũng như đối với bất kỳ sinh vật nào khác, việc lai nấm men được

thực hiện với nhiều mục đích khác nhau, Người ta tạo ra noi lai để sử dụng

vào san xuất trong trường hợp chúng kết hợp được những tính trạng quí

của cả hai nòi cha mẹ, hoặc khi nòi lai có biểu hiện ưu thế lai Trong nghiên

cứu, người tadùng đến lai khi cần xác định đặc điểm di truyền của một

tính trạng nào đó ( được qui định bởi gen nhân hay gen tê bào chât, phụ

thuộc vào một hay nhiều gen ) Người ta phân tích sự phân ly trong thế hệ

con theo những tính trang di truyền rõ tầng ( các dấu chuẩn di truyền ) dé

dựa theo đó mà giải cấu trúc của bộ máy di truyền của tế bào Lai và phan

tích lai chính là công cụ căn bản của nhà di truyền học Mặc dù di truyền

học hiện đại của nam men đã ra đời từ cuối những năm 70 nhưng nó không

loại trừ di truyền học kinh điển của đối tượng này ma ca hai loại phương

pháp được sử dụng phối hợp với nhau [ 4, 117, 141 J.

Việc kết hợp các tính chất của hai đạng cha mẹ vào một tế bào lai có thé

đạt được bằng hai cách Thứ nhất, tạo ra thé lai lưỡng hội, đa bội Thể lai nàyngay từ đầu đã biểu hiện tất ca các tính trạng trội của cả hai dạng cha me.Nấm men sinh trưởng theo lối nay chai là chú yếu, nên có thé duy trì lầu dai

trạng thái nói trên và sử dụng chúng vào sản xuất Thứ hai, việc kết hợp các

lính trạng của hai dạng cha mẹ có thể đạt được nhờ qua trình tai tổ hợp xảy

ra trong giam phân Hiện tượng tái tổ hợp xảy ra với tần số cao khi các gen

kiểm soat các tính trạng đó nam trên các nhiễm sac thể khác nhau [ 4 115,

tế bào thuộc hai dạng khác nhau cạnh nhau và theo déi cho đến khi chúng

kết liền lại với nhau Phương pháp ghép đôi trực tiếp này được Lindegren sử

dụng thành công lần đầu tiên vào năm 1935 [ 48 ] Sau đó nó không ngừng

được cai tiễn và sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Cho đến

nay, no van còn được sử dụng có hiệu qua dé lai các nồi nấm men &.

cerevisiae, S logos, S uvarum, S rosei và S rouxti [ 125, 141 J.

22F22

+ Lai bằng cách sử dụng các dấu chuẩn di truyền Day là phương pháp

được sử dung thường xuyên nhất Vì, nếu như phương pháp lai bằng mấy

vi thao tác thường chỉ áp dung dé lai các nòi nấm men đồng tân thì phương

pháp này có thể dùng để lai cả các nồi nấm men dj tan và những đối tượng

mà tế bào của chúng rất ít khi kết hợp với nhau Bằng phương pháp đánh dấu

di truyền, người ta đã tạo được thể lai ở một số loài nấm mà trước đó chưa

phát hiện được giai đoạn hữu tính [ 4 ].

Nội dung của phương pháp đánh dấu di truyền như sau: mỗi dang cha

mẹ được đánh dẫu bằng một đột biến nào đó Thí dụ, ở S cerevisiae, đạng

kiểu dai tao nên khuan lạc có mau trắng nhắn Vậy thì, một đạng cha mẹ

được đánh dấu bằng đột biến tạo ra khuẩn lạc mầu đó; còn dạng cha mẹ thứhai được đánh dấu bằng đột biến tao ra khuẩn lạc xù xì Sau khi trộn lẫn

chúng với nhau và nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, các khuẩn lạc có mầu

trắng „ nhẫn mọc lên chính là the lai, Trong trường hợp tần số xuất hiện thelai thấp ( vi du 1/100 000 ) thì can đánh dấu cha me bằng các đột biến

khuyết dưỡng ( dấu chuẩn hoá sinh ) để cho thé lai có thé tự động tách ra

khỏi khối các tế bào đem lai ở trên môi trường chọn lọc đặc biệt Nhờ vậy,

có thê thu được nòi lai ngay ca khi tan số xuat hiện của nó rat thâp [ 4 |.

Từ cuối những năm 1970, một số phương pháp mới đã được sử dụng

dé tạo ra các nòi nấm men mới Đó là kỹ thuật dung hợp tế bào trần , kỹ thuật

biến nạp và ADN tái tổ hợp Các kỹ thuật này tạo ra khả năng to lớn và

nhiều hứa hẹn do không bị ảnh hưởng bởi mức bội thể, khả năng sinh bào tử

và giới tinh của tế bào [115, 116, 117 ].

III.2.Dung hợp tế bào trần.

Bước đầu tiên trong kỹ thuật dung hợp tế bào trần là việc bóc đi toàn

bộ hay gan hoàn toàn vỏ tê bao nam men bang các enzvm phân giải ( được

23

chiét ra từ tuyên tiêu hoá của oc sên hay từ một số vi sinh vật) Tế bào trần

tn ` at ` Eg Ấ và x N ` k

được giữ gìn trong môi trường có ấp suât thám thâu cao, thường là 0,8 - !,2M

sorbitol Sau khi rửa sạch enzym phân giải, tê bao trần của hai nòi khác

nhau được trộn lẫn với nhau cùng với tác nhân dung hợp gồm

polyethylene glycol (PEG ) và ion canxi Hoạt động của PEG chưa được

biết rõ Tuy nhiên, người ta đã biêt là nó có tác dụng như một polycation tạo

ys > a 4 z z Aas > 24s ` z Ầ 2

nên quan tụ nhỏ của các nhóm tê bào trần Trong quá trinh này có thê xây ra

sự trao đôi lan nhau của vat liệu di truyền do vỏ té bào đã bị bóc đi Sau khi

me ban dau Bởi thê nên tương đôi khó khăn nêu muôn đưa một đặc tính

đơn lẻ từ thê cho vào thê nhận Nghia là, kỹ thuật này không đủ đặc hiệu đềcai biên di truyền các nòi nam men theo kiêu mà nhà chọn giông mong

muốn [ 112, 117, 126 |.

III.3 Hiến nạp và ADN tái tổ hợp.

Đây là kỹ thuật cho phép khắc phục được tính không đặc hiệu của các

kỹ thuật dung hợp tế bào trần và lai Và đây cũng chính là cách điều khiển sự

biến đối kiểu gen của một nòi nắm men the nhận bằng ảnh hưởng của một

phan tử ADN riêng biệt tách ra từ thể cho Phân tử ADN có thể được tách ra

từ các tế bào của một nòi nấm men khác, các loài khác, các giống khác, của

những ngành hoàn toàn không liên quan khác, thậm chí là các phân tứ

ADN được tong hợp theo con đường hoá học; hoặc là các phân từ ADN lai.

Các bước căn ban của quá trình biến nạp là: (1) Tach chiết ADN từ cácnguồn khác nhau; (2) Nồi các đoạn ADN thành một phân tử ADN có kha

năng hoạt động chức năng; (3) Dua phân tử ADN lai vào tế bào thể nhận

6) nam men, khi tiến hành biến nạp, trước hết tế hào thể nhận phải

được xử lý để trở thành té bào trần Sau đó, ủ chúng với ADN tai tổ hợp

cùng với PEG và ion canxi Tiếp theo là việc rửa sạch tế bào thể nhận và

đưa vào môi trường thạch thích hợp để tái tạo lại vỏ tế bào và chọn lọc các

thê biên nạp mong mu6n [ 117 ].

Tuy nhiên, có một gõ van dé cần phải quan tâm khi muốn ứng dụng

kỹ thuật biên nạp và ADN tai tô hợp đề cai tạo di truyền đôi với các nòi nam

` > Z Z x 2 a La xà “ hạ

men Thứ nhât, cần phải có các dau chuân đề có thé chon lọc được các thê

biên nạp Các gen trội - như các gen STA ở nam men S diastaticus - có thê

9 7

được sử dụng trong việc chọn lọc thé biên nạp có kha năng đường hoá tinh

bot Chính vi vậy ma gen STAI đã được tach dòng và biên nạp vào nam

kho 6n định Có 4 loại vector thường được su dụng trong biên nap nam men.

(1) YIp - plasmit xen : loại plasmit này không tự sao chép trong tế bào nam

` ` ^ =4 2 “ Bi # “ “ Pd `

men ma lại xen vào nhiễm sac thê của nó Vi thê, nó khá õn định.

(2) YRp - plasmit sao chép : loại plasmit này có mang đoạn khởi đầu sao chép

của nhiễm sắc thé, cho nên ồn định được trong tê bào là nhờ kha năng tự sao

3) YEp - plasmit loại episom : loại plasmit này có mang đoạn khởi đầu sao

Moin av mea tt 2 9 x - xã 6 ở 2 ow su `

chép của plasmit 2 um của nam men, cho nên cũng có khả năng ôn định

như loại plasmit YRp.

(4) YCp - plasmit cố tam động : loại plasmit nay có mang đoạn tam động va

cả đoạn khởi đầu sao chép Nhờ có tâm động mà plasmit này thường có một

hoặc hai bản sao trong một tế bào và phân ly giống như một nhiễm sắc thể

phụ Một biến thế của YCp là ahidm sắc thé nhân tạo của nắm men ( YAC )

nó có mang cả đoạn tâm động lẫn hai gen kết thúc ( telomer ) ở hai đầu dé

có thê sao chép như một nhiễm sắc thé ở dang thang, nhỏ [ 125, 129 ].

Thứ ba, cần phải đặt gen đang nghiên cứu dưới sự điều khiên của đoạn khởi

động thích hợp của nam men, đó là đoạn khởi động của gen aleohol

dehydogenaza I của nó Chẳng hạn, người ta biết rằng enzym ơ- amylaza Ở

trong tuyến nước bọt của chuột có khả năng thủy phân rat tốt các liên kếtœ- 1,4 glucosit ở trong các polysaccarit, vi dụ như tinh bột Cho nên yen ma

hoá cho œ- amylaza ở trong tuyến nước họt của chuột đã được tách dòng và

nối vào plasmit pMS12, ở phía cuối của đoạn khởi động của gen alcoholdehydrogenaza I của nam men (ở vị trí - 14 của gen ADC I ) Phân tử

ADN tái tổ hợp mdi được tạo ra được ding để biến nạp vào nòi nấm men cómang gen STA Vi thế, các thé biến nap thu được trong trường hợp này đã cothể tiết ra cả enzym glucoamylaza của nấm men lẫn enzym ơ- amylaza củachuột Một trong các thể biến nạp đó đã có thể biến đổi 92,8 % tinh bột cótrong môi trường thành đường khử chỉ trong 2 ngày [ 74, 95, 124 ] Cũng

bằng cách tương tự mà cả interferon bạch cầu của người lẫn kháng nguyênbề mặt của virus viêm gan B đã được tổng hợp ở trong té bào nấm men [ 24,

64 ].

Có thể nói, ngày nay kỹ thuật biến nạp và ADN tái tô hợp đang

được sử dụng một cách thường xuyên hàng ngày ở các phòng thí nghiệm

sinh học trên thế giới và nó đã góp phần đáng kế cả cho các nghiên cứu lý

thuyết lẫn cho việc tạo ra các nòi nam men hữu ích cho hoạt động sản xuất

của con người [ 67, 116, 117 ].

IV MỘT SỐ THÀNH TỰU VỆ TẠO GIỐNG NẮM MEN.

Một mặt, chúng ta biết rằng nguyên liệu chủ yếu của ngành sản xuất

nam men công nghiệp là rỉ đường củ cải và ri đường mia Nguồn hydrad

cac bon chủ yếu trong các nguyên liệu đó là saccaroza, mặc dù ri đường củ

cải có thể chứa đến 1,5 % raffinoza Chúng ta cũng biết rằng nhiều loại

đường khác nhau như : gaccaroza, ginocoza, fructoza, maltoza, maltotrioza co

mặt trong dịch lên men bia Mặt khác, trong tự nhiên, không có nòi nấm men

nào lại mang day đủ tất cả các gen SUC và các gen MAI trong hệ gen của

mình; thậm chí có ndi nấm men lại không lên men được một vài loại đường.

( ví dụ, nòi nấm men & cerevisiae dùng trong sản xuất cồn không có enzymmelibiaza để thuỷ phân raffinoza, mặc dù nó rất thích nghỉ với việc sinh

trưởng trong rỉ đường và lên men tốt các loại đường khác có trong rỉ đường,

còn nòi nấm men S earisbergensis thì có kha năng thủy phân đường

raffinoza ; hay nòi nấm men 220 sử dụng trong công trình này thì không có

kha năng lên men maltoza ) Ngược lại, những nồi nam men khác nhau có

thể có những tính trạng quí khác nhau Vi thế, các nhà nghiên cứu đã tim

cách để phối hợp các phẩm chất có giá trị ở các nồi nấm men khác nhau vào

mot nồi Chẳng hạn, người ta đã lai Š cerevisiae và Š carlsbergensis và thu

được noi lai có được những phẩm chất quí của cà hai ndi cha mẹ Nó sinh

trưởng tốt ở rỉ đường và tạo ra 7.43 % độ cồn, trong khi nồi & cerevisiaeban đầu chi tạo ra 6,88 % con Khi lai S globosus với S.carishergensis,

người ta đã thu được nồi nam men lai dùng để sản xuất bia ngọt VI, loàithứ nhất lên men được cả saccaroza và maltoza ; loài thứ hai không lên men

cả hai loại đường đó Trong số các thể tái tổ hợp, người ta đã thu được noi

nam men có kha năng lên men được maltoza nhưng không lên men được

saccaroza Chính đường saccaroza còn lại đó đã làm cho bia có độ ngọt [ 4,

135, 141 J Bang dung hợp té bào trần giữa nòi S uvarum và S.

diastaticus , người ta đã thu được cae noi lai có kha năng lên men dextrin va

tạo ra độ côn cao hơn, có sức chồng chịu tốt hơn với những ảnh hưởng âm

tinh của áp suất thâm thấu [ 126 ] Cũng với kỹ thuật đó, các tác gia khác đã

thu được noi lai giữa 8 cerevisiae và S.mellis có kha năng lên men được dung

dịch có nồng độ glucoza cao ( 49 % w/v ) và có khả năng chống chịu với ap

suat tham thau cao [81,82] Còn khi lai ndi nắm men S cerevisiae TIL ( lànoi nam men kết cum tốt, nhưng kem chịu cồn ) với noi S cerevisiae NI

( là nòi kết cụm kém, nhưng chịu côn tốt ), người ta đã thu được noi lai vừa

kết cụm tốt vừa có thể tạo ra đến 12,4 % (v/v )cồn [112] Các noi nam

men bia dùng trong công nghiệp thường là đa bội, thậm chí lệch bội Vì thế

ma chúng thường sinh bao tử kém, các nang được tạo ra thường chỉ có | hoặc

2 bào tử, và khả năng sống của các bào tử rất thấp Khi các sản phẩm dung

hợp được tao ra từ các noi nam men bia như thé thì lại thường có khả năngsinh bao tử tốt và tỉ lệ các nang chứa bốn bào tử khá cao Đặc điểm này tạo

điêu kiện thuận lợi cho việc phân tích di truyền các noi nam men bia [ 116 ].

Bằng kỹ thuật biến nạp và ADN tái tổ hop, người ta đã tạo ra được

những nòi nấm men tiết ra cả glucoamylaza của nam men và cả œ-atinylaza

của chuột dùng để lên men tỉnh bột với hiệu qua cao [ 74 ] Hay, người tabiết rằng enzym - glucanaza của hạt lua mạch hầu như bị bất hoạt tron g

quá trình ủ và nghiền Malt Cho nên, một lượng lớn - glucan có trọng

lượng phân tử cao sót lại trong dich bia ( không được thủy phân thành đường

); Vì thế mà gây ra nhiều khó khăn trong việc lọc dich bia trước khi lên menvà lọc bia sau khi đã lên men Trước đây người ta phải sử dụng chế phẩm

enzym (1-3,1-4 )-B-glucanaza bền nhiệt tach ra từ các vi sinh vật khác ( ví

dụ : Bacillus subtilis, Aspergillus niger Trichoderma reesei ) vào trong qua

trinh nghiền malt hay bổ sung vào giai đoạn cuối cùng của quá trinh lên menđể khắc phục khó khăn nói trên và để thu được sản phẩm có độ trong suốt

cao hơn Nhưng gần đây, người ta đã tạo ra được nòi nấm men có khả năng

tiết ra enzym (1-3,1-4 )-f glucanaza bền nhiệt Dé đạt mục dich đó, người

ta đã tạo ra các phân tử ADN tái tổ hợp từ các gen (1-3,1-4)-B-glucanaza

của Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus macerans roi dua vao nam men

Nghia la, người ta dùng phân ứng dây chuyền polymeraza đề nhân gen A

-đó chính là gen ( 1- 3, 1-4 ) - B-glucanaza của B amyloliqnefaciens - bằngcặp mồi thứ nhất ( mỗi số 1 và mồi số 2 ) và dé nhân gen B - đó là gen ( 1-3,

1-4) - B-glucanaza của B macerans - bằng cặp moi thứ hai ( moi gế 3 và mồi

số 4) Sau khi thu được sản phẩm của cả gen A lẫn gen Ð, người ta trộn lẫn

chúng với nhau, làm biến tính chúng và lại chạy phản ứng dây chuyền

polymeraza với các mỗi số 1 và mồi gố 4 Nhờ vậy, người ta đã thu được phan

tử ADN tái tổ hop Chúng được dùng dé biến nạp vào nam men Các thể

biến nạp thu được đã tiết ra (1-3,1-4) plucanaza ben nhiệt: Sau khi ủ 60

29

phút ở 70” C, pH 6 enzym từ các vi khuân cha mẹ chỉ cồn ít hơn 5 % hoạt

tinh trong khi đó enzym lai tiẾt ra từ nấm men vẫn giữ được 90 % hoạt

tinh [ 28, 29, 97, 98].

Trong những nam tới gố lượng và chủng loại các san phẩm từ nấm men

sẽ còn tăng lên nhanh chóng do việc sử dụng kỹ thuật di truyền để đưa các

gen xác định từ động vật, thực vật vào nam men và dùng nam men như

những “ nha may ti hon “ nhưng nắng suất ratcao, dé san xuất các hoạt chất

mà trước đây chỉ tách chiết được với số lượng ít di và rất khó khăn từ các bộ

phận của động vật, thực vật như các enzym, hormon Tóm lại, đúng như

tác gia Lê Dinh Lương đã viết: Nấm men chính là đỗi tướng quan trọngbậc nhất của công nghệ sinh học hiện dai [ 16 |.

30

Nhà máy Thực pham Da nang

Viện Công nghiệp thực pham Hà nội

Nhà may mi Chùa bộc, Hà nội

Nhà may mi Tương Mai, Hà nội

Xí nghiệp Vang Thang long, Hà nội

Đại học Tông hợp Leningrad, Liên xô

Men thương pham của Phap

Men thương pham của Anh

Men thương phâm của Hà lan

Đại học Tổng hợp Kasetsart, Thailand

31

LV Bánh men Lang Vân

HB Banh men Ha Bae

CỊ | Cơm tượun Cửa Thư

C2 Cơm rượu Cửa Lò '

C3 | Com tượu Hưng Ding SỐ

() | Qua Táo la

40 | Q2 | QuẢNa S

4l Q3 Quả Mơ i ¬

32

I.2 Hóa chất tinh khiết.

Môi trường đủ có pepton.

La môi trường đủ được bố sun g thêm [0g Pepton.

33

Môi trường lên men.

Là môi trường đủ được bo sung 10% (w/v ) đường.

Mai trường tối thiểu

Glucoza 20KEL, PO, 2

Dich chiét nam men 20 ml