MỤC TIÊU BÀI HỌC
Bài học trang bị cho sinh viên các kiến thức:
Cấu tạo của kính hiển vi, cách sử dụng và những điểm cần chú ý khi sử dụng kính hiển vi
Kiến thức về tế bào Eukaryote và Prokaryote
Thực hành quan sát tế bào hành lá, tế bào biểu bì lá lẻ bạn, tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis.
LÝ THUYẾT
1 Cấu tạo của kính hiển vi: Gồm có giá kính và hệ thống quang học a) Giá kính:
Bàn kính (bàn mang mẫu vật)
Các ốc điều chỉnh sơ cấp (ốc chỉnh thô)
Các ốc điều chỉnh vi cấp (ốc chỉnh tinh): để điều chỉnh rõ nét của vật b) Hệ thống quang học:
Tụ quang: để tập trung ánh sáng vào vật
Hệ thống đèn chiếu sáng hoặc gương phản quang
_Về mặt lý thuyết, kính hiển vi quang học cho phép nhìn thấy một vật có kích thước từ 0,2àm Thực tế, chỉ cú thể thấy vật cú độ lớn từ 0,3àm – 0,5um
_Các vật kính sử dụng trong kính hiển vi quang học có độ phóng đại x10, x20, x40, x60, x90, x100
_Thị kính thường có độ phóng đại x10 hoặc x15
_Vì vậy, độ phóng đại của kinh đƣợc tính nhƣ sau: Độ phóng đại kính = độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính
_ Sử dụng kính hiển vi để quan sát mẫu vật ở trạng thái sống
_ Độ rõ của vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có yếu tố nguồn sáng Nguồn sáng có thể là nguồn sáng tự nhiên (dùng gương phản xạ), hoặc nguồn sáng điện Trong trường hợp dùng gương phản xạ ta điều chỉnh gương để có nguồn sáng tốt
_ Đặt tiêu bản lên bàn kính, nâng bàn kính lên sát vật kính có độ phóng đại nhỏ (x10, x20), sau đó vừa nhìn qua thị kính, vừa điều chỉnh ốc sơ cấp, từ từ hạ vật kính xuống cho đến khi thấy mẫu vật trong tiêu bản Sau đó, chỉnh ốc thứ cấp để thấy rõ ảnh của vật
_ Khi đã xác định vị trí cần xem, đổi vật kính sang độ phóng đại lớn hơn
(x40 hoặc x60) Sau đó điều chỉnh ốc thứ cấp để nhìn thấy rõ ảnh của vật
Hình 1.1: Cấu tạo kính hiển vi quang học
3 Những điểm cần chú ý khi sử dụng kính hiển vi:
_Không đụng tay vào các thấu kính Khi thấu kính bẩn, lau nhệ bằng vải bông mềm, sạch, tránh làm xước thấu kính
_Bỏ tiêu bản ra khỏi kính hiển vi khi đã sử dụng xong Lau sạch đầu kính trên vật kính bằng xylen (lưu ý không sử dụng quá nhiều xylen để lau vì xylen độc hại và làm tan chất gắn vật kính)
_Bảo quản kính hiển vi ở trạng thái sạch và khô
_Không xoay các ốc điều chỉnh quá nhanh và mạnh
4 Tế bào Eukaryote và prokaryote: a) Tế bào Eukaryote: còn gọi là sinh vật nhân thực, sinh vật nhân điển hình hoặc sinh vật có nhân chính thức (danh pháp: Eukaryota hay Eukarya) là một sinh vật gồm các tế bào phức tạp, trong đó vật liệu di truyền đƣợc sắp đặt trong nhân có màng bao bọc Sinh vật nhân chuẩn gồm có động vật, thực vật và nấm - hầu hết chúng là sinh vật đa bảo - cũng nhƣ các nhóm đa dạng khác đƣợc gọi chung là nguyên sinh vật (đa số là sinh vật đơn bảo, bao gồm động vật nguyên sinh và thực vật nguyên sinh)
Hình 1.2: Cấu trúc tế bào động vật điển hình
9 b) Tế bào Prokaryote: hay sinh vật tiền nhân hoặc sinh vật nhân nguyên thủy (Prokaryote) là nhóm sinh vật mà tế bào không có màng nhân Tuy nhiên, trong tế bào của một số loài Planctomycetales, ADN đƣợc bao bọc bởi một màng đơn Đặc điểm chính để phân biệt với các sinh vật nhân chuẩn đƣợc các nhà sinh học phân tử sử dụng trình tự gene mã hóa cho rRNA.
THỰC HÀNH
1 Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ và thiết bị: a) Chuẩn bị
- Củ hành đỏ (Allium cepa) 1 củ
- Que cấy, kim mũi mác, đèn cồn 1 bộ
- Tiêu bản nhuộm nấm men S.cerevisiae, vi khuẩn Bacillus subtilis b) Ý nghĩa và vai trò của hóa chất
_Chất bảo quản mẫu: Glycerin có khả năng tạo ra môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn và nấm, do đó nó đƣợc sử dụng nhƣ một chất bảo quản mẫu trong các nghiên cứu vi sinh vật Glycerin có khả năng bảo quản mẫu trong thời gian dài mà không làm thay đổi tính chất của chúng
_ Chất phụ gia trong phân tích sinh hóa: Glycerin có tính chất hòa tan tốt trong nước và có thể được sử dụng như một chất phụ gia trong các phương pháp phân tích sinh hóa Nó có thể đƣợc sử dụng trong các phản ứng
10 enzymatic hoặc phương pháp phân tích khác để tăng độ nhớt, ổn định pH hoặc tăng hiệu suất phản ứng
_ Chất làm đệm: Glycerin có khả năng duy trì pH ổn định và có tính chất làm đệm Vì vậy, nó có thể đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần của các dung dịch đệm, giúp giữ cho pH của dung dịch ổn định trong quá trình thí nghiệm
_ Chất bảo quản trong mô học: Glycerin đƣợc sử dụng trong mô học để bảo quản và lưu trữ mẫu mô Khi mô được ngâm trong glycerin, nó giúp ngăn chặn quá trình hủy hoại mô, giữ cho mô đƣợc bảo quản tốt hơn và duy trì cấu trúc và tính chất của nó
_ Tạo độ nhớt: Glycerin có tính chất nhớt và có thể đƣợc sử dụng để điều chỉnh độ nhớt trong các dung dịch hoặc môi trường thí nghiệm Điều này có thể hữu ích trong các nghiên cứu về nhiễu loạn chuyển động và sự tương tác giữa các hạt nhỏ trong các hệ thống phức tạp
Tiến hành: a) Quan sát tế bào hành lá
Hình 1.3: Thao tác tạo tiêu bản
Bước 1: Cho một giọt glyxerine (hoặc nước cất) lên lame
Bước 2: Dùng đầu kim mũi mác lách nhẹ và bóc lấy một lớp mỏng biểu bì củ hành Đặt lớp biểu bì chìm trong một giọt glyxerine (hoặc nước cất)
Bước 3: Đậy lamelle, quan sát dưới kính hiển vi
Thao tác tạo tiêu bản:
_Dưới vật kính nhỏ, ta thấy những tế bào biểu bì có hình thoi dài, xếp liền nhau Dịch chuyển tiêu bản, chịn những điểm tỏa sáng và rõ nhất đeẻ quan sát ở vật kính lớn
_Vật kính lớn hơn ( x40 ) ta thấy:
_Vách tế bào: dưới kính hiển vi ta thấy một đường ngăn cách giữa hai tế bào cạnh nhau tạo thành
_Tế bào chất: nằm ở xung quanh nhân và sát màng tế bào
_Không bào: là những khoảng trống trong tế bào chất, rất khó nhận biết vì không bào thường chứa đầy dịch tế bào nên không phân biệt được ranh giới giữa tế bào và tế bào chất
12 b) Quan sát tế bào biểu bì lá lẻ bạn
Bước 1: Cho một giọt glycerine (hoặc nước cất) lên lame
Bước 2: Dùng đầu kim mũi mác lách nhẹ và bóc lấy một lớp mỏng biểu bì mặt dưới lá Đặt lớp biểu bì chìm trong một giọt glycerine (hoặc nước cất)
Bước 3: Đậy lamelle, quan sát dưới kính hiển vi
Kết quả: Thấy có vách ngăn giữa các tế bào rõ, không bào to, các hạt lục lạp và khí khổng của lá
Hình 1.5: Tế bào hành tím 10X
Hình 1.4: Tế bào hành tím 40X
Hình 1.6: Tế bào biểu bì lá lẻ bạn Hình 1.7: Tế bào biểu bì lá lẻ bạn
14 c) Quan sát tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
Bước 1: Nhỏ một giọt nước cất lên lame sạch
Bước 2: Sử dụng que cấy đã khử trùng lấy nấm men trong ống nghiệm cho vào giọt nước cất trên lame
Bước 3: Từ từ đậy lame, tránh tạo bọt khí và quan sát dưới kính hiển vi d) Quan sát tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis
Bước 1: Nhỏ một giọt nước cất lên lame sạch
Bước 2: Sử dụng que cấy đã khử trùng lấy vi khuẩn trong ống nghiệm cho vào giọt nước cất trên lame
Bước 3: Từ từ đậy lame, tránh tạo bọt khí và quan sát dưới kính hiển vi
MỘT SỐ THIẾT BỊ THÔNG DỤNG VÀ THAO TÁC CƠ BẢN TRONG THÍ NGHIỆM SINH HỌC TẾ BÀO PHÂN TỬ
LÍ THUYẾT
1 Một số dụng cụ thí nghiệm: a) Ống eppendorf: ống nghiệm bằng polyethylene pplypropylene, dùng để chứa những thể tích dung tích nhỏ
+ Có nhiều cỡ thể tích: 0.2m; 0,5ml; 1,5ml và 2ml,…
+ được khử trừng ở điều kiện thông thường *( 1atm,120 0 c, 20 phút)
+ Chịu dƣợc nhiệt độ thấp (-20 0 C) và dung môi hữu cơ nhƣ chloform,… + Để tránh sự thất thoát mẫu chứa, người ta sử dụng eppendorf có ngấn an toàn
16 b) Micropipette (pipetman):là dụng cự để thu nhận những thể tích nhỏ, cần đồ chính xác cao
_Đƣợc chia thành 4 cỡ tùy theo thể tích tối đa cần hút:
+Cỡ nhỏ: thể tớch tối đa 10àl - 20àl - 50àl
+Cỡ trung bỡnh: thể tớch tối đa 100àl - 200àl
+Cỡ rất lớn: thể tớch tối đa 5000àl (ớt sử dụng)
Lưu ý: Cần rất thận trọng khi hút các dung môi hữu cơ không để gần nguồn nhiệt (đèn cồn), không hấp khử trùng (trừ khi có chỉ định của hãng sản xuất), tuyệt đối không được điều chỉnh thể tích dưới ngưỡng tối thiểu và trên ngƣỡng tối đa cho phép
Hình 2.2: Cách sử dụng Eppendorf
17 c) Pipet: Dùng để đong, hút dung dịch có độ chính xác cao hơn Có rất nhiều loại pipet thủy tinh khác nhau nhƣ pipet Pasteur, pipet chia vạch thông thường,
_Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nghiêm cấm việc hút pipet bằng miệng, thay vào đó ta dùng quả bao cao su, quả bóp hút 3 van, hoặc dùng pipet hút tự động (pipet aid)
Hình 2.4: Một số loại pipet Hình 2.3: Cấu tạo và một số loại Micropipette
18 d) Burét: Dùng trong các thí nghiệm chuẩn độ để xác định nồng độ các chất
_Khi dùng cần lưu ý khóa cửa burét nên bôi vaselin để không bị rít
_Tuyệt đối khí khi chuẩn độ không để có bọt khí, nên cầm khóa burét bằng tay trái còn tay phải cầm lắc khi chuẩn độ
_Mắt nhìn thẳng burét khi đọc thể tích và burét phải đƣợc kẹpthẳng
Hình 2.5: Một số loại Burét
2 Một số thiết bị thông dụng: a) Máy lắc ổn nhiệt: dùng cho các phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng emzyme, lai…)
+Máy bao gồm một bể nước có nhiệt độ được điều chỉnh đi kèm với bộ phận lắc
Hình 2.6: Hình ảnh máy lắc ổn nhiệt b) Tủ hút khí độc (tủ cấy vô trùng): đƣợc sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vô trùng
+Tủ phải luôn đƣợc giữ sạch bề mặt thí nghiệm đƣợc khử trùng bằng cồn +Trước và sau sử dụng thanh trùng đều phải bật đèn tử ngoại ( đèn UV ) trong ít nhất 15 phút
20 c) Tủ lạnh: Là tủ mát (4 0 C) hoặc tủ lạnh sâu (-20 0 C ) dùng để giữ các sinh phẩm, hóa chất cần giữu ở nhiệt độ lạnh
Hình 2.7: Hình ảnh tủ hút khí độc (tủ cấy vô trùng)
21 d) Máy li tâm: dùng để thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch, có hai phương pháp ly tâm:
+ Ly tâm phân đoạn (ly tâm vùng): Phuong pháp này tách các phần tử
+ Ly tâm đẳng tỷ trọng: Đây là phương pháp phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng Phương pháp này cho hiệu quả phân tách rất cao, các phân đoạn đƣợc phân tách rất thuần khiết
3 K ết qu ả và thả o luậ n
_Qua từng thí nghiệm và tìm hiểu các phương pháp và các cách sử các thiết bị trong phòng thí nghiệm sinh học tế bào – phân tử chúng ta đã hiểu hơn và biết cách sử dụng và những lưu ý khi sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm
_Áp dụng những kiến thức đã đƣợc học và nắm bắt tốt kĩ thuật để áp dụng vào thực tiễn sau này
Hình 2.8: Hình ảnh tủ lạnh
Hình 2.9: Hình ảnh máy ly tâm
VẬN CHUYỂN NƯỚC QUA MÀNG
Bài học trang bị cho sinh viên các kiến thức:
Tính bán thấm của màng nguyên sinh, các kiến thức về dung dịch ƣu trương, nhược trương, đẳng trương
Quan sát và ghi nhận hiện tƣợng phản co nguyên sinh
Cách xác định nồng độ dung dịch dựa trên sự thay đổi kích thước mô
1 Đặc điểm màng bán thấm (màng thấm chọn lọc):
_ Màng bán thấm là 1 loại màn sinh học cho phép 1 số phân tử hay ion qua màng bởi cơ chế khuếch tán và đôi khi chuyên biệt bằng khuyếch tán có trợ lực
_ Tốc độ vận chuyển qua màng tùy thuộc vào áp suất, nồng độ và nhiệt độ của phân tử hay chất tan cũng nhƣ độ thấm của màn đối với mỗi chat tan
_ Tùy thuộc vào màn và chất tan, độ thấp có thể thay đổi theo kích cỡ, độ tan, tính chất hóa học của chất tan Tốc độ thấm và độ thấm của màng đƣợc xác định tùy vào cấu trúc của màng
2 Co nguyên sinh và phản co nguyên sinh:
_ Co nguyên sinh là một quá trình diễn ra trong tế bào thực vật, trong đó tế bào chất bị co rút lại và tách khỏi thành tế bào thông qua quá trình thẩm thấu
_ Quá trình ngƣợc lại là phản co nguyên sinh, xảy ra khi tế bào ở trong môi trường nhược trương, tức áp suất thẩm thấu của môi trường ngoài cao hơn bên trong tế bào và điều này khiến nước thấm từ ngoài vào trong tế bào
_ Thông qua việc quan sát sự co và phản co nguyên sinh thì có thể xác định được tính trương của môi trường tế bào cũng như mức độ dung môi thẩm thấu qua màng tế bào
_ Có hai dạng co nguyên sinh nếu xét theo bề mặt khoảng không giữa màng tế bào và vách tế bào, đó là co nguyên sinh lồi và co nguyên sinh lõm
Hình 3.1: Minh họa tế bào thực vật trong các môi trường ưu trương, đẳng trương và nhược trương
1 Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ và thiết bị: a) Hóa chất:
- CaCl2 các nồng độ 1 lọ (0,02M ; 0,08M ; 0,15M ; 0,3M)
2 Tiến hành: a) Thí nghiệm 1: Hiện tƣợng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh
Dùng kim mũi mác tách lấy một lớp tế bào biểu bì hành có màu đỏ đặt lên lame với 1 vài giọt nước, đậy lamelle
Xem kính ở bội giác nhỏ, tất cả tế bào có màu đỏ đồng đều Tại một phía của lamelle ta nhỏ giọt dung dịch KNO3 5% và phía đối diện đặt miếng giấy thấm để rút nước Quan sát hiện tượng, ghi nhận kết qủa và giải thích
Sau đó, tại một phía của lamelle, nhỏ vài giọt nước cất và phía đối diện đặt miếng giấy thấm để rút nước, lập lại vài lần, quan sát, ghi nhận hiện tƣợng và giải thích
Hình 3.2: Tế bào biểu bì hành có màu đỏ đặt lên lame với 1 vài giọt nước
Hình 3.3: Tế bào biểu bì hành với giọt dung dịch KNO 3 5%
Hình 3.4: Tế bào hành sau khi thấm dung dịch KNO 3 và thay bằng nước cất
Khi cho dung dịch KNO3 5% vào tiêu bản, môi trường bên ngoài trở lên ưu trương, nước thấm từ tế bảo ra ngoài làm tế bảo mất nước, chất nguyên sinh co lại, lúc này màng sinh chất tách khỏi thành tế bào gây ra hiện tƣợng co nguyên sinh ở tế bào biểu bì hành tím
Khi cho thêm nước cất vào tiêu bản, môi trường ngoài nhược trương làm nước lại thấm vào trong tế bào làm tế bào từ trạng thái co nguyên sinh trở lại trạng thái bình thường tạo nên phản co nguyên sinh
Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ dung dịch đẳng trương dựa trên sự biến đổi kích thước mô
Đổ các dung dịch CaCl2 có nồng độ khác nhau (0,02M; 0,08M; 0,15M; 0,3M) vào các dĩa petri có nắp đậy và ghi số để tránh nhầm lẫn
Cắt khoai tây thành các đoạn bằng nhau dài 3cm, rộng 1cm, dày 0,5cm Mỗi dung dịch ngâm 3 đoạn mẫu Ngâm trong 45 phút
Lấy các đoạn ra, đo lại kích thước Xác định nồng độ dung dịch đẳng trương
Bảng 3 1: Thí nghiệm xác định nồng độ dung dịch đẳng trương b) Thí nghiệm 3:
Cho 2 quả trứng vào cốc thủy tinh, cho thêm dung dịch acetic acid 5% vào cốc thủy tinh
Để qua 24h, vớt trứng ra cân khối lƣợng và ghi nhận lại
Cho 2 quả trứng vào 2 cốc thủy tinh Cho nước muối vào cốc thủy tinh 1, nước cất vào cốc thủy tinh 2
Sau 8h, cân trọng lƣợng trứng và ghi nhận
Trứng để trong môi trường hypertonic (ưu trương) sẽ bị mất nước và nhẹ hơn khối lượng ban đầu, trứng để trong môi trường hypotonic (nhược trương) sẽ nhận thêm nước và nặng hơn khối lượng ban đầu
Khối lƣợng trứng ban đầu
Khối lƣợng trứng sau ngâm acetic acid
Khối lƣợng trứng trong nước muối
Khối lƣợng trứng rong nước cất
Hình 3.7: Khối lượng trứng sau khi ngâm NaCl
Hình 3.8: Khối lượng trứng sau khi ngâm nước cất
Hình 3.6: Khối lượng trứng sau khi ngâm acetic acid
Hình 3.5: Khối lượng trứng ban đầu
THÀNH PHẦN HƯU CƠ CỦA TẾ BÀO EUKARYOTAE
Bài học trang bị cho sinh viên các kiến thức:
Các thành phần hữu cơ của tế bào Eukaryotae
Làm thí nghiệm và nhận biết các thành phần hưu cơ của tế bào
_Protid là đại phân tử cấu tạo gồm những monomere là các acid amin nối với nhau bằng liên kết peptid ( - CO - NH -) Protein trong tế bào hiện diện ở cả tế bào chất lẫn trong nhân liên kết với DNA
_Glucid là nhóm hợp chất hữu cơ phổ biến ở Động Thực vật và Vi sinh vật Glucid là thành phần cấu tạo nên tế bào của các sinh vật, tùy loài mà chúng chiếm những tỷ lệ khác nhau Dựa vào cấu tạo mà glucid đƣợc chia thành 2 loại chính:
_Glucid đơn giản: cấu tạo gồm một đơn vị đường đơn, được gọi là monosaccharid, gồm có glucose, fructose,
_Glucid phức tạp: gồm 2 loại
+Oligosaccharid: cấu tạo từ 2 phân tử đường đơn, nối với nhau bằng liên kết glucoside, gồm có lactose, maltose, saccharose, sucrose,
+Polysaccharid: cấu tạo từ (n) phân tử đường đơn, nối với nhau bằng liên kết glucoside, gồm có tinh bột, cellulose, pectin,
_Trong tế bào, lipid tồn tại ở các dạng khác nhau nhƣ triglycerid, phospholipid, glycolipid, steroid, cholesterol Mỗi dạng đóng vai trò khác nhau trong sự sống chung của tế bào
4 Nguyên lí a) Phản ứng Xanthoproteic:
Nguyên tắc: amino acid (nhân thơm) phức màu vàng phức màu da cam
Hiện tƣợng: khi đun dung dịch có màu vàng của dẫn xuất nitro
Trong môi trường kiềm, sản phẩm này chuyển thành muối có màu da cam đặc trƣng
Kết luận: Phản ứng xanthoproteic là phản ứng đặc trƣng để phát hiện acid amin nhân thơm b) Phản ứng Biuret:
Nguyên tắc: Protein phức màu xanh tím
Hiện tƣợng: dung dịch có màu xanh tím
Giải thích: Các phân đoạn protein có từ hai liên kết peptid trở lên trong môi trường kiềm đậm sẽ cùng với Cu++ tạo thành một phức hợp màu hồng tím Biuret – Cu
Phản ứng Biuret là phản ứng màu đặc trƣng để phát hiện liên kết peptide
Độ tím của phản ứng phụ thuộc vào độ dài của liên kết peptide và lƣợng muối CuSO4
Đối với đại phân tử Protid:
Lòng trắng trứng đã đánh, lọc qua giấy lọc
Đối với nhóm hợp chất hữu cơ Glucid:
Khoai tây, đậu xanh, giá, củ cải trắng
Ống bóp cao su 1 cái
Đậu phộng đã ngâm nước
Lớp mỏng mô ớt (xanh và đỏ)
Thí nghiệm 1: a) Phản ứng Xanthoproteic:
- Cho vào mỗi ống nghiệm 3ml dd albumin + 1ml acid HNO3 đđ
- Khi thấy xuất hiện tủa trắng, đun nhẹ cho đến khi tủa vàng và cuối cùng hòa tan
- Để nguội, thêm 3 giọt NH 4 OH, xuất hiện màu vàng cam
Giải thích hiện tƣợng: khi đun dung dịch có màu vàng của dẫn xuất nitro Trong môi trường kiềm, sản phẩm này chuyển thành muối có màu da cam đặc trưng b) Phản ứng Biuret:
- Cắt một lát mỏng đậu trắng đặt lên lame, nhỏ 2 giọt CuSO 4 5%
- Sau 30 phút, thấm hết CuSO4 5%, rửa mẫu với nước cất
- Dùng giấy thấm thấm hết nước, nhỏ lên mẫu 2 giọt NaOH 30%
- Quan sát màu xuất hiện trên lát cắt
-Hiện tƣợng: Lát mỏng đậu trắng chuyển thành màu xanh tím
-Giải thích hiện tƣợng: Do tạo ra Cu(OH) 2 theo PTHH:
2NaOH + CuSO 4 → Na 2 SO4 + Cu(OH) 2
Phản ứng giữa Cu(OH) 2 với các nhóm peptit -CO-NH- tạo ra sản phẩm màu xanh tím
- Dùng kim mũi giáo cạo nhẹ một lát khoai tây để vào giọt nước trên lame
- Dùng giấy thấm hút bớt nước, nhỏ 1-2 giọt dd Lugol lên mẫu, đậy lamel rồi quan sát dưới kính hiển vi x10, x40
-Hiện tượng: Mẫu khoai tây chuyển sang màu xanh dương
- Giải thích hiện tƣợng: Tinh bột khi kết hợp với Iod có trong thuốc thử Lugol sẽ tạo màu xanh dương b) Đường khử:
- Thực hiện 3 loạt ống nghiệm sau :
Ống 1: 2ml thuốc thử Fehling + 2ml nước cất
Ống 2: 2ml thuốc thử Fehling + 2ml dịch lọc giá ( giã 10 cọng giá + 10 ml nước lọc)
Ống 3: 2ml thuốc thử Fehling + 2ml dịch lọc hạt đậu xanh ( giã 10 hạt đậu xanh đã ngâm nước 1 giờ + 10 ml nước lọc)
- Đặt 3 ống nghiệm vào becher có nước sôi trong 5-10 phút
- Quan sát hiện tƣợng từng ống nghiệm
Hình 4.3: Quan sát tinh bột bằng kính hiển vi 40X Hình 4.4: Quan sát tinh bột bằng kính hiển vi 10X
Hình 4 5: Hình ảnh tinh bột vẽ tay
Hình 4.7: Hình ảnh sau thí nghiệm Hình 4.6: Hình ảnh trước thí nghiệm
-Hiện tƣợng: Ống 1: Không xuất hiện hiện tƣợng Ống 2: Xuất hiện kết tủa màu vàng đậm Ống 3: Xuất hiện kết tủa vàng nhạt
-Giải thích hiện tƣợng: Ống 1: Chứa nước cất nên không phản ứng với Fehling Ống 2: Chứa giá đã được giã với 10ml nước và lọc qua sau khi đun nóng đã phản ứng với Fehling do giá chính là hạt bước sang giai đoạn nẩy mầm, glucid dự trữ ở dạng tinh bột của hạt sẽ được thủy phân thành đường đơn
(monosaccharid) để cung cấp cho hoạt động biến dưỡng Các đường đơn này ( mang gốc C=0) có tính khử, khi tiếp xúc với thuốc thử Fehling ở nhiệt độ cao sẽ khử Cu++ thành Cu+ tạo màu vàng đậm ( CuOH) Ống 3: Chứa hạt đậu xanh đã được giã với 10ml nước và lọc qua sau khi đun nóng thì phản ứng với Fehling Do hat đậu xanh vẫn chuẩn bị bước vào gian đoạn nẩy mầm giống với giá ở ống 2 nên lượng đường đơn được thủy phân còn thấp khi tiếp xúc với thuốc thử Fehling ở nhiệt độ cao sẽ xuất hiện màu vàng nhạt c) Cellulose:
- Dùng kim mũi giáo cắt một lát mỏng củ cải trắng, đặt lên lame, nhỏ 1 giọt dd Lugol lên mẫu
- Dùng giấy thấm thấm hết Lugol, đậy lamel lên mẫu Sau đó nhỏ từ mép lamel H2SO4 75% để thấm dần vào mẫu củ cải (10 phút)
- Quan sát dưới kính hiển vi 10x, 40x và vẽ hình vách tế bào củ cải trắng
-Hiện tƣợng: Chỉ nhỏ Lugol thì không có hiện tƣợng, sau khi bổ sung H2SO4
75% thì vách tế bào củ cải trắng chuyển sang màu xanh dương
-Giải thích: Vách tế bào củ cải trắng đƣợc cấu tạo từ cellulose bản chất là không tạo màu đƣợc với Iod nhƣng khi ta cho thêm H2SO4 vào thành tế bào nhỏ hơn được gọi là hydrocellulose tạo thành màu xanh dương với Iod có trong thuốc thử Lugol
Cắt 1 lát mỏng đậu phộng đã tẩm nước, đặt lên giọt Soudan III trên lame
15 phút sau dùng giấy thấm thấm hết Soudan, rửa lại với rƣợu 20%
Dùng giấy thấm thấm hết rƣợu, nhỏ 1 giọt glycerin lên mẫu, đặt lamel lên, quan sát dưới kính hiển vi
- Hiện tƣợng: Soudan III bao bọc xung quanh các giọt dầu đậu phộng làm cho nó có màu đỏ
Hình 4.9: Ảnh chụp tế bào củ cải trắng sau khi có thuốc thử
Lugol và bị phân hủy bởi H2SO4 10X
Hình 4.8: Ảnh chụp tế bào củ cải trắng sau khi có thuốc thử Lugol và bị phân hủy bởi H2SO4 40X
Hình 4.10: Ảnh vẽ tay vách tế bào củ cải trắng
- Giải thích hiện tƣợng: Soudan III là chất không phân cực nên nó có thể làm nhũ tương hóa dầu đậu phộng thành các giọt nhỏ li ti
- Nhận xét vị trí các giọt dầu trong tế bào đậu phộng: ta thấy chúng phân bố không đồng đều
Dùng kim mũi giáo tách một lớp mỏng mô ớt (xanh và đỏ) đặt lên lame, nhỏ một giọt nước cất lên mẫu, đậy lamel, quan sát dưới kính hiển vi x10, x40 Vẽ hình tế bào ớt với các sắc tố (xanh, đỏ)
Hình 4.11: Các giọt dầu trong tế bào đậu phộng
Hình 4.12:Mô ớt xanh dưới kính hiển vi 10X Hình 4.13: Mô ớt xanh dưới kính hiển vi 40X
-Giải thích: Ớt có màu xanh nhờ chứa nhiều sắc tố chlorophyll
Hình 4.14: Hình vẽ tay mô ớt xanh
Hình 4.14: Mô ớt đỏ dưới kính hiển vi 10X Hình 4 15: Mô ớt đỏ dưới kính hiển vi 40X
Hình 4.16: Hình vẽ tay mô ớt đỏ
-Giải thích: Ớt có màu đỏ nhờ chứa nhiều sắc tố anthocyanin
Phản ứng xanthoproteic là phản ứng đặc trƣng để phát hiện acid amin nhân thơm Đây là một thử nghiệm định tính để xác định sự định tính của Protein
Phản ứng Biuret là phản ứng màu đặc trƣng để phát hiện liên kết peptide
Độ tím của phản ứng phụ thuộc vào độ dài của liên kết peptide và lƣợng muối CuSO4
Nhận biết sự có mặt của Glucid
Trong hạt đậu chứa rất nhiều Lipit
2 loại sắc tố trong mô ớt xanh và đỏ lần lƣợt là: chlorophyll, anthocyanin
HÔ HẤP – QUANG HỢP
- Xác định tính chất và phân tích thành phần sắc tố lá cây bằng phương pháp sắc ký giấy
- Xác định cường độ quang hợp qua lượng oxi thoát ra do quang hợp
- Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như ánh sáng, nồng độ CO2 đến khả năng quang hợp
Thực vật xanh có khả năng quang tự dƣỡng đó là khả năng sử dụng năng lƣợng ánh sáng mặt trời và các chất vô cơ đơn giản là CO2 và nước để tạo ra những chất hữu cơ giàu năng lƣợng, cơ chế này gọi là sự quang hợp Khả năng quang hợp tùy thuộc vào sự có mặt của hệ sắc tố đặc biệt – diệp lục tố chứa trong lục lạp có cấu trúc tinh vi để thực hiện chức năng quang hợp Phản ứng tổng quát của quang hợp
Hô hấp là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ tạo các sản phẩm đơn giản hơn tạo ra năng lƣợng cho hoạt động sống của tế bào và cơ thể Quá trình phân hủy háo khí các chất hữu cơ kèm theo tổng hợp ATP đƣợc gọi là hô hấp tế bào Trong quá trình hô hấp tế bào có sự khử hidro các chất hữu cơ nhờ enzym dehyrogenase
Diệp lục tố Iệp iệp lục Ánh sáng
Các enzym này có coenzym là NAD hoặc FAD nhận hidro và trở thành chất khử NADH2, FADH2 Trong điều kiện háo khí các coenzym khử sẽ đƣợc oxy hóa trở lại do oxy của không khí qua chuỗi chuyển điện tử hô hấp Để chứng minh các phản ứng oxi hóa khử này phải dùng những chất có đặc tính đổi màu khi chuyển từ oxi hóa sang trạng thái khử hoặc ngƣợc lại nhƣ dùng phẩm xanh diệp lục tố metilen, có thể thay oxi làm chất nhận hidro Sự mất màu của xanh metilen khi tiếp xúc mô chứng minh sự hoạt động của dehyrogenase có trong mô
H2O2 đƣợc nhanh chóng phân giải bởi enzym catalase:
Catalase là 1 enzyme rất phổ biến, đƣợc tìm thấy trong hầu hết các cơ thể sống có tiếp xúc với oxy (các loại rau cải, trái cây hay động vật) Enzyme này xúc tác cho quá trình phân hủy hydrogen peroxide thành nước và khí oxy Nó là 1 enzyme rất quan trọng giúp tế bào tránh khỏi sự oxy hóa bởi các gốc oxy hóa tự do (Reactive oxygen species)
Hô hấp ở sinh vật có thể chia thành 3 dạng chính sau:
Trong hô hấp hiếu khí cần có oxy, các chất dinh dƣỡng đƣợc phân hủy hoàn toàn thành CO2 và H2O, một trong những con đường chung của hô hấp là phân hủy đường glucose theo phương trình tổng quát như sau: C6H12O6 + 6O2 + 6H2O 6CO2 + 12 H2O + năng lƣợng (36 hoặc 38 ATP)
Hô hấp yếm khí thường gặp có ở những loài vi khuẩn, một số loài vi khuẩn thì oxy là chất độc và chỉ sống đƣợc trong điều kiện kỵ khí (vi khuẩn kỵ khí bắt buộc) nhờ quá trình hô hấp yếm khí
Lên men xảy ra khi không có oxy hoặc không cung cấp đầy đủ oxy thì tế bào chỉ phân giải một phần của phân tử glucose đến acid pyruvic thì có sự chuyển hóa yếm khí acid pyruvic thành nhiều chất khác nhau nhƣ acid lactic, rƣợu etanol
1 Thí nghiệm 1: Sự cần thiết của ánh sáng trong quang hợp a Dụng cụ hóa chất:
Chậu nước có cây thủy sinh 1 cái
Chậu nước có pha vài giọt phenol đỏ 1 chậu
Giấy bạc bọc ống nghiệm 1 miếng
Giấy bạc bọc kín miệng ống nghiệm 2 miếng
Ống nghiệm 2 cái b Phương pháp thực hiện:
Lấy 2 nhánh cây thuỷ sinh có kích thước bằng nhau Đặt mỗi nhánh vào một ống nghiệm đã chứa nước cũng có thể tích nước bằng nhau Một ống nghiệm đƣợc phủ kín bằng giấy kim loại chắn sáng và cho vào mỗi ống 5 giọt phenol đỏ (mỗi lần nhỏ một giọt vào phải đợi dung dịch chuyển sang màu vàng rồi nhỏ tiếp) Đậy nhẹ nắp lên mỗi ống Đặt cả 2 ống nghiệm trên dưới ánh sáng trắng Quan sát sự thay đổi màu của ống nghiệm không bị che tối Khi màu bị thay đổi hoàn toàn thì lấy miếng giấy kim loại chắn sáng ở ống nghiệm kia ra và so sánh màu ở cả hai ống với nhau
- Hiện tƣợng: phenol red chuyển sang màu vàng trong thí nghiệm
- Giải thích hiện tượng: Vì trong môi trường có CO2, phenol red sẽ chuyển từ màu đỏ sang màu vàng do CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường
2 Thí nghiệm 2: Tách sắc tố bằng phương pháp sắc ký trên giấy a Dụng cụ hóa chất:
Bồn sắc ký có sẵn dung môi (9 ete dầu hỏa: 1 aceton) 1 cái
Giấy sắc ký (12 x 3 cm) 2 miếng
Hình 5 1: Ảnh 2 ống nghiệm cây thủy sinh Hình 5 2: Ảnh 2 ổng nghiệm cây thủy sinh dưới ánh sáng trắng
Ống đong loại 25 ml 1 cái
Phễu thủy tinh 1 cái b Phương pháp thực hiện:
Giã 3 g lá sạch trong một cối sạch và khô cùng với 5 ml cồn, nghiền kỹ và cho tiếp 20 ml aceton rồi nghiền tiếp, để ít phút cho bã lắng xuống rồi lọc qua giấy lọc xếp, dịch lọc hứng ở ống nghiệm sạch và khô Đậy nút kín và quan sát màu của dung dịch dưới ánh sáng truyền suốt và ánh sáng phản xạ
Cắt một mẩu giấy sắc ký 12 x 3 cm, dùng bút chì kẻ nhẹ một đường thẳng theo chiều rộng cách đầu giấy sắc ký 1 cm Dùng ống mao quản chấm sắc tố theo vạch chì từ bên này sang bên kia của tờ giấy sắc ký Sau mỗi lần chấm làm khô bằng máy sấy (mát) hoặc bằng quạt máy, mỗi lần chấm với đường kính vệt chấm < 3 mm rồi mới chấm tiếp Sau khi đã chấm hết dọc theo tờ giấy sắc ký, dùng kim chỉ cột lại và cho vào bình chạy sắc ký đã có sẵn dung môi 9 ether dầu hỏa : 1 aceton Đậy kín bình khoảng 15 – 20 phút (vệt chạy sắc ký cách đầu mép trên của giấy sắc ký khoảng 1 – 1,5 cm) sau đó mang giấy sắc ký ra sấy khô, sắc tố sẽ đƣợc tách riêng ra từng loại nhƣ sau:
Diệp lục tố a (chlorophyll a) có màu xanh đậm
Diệp lục tố b (chlorophyll b) có màu xanh nhạt
Caroten, xantophyll có màu vàng
Vị trí của các sắc tố trên giấy đƣợc biểu thị bằng trị số Rf
Giải thích hiện tƣợng: Do sự khác nhau về độ phân cực giữa các sắc tố và dung môi sắc ký
3 Thí nghiệm 3: Xác định cường độ quang hợp của cây a Dụng cụ hóa chất:
Chậu nước có cây thủy sinh 1 cái
NaHCO3 1,5% 1 chai b Phương pháp thực hiện: Để ngƣợc một nhánh rong đã đƣợc cắt ngang thân cho vào ống nghiệm và đổ đầy nước sao cho mặt nước cách phần trên cùng của cành rong từ 3- 4 cm Đặt 2 ngọn đèn điện 100W cách cành lá rong chừng 15 cm Đếm số bọt khí thoát ra mặt cắt của cành rong trong 10 phút Tính cường độ quang hợp qua công thức
Tính cường độ quang hợp = Số bọt khí thoát ra/ thời gian thực hiện:
Hình 5 4: Dịch lọc 3g lá sạch + 5ml cồn + 20ml aceton Hình 5 3: Kết quả sắc kí
Cường độ quang hợp = 10/10 4 Thí nghiệm 4: Enzym trong quá trình hô hấp a Dụng cụ hóa chất:
Cốc loại 250 ml đựng nước ấm 1 cốc
Khoai tây 10 g Đũa thủy tinh 1 cái Ống nghiệm 2 cái
Cho vào ống nghiệm những miếng củ cải mỏng 3 - 4 mm thêm vào dung dịch xanh metilen 0,005 % ngập quá những lát củ cải ngập khoảng 1 cm Đổ thêm lớp dầu 4 – 5 mm lên trên mặt chất lỏng Đặt ống nghiệm trong nước ấm 35 – 40oC trong 30 phút
Hiện tƣợng:Dung dịch xanh metilen ở gần vùng miếng củ cải trắng có hiện tƣợng nhạt màu hơn so với những vùng khác Miếng củ cải trắng đƣợc nhuộm thành màu xanh dương
Hiện tƣợng:Dung dịch xanh metilen ở gần Dehydrogenase
Giải thích:Acetyl-CoA là eym dùng trong
Giải thích hiện tƣợng: do enzyme Dehydrogenase trong củ cải tạo ra sản phẩm Acetyl-CoA trong quá trình hô hấp tế bào Sản phẩm này sinh ra H+ khi tiếp xúc với dd xanh metilen sẽ khiến cho màu xanh của nó nhạt màu dần
Hình 5.5: Thí nghiệm định tính enzyme Dehydrogenase
Nghiền 10 g khoai tây trong cối Thêm 10 ml nước, dùng chày nghiền nát, nước lọc cho vào trong ống nghiệm sạch Lấy 0,5 ml dịch này vào 2 ml H 2 O2 1%
Hiện tƣợng: Dung dịch trong ống nghiệm sủi bọt
