Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm.... Khảo sát hiệu lực gây chết của
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
Thu thập nguồn rệp sáp từ các vườn chuối tại Dầu Tiếng và vườn na thuộc thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương Việc xác định loài rệp sáp hại cây ăn quả được dựa vào tài liệu của tác giả Nguyễn Viết Tùng "Giáo trình Côn trùng đại cương."
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2006).
2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm:
Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấm kí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu tằm bị nấm kí sinh tấn công tại vườn dâu huyện
Bảo Lâm , tỉnh Lâm Đồng.
Hình 2.2.2 Vị trí lấy mấu nấm kí sinh
Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùngBeauveria sp sau khi phân lập và làm thuần sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học.
Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học,
Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương.
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG
- Mẫu nấm kí sinh côn trùngBeauveriasp đã được phân lập.
- Đối tượng thử nghiệm: rệp sáp (Planococcus citri)
- Hóa chất: cồn 70 0 , cồn 96 0 , D-Glucose, NaCl, dung dịch, pepton, cao nấm men,
- Các nguyên liệu để phun dịch chiết nấm: nước, bình phun 1 lít,
- Môi trường: Potato Dextrose Agar (PDA), SDAY, SDAY1,
- Các thiết bị và dụng cụ: tủ cấy vô trùng, đĩa petri, kính hiển vi huỳnh quang, ống nghiệm, que cấy, nồi hấp, tủ lạnh, tủ đông, cân điện tử, hộp nuôi rệp sáp,chai trung tính Schott, bình tam giác,…
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chính:
- Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp như thống kê, so sánh, khảo sát, quan sát,
- Giữ nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp đã được định danh hình thái và
- Khảo sát các loại môi trường để chọn ra môi trường tối ưu nhất nuôi cấy chủng nấmBeauveriasp kí sinh côn trùng
- Tiến hành thu mẫu rệp sáp tại các vườn cây ăn trái trong khu vực Tỉnh
2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm:
Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)
Hóa chất: Nacl, đường Glucose, cồn 96, cồn 70, , pepton, cao nấm men.
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
−Chủng nấm Beauveriasp đã phân lập & giữ chủng
−Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của chủng nấmBeauveriasp.
−Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử.
−Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Beauveriasp.
−Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng
−Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng Beauveriasp.
−Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí nghiệm.
−Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Isaria fumosorosea
Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí nghiệm.
−Khảo sát hiệu lực gây chết của 2 dịch chiết chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 Và Beauveria spp ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sápPlanococcus citri trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.4.2 Nhân nuôi nguồn rệp sáp
Thu nhập mẫu như: rau, cây ăn trái,…có dấu hiệu bị rệp sápPlanococcus citri đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa công nghệ sinh hoc, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hành nhân nuôi bằng cách thả cho rệp kí sinh trên trái bí đỏ bỏ vào các hộp nhựa có đục lỗ Rệp sẽ bám vào vỏ ngoài của trái bí đỏ , rệp sẽ trải qua các vòng đời và bắt đầu sinh sản, trong quá trình nhân nuôi rệp cần theo dõi vệ sinh hộp đựng và hại cây ăn quả được dựa vào tài liệu Cục Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
2.4.3 Phương pháp định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử.
⮚ Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm kí sinh côn trùngBeauveriasp.
−Quan sát nấm trên vật chủ
−Cấu trúc sinh bào tử
−Khuẩn lạc trên môi trường PDA.
DNA của nấm kí sinh côn trùng được tách chiết theo hướng dẫn của bộ KIT:
GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit.
Sử dụng các đoạn mồi như sau để khuếch đại vùng ITS1- ITS4:
( http://www.fungalbarcoding.org/DefaultInfo.aspx?Page=Primers)
Hình 2.4.2 Hình ảnh nhân nuôi lấy rệp sápPlanococcus citritừ chuối.
Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tớch phản ứng là 25àl với cỏc thành phần: 12 àl Master mix, 2àl DNA, 1,2àl mồi xuụi, 1,2àl mồi ngược và
8,6àl nước cất Cho vào mỏy PCR và chỉnh thời gian, nhiệt độ theo chu kỡ như hình 2.4.3 sau:
⮚ Điện di gel chứa sản phẩm PCR.
Sản phẩm DNA của nấm kí sinh côn trùng sau khuếch đại bằng phản ứng PCR được đem phân tích thông qua phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
− Chạy điện di trên gel agarose: đặt khuân gel vào bể điện di TAE buffer 1X cho ngập giếng, load vào mỗi giếng 6àl DNA đó được trộn với 1àl loading buffer.
Load 6àl thang chuẩn vào giếng cũn lại Bật nguồn điện cho thiết bị chạy ở 70V trong 40 phút Sau đó tắt nguồn điện, lấy khuân gel ra khỏi thiết bị điện di và chụp hình gel.
−Chụp hình gel đã chạy điện di.
⮚ Giải trình tự DNA và xây dựng cây phát sinh loài
- Sử dụng chương trình BLAST và CLUSTAL để so sánh trình tự DNA của nấm với trình tự các đoạn DNA của bộ gen của các loài nấm có trong ngân hàng gen (NCBI) và vẽ cây phả hệ để định danh vi nấm Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X.
- Tiến hành giữ chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveriasp và quan sát các đặc điểm hình thái của chủng nấm
- Phương pháp dựng cây bằng phương pháp: Neighbor-Joining, Maximum
- Trộn 8g D-glucose + 100ml nước cất
- Chia đều vào các bình serrum nhỏ
- Bảo quản ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng
- Các bước giữ giống chủng nấmBeauveriasp.
Nấm kí sinh côn trùng được cấy trên môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả
Quan sát hình thái của nấm sau khi cấy từ 3- 15 ngày, ghi chép lại các đặc điểm của nấm như: hình dáng, kích thước (đường kính, chiều dày), dạng mặt
(nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm,…), màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới,…
Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau:
⮚ Quan sát trên kính hiển vi :
Thực hiện: chuẩn bị kính lam sạch, trong đã sấy khô, cắt giấy lọc thành khung vuông 2x2cm, độ dày của khung là 0.3cm Đặt khung giấy lọc vào giữa lam kính, bơm PDA lỏng (khoảng 10µl) vào giữa khung giấy Tiếp đó, cấy nấm vào giữa môi trường đã được bơm (cấy đơn bào tử hoặc cấy đầu sợi nấm) Đậy lam kính lên và đặt lên thanh chữ U trong hộp giữ ẩm (có thể sử dụng đĩa petri có chứa bông gòn ẩm phía dưới và thanh chữ U bằng sắt phía trên) Sau 2 ngày lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm lactophenol và quan sát Quan sát đặc điểm vi thể: hình dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính x40 Chụp ảnh khóm nấm trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính.
- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả.
- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở
2.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Beauveria sp.
2.4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấmBeauveriasp.
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức gồm chủng nấm phân lập được và môi trường dinh dưỡng khác nhau SDAY,
SDAY1, PDA Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là ba đĩa nấm.
- Điều kiện: nhiệt độ phòng, tối hoàn toàn.
- Chuẩn bị chủng nấmBeauveriasp thuần
- Cấy vào dĩa petri trên 3 môi trường ( SDAY, SDAY1, PDA )
- Nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng
- Nuôi trong môi trường có pH là 6.5
- Theo dõi nấm phát triển sau 6,8,10,12 ngày
- Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu
Bảng 2.4.4.1.Bảng thành phần môi trường thạch
Thành phần Đơn vị tính
2.4.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùngBeauveriasp.
Mục đích: Để đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh côn trùngBeauveriasp kết quả từ thí nghiệm 2.4.1.1, sau khi chọn được môi trường nấm sinh trưởng và đạt bào tử tốt nhất thì sẽ sử dụng cho thí nghiệm này.
- Chuẩn bị chủng nấm Beauveriasp.thuần
- Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen
- Điều chỉnh pH bằng máy đo pH
- Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen
- Đem hấp 121°C ( 1atm) trong 30 phút Để nguội đổ môi trường đĩa petri
- Cấy vào đĩa petri có 5 mức dộ pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5.
- Nuôi ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng
- Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu sau 12 ngày.
2.4.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùngBeauveriasp.
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp Đối với nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường tối ưu nhất được chọn từ thí nghiệm 2.4.4.1, trong khi giá trị pH tối ưu được xác định từ thí nghiệm 2.4.4.2.
- Chuẩn bị chủng nấm Beauveriasp thuần
- Cấy nấm vào đĩa petri có môi trường tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.1 và pH tối ưu ở thí nghiệm 2.4.4.2
- Nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng
- Theo dõi sự phát triển của nấm sau 6, 8,10, 12 ngày.
- Đo đường kính khuẩn lạc và đếm mật độ bào tử.
Phương pháp chung cho cả 3 thí nghiệm trên:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là bốn đĩa nấm, đĩa petri được hấp khử trùng ở 121 0 C (1atm) trong 30 phút sau đó đi sấy khô và đổ môi trường PDA đã hấp sẵn.
Thu thập số liệu và thống kê bằng Microsoft EXCEL và các chỉ tiêu theo dõi được so sánh bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố (One-Way
ANOVA), sau đó so sánh LSD xử lý thống kê bằng phần mền STATGRAPHICS plus.
Chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của nấmBeauveriasp.:
− Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): đo độ dài đường kính trên 2 trục của khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy theo công thức ( Trịnh Xuân Thu và Lê Tuấn
Trong đó: d1 và d2 là độ dài 2 dường kính chéo phần khuẩn lạc phân bố trên
Mật độ bào tử/ml mẫu được tính ở thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Thoma:
� Trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ ( V=1/4000 mm 3 )
4000= số qui đổi từ 1/4000 mm 3 thành 1mm 3
1000= số qui đổi từ 1mm 3 thành 1ml ( 1ml00mm 3 )
H= hệ số pha loãng ( ví dụ: H -2 )
Trường hợp 1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm 2 Vậy Vô nhỏ= 0.1mm x 1/400mm 2 =1/4000mm 3
TIẾN HÀNH GIỮ CHỦNG NẤM Beauveria sp TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM54 3.3 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Beauveria sp 54 3.4 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
Nấm sau khi được cấy vào các bình serum sau khoảng thời gian khoảng 10 ngày, quan sát thấy nấm phát triển và phủ đều bề mặt giá thể lúa và có phát sinh bào tử.
Hình 3.2 ChủngBeauveriasp được giữ giống trong giá thể lúa
3.3 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM
3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấmBeauveriasp khi nuôi cấy ở ba môi trường khác nhau.
Bảng 3.3.1 Mật số bào tử (bt/ml) trên 3 loại môi trường thạch ở thời điểm 6, 8,
Môi trường Mật độ bào tử qua các ngày nuôi cấy (cm)
Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05
Kết quả ở bảng 3.3.1 cho thấy mật độ bào tử của chủng nấmBeauveriasp. phát triển trên 3 loại môi trường SDAY; SDAY1; PDA ở các thời điểm 6; 8;
10;12 ngày sau nuôi cấy cho thấy:
−Ở thời điểm 6 ngày sau nuôi cấy, nấm Beauveria sp cho mật độ bào tử còn thấp, thể hiện qua PDA (3,4 ± 1 x 10 14 ) khác biệt có ý nghĩa (P< 0,05) so với SDAY1 và SDAY lần lượt là 2,3 ±1,73205 x 10 10 và 1,4 ± 5,2373 x 10 11
Ở thời điểm 8 ngày sau nuôi cấy, mật độ bào tử nấm tăng đáng kể, với môi trường PDA đạt (5,92 ±2,3 x 10 13 ) bào tử/ml, cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) so với hai môi trường còn lại Ngược lại, mật độ bào tử trên môi trường SD1 và SDAY không có sự chênh lệch đáng kể, đạt lần lượt là (2,96 ±0,62 x 10 13 ) bào tử/ml và (2,21 ±0,35 x 10 13 ) bào tử/ml.
−Khi xét ở thời điểm 10 ngày sau nuôi cấy , mật độ bào tử tăng lên cao.
Tăng cao nhất vẫn là ở môi trường PDA đạt mật độ 5 ± 1,143 x 10 12 bt/ml có sự khác biệt ý nghĩa (P
