phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

Dương Nhật Linh Học viên thực hiện Đặng Thị Sen Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh Gia Lai Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM KHÁNG TH

-PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHÂT CÓ HOẠT

TÍNH KHÁNG VI KHUẨN gramâmkháng

x0x -ĐẶNG THỊ SEN

PHÂNLẬP VÀ TINH CHẾ hợpchấtcóhoạt

TÍNH KHÁNG VI KHUẨN gramâmkháng

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Đặng Thị Sen

Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh: Gia Lai

Chuyên ngành: Y dược Mã sinh viên: 1653010255

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Đặng Thị Sen

Giảng viên hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh

Học viên thực hiện Đặng Thị Sen Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh Gia Lai

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM KHÁNG THUỐC TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU

ĐẮNG (Phyllanthus amarus)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Đặng Thị Sen

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến cô ThS Dương Nhật Linh đã tận

tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Tấn Phát

đang công tác tại Viện Công nghệ Hóa học là người đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị và phương pháp thực hiện có trong đề tài của em

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã hết lòng giúp đỡ em giải quyết các vấn

đề gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Và nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn đến Ba mẹ người đã sinh thành

dưỡng dục và nuôi dạy em nên người để em có được ngày hôm nay

Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các bạn tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh- Trương Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài

Bình Dương, Ngày 20 tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Sen

MỤC ỤC II DANH MỤC VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH ẢNH VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ IX DANH MỤC SƠ ĐỒ IX

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.TỔNGQUANVỀNGUYÊNLIỆU 5

1.1.1 Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 5

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái 6

1.1.4 Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P amarus) 6

1.1.5 Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P amarus) 9

1.2.TỔNGQUANVỀMỘTSỐVIKHUẨNGÂYBỆNHỞNGƯỜI 11

1.2.1 Vi khuẩn sinh enzym ESBL 11

1.2.2.Vi khuẩn sinh carbapenemase 13

1.3.TÌNHHÌNHNGHIÊNCỨUTRONGNƯỚCVÀNGOÀINƯỚC 14

1.4.KHÁIQUÁTVỀPHƯƠNGPHÁPCHIẾTCAODƯỢCLIỆU 16

1.4.1 Phân loại cao dược liệu 16

1.4.2 Các kỹ thuật chiết dược liệu 17

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 24

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 25

2.2.2 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu 27

2.2.3 Xác định tên khoa học của cây thuốc 27

2.2.4 Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P amarus) 27

2.2.5 Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 29

2.2.6 Phương pháp khuếch tán giếng thạch 30

2.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh 32

2.2.8.Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột 33

2.2.9 Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ 34

2.2.10 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 34

PHẦN III KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 35

3.1.KẾTQUẢGIÁMĐỊNHTÊNKHOAHỌCCỦACÂY 36

3.2.KẾTQUẢCHIẾTCAODƯỢCLIỆU 36

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đên khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng(P amarus) 36

3.2.2 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 38

3.3.KẾTQUẢĐỊNHTÍNHKHẢNĂNGKHÁNGKHUẨN 39

3.4.KẾTQUẢXÁCĐỊNHNỒNGĐỘỨCCHẾTỐITHIỂU(MIC)CỦACAOCHIẾT 42

3.5.ĐIỀUCHẾCÁCPHÂNĐOẠNTỪCAOETHYLACETATE 44

3.6.KHẢOSÁTHOẠTTÍNHKHÁNGKHUẨNCỦACAOPHÂNĐOẠNETHYLACETATE 45

3.7.XÁCĐỊNHKHẢNĂNGKHÁNGKHUẨNBẰNGPHƯƠNGPHÁPTỰSINHĐỒ 52

3.8.XÁCĐỊNHCẤUTRÚCCỦAHỢPCHẤTPA01 53

Danh mục viết tắt

A baumannii B subtilis cs

: Acinebacter baumannii : Bacillus subtilis

DMSO

β-lactamase

NA

P aeruginosa P amarus S typhi S paratyphi

: Nutrient Agar

:Pseudomonas aeruginosa : Phyllanthus amarus

:Salmonella typhi

:Salmonella paratyphi

S albus S aureus S mutans S salivarus S faecalis

SKC SKLM

: Staphylococcus albus : Staphylococcus aureus : Streptococcus Mutans : Streptococcus salivarus

Danh mục bảng

Bảng 3.1 Hiệu suất thu cao từ dung môi chiết 36

Bảng 3.2 Hiệu suất thu cao từ các loại dung môi chiết 37

Bảng 3.3 Kết quả xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết 38

Bảng 3.4 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết 39

Bảng 3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết (µg/mL) 42

Bảng 3.6 Khối lượng của các phân đoạn thu được (g) 45

Danh mục hình ảnh

Hình 1.1 Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 5Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus) 7Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P

amarus) (tiếp theo) 8Hình 1.4 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P

amarus) (tiếp theo) 9

Hình 2.1 Kết quả kháng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán 32qua giếng thạch 32

Hình 3.1 Thu cao n–hexane và ethyl acetat bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 38

Hình 3.2 Đường kính vòng kháng của các loại cao chiết 42Hình 3.3 Nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của cao ethyl acetate từ cây diệp hạ châu

đắng (P amarus) 44

Hình 3.4 Khả năng kháng khuẩn của 5 phân đoạn 47

Hình 3.5 Cột phân đoan 3 được chạy sắc ký cột một lần nữa với hệ dung môi n–

hexane: ethyl acetate (95:5) 48Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng thu được từ cao chiết phân đoạn 3 49Hình 3.7 Sắc ký cột hệ chloroform: methanol (99:1) 50Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng thu được từ sắc ký cột hệ dung môi chloroform:

methanol (99:1) với UV 254 nm 50Hình 3.9 Sắc ký cột hệ chloroform (100%) 51Hình 3.10 Sắc ký lớp mỏng chất PA01 52Hình 3 11.Kết quả kháng vi khuẩn Acinetobacter 77a bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn 53

Hình 3.11 Cấu trúc của PA01 55

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ chiết cao diệp hạ châu đắng (P amarus) 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới, sự xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+) Trong đó có các chủng kháng

kháng sinh phổ biến nhất E coli, Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA)

là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới Trong thập kỷ qua, đáng báo động là sự bùng nổ của vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL Extended–spectrum β– lactamase (ESBL) chỉ định chung cho trực khuẩn Gram (-) sản xuất β–lactamase phổ rộng, enzym này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh tiêu diệt chúng (Horie và cs., 2017) Bên cạnh đó, theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) các vi khuẩn kháng kháng sinh được xếp vào mức

độ ưu tiên hàng đầu là các loại A baumannii, P aeruginosa có khả năng kháng

Carbapenem – là một trong những loại kháng sinh mạnh nhất của con người Theo đó, sự lan truyền của vi khuẩn kháng carbapenem là một cuộc khủng hoảng sức khỏe toàn cầu (Nicolau và cs., 2008) Vì vậy việc tìm được nguồn thuốc mới thay thế các thuốc đang sử dụng hiện tại trở thành một vấn đề vô cùng cấp thiết, trong đó thực vật là dược liệu đầy tiềm năng

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm vì vậy có hệ thực vật được dùng làm dược liệu vô cùng phong phú và đa dạng Đây chính là tài nguyên hết sức quý giá Hiện nay, việc sử dụng các bài thuốc từ tự nhiên để hỗ trợ điều trị

bệnh đang ngày càng phát triển, trong đó đáng kể đến là diệp hạ châu đắng (P amarus) Diệp hạ châu đắng (P amarus) được dân gian sử dụng để sát khuẩn, các

bệnh của hệ niệu – sinh dục, đái tháo đường, lợi tiểu trị sỏi mật và sỏi thận, chống oxy hóa (Đỗ Huy Bích và cs., 2004), chống viêm (Harikrishnan và cs., 2018), chống lại virus viêm gan B (Thyagarajan và cs., 1988; Wang và cs., 1995), chống ung thư (Joy và cs , 1988)

Năm 2010 theo nghiên cứu của Adegoke và cộng sự, cho thấy cao chiết

ethanol của lá cây diệp hạ châu đắng (P amarus) có sự hiện diện của alkaloid, tannin và flavonoid và có tác dụng kháng lại các vi khuẩn S aureus, E coli và Klebsiella spp (Adegoke và cs., 2010)

Dhandapani và cộng sự (2017) đã nghiên cứu sàng lọc sơ bộ hợp chất tự

nhiên của cao chiết từ lá và rễ diệp hạ châu đắng (P amarus) cho thấy có sự hiện

diện của các alkaloid, phytosterol, hợp chất phenolic và tannin, protein và amino acid, lignin và saponin Các hợp chất này đều cho thấy khả năng kháng khuẩn

chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh như các vi khuẩn Gram (+) S aureus, S albus, B subtilis và vi khuẩn Gram (-) như E coli (Dhandapani và cs., 2007)

Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu được công bố về việc sử

dụng các hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus) để kháng lại

với các vi khuẩn kháng thuốc Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ

TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM

KHÁNG THUỐC TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)”

Mục tiêu: Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt chất kháng vi khuẩn Gram

âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

Nội dung thực hiện bao gồm:

- Chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P amarus)

- Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao chiết diệp hạ châu đắng

(P amarus)

- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethyl acetate diệp hạ châu

đắng (P amarus) với vi khuẩn kháng thuốc

- Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột - Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao phân đoạn ethyl acetate

- Phân lập hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus) có khả năng

kháng khuẩn bằng phương pháp sắc ký cột

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nguyên liệu

1.1.1 Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

Tên khoa học: Phyllanthus amarus, thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae), tên

thường gọi: chó đẻ thân xanh, chó đẻ răng cưa, cam kiềm, rút đất, kham ham Vị trí phân loại:

Giới: Plantae

Ngành: Angiospermae Lớp: Dicotyledoneae Bộ: Tubiflorae Họ: Euphorbiaceae

Chi: Phyllanthus

Loài: Amarus Schum.et Thonn

(Hemant Dhongade và cs., 1999)

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Diệp hạ châu đắng (P amarus) là loài cây nhiệt đới, có nguồn gốc xa xưa ở

vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới cổ Ở Châu Á gồm các nước Ấn Độ, Malaysia, Phillippin, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi (Đỗ Huy Bích và

cs., 2004) Ở Việt Nam, diệp hạ châu đắng (P amarus) mọc rải rác khắp nơi, từ các

tỉnh ở vùng đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh ở trung du và miền núi, có độ cao dưới 800 m Ở các nước Đông Nam Á, độ cao phân bố của diệp hạ châu

đắng (P amarus) có thể lên tới 1.000 m Chi Phyllanthus L có nhiều loài, gồm

những cây thảo đến các cây bụi hay gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Hình 1.1 Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài Trên thế giới, các loài này cũng có phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới Châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Nam Trung Quốc

Diệp hạ châu đắng (P amarus) là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu

bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở ruộng cao, nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi không chịu được ngập úng Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa…) pH từ 5,0 đến 6,5 Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân; sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25–30o

C Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gần nên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loại cỏ dại và cây trồng khác, vòng đời kéo dài 3–5 tháng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây thảo, sống hằng năm hay sống dai, cao khoảng 20–30 cm, có thể đến 60–70 cm Thân nhẵn, mọc thẳng đứng, lá mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy như một lá kép hình lông chim Phiến lá thuôn, dài 1–1,5 cm, rộng 3–4 mm, đầu lá nhọn hay hơi tù, mép có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới lá màu xanh lơ; cuống lá rất ngắn Hoa mọc ở kẽ lá, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực ở đầu cành có 6 lá dài, 3 nhị, chỉ nhị ngắn; hoa cái ở cuối cành, 6 lá dài, bầu hình trứng Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh Mùa hoa: tháng 4–6; mùa quả: tháng 7–9 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

1.1.4 Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P amarus)

Diệp hạ châu đắng (P amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như

alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen, lignan và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích

Diệp hạ châu đắng (P amarus) có các hợp chất chủ yếu như lignans,

geraniin và 5 hợp chất của flavonoids như quercertin, astralgin, quercertrin, isoquercitrin và rutin (Sharma và cs., 1993; Somanabandhu và cs., 1993) Theo

Pereira và cộng sự (2016) đã xác định trong toàn cây diệp hạ châu đắng (P amarus)

có 7 hợp chất lignan là 5–demethoxy–niranthin, phyllanthin, filtetralin, 5–demethox nirtetralin, nirtetralin, hipophyllanthin và niranthin, trong đó chiếm chủ yếu là phyllanthin và hipophyllanthin (Pereira và cs., 2016) Đồng thời trong cây diệp hạ

châu đắng (P amarus) cũng chứa những hợp chất nhỏ như hydrolysable tannin là

phyllanthusiin D (Houghton và cs., 1996), amariin (Foo, 1993), amarulone (Rao và Bramley, 1971), amarinic acid, alkaloid như ent–norsecurinine, sobubbialine, epibubbialine, diarylbutane, nyrphyllin và neolignan, phyllnirurin

Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus)

Phyllanthin

Rutin Quercertin

Isoquercitrin

AmariinPhyllanthusiin D

Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus) (tiếp theo)

1.1.5 Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P.amarus)

Diệp hạ châu đắng (P amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như

alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, tất cả bộ phận cây

diệp hạ châu đắng (P amarus) được phơi khô, sắc uống dùng chữa đau viêm họng,

đinh râu, mụn nhót, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi,

PhyllnirurinEpibubbialine

chàm má Người Ấn Độ sử dụng diệp hạ châu đắng (P amarus) để trị ho, viêm phế quản, hen phế quản, lao,… Ngoài ra diệp hạ châu đắng (P amarus) còn có khả năng

làm hạ men gan, tăng cường chức năng gan và ức chế sự phát triển của virus viêm gan siêu vi B (Break Stone và cs., 1982) Năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá được tác dụng ức chế sự phát triển HIV–1 từ cao chiết diệp hạ

châu đắng (P amarus)

Theo nghiên cứu của Trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil, 1984) đã

phát hiện alkaloid có trong diệp hạ châu đắng (P amarus) có tác dụng chống co thắt

cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật

Theo Thyagarajan và cộng sự (1988) đã nghiên cứu cho thấy cao chiết từ bột

của cây P amarus có khả năng làm mất kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

trong thời gian điều trị là 30 ngày tạo tiền đề cho những nghiên cứu về chiết xuất

của P amarus sau này (Thyagarajan và cs., 1988)

Năm 2000, Ali và cộng sự đã nghiên cứu cao chiết P amarus có hoạt động

ức chế α–Amylase hỗ trợ trong điều trị bệnh tiểu đường

Cao chiết methanol của lá cây P amarus có chứa các hợp chất saponin, phenolics, flavonoid và proanthocyanidin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, bắt các gốc tự do và ức chế peroxid hóa lipid (Nguyen và cs., 2017)

❖ Chữa viêm gan B:

Diệp hạ châu đắng (P amarus) 30 g, nhân trần 12 g, sai hồ 12 g, chi từ 8 g,

hạ khô thảo 12 g, sắc (nấu) uống ngày 1 thang ❖ Chữa xơ gan cổ trướng thể nặng:

Diệp hạ châu đắng (P amarus) sao khô 100 g sắc nước 3 lần Trộn chung

nước sắc, thêm 150 g đường, đun nấu cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30–40 ngày

❖ Chữa sốt rét:

Dùng diệp hạ châu đắng (P amarus) 8 g, thảo quả, dây hà thủ ô, lá mãng cầu

ta tươi, thường sơn, dây gắm mỗi vị 10 g, bình lang (hạt cau), ô mai, dây cóc mỗi vị 4 g đem sắc với 600 mL nước, còn 200 mL, chia uống 2 lần trường khi lên cơn sốt rét 2 giờ Nếu không hết cơn, thêm sài hồ 10 g

1.2 Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người

1.2.1 Vi khuẩn sinh enzym ESBL

1.2.1.1 Giới thiệu tổng quan về enzym ESBL

Đầu những năm 1980, các cephalosporins thế hệ 3 được đưa vào để điều trị các vi khuẩn kháng thuốc Sự ra đời các kháng sinh β–lactams mới này đặc biệt là cephalosporin thế hệ 3, đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến đấu lâu

dài với vi khuẩn sinh enzym β–lactamase (ví dụ chủng E coli tiết ra enzym TEM–1 kháng ampicillin, chủng K pneumoniae sinh enzym SHV–1 β–lactamase) Nhưng

một loại enzym β–lactamase có khả năng phân hủy các cephalosporins thế hệ 2, 3 và monobactams, có nguồn gốc do TEM–1, TEM–2, SHV–1 đột biến thay đổi một số amino acid gọi là ESBL phổ rộng đã xuất hiện (Paterson và cs., 2005)

Là một loại enzym β–lactamase do trực khuẩn Gram (-) sinh ra ESBL đề kháng với penicillin (trừ temocillin), cephalosporin thế hệ thứ ba (ví dụ ceftazidime, cefotoxime, ceftriaxone), aztreonam, cefamandole, cefoperazone, tuy nhiên nó rất nhạy cảm với methoxy–cephalosporin (cephamycins và carbapenems) và có thể bị ức chế bởi các thuốc ức chế β–lactamase như acid clavulanic, sulbactam, hoặc tazobactam (Giedraitiene và cs., 2011) ESBL chủ yếu có nguồn gốc từ các thành viên của TEM–, SHV–, và OXA– β–lactamase có một hoặc nhiều amino acid thay thế

ESBL có nguồn gốc từ đột biến của β–lactamase do cephalosporin thế hệ 3 cảm ứng tạo thành Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến 7 amino acid nằm gần vị trí tâm hoạt động của enzym Những thay đổi trên đã tạo ra vị trí tâm hoạt động của enzym linh hoạt hơn, tiến hóa hơn vì thế gia tăng ái lực và

tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone,…) và monobactam (aztreonam) (Brafold, 2001)

2.2.1.2 Tình hình vi khuẩn sinh ESBL trên thế giới và Việt Nam

Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi

khuẩn E coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển Các nghiên cứu tại Ấn Độ đã ghi nhận được các chủng E coli sinh ESBL

chiếm 24,8%–63,8% vi khuẩn sinh ESBL (Kumar và cs., 2006; Goyal và cs., 2009) Trong một báo cáo tiến hành tại một bệnh viện đại học ở Mwanza, Tanzania, tỷ lệ vi khuẩn ESBL (+) trong tất cả các vi khuẩn Gram (-) chiếm tới 29%, trong đó, tỉ lệ

K pneumoniae tiết ESBL chiếm tới 64% và E coli tiết ESBL chiếm 24% (Mshana

và cs.,2009) Trong năm 2013, tại 17 trong số 22 nước Châu Âu phân lập được

85%–100% E coli sinh ESBL (EARS–Net, 2014) Tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng

gây ra bởi kháng sinh β–lactams do việc sản xuất các enzym khác nhau có tăng trong những năm gần đây Phát hiện vi khuẩn ESBL (+) là hết sức cần thiết cả trong bệnh viện và cộng đồng Các học viên kiểm soát lây nhiễm và bác sĩ lâm sàng cần nhanh chóng xác định và mô tả các loại vi khuẩn đề kháng kháng sinh khác nhau Điều này là cấp thiết để giảm thiểu sự lây lan của các vi khuẩn và giúp chọn kháng sinh thích hợp trong điều trị (Shaikh và cs., 2015; Phumart và cs., 2012)

Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt

Nam năm 2008–2009, đã cho thấy tỷ lệ ESBL (+) của các chủng E coli và Klebsiella spp.dao động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương với 54,7% trên E coli và 72,7% Klebsiella spp., sau đó là bệnh viện Chợ Rẫy

với 49% và 58,2%, bệnh viện Việt Đức với 57,3% và 48,5%, bệnh viện Bình Định

và 2 bệnh viện Nhi với tỷ lệ gần 40% trên E coli và 50% trên Klebsiella spp Đây cũng là các bệnh viện có tỷ lệ E coli và Klebsiella spp kháng cephalosporins thế hệ

3 cao hơn các bệnh viện khác (GARP–Vietnam, 2010) Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin

của E coli lên tới 81,4%; kháng amoxicillin/clavulanic và ampicillin/sulbactam

khoảng 40% Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro–quinolon cũng bị kháng khoảng 45% (Trần Thị Thùy Giang và cs., 2014)

1.2.2.Vi khuẩn sinh carbapenemase

1.2.2.1 Giới thiệu tổng quát về enzym carbapenemase

Carbapenemase là enzym thuộc họ β–lactamase bất hoạt được tất cả các loại β–lactams như Pencillin, Cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện nay là Carbapenem, vũ khí kháng sinh duy nhất giúp các bác sĩ điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn tiết ESBL gây ra (Queenan và cs., 2007; Phạm Hùng Vân, 2013) Các gen mã hoá cho các loại carbapenemase nằm trên plasmid hay integron của nhiễm sắc thể nên có khả năng lây lan cao Các loại carbapenemase hiện nay đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và đang được xem là “ác mộng” đề kháng kháng sinh đối với con người (Phạm Hùng Vân, 2013) Có hai loại carbapenemase được cảnh báo gần đây, đó là blaKPC và NDM–1 KPC là một loại β–lactamase lớp A

nguồn gốc plasmid phát hiện trên K pneumoniae, lưu hành ở Hoa Kỳ, Nam Mỹ và

Châu Âu và hiện cũng lây lan ra một số loài khác (Yigit và cs., 2001) NDM–1 được cảnh báo là nguy hiểm nhất vì lan truyền cao, thuộc lớp B, metallo–β–

lactamase, có nguồn gốc plasmid và intergon được phát hiện trên K pneumoniae và E coli, được lưu hành cao ở Ấn Độ, Pakistan (Yong và cs., 2009) Chính vì vậy,

việc phát hiện vi khuẩn tiết ra enzym này rất quan trọng để cảnh báo nguy cơ lây lan tính đề kháng kháng sinh này trong cộng đồng (Phạm Hùng Vân, 2013)

2.2.2.2 Tình hình vi khuẩn sinh enzym carbapenemase trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng Carbapenem đang là vấn đề khủng hoảng toàn cầu và đáng lo ngại của thế giới đối với sức khỏe Tỉ lệ

Acinetobacter spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng lên đều đặn trong những

năm gần đây trên thế giới Cùng với tỉ lệ nhiễm khuẩn tăng, tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng đang tăng một cách đáng lo ngại Ở Anh, các ca nhiễm khuẩn

bệnh viện do Acinetobacter spp kháng các loại Carbapenem đã xảy ra từ năm 2000

Cụ thể hơn, khoảng thời gian năm 2004–2008, tỉ lệ kháng Meropenem đã tăng từ 13

đến 29% Riêng tại Mĩ, các ca nhiễm khuẩn bệnh viện bởi Acinetobacter spp đa

kháng thuốc là 65–75% và không nhạy với Carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995

lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011) Tỉ lệ P aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh

viện đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam Cùng với sự gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn là sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh, cụ thể là khả năng kháng với Carbapenem (Hoàng Doãn Cảnh và cs., 2014)

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

❖ Ngoài nước:

Theo Aliyu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu cao chiết methanol của toàn cây

diệp hạ châu đắng (P amarus) có chứa các hợp chất alkaloids, flavonoids, saponins,

tannins và glycoside tim có khả năng kháng MRSA cho đường kính vòng vô khuẩn 13 mm (Aliyu và cs., 2008)

Theo Akinjogunla và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cao chiết ethanol thô của

rễ và lá của P amarus có chứa akaloid, saponin, flavonoids, terpenes và glycosides tim có khả năng ức chế E coli–ESBL (Akinjogunla và cs., 2010)

Theo Bhat và cộng sự năm (2015) đã nghiên cứu cao chiết ethanol của P amarus cho thấy ức chế chống lại S mutans và S salivarus có đường kính vòng

kháng khuẩn lần lượt là 5,7 mm và 6,3 mm (Bhat và cs., 2015)

Theo Valle và cộng sự (2015), chiết xuất dung dịch nước và acetone của P amarus đã được nghiên cứu chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (B subtilis, S aureus, Enterococcus fecalis, S typhi, S paratyphi B, Proteus Vulgaris và Serratia marsescens) (Valle và cs., 2015)

Theo nghiên cứu của Oluboyo và cộng sự (2016), đã nghiên cứu cao chiết

ethanol của cây diệp hạ châu đắng (P amarus) có khả năng kháng với S aureus và

P aeruginosa có đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 17,82 mm và 10,82 mm

ở nồng độ 10 mg/mL (Oluboyo và cs., 2016)

Theo Akporowhe và cộng sự (2016), đã nghiên cứu cao chiết ethanolic thô

của lá diệp hạ châu đắng (P amarus) có chứa các hợp chất flavonoids, tannins,

saponins, alkaloids, terpenoids, gycosides và anthroquinones có khả năng chống oxy hóa ở chuột (Akporowhe và cs., 2016)

Theo Putakala và cộng sự (2017) cao chiết nước của P amarus có chứa các

flavonoids, quercetin và rutin, các lignans phyllanthin và hypophyllanthin, saponin và các hợp chất phenolic acid galic có tác dụng bảo vệ tim mạch khi tiến hành nghiên cứu trên chuột (Putakala và cs., 2017)

Các chất chiết xuất từ lá P amarus đã được kiểm tra để phân tích hóa học

hoàn chỉnh cùng với tiềm năng chống vi khuẩn của chúng Các chất chiết xuất ổn

định khác nhau, ví dụ, n-hexane (59%), acetone (57%) và chiết xuất nước (48 %) đã

được điều chế, có chứa nhiều alkaloid, saponin, anthraquinone, tannin và phenolics trong môi trường acid Nhìn chung, việc kết hợp chiết xuất lá với bacitracin hoặc erythromycin đơn thuần có tác dụng hiệp lực, do đó mô tả lợi thế quan trọng của sự

kết hợp giữa các kháng sinh phổ quát này với chiết xuất P amarus để điều trị các

bệnh nhiễm trùng khác nhau (Senjobi và cs., 2017)

Theo Senjobi và cộng sự (2017) nghiên cứu cao chiết thô của lá diệp hạ châu

đắng (P amarus) có khả năng kháng các nấm Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Candida albicans và Fusarium oxysporium với đường kính vòng kháng trung bình

từ là 4–6 mm (Senjobi và cs., 2017)

Theo Ribeiro và cộng sự (2019) nghiên cứu P amarus là một nguồn giàu tannin thủy phân (ellagitanin), flavonoid, các akaloid, triterpen, sterol và lignan Phyllanthin và hypophyllanthin là lignans đặc trưng chính của cây đã cho thấy các đặc tính estrogen, làm giảm căng thẳng mạch máu và bảo vệ tế bào gan Cao chiết

dung dịch nước và acetone của lá và toàn cây của P amarus đã được báo cáo cho thấy một số hoạt động sinh học như chống oxy hóa, bảo vệ dạ dày, tác dụng bảo vệ

tim mạch Các nghiên cứu trước đây đã xác minh rằng cao chiết P amarus thu được

từ lá của cây cho thấy hoạt động kháng khuẩn chống lại một số nhóm mầm bệnh, bao gồm cả vi khuẩn đa kháng thuốc (Ribeiro và cs., 2019)

❖ Trong nước:

Theo Huỳnh Kim Diệu và cộng sự năm (2011) nghiên cứu cây diệp hạ châu

đắng (P amarus) có hoạt tính kháng lại 8 chủng vi khuẩn S aureus, S faecalis, E coli, P aeruginosa, Salmonella spp và Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho thấy tác động mạnh nhất đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (MIC = 64–512 µg/mL) (Huỳnh Kim Diệu và cs., 2011)

Cao chiết methanol của lá cây P amarus có chứa các hợp chất saponin, phenolics, flavonoid và proanthocyanidin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, bắt các gốc tự do và ức chế peroxid hóa lipid (Nguyen và cs., 2017)

1.4 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)

1.4.1 Phân loại cao dược liệu

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác,

quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế

Cao đặc: là khối đặc quánh, hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn –lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm chiết (maceration), chiết với máy Soxhlet, chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method), (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2 Các kỹ thuật chiết dược liệu

1.4.2.1 Kỹ thuật ngấm kiệt (Percolation)

Dụng cụ: bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Tiến hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm, mẫu không được xay quá mịn hay có tính nhầy nhụa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

Để yên sau một thời gian, thường là 12–24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

Ưu điểm: dược liệu được chiết kiệt, giữ được hoạt tính

Nhược điểm: năng suất thấp, thủ công, phức tạp, tốn dung môi (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.2 Kỹ thuật ngâm chiết (Maceration)

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép không rỉ có nắp đậy Rót dung môi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài) Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không được để lượng bột cây cao hơn mức thông nhau của trụ chiết

Rót dung môi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (không được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu)

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy không có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất lấy dung môi ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi thu được cao chiết

Đối với dịch chiết ethanol 100 mL, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60–80oC trong 10 giờ, dịch chiết đem sấy khô 40oC, ly tâm 5.000 vòng/10 phút, lọc với giấy lọc, cô quay cho bay ethanol

Ưu điểm: tiết kiệm dung môi, không tốn thao tác lọc và châm dung môi, chiết kiệt hợp chất trong bột cây

Nhược điểm: hạn chế lượng bột cây cần chiết do kích thước máy nhỏ, các hợp chất kém bền nhiệt có chứa trong bột cây dễ bị phân hủy Giá thành máy khá cao, máy làm bằng thủy tinh nên dễ vỡ, nhất là các nút mài được gia công bằng thủ công nên khi bị vỡ rất khó tìm được bộ phận khác để thay thế (Từ Minh Koóng, 2007)

1.4.2.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung môi

Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ sao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60oC) Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007)

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,

- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

1.4.3 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến

dung môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n–hexane, ether ethyl, chloroform,

ethyl acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ

methanol ) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH ) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

- Chuẩn bị cột

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột

• Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực và trộn đều

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Cách thực hiện: Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng Thể tích dung dịch từ 0,001–0,005 mL đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,1–0,2 mL khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5–2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8–1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2–6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Ðặt bản nhôm gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi

Đọc kết quả: Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách Tính hệ số Rf:

Rf = a/b Trong đó:

a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử (cm)

b: là khoảng các từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm) 0 < Rf < 1

Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng các phương pháp

phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu thamkhảo

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT–NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn), 1H– (500 MHz)và 13C– (125 MHz) tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

PHẦN II

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 08 năm 2020 - Địa điểm:

+ PTN Công nghệ Vi Sinh – cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

+ Phòng 19, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

+ Phòng 4.4, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, TL29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP Hồ Chí Minh

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

- Diệp hạ châu đắng (P amarus) được thu hái ở tỉnh Tây Ninh

- Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi khoa Y, Trường Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh

+ Chủng vi khuẩn sinh ESBL: E coli 128a

+ Chủng vi khuẩn sinh Carbapenemase: Klebsiella 26k, Acinetobacter 77a, E coli 49e

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

❖ Hóa chất

- Dung môi để chiết cao diệp hạ châu đắng (P amarus): nước, n–hexane,

diclorometan (CH2Cl2), ethanol Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO)

- Ống mẫu Mc Farland 0,5:

+ Dung dịch H2SO4 1% 9,95 mL + Dung dịch BaCl2 1% 0,05 mL

Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1–1,5 x 108

vi khuẩn/mL

❖ Môi trường

Nước muối sinh lý 0,85%, NA (Nutrient Agar), MHA (Muller Hinton Agar)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi bố trí thí nghiệm:

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Sấy khô và xay

Bột dược liệu

Chiết với các dung môi

Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng

thuốc bằng phương pháp khuếch tán

giếng thạch

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của

cao ethyl acetate Cô thành cao dược

liệu

Chạy cột sắc ký thu phân đoạn Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng

thuốc của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng

thạch

Chọn phân đoạn kháng vi khuẩn kháng thuốc

tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận

và phân lập hợp chất trong cây diệp hạ châu

đắng (P amarus) Diệp hạ châu đắng (P

amarus) Định danh tên khoa học

Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được có trong cây diệp hạ châu

đắng (P amarus)

Xác định khả năng kháng khuẩn của hợp chất bằng phương pháp

tự sinh đồ