Dương Nhật Linh Học viên thực hiện Đặng Thị Sen Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh Gia Lai Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM KHÁNG TH
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY
Mẫu cây thu hái được định danh tại Bộ môn Thực vật trường Đại học khoa học tự nhiên như sau:
Loài Amarus Schum.et Thonn
Từ kết quả giám định trên cho thấy mẫu cây được chúng tôi thu nhận để thực hiện đề tài đúng là cây diệp hạ châu đắng (P amarus).
KẾT QUẢ CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU
3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đên khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng(P amarus)
Mẫu dược liệu được thu hái, sắc mỏng và sấy khô ở 50 o Ctrong 3 ngày rồi xay thành bột Bột dược liệu (3 kg) được sử dụng để ngâm chiết với ethanol 96 o theo tỉ lệ 1:5 trong 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc và được cô quay ở 50 o C làm bốc hơi hết dung môi để có được cao dược liệu, trọng lượng cao thô thu được là
360 g Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Hiệu suất thu cao từ dung môi chiết
Dung môi Khối lượng cao Hiệu suất %
Sau đó, đem toàn bộ cao chiết thu được thực hiện chiết lỏng – lỏng với các loại dung môi là n–hexane, ethyl acetate Sau khi bốc hơi dung môi thu được cao đặc n–hexane, ethyl acetate, và dịch nước còn lại đem cô quay thu được cao nước, cân trọng lượng cao và kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Hiệu suất thu cao từ các loại dung môi chiết
Dung môi Khối lượng cao (g) Hiệu suất (%)
Dung môi nước cho khối lượng cao chiết cao nhất là 35,00 g với hiệu suất thu hồi là 17,50% Tiếp theo là dung môi n–hexane và thấp nhất là dung môi ethyl acatate cho khối lượng cao là 30,00 g với hiệu suất thu hồi là 15,00% Điều này chứng tỏ dung môi nước có khả năng chiết được nhiều hợp chất có trong cây diệp hạ châu đắng (P amarus) Sau đó thực hiện kiểm tra độ nhiễm khuẩn và khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết thu được
Theo kết quả nghiên cứu của Harlita và cs (2018), các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ được chiết xuất dựa trên mức độ phân cực của các loại dung môi để tối đa hóa quá trình chiết và thu cao (Harlita và cs., 2018) Việc sử dụng dung môi n– hexane nhằm mục đích chiết xuất các hợp chất không phân cực, dung môi ethyl acetate để chiết xuất hợp chất bán cực và dung môi ethanol để chiết xuất hợp chất phân cực
Hình 3.1 Thu cao n – hexane và ethyl acetat bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng
3.2.2 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Cao chiết sau khi trích ly ta tiến hành thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn, nấm có trong cao chiết diệp hạ châu đắng (P amarus)
Mẫu cao chiết được hũa tan trong DMSO 10% theo tỉ lệ 1 àg/mL và được giữ trong điều kiện vô trùng Kết quả đếm tổng số nấm men– nấm mốc, vi khuẩn hiếu khí được thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Cao chiết từ dung môi Tổng số vi khuẩn hiếu khí ( CFU/g)
Tổng số nấm men – nấm mốc ( CFU/g)
Ghi chú (-): ít hơn 10 vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc trong 1 g cao thuốc
Từ bảng 3.3 về thử giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu cao chiết cho thấy:
Mẫu cao chiết không bị nhiễm nấm men, nấm mốc, tổng số vi khuẩn hiếu khí nằm trong khoảng giới hạn cho phép của dược điển Việt Nam IV năm 2009 là không quá 5 x 10 4 CFU/g.
KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
Mẫu cao chiết từ cây diệp hạ châu đắng (P amarus) được chiết bằng các dung môi khác nhau, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng các vi khuẩn kháng thuốc Gram (-) (E coli 128a, Klebsiella 26k., Acinetobacter 77a, E coli 49e)
Chúng tôi pha loãng cao chiết với DMSO 10% theo tỉ lệ cao/ DMSO 10% là
1 mg/mL để khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết và kết quả được thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết
STT Loại cao chiết E coli 128a Acinetobacter
Trong cùng một cột các trị số có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa
Chú thích:a,b,c là mẫu tự
Biểu đồ 3.1 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết
Từ kết quả bảng 3.4 và biểu đồ 3.1, cao ethyl acetat có khả năng kháng khuẩn cao nhất và kháng cao nhất với E coli 128a lần lượt là 19,00 ± 1,00 mm Tiếp theo là cao nước và kháng Acinetobacter 77a và E coli 49e với đường kính cao nhất là 14,7 ± 0,57mm Cao n–hexane kháng yếu hơn cao nước và cao ethyl acetate
Theo nghiên cứu của Pathmavathi và cộng sự ( 2016), cao ethyl acetate của diệp hạ châu đắng (P amarus) có khả năng kháng khuẩn như sau:
- Kháng với E coli với đường kính vòng kháng là 18,00 ± 0,50 mm tương ứng với nồng độ cao/dung môi là 1000, 500, 250 μg/mL
- Kháng với K pneumoniae với đường kính vòng kháng là 14,30 ± 0,68 mm tương ứng với nồng độ cao/dung môi là 1000, 500, 250 μg/mL
Theo nghiên cứu của Unor và cộng sự (2016), cao ethyl acetate của diệp hạ châu đắng (P amarus) có khả năng kháng E coli với đường kính vòng kháng là 10 mm tương ứng với nồng độ cao/dung môi là 20 μg/mL (Unor và cs., 2016)
Theo Ogunlesi và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cao chiết ethyl acetate của lá và hạt diệp hạ châu đắng (P amarus) có hoạt tính kháng các vi khuẩn E coli sinh Carbapenemase, K pneumoniae với đường kính vòng kháng trung bình từ 11–18 mm (Ogunlesi và cs., 2009)
Từ những nghiên cứu trên và kết quả thí nghiệm ở trên cho thấy cao ethyl acetate có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, nên chúng tôi chọn cao ethyl acetate để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo
Hình 3.2 Đường kính vòng kháng của các loại cao chiết
KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA
Chúng tôi tiến hành hòa tan cao ethyl acetate trong DMSO 10% thành dãy nồng độ liờn tiếp nhau 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64 (nồng độ sau bằng ẵ nồng độ trước) Tác động kháng vi sinh vật được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của chất thử (MIC) và kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết (àg/mL)
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (àg/mL) của cao ethyl acetate
Cao chiết với ethyl acetate có tác động ức chế E coli 128a ở nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) là 15,63 àg/mL
Cao chiết ethyl acetate có tác động ức chế Acinetobacter 77a, Klebsiella 26k và E coli 49e ở nồng độ ức chế tối thiểu là 31,25 àg/mL
Qua kết quả MIC, đã cho thấy cao ethyl acetate của diệp hạ châu đắng (P amarus) có tính kháng khuẩn tốt với các vi khuẩn kháng thuốc được thí nghiệm ở nồng độ thấp Theo Akinjogunla và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cao ethyl acetate của cây diệp hạ châu đắng (P amarus) có khả năng ức chế vi khuẩn E coli sinh
ESBL với MIC = 5 mg/mL (Akinjogunla và cs., 2010) Từ đó thấy được cao chiết của cây diệp hạ châu đắng (P amarus) có thể sử dụng để thay thế kháng sinh trị bệnh cho người, gia súc và động vật thủy sản trong tương lại
Hình 3.3 Nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của cao ethyl acetate từ cây diệp hạ châu đắng (P amarus)
ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CAO ETHYL ACETATE
Từ cao ethyl acetate (30 g) đem đi chạy sắc ký cột với 5 hệ dung môi theo tỉ lệ lần lượt là n hexane: ethyl acetate (75:25), n–hexane : ethyl acetate (50:50), n– hexane: ethyl acetate (25:75), n–hexane: ethyl acetate (0:100) và ethyl acetate: methanol (90:10) Sau đó sẽ thu được 5 tiểu phân đoạn, mỗi hệ dung môi được sử dụng để chạy cột tương ứng với 1 tiểu phân đoạn: PA– E1, PA– E2, PA– E3, PA– E4, PA– E5
Bảng 3.6 Khối lượng của các phân đoạn thu được (g)
Từ bảng 3.6 cho thấy PA– E5 có khối lượng cao nhất là 7,2 g Tiếp theo là PA– E1, PA– E4, PA– E3 và thấp nhất là PA– E2 là 4,1 g.Từ kết quả trên cho thấy rằng các cao PA– E5 (7,2 g) chiếm hàm lượng lớn, chứa các hợp chất phân cực so với các phân đoạn khác.
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO PHÂN ĐOẠN
Sau khi thu được các cao phân đoạn, chúng tôi thực hiện khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của các cao phân đoạn ethyl acetate bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và kết quả được thể hiện ở bảng 3.7
Phân đoạn Hệ dụng môi n–hexane: ethyl acetate
Bảng 3.7 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các phân đoạn
Trong cùng một cột các trị số có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa
Chú thích:a,b,c là mẫu tự
Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của cao phân đoạn diệp hạ châu đắng (P amarus)
PA– E1 PA– E2 PA– E3 PA– E4 PA– E5
Loại cao chiết E coli 128a Acinetobacter
Phân đoạn PA-E3 của cây diệp hạ châu đắng (P amarus) thể hiện khả năng kháng mạnh mẽ nhất đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm Đặc biệt, phân đoạn này có hiệu quả kháng khuẩn cao nhất đối với chủng Acinetobacter 77a, với vùng ức chế đạt 18,33 ± 0,57 mm Do đó, các nhà nghiên cứu đã chọn phân đoạn PA-E3 để tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc của chiết xuất diệp hạ châu đắng.
Hình 3.4 Khả năng kháng khuẩn của 5 phân đoạn
Phân đoạn PA– E3 được lên cột thêm một lần nữa với hệ dung môi theo tỉ lệ là n–hexane : ethyl acetate (95:5) kết hợp với SKLM để phân lập các hợp chất
Dùng bình bi để hứng dịch chất, các bình bi nào có vệt giống nhau trên SKLM sẽ được gom chung lại với nhau để dung môi bay hơi hết ở nhiệt độ phòng và thu tinh thể
Hình 3.5 Cột phân đoan 3 được chạy sắc ký cột một lần nữa với hệ dung môi n– hexane: ethyl acetate (95:5)
Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng thu được từ cao chiết phân đoạn 3
A: SKLM ở UV 254 nm B: SKLM sau khi tác dụng với acid và nhiệt
Tiến hành gom những bình bi có vết giống nhau trên sắc ký lớp mỏng lại với nhau và thu được một lượng hợp chất Đem lượng hợp chất thu được tiếp tục chạy sắc ký cột một lần nữa với hệ dung môi theo tỷ lệ chloroform: methanol (99:1), kết hợp với SKLM để để phân lập các hợp chất Dùng bình bi để hứng dịch chất, các bình bi nào có vệt giống nhau trên SKLM sẽ được gom chung lại với nhau để dung môi bay hơi hết ở nhiệt độ phòng và thu tinh thể
Hình 3.7 Sắc ký cột hệ chloroform: methanol (99:1)
Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng thu được từ sắc ký cột hệ dung môi chloroform: methanol (99:1) với UV 254 nm
Tiến hành gom các bình bi có vết giống nhau trên sắc ký lớp mỏng lại với nhau, thu được một lượng hợp chất Tiếp theo, chạy sắc ký cột với hệ dung môi bao gồm chloroform (100%) kết hợp với silica gel kim loại (SKLM) để phân lập các hợp chất Thu dịch chất vào các bình bi Các bình bi có vệt giống nhau trên SKLM chứa các hợp chất giống nhau.
SVTH: ĐẶNG THỊ SEN sẽ được gom chung lại với nhau để dung môi bay hơi hết ở nhiệt độ phòng và thu tinh thể Hợp chất thu được chúng tôi đặt tên là PA01 dưới dạng hình kim màu trắng Sau đó chúng tôi xác định cấu trúc của chất PA01
Hình 3.9 Sắc ký cột hệ chloroform (100%)
Hình 3.10 Sắc ký lớp mỏng chất PA01
A: SKLM ở UV 254 nm B: SKLM sau khi tác dụng với acid và nhiệt
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ
Dựa vào kết quả sắc ký cột của cao chiết và sắc ký lớp mỏng của phân đoạn
PA–E3, tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn Acinetobacter 77a của cao chiết phân đoạn PA–E3 bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn và thu được kết quả như sau:
Hình 3 11.Kết quả kháng vi khuẩn Acinetobacter 77a bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn
Sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn PA–E3 được thử nghiệm bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn Acinetobacter 77a trực tiếp cho kết quả có vùng màu trắng xuất hiện tại băng có Rf bằng 0,35 và 0,8 tức là hợp chất có khả năng kháng khuẩn, sự hiện diện của vi khuẩn được nhận biết bằng muối tetrazolium, muối này chuyển đổi dehydrogenase của vi sinh vật thành màu formazan (Silva và cs., 2005)
Từ kết quả sắc ký lớp mỏng và tự sinh đồ cho thấy hợp chất PA01 kháng lại vi khuẩn Gram âm kháng thuốc.
