Phân lập và tinh chế hợp chất kháng vi khuẩn gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus

Vật liệu

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. + PTN Công nghệ Vi Sinh – cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương. Hồ Chí Minh. Hồ Chí Minh. Đối tượng nghiên cứu. amarus) được thu hái ở tỉnh Tây Ninh. Thiết bị: cân phân tích, tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy cô quay chân không, máy vortex, kính hiển vi, bộ soxhlet,. Dụng cụ: bình chiết dược liệu, phễu lọc, bếp cách thủy, tủ sấy, lọ bi thủy tinh, đĩa petri, micropipet, ống nghiệm, erlen, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn, bông không thấm nước….

Phương pháp nghiên cứu 1. Bố trí thí nghiệm

Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO). Phương pháp nghiên cứu. SVTH: ĐẶNG THỊ SEN. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Sấy khô và xay. Bột dược liệu. Chiết với các dung môi. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng. thuốc bằng phương pháp khuếch tán. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của. cao ethyl acetate Cô thành cao dược. Chạy cột sắc ký thu phân đoạn. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng. thuốc của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng. Chọn phân đoạn kháng vi khuẩn kháng thuốc. tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận. và phân lập hợp chất trong cây diệp hạ châu. amarus) Diệp hạ châu đắng (P. amarus) Định danh tên khoa học. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được có trong cây diệp hạ châu. amarus) Xác định khả năng kháng khuẩn của hợp chất bằng phương pháp. Cây diệp hạ châu đắng(P. amarus) đắng sau khi đem về xử lý, lựa chọn những cây khỏe mạnh, lá xanh tốt, không mắc bệnh gửi cho Bộ môn Thực vật Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên giám định tên khoa học của cây. Lượng chất thử cho vào mỗi giếng giếng tương đương 70 μL, mỗi đĩa petri có thể khảo sát được 4 dịch cao chiết khác nhau, song song với 5 giếng chứa chất thử, 1 giếng làm đối chứng được chứa 70 μL dung dịch DMSO 10% (Rajasekaran và cs., 2008).

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration– MIC) là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà tại đó cao chiết có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hòa mẫu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc thủy tinh để hấp thụ mẫu, trộn mẫu và silica gel cho đến khi được một hỗn hợp khô. Tuy nhiên, với những hỗn hợp các chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100–200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Sau đó, lựa chọn phân đoạn có khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc tốt nhất tiếp tục đem đi tiến hành chạy sắc ký cột để thu các hợp chất và cuối cùng là đem các chất sau khi chạy cột của phân đoạn tốt nhất đi xác định cấu trúc.

Kết quả giám định tên khoa học của cây

Từ kết quả giám định trên cho thấy mẫu cây được chúng tôi thu nhận để thực hiện đề tài đúng là cây diệp hạ châu đắng (P.

Kết quả chiết cao dược liệu

Sau đó, đem toàn bộ cao chiết thu được thực hiện chiết lỏng – lỏng với các loại dung môi là n–hexane, ethyl acetate. Sau khi bốc hơi dung môi thu được cao đặc n–hexane, ethyl acetate, và dịch nước còn lại đem cô quay thu được cao nước, cân trọng lượng cao và kết quả được trình bày trong bảng 3.2. Tiếp theo là dung môi n–hexane và thấp nhất là dung môi ethyl acatate cho khối lượng cao là 30,00 g với hiệu suất thu hồi là 15,00%.

Sau đó thực hiện kiểm tra độ nhiễm khuẩn và khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết thu được. Theo kết quả nghiên cứu của Harlita và cs (2018), các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ được chiết xuất dựa trên mức độ phân cực của các loại dung môi để tối đa hóa quá trình chiết và thu cao (Harlita và cs., 2018). Cao chiết sau khi trích ly ta tiến hành thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn, nấm có trong cao chiết diệp hạ châu đắng (P.

Mẫu cao chiết không bị nhiễm nấm men, nấm mốc, tổng số vi khuẩn hiếu khí nằm trong khoảng giới hạn cho phép của dược điển Việt Nam IV năm 2009 là không quá 5 x 104 CFU/g.

Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn

Từ kết quả bảng 3.4 và biểu đồ 3.1, cao ethyl acetat có khả năng kháng khuẩn cao nhất và kháng cao nhất với E. Theo nghiên cứu của Unor và cộng sự (2016), cao ethyl acetate của diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng kháng E. Theo Ogunlesi và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cao chiết ethyl acetate của lá và hạt diệp hạ châu đắng (P. amarus) có hoạt tính kháng các vi khuẩn E.

Từ những nghiên cứu trên và kết quả thí nghiệm ở trên cho thấy cao ethyl acetate có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, nên chúng tôi chọn cao ethyl acetate để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết

Qua kết quả MIC, đã cho thấy cao ethyl acetate của diệp hạ châu đắng (P. amarus) có tính kháng khuẩn tốt với các vi khuẩn kháng thuốc được thí nghiệm ở nồng độ thấp. Theo Akinjogunla và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cao ethyl acetate của cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng ức chế vi khuẩn E. Từ đó thấy được cao chiết của cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có thể sử dụng để thay thế kháng sinh trị bệnh cho người, gia súc và động vật thủy sản trong tương lại.

Nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của cao ethyl acetate từ cây diệp hạ châu đắng (P.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn ethyl acetate

Với mục tiêu khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc của diệp hạ châu đắng (P. amarus), chúng tôi nhận thấy cao phân đoạn PA– E3 có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, nên chúng tôi chọn phân đoạn PA– E3 để tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn. Phân đoạn PA– E3 được lên cột thêm một lần nữa với hệ dung môi theo tỉ lệ là n–hexane : ethyl acetate (95:5) kết hợp với SKLM để phân lập các hợp chất. Dùng bình bi để hứng dịch chất, các bình bi nào có vệt giống nhau trên SKLM sẽ được gom chung lại với nhau để dung môi bay hơi hết ở nhiệt độ phòng và thu tinh thể.

Đem lượng hợp chất thu được tiếp tục chạy sắc ký cột một lần nữa với hệ dung môi theo tỷ lệ chloroform: methanol (99:1), kết hợp với SKLM để để phân lập các hợp chất. Dùng bình bi để hứng dịch chất, các bình bi nào có vệt giống nhau trên SKLM sẽ được gom chung lại với nhau để dung môi bay hơi hết ở nhiệt độ phòng và thu tinh thể. Đem lượng hợp chất thu được tiếp tục chạy sắc kýcột một lần nữa với hệ dung môi theo tỷ lệ chloroform (100%), kết hợp với SKLM để để phân lập các hợp chất.

Sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn PA–E3 được thử nghiệm bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn Acinetobacter 77a trực tiếp cho kết quả có vùng màu trắng xuất hiện tại băng có Rf bằng 0,35 và 0,8 tức là hợp chất có khả năng kháng khuẩn, sự hiện diện của vi khuẩn được nhận biết bằng muối tetrazolium, muối này chuyển đổi dehydrogenase của vi sinh vật thành màu formazan (Silva và cs., 2005).

Xác định cấu trúc của hợp chất PA01

11.Kết quả kháng vi khuẩn Acinetobacter 77a bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn. Từ kết quả sắc ký lớp mỏng và tự sinh đồ cho thấy hợp chất PA01 kháng lại vi khuẩn Gram âm kháng thuốc.

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 , δ ppm) của PA01 cho các tín hiệu proton

Phyllanthin cho tinh thể hình kim khi kết tinh trong dầu hỏa, tan nhiều trong n–hexane, ethyl acetate, methanol, sắc ký lớp mỏng trên bản silica gel 60 F254 Merck, dung môi động n–hexane – ethyl acetate (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10%. Theo nghiên cứu của Bhat và cộng sự (2015), Phyllanthin và Nirphyllin có trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có hoạt tính giảm đau và kháng các vi khuẩn đường miệng như S. Theo Ribeiro và cộng sự (2019), đã nghiên cứu hợp chất Phyllanthin được phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng điều chỉnh kháng fluoroquinolone trong Staphylococcus aureus SA1199-B (Ribeiro và cs., 2019).

Theo nghiên cứu của Ilangkovan và cộng sự (2016), Phyllanthin phân lập từ cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có tác dụng ức chế miễn dịch đối với các phản ứng miễn dịch tế bào ở chuột Balb/C. Thông qua ức chế sự tăng sinh tế bào T và B, biệt hóa tế bào T và điều hòa các cytokine bởi các tế bào Th1/Th2 và cũng bằng cách ức chế phản ứng DTH ở chuột Balb/C được miễn dịch sRBC ( Ilangkovan và cs., 2016). Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng Phyllanthin có khả năng kháng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) kháng kháng sinh như S.aureus, S.

Từ đó cho thấy diệp hạ châu đắng (P. amarus) có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc.